BR122018075730B1 - Flavivírus na preparação de uma composição de vacina e composição de vacina - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção: "FLAVIVÍRUS NA PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA E COMPOSIÇÃO DE VACINA". A presente invenção refere-se a provê vacinas de flavivírus e métodos de fabricação e uso dessas vacinas. A presente invenção provê flavivírus incluindo uma ou mais mutações de região impedida que reduzem viscerotropismo do flavivírus. Esses flavivírus podem ser, por exemplo, vírus da febre amarela (por exemplo, uma cepa de vacina do vírus da febre amarela); um flavivírus viscerotrópico selecionado do grupo consistindo em vírus do Dengue, Vírus do Nilo do Ocidente, vírus Wesselsbron, vírus da Doença da Floresta de Kyasanur e vírus da febre Hemorragia Omsk; ou um flavivírus quimérico.

Description

[001] Dividido do PI0306905-2, depositado em 15.01.2003.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção refere-se a vacinas de flavivírus.

Antecedentes da Invenção

[003] Flavivírus são um vírus de RNA de filamento positivo, enve lopes, pequenos, cujos vários deles oferecem ameaças reais ou poten-ciais à saúde pública global. O vírus da febre amarela, por exemplo, foi a causa de epidemias em certos locais de selva da África subSahara, bem como em algumas partes da América do Sul. Embora muitas infecções de febre amarela sejam suaves, a doença pode também causar doenças ameaçadoras à vida, graves. O estado de doença tem duas fases. A fase aguda ou inicial é normalmente caracterizada por febre alta, calafrios, dor de cabeça, dor nas costas, dores musculares, perda de apetite, náusea e vômito. Após três a quatro dias, esses sintomas desaparecem. Em alguns pacientes, os sintomas então reaparecem, conforme a doença entra em sua chamada fase tóxica. Durante esta fase, febre alta reaparece e pode levar a choque, sangramento (por exemplo, sangramento da boca, nariz, olhos e/ou estômago), falência renal e falência hepática. Na verdade, falência hepática causa icterícia, que é o amarelecimento da pele e da parte branca dos olhos, e desse modo dá seu nome de "febre amarela". Cerca de metade dos pacientes que entram na fase tóxica morrem dentro de 10 a 14 dias. No entanto, pessoas que se recuperam da febre amarela têm imunidade por toda a vida contra reinfecção. O número de pessoas infectadas com o vírus da febre amarela durante as duas últimas décadas aumentou, agora sendo cerca de 200.000 casos de febre amarela, com cerca de 30.000 mortes, a cada ano. A emergência do vírus da febre amarela agora representa uma preocupação de saúde publica séria.

[004] O vírus do dengue (DEN) é um outro exemplo de um flaviví- rus. Os vírus do dengue são transmitidos a humanos por mosquitos (principalmente Aedes aegypti) e são a causa de um problema de saúde pública em crescimento em todo o mundo. Cinqüenta a cem milhões de pessoas são infectadas pelo Dengue anualmente, e taxas de infecção tão altas quanto 6% foram observadas em algumas áreas (Gubler, "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever," CABI Publ., New York, Capítulo 1, pp. 1-22, 1997; Burke e outros, Am. J. Trop. Med. Hyg. 38:172-180, 1988). Quatro sorotipos de vírus do dengue (dengue dos tipos 1-4) circulam no Caribe, Ásia e nas Américas. A forma potencialmente letal, grave, de infecção por DEN [febre hemorragia do dengue/síndrome do choque do dengue (DHF/DSS)] é uma doença imunopatológica que acontece em indivíduos que têm infecções se- qüenciais prolongadas com sorotipos de DEN diferentes. Mais de 3,6 milhões de casos de DHF e 58.000 mortes causadas por DHF foram descritos entre 1980 e 1995 (Halstead, "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever," CABI Publ., New York, Capítulo 2, pp. 23-44, 1997). Por causa da patogênese de DHF/DSS, é geralmente imaginado que uma vacina do dengue ótima possa ser necessária para imunizar contra todos os quatro sorotipos do vírus do Dengue simultaneamente e induzir imunidade de longa duração. Apesar dos grandes esforços que foram feitos para se desenvolver uma vacina do Dengue eficaz desde a Segunda Guerra Mundial II, não há nenhuma vacina do dengue atualmente aprovada disponível.

[005] Flavivírus, incluindo vírus da febre amarela e vírus do den gue, tem duas propriedades biológicas principais responsáveis pela sua indução de estados de doença em humanos e animais. A primeira dessas duas propriedades é neurotropismo, que é uma propensão ao vírus invadir e infectar tecido nervoso do hospedeiro. Infecção por fla- vivírus neurotrópica pode resultar em inflamação e dano ao cérebro e cordão espinhal (isto é, encefalite), consciência prejudicada, paralisia e convulsões. A segunda propriedade biológica do flavivírus é viscero- tropismo, que é a propensão do vírus a invadir e infectar órgãos visce-rais vitais, incluindo o fígado, rim e coração. Infecção por flavivírus vis- cerotrópica pode resultar em inflamação e dano ao fígado (hepatite), rim (nefrite) e músculo cardíaco (miocardite), levando à falência ou disfunção desses órgãos. Neurotropismo e viscerotropismo parecem ser propriedades distintas e separadas do flavivírus.

[006] Alguns flavivírus são principalmente neurotrópicos (tal como vírus do Nilo Ocidental), outros são principalmente viscerotrópicos (por exemplo, vírus da febre amarela e vírus do dengue) e ainda outros exibem ambas propriedades (tal como vírus da doença da Floresta de Kyasanur). No entanto, ambos neurotropismo e viscerotropismo estão presentes em algum grau em todos os flavivírus. Dentro do hospedeiro, uma interação entre viscerotropismo e neurotropismo é provável de acontecer, porque a infecção da víscera acontece antes da invasão do sistema nervoso central. Desse modo, neurotropismo depende da ha-bilidade do vírus em replicar em órgãos extraneurais (víscera). Esta replicação extraneural produz viremia, que por sua vez é responsável por invasão do cérebro e cordão espinhal.

[007] Uma abordagem no desenvolvimento de vacinas contra fla- vivírus é modificar suas propriedades de virulência, de modo que o vírus da vacina perde seu neurotropismo e viscerotropismo para humanos e animais. No caso do vírus da febre amarela, duas vacinas (febre amarela 17D e vacina neurotrópica Francesa) foram desenvolvidas (Monath, "Yellow Fever," In Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3a ed., 1999, Saun-ders, Philadelphia, pp. 815-879). A vacina da febre amarela 17D foi de-senvolvida através de passagem em série em tecido embrionário de galinha, e resultou em um vírus com neurotropismo e viscerotropismo significantemente reduzidos. A vacina neurotrópica Francesa foi desen-volvida através de passagens em série em tecido cerebral de camun-dongo, e resultou em perda de viscerotropismo, mas reteve neurotro- pismo. Uma alta incidência de acidentes neurológicos (encefalite pós- vacina) foi associada ao uso de vacina Francesa. Vacinas aprovadas não estão atualmente disponíveis para muitos flavivírus medicinalmente importantes tendo propriedades viscerotrópicas, tal como dengue, Nilo Ocidental e vírus da febre hemorragia Omsk, dentre outros.

[008] Virions maduros, integralmente processados, de flavivírus contêm três proteínas estruturais, capsídeo (C), membrana (M) e en-velope (E) e sete proteínas não-estruturais. Flavivirions imaturos en-contrados em células infectadas contêm proteína de pré-membrana (prM), que é um precursor para a proteína M. As proteínas de flavivírus são produzidas através de tradução de uma estrutura de leitura aberta longa, única, para gerar uma poliproteína, seguido por uma série com-plexa de clivagens proteolíticas pós-traducionais da poliproteína, para gerar proteínas virais maduras (Amberg e outros, J. Virol. 73:80838094, 1999; Rice, "Flaviviridae," In Virology, Fields (ed.), Raven- Lippincott, New York, 1995, Volume I, p. 937). As proteínas estruturais de vírus são arrumadas na poliproteína na ordem C-prM-E.

Sumário da Invenção

[009] A invenção provê flavivírus incluindo uma ou mais muta ções de região impedida que reduzem viscerotropismo do flavivírus. Esses flavivírus podem ser, por exemplo, vírus da febre amarela (por exemplo, uma cepa de vacina do vírus da febre amarela); um flavivírus viscerotrópico selecionado do grupo consistindo em vírus do Dengue, Vírus do Nilo do Ocidente, vírus Wesselsbron, vírus da Doença da Flo-resta de Kyasanur e vírus da febre Hemorragia Omsk; ou um flavivírus quimérico. Em um exemplo de um flavivírus quimérico, a quimera inclui as proteínas capsídeo e não-estruturais de um primeiro vírus flavivírus (por exemplo, um vírus da febre amarela) e as proteínas de pré- membrana e envelope de um segundo flavivírus (por exemplo, um vírus da encefalite Japonesa ou um vírus do Dengue (por exemplo, vírus do Dengue 1, 2, 3 ou 4) incluindo uma mutação da proteína envelope que diminui o viscerotropismo do flavivírus quimérico. No caso do vírus do Dengue, a mutação pode ser, por exemplo, na lisina na posição 202 ou 204 do aminoácido envelope do Dengue. Este aminoácido pode ser substituído por, por exemplo, arginina.

[0010] A presente invenção provê também composições que inclu em qualquer um dos vírus descritos aqui e um veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável, bem como métodos de indução de uma res-posta imune a um flavivírus em um paciente através de administração de tal composição de vacina ao paciente. Pacientes tratados usando esses métodos podem não ter, mas estar sob risco de desenvolver, a infecção por flavivírus, ou podem ter a infecção por flavivírus. Ainda, a invenção inclui uso das vacinas da invenção no tratamento de infecção por flavivírus e na preparação de medicamentos para tais propósitos.

[0011] Também incluídos na invenção estão métodos de produção de vacinas de flavivírus, envolvendo introdução em um flavivírus de uma mutação que resulta em viscerotropismo menor. Ainda, a invenção inclui métodos de identificação de candidatos de vacina de flaviví- rus (por exemplo, vírus da febre amarela ou flavivírus quimérico), envolvendo (i) introdução de uma mutação na região impedida de um fla- vivírus; e (ii) determinação de se o flavivírus incluindo a mutação da região impedida tem viscerotropismo menor, conforme comparado com um vírus flavivírus sem a mutação.

[0012] Os flavivírus da invenção são vantajosos porque, ao ter vis- cerotropismo menor, eles provêem um nível adicional de segurança, conforme comparado com seus pares não-mutados, quando adminis-trados a pacientes. Vantagens adicionais desses vírus são providas pelo fato de que eles podem incluir seqüências da cepa do vírus da febre amarela YF17D (por exemplo, seqüências codificando proteínas capsídeo e não-estruturais), que (i) teve sua segurança estabelecida para >60 anos, durante o que mais de 350 milhões de doses foram administradas a humanos, (ii) induz uma longa duração de imunidade após uma única dose, e (iii) induz imunidade rapidamente, dentro de alguns dias de inoculação. Em adição, o vírus da vacina da invenção causa uma infecção ativa nos pacientes tratados. Uma vez que o meio da citocina e a resposta imune inata de indivíduos imunizados são si-milares àqueles na infecção natural, a massa antigênica se expande no hospedeiro, epítopos conformacionais apropriadamente duplicados são processados eficientemente, a resposta imune adaptativa é forte e memória é estabelecida. Além disso, em certas quimeras da invenção, as proteínas prM e E derivadas do vírus alvo contêm os antígenos crí-ticos para imunidade humoral e celular protetora.

[0013] Outras características e vantagens da invenção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada que segue, dos desenhos e das reivindicações.

Breve Descrição do Desenhos

[0014] A Figura 1 mostra variantes de tamanho de placa produzi dos por ChimeriVax®-JE FRhL3 (placa grande, Painel A) e FRhL5 (placa pequena, Painel B). Placas foram tingidas usando anti-soro anti-JE de coelho seguido por peroxidase de rábano silvestre-IgG anticoelho.

[0015] A Figura 2 é uma série de gráficos mostrando distribuições de sobrevivência de construtos YF-VAX® e ChimeriVax®JE, com e sem uma mutação em E279 (M^K). Camundongos na fase de amamentação de quatro dias de vida inocularam através de via cerebral (Figura 2A) aproximadamente 0,7 log10 PFU; (Fig. 2B) aproximadamente 1,7 log10 PFU; e (Fig. 2C) ~2,7 log10 PFU.

[0016] A Figura 3 é um gráfico de análise de regressão, dose de mortalidade vs. vírus, mostrando declives similares e linhas paralelas para vírus com (FRhL5) e sem (FRhL3) a reversão Met para Lys, permitindo comparação estatística. O vírus FRhL5 era 18,52 mais vezes potente (virulento) do que FRhL3 (p<0,0001).

[0017] A Figura 4 mostra os resultados de transfecção de RNA in dependente e séries de passagem de vírus ChimeriVax®-JE em células FRhL e Vero. A emergência de mutações nos genes prME através de nível de passagem é mostrada.

[0018] A Figura 5 é um modelo tridimensional do ectodomínio de glicoproteína envelope de flavivírus mostrando locais de mutações da região impedida que acontecem com adaptação em células FRhL ou Vero. A seqüência da glicoproteína envelope de JE (cepa JaOArS982; Sumiyoshi e outros, Virology 161:497-510, 1987) foi alinhada com um dos moldes estruturais TBE (Rey e outros, Nature 375:291-298, 1995) como um dado de entrada para construção de modelo de homologia automatizada através do método SegMod (Modelagem de Combinação de Segmento) usando o Software LOOK (Molecular Applicaton Group, Palo Alto, CA).

Descrição Detalhada

[0019] A invenção provê flavivírus (por exemplo, vírus da febre amarela e flavivírus quiméricos) tendo uma ou mais mutações que re-sultam em viscerotropismo menor, métodos para fabricação de tais flavivírus, e métodos para uso desses flavivírus para prevenir ou tratar infecção por flavivírus. A mutação (ou mutações) nos flavivírus da in-venção está presente na região impedida da proteína envelope, que foi mostrada desempenhar um papel na determinação de viscerotropis- mo. Os vírus e métodos da invenção são adicionalmente descritos, como segue.

[0020] Um exemplo de flavivírus que pode ser usado na invenção é vírus da febre amarela. Mutações podem ser feitas na região impe- dida do envelope de um clone infeccioso do tipo selvagem, por exemplo, o clone infeccioso Asibi ou um clone infeccioso de um outro vírus da febre amarela virulento, do tipo selvagem, e os mutantes podem ser então testados em um sistema de modelo animal (por exemplo, em sistemas de modelo de hamster e/ou macaco) para identificar locais que afetam o viscerotropismo. A redução no viscerotropismo é julgada, por exemplo, através de detecção de menor viremia e/ou dano hepático no sistema de modelo (vide abaixo para mais detalhes). Uma ou mais mutações verificadas diminuir viscerotropismo do vírus do tipo selvagem são então introduzidas em uma cepa de vacina (por exemplo, YF17D), e esses mutantes são testados em um sistema de modelo animal (por exemplo, em um sistema de hamster e/ou de macaco) para determinar se os mutantes resultantes têm viscerotropismo menor. Os mutantes que foram verificados diminuir viscerotropismo podem então ser usados como novas cepas de vacina que têm segurança maior, devido aos níveis menores de viscerotropismo.

[0021] Flavivírus adicionais que podem ser usados na invenção incluem outros flavivírus de mosquito, tal como encefalite Japonesa, Dengue (sorotipos 1-4), encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo do Ocidente, Kunjin, encefalite Rocio e vírus Ilhéus; flaviví- rus transmitido por carrapato, tal como encefalite da Europa Central; encefalite Siberiana, encefalite da Primavera-Verão Russa, Doença da Floresta de Kyasanur, febre Hemorrágica de Omsk, encefalomielite ovina (Loupongill), vírus Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi e Hypr; bem como vírus do gênero Hepacivírus (por exemplo, vírus da hepatite C). Todos esses vírus têm alguma propensão a infectar órgãos viscerais. O viscerotropismo desses vírus pode não causar disfunção dos órgãos viscerais vitais, mas a replicação de vírus nesses órgãos pode causar viremia e desse modo contribuir para invasão do sistema nervoso central. Diminuição do viscerotropismo desses vírus através de mutagênese pode então reduzir suas habilidades em invadir o cérebro e causar encefalite.

[0022] Em adição aos vírus listados acima, bem como outros flavi- vírus, flavivírus quiméricos que incluem uma ou mais mutações que diminuem o viscerotropismo são incluídos na invenção. Essas quimeras podem consistir em um flavivírus (isto é, um flavivírus de estrutura principal) onde uma proteína estrutural (ou proteínas) foram substituídas com uma proteína estrutural correspondente (ou proteínas) de um segundo vírus (isto é, um vírus de teste ou predeterminado, tal como flavivírus). Por exemplo, as quimeras podem consistir em um flavivírus de estrutura principal (por exemplo, um vírus da febre amarela) onde as proteínas prM e E do flavivírus foram substituídas com as proteínas prM e E do segundo vírus, de teste, (por exemplo, um vírus do dengue (1-4), vírus da encefalite Japonesa, vírus no Nilo do Ocidente, ou um outro vírus, tal como qualquer um daqueles mencionados aqui) (cuja proteína E tem uma mutação de região impedida conforme aqui descrito). Os vírus quiméricos podem ser feitos de qualquer combinação de vírus. De preferência, o vírus contra o qual a imunidade é pretendida é a fonte da(s) proteína(s) estrutural(ais) inserida(s).

[0023] Um exemplo específico de um vírus quimérico que pode ser incluído nas vacinas da invenção é a cepa da vacina humana da febre amarela, YF17D, onde a proteína prM e a proteína E foram substituías com a proteína prM e a proteína E (incluindo uma mutação de impedi-mento conforme aqui descrito) de um outro flavivírus, tal como vírus do Dengue (sorotipo 1, 2, 3 ou 4), vírus da encefalite Japonesa, vírus do Nilo do Ocidente, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite do Vale Murray, ou qualquer outro flavivírus, tal como aqueles listados acima. Por exemplo, os flavivírus quiméricos que seguem,que foram depositados com o American Type Culture Collection (ATCC) em Ma-nassas, Virginia, U.S.A. sob os termos do Tratado de Budapeste e concedida uma data de depósito de 6 de janeiro de 1998, podem ser usados para se fazer vírus da invenção: Vírus da Febre Amarelo Qui-mérico 17D/do Dengue do Tipo 2 (YF/DEN-2; ATCC número de acesso ATCC VR-2593) e vírus da Febre Amarela Quimérico 17D/Encefalite Japonesa SA14-14-2 (YF/JE A1.3; ATCC número de acesso ATCC VR-2594). Detalhes de fabricação de vírus quiméricos que podem ser usados na invenção são providos, por exemplo, nos pedidos Internacionais PCT/US98/03894 e PCT/US00/32821; e Chambers e outros, J. Virol. 73:3095-3101, 1999, cada um deles aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0024] Conforme acima notado, mutações que estão incluídas nos vírus da presente invenção diminuem o viscerotropismo. Em um exemplo, essas mutações estão presentes na região de impedimento da proteína envelope do flavivírus. A cadeia de polipeptídeo da proteína envelope dobra em três domínios distintos: um domínio central (domínio I), um domínio de dimerização (domínio II) e um domínio de módulo do tipo imunoglobulina (domínio III). A região de impedimento está presente entre os domínios I e II e, quando da exposição a pH ácido, sofre uma mudança conformacional (desse modo a designação "impedida" envolvida na fusão de membranas virais e endossomais, após absorção do vírus por uma endocitose mediada por receptor. Vários aminoácido envelope estão presentes na região impedida, incluindo, por exemplo, aminoácidos 48-61, 127-131 e 196-283 do vírus da febre amarela (Rey e outros., Nature 375:291-298, 1995). Qualquer um desses aminoácidos, ou aminoácidos proximamente vizinhos (e aminoácidos correspondentes em outras proteínas envelope de flaviví- rus), pode ser mutado de acordo com a invenção, e testados quanto a uma diminuição resultante no viscerotropismo. Mutações podem ser feitas na região de impedimento usando métodos padrão, tal como mutagênese direcionada ao local. Um exemplo do tipo de mutação presente nos vírus da invenção é substituição, mas outros tipos de mu-tações, tal como deleções e inserções, podem ser também usados. Em adição, conforme é acima notado, as mutações podem estar presentes unicamente no contexto de uma ou mais mutações adicionais.

[0025] Os vírus (incluindo quimeras) da presente invenção podem ser feitos usando métodos padrão da técnica. Por exemplo, uma molé-cula de RNA correspondendo ao genoma de um vírus pode ser intro-duzida em células primárias, embriões de galinha, ou tipos de célula diplóide, dos quais vírus da progênie (ou seus sobrenadantes) podem ser então purificados. Um outro método que pode ser usado para produzir os vírus empregam células heteroplóides, tal como células Vero (Yasumura e outros, Nihon Rinsho 21, 1201-1215, 1963). Neste método, uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, uma molécula de RNA) correspondendo ao genoma de um vírus é introduzida nas células heteroplóides, o vírus é coletado do meio onde as células foram culturadas, o vírus coletado é tratado com uma nuclease (por exemplo, uma endonuclease que degrada ambos DNA e RNA, tal com Benzo- nase®; Patente U.S. No. 5.173.418), o vírus tratado com nuclease é concentrado (por exemplo, através do uso de ultrafiltragem usando um filtro tendo um redução (cut-off) de peso molecular de, por exemplo, 500 kDa), e o vírus concentrado é formulado para os propósitos de va-cinação. Detalhes deste método são providos no Pedido de Patente U.S. No. 60/348.565, depositado em 15 de janeiro de 2002, que é aqui incorporado a título de referência.

[0026] Os vírus da invenção podem ser administrados como agen tes profiláticos primários em adultos ou crianças sob o risco de infecção, ou podem ser usados como agentes secundários para tratamento de pacientes infectados. Por exemplo, no caso de quimeras de febre amarela/dengue, as vacinas podem ser usadas em adultos ou crianças sob risco de infecção por Dengue, ou podem ser usadas como agen- tes secundários para tratamento de pacientes infectados com Dengue. Exemplos de pacientes que podem ser tratados usando as vacinas relacionadas ao dengue e métodos da invenção incluem (i) crianças em áreas onde o Dengue é endêmico, tal como Ásia, América Latina e Caribe, (ii) viajantes estrangeiros, (iii) pessoal militar e (iv) pacientes em áreas de uma epidemia de Dengue. Além disso, os habitantes de regiões na qual a doença foi observada estar em expansão (por exemplo, Argentina, Chile, Austrália, partes da África, Sul da Europa, o Meio Oeste e o sul dos Estados Unidos), ou regiões onde ela pode ser observada se expandir no futuro (por exemplo, regiões infestadas com Aedes aegypti), podem ser tratados de acordo com a invenção.

[0027] A formulação dos vírus da invenção pode ser realizada usando métodos que são padrão na técnica. Várias soluções farma- ceuticamente aceitáveis para uso na preparação de vacina são bem conhecidas e podem ser imediatamente adaptadas para uso na presente invenção por aqueles versados na técnica. (Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (18a edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA.). Em dois exemplos específicos, os vírus são formulados em um Sal de Earle de Meio Essencial Mínimo (MEME) contendo 7,5% de lactose e 2,5% de albumina de soro ou MEME contendo 10% de sorbitol. No entanto, os vírus podem simplesmente ser diluídos em uma solução fisiologicamente aceitável, tal como solução salina estéril ou solução tamponada estéril. Em um outro exemplo, os vírus podem ser administrados e formulados, por exemplo, da mesma maneira que a vacina 17D da febre amarela, por exemplo, como uma suspensão isenta de tecido embrionário de galinha infectado, ou um fluido coletado de culturas celulares infectadas com vírus da febre amarela quimérico.

[0028] As vacinas da invenção podem ser administradas usando métodos que são bem conhecidos na técnica, e quantidades apropria- das das vacinas administradas podem ser imediatamente determinadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os vírus da invenção podem ser formulados como soluções aquosas estéreis contendo entre 102 e 107 unidades infecciosas (por exemplo, unidades de formação de placa ou doses infecciosas de cultura de tecido) em um volume de dose de 0,1 a 1,0 ml, a serem administradas através de, por exemplo, via intramuscular, subcutânea ou intradermal. Em adição, devido ao fato dos flavivírus serem capazes de infectar o hospedeiro humano através de vias mucosais, tal como a via oral (Gresikova e outros., "Tick-borne Encephalitis," Em The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203), os vírus podem ser administrados através de vias mucosais também. Ainda, as vacinas da invenção podem ser administradas em uma dose única ou, opcionalmente, a administração pode envolver o uso de uma dose inicial seguido por uma dose de reforço que é administrada, por exemplo, 2-6 meses mais tarde, conforme determinado ser apropriado por aqueles versado na técnica.

[0029] Opcionalmente, adjuvantes que são conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados na administração dos vírus da invenção. Adjuvantes que podem ser usados para aumentar a imuno- genicidade dos vírus incluem, por exemplo, formulações lipossômicas, adjuvantes sintéticos, tal como (por exemplo, QS21), dipeptídeo mu- ramila, lipídeo A de monofosforila ou polifosfazina. Embora esses ad-juvantes sejam tipicamente usados para aumentar respostas imune a vacinas inativadas, eles podem ser também usados com vacinas vivas. No caso de um vírus aplicado através de uma via mucosal, por exemplo, oralmente, adjuvantes mucosais tal como a toxina lábil ao calor de E. coli (LT) ou derivações mutantes de LT podem ser usados como adjuvantes. Em adição, genes codificando citocinas que têm atividades adjuvantes podem ser inseridos nos vírus. Desse modo, ge nes codificando citocinas, tal como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 ou IL-5, podem ser inseridos junto com genes de antígeno estrangeiro para produzir uma vacina que resulta em respostas imune maiores, ou para modular a imunidade direcionada mais especificamente a resposta ce-lular, humoral ou mucosal.

[0030] No caso do vírus do Dengue, contra o qual vacinação ótima pode envolver a indução de imunidade contra todos os quatro soroti- pos de dengue, os vírus quiméricos da presente invenção podem ser usados na formulação de vacinas tetravalentes. Qualquer uma ou todas as quimeras usadas em tais formulações tetravalentes pode(m) incluir uma mutação que diminui o viscerotropismo, conforme aqui descrito. As quimeras podem ser misturadas para formarem preparações tetravalentes em qualquer ponto durante a formulação, ou podem ser administradas em série. No caso de uma vacina tetravalente, para reduzir a possibilidade de interferência viral e desse modo para se atingir uma resposta imune equilibrada, as quantidades de cada uma das quimeras diferentes presentes nas vacinas administradas pode variar. Em resumo, em um exemplo de tal formulação, pelo menos 5 vezes menos da quimera de Dengue-2 (por exemplo, 10, 50, 100, 200 ou 500 vezes menos) são usadas com relação a outras quimeras. Neste exemplo, as quantidades das quimeras de Dengue-1, Dengue-3 e Dengue 4 podem ser equivalentes ou podem variar. Em um outro exemplo, as quantidades de vírus do Dengue-4 e/ou Dengue-1 podem ser também diminuídas. Por exemplo, em adição a usar menos quimera de Dengue-2, pelo menos 5 vezes menos da quimera do Dengue-4 (por exemplo, 10, 50, 100, 200 ou 500 vezes menos) podem ser usadas com relação às quimeras do Dengue-1 e Dengue-3; pelo menos 5 vezes menos da quimera do Dengue-1 (por exemplo, 10, 50, 100, 200 ou 500 vezes menos) podem ser usadas com relação às quimeras do Dengue-3 e Dengue-4; ou pelo menos 5 vezes menos das quimeras do Dengue-1 e Dengue-4 podem ser usadas com relação à quimera do Dengue-3. Pode ser particularmente desejável, por exemplo, diminuir a quantidade de quimera do Dengue-1 com relação às quantidades de quimera do Dengue-2 e/ou Dengue-4 como quando a mutação de E-2045/E202 descrita aqui não está incluída na quimera.

[0031] Detalhes da caracterização de um exemplo de uma muta ção incluída na invenção, que acontece na posição 279 da proteína envelope de uma quimera de encefalite da febre amarela/Japonesa, são providos abaixo. São também providos abaixo detalhes com relação às quimeras de vírus da febre amarela/dengue, onde as proteínas envelope do vírus do dengue incluem uma ou mais mutações que diminuem o viscerotropismo. Em um exemplo de tal mutação, a lisina na posição 204 da proteína envelope do Dengue-1, Dengue-2 ou Dengue- 4, ou a lisina na posição 202 da proteína envelope do Dengue-3, que é dois aminoácidos mais curta do que as proteínas envelope de outros sorotipos do Dengue, é substituída ou deletada. Esta lisina pode ser, por exemplo, substituída com arginina. Outros resíduos próximos ao aminoácido 204 envelope (202 para Dengue-3) podem ser mutados para atingir menor viscerotropismo. Por exemplo, qualquer um dos aminoácidos 200-208 ou combinações desses aminoácidos pode ser mutado. Exemplos específicos incluem o que segue: posição 202 (K) do Dengue-1; posição 202 (E) do Dengue-2; posição 200 do Dengue-3 (K); e posições 200 (K), 202 (K) e 203(K) do Dengue-4. Esses resíduos podem ser substituídos com, por exemplo, arginina.

Resultados Experimentais I. Quimera da Febre Amarela/Encefalite Japonesa Incluindo uma Mutação de Região de Impedimento Sumário

[0032] Uma vacina de febre amarela quimérica (YF)-encefalite Ja ponesa (JE) (ChimeriVax®JE) foi construída através de inserção dos genes de prM-E da cepa da vacina JE SA14-14-2 em um clone de cDNA de comprimento integral do vírus YF 17D. Passagem em células de pulmão rhesus fetal (FRhL) levaram à emergência de um vírus de placa pequena contendo uma mutação de aminoácido Met^Lys em E279, revertendo este resíduo do SA14-14-2 para o aminoácido do tipo selvagem. Um vírus similar foi também construído através de mu- tagênese direcionada ao local. A mutação de E279 está localizada em uma folha beta na região impedida da proteína E, que é responsável por uma mudança conformacional dependente do pH durante penetração de vírus a partir do endossoma para o citoplasma de uma célula infectada. Em estudos de passagem de transfecção independentes em células FRhL ou Vero, as mutações aparecem com mais freqüência no impedimento 4 (ligado pelos aminoácidos E266 a E284), refletindo instabilidade genômica nesta região funcionalmente importante. A reversão de E279 causou um aumento significante na neurovirulência, conforme determinado através de LD50 e distribuição de sobrevivência em camundongo em fase de amamentação e através de histopatologia em macacos rhesus. Com base na sensibilidade e capacidade de comparação de resultados com macacos, o camundongo em fase de amamentação está em um hospedeiro apropriado para teste de segurança de candidatos de vacina de flavivírus para neurotropismo. O vírus E279 Lys era restrito com relação à replicação extraneural em macacos, uma vez que viremia e níveis de anticorpo (marcadores de visce- rotropismo) foram significantemente reduzidos comparado com o vírus E279 Met. Antecedentes

[0033] O estudo de vírus quimérico deu novas visões à base mole cular de virulência e novos prospectos para desenvolvimento de vacina. Por exemplo, clones moleculares de alfavírus de filamento positivo (Morris-Downes e outros, Vaccine 19:3877-3884, 2001; Xiong e outros, Science 243:1188-1191, 1991) e flavivírus (Bray e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10342-10346, 1991; Chambers e outros, J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001; Huang e outros, J. Virol. 74:3020-3028, 2000) foram modificados atra-vés de inserção de genes estruturais codificando o envelope viral e de-terminantes envolvidos em neutralização, ligação celular, fusão e inter- nalização. A replicação desses vírus quiméricos é controlada por prote-ínas não-estruturais e os terminais de não-codificação expressos pela cepa de origem, enquanto que as proteínas estruturais dos genes doa-dores dão imunidade específica. As características biológicas de vírus quiméricos são determinadas por ambos genes do vírus do doador e do recipiente. Comparando construtos com diferenças de seqüência de nucleotídeo nos genes do doador, é possível identificar os papéis funci-onais de resíduos de aminoácido individuais em virulência e atenuação.

[0034] Usando um vírus da febre amarela quimérico (YF) que in corporava os genes de prM-E de uma cepa atenuada (SA14-14-2) de encefalite Japonesa (JE), um exame detalhado foi feito do papel das 10 mutações de aminoácido que distinguiam o vírus de JE atenuado do vírus de JE virulento, do tipo selvagem, (Arroyo e outros, J. Virol. 75:934-942, 2001). Os fatores de virulência foram definidos revertendo cada mutação sozinha ou como grupos para a seqüência do tipo sel-vagem e determinação dos efeitos sobre a neurovirulência para ca-mundongos adultos jovens inoculados através de via intracerebral (IC) com 104 unidades de formação de placa (PFU). Todos os vírus de re-versão de sítio único permaneceram altamente atenuados, e reversões nos resíduos 3 ou 4 foram necessárias para restaurar o fenótipo de neurovirulência. Apenas um reversor de sítio único (E279 Met^Lys) mostrou qualquer evidência de uma mudança na neurovirulência, com 1 a 8 animais sucumbindo após inoculação IC.

[0035] A fim de explorar mais o papel funcional do determinante de E279, foram comparados vírus quiméricos de YF/JE que diferenciavam neste resíduo de aminoácido quanto às suas habilidades em causar encefalite em camundongos e macacos em fase de amamentação. Inoculação IC de macacos é rotineiramente usada como um teste para segurança de flavivírus e outras vacinas vivas, e exame patológico quantitativo do cérebro e cordão espinhal provê um método sensível para distinguir cepas do mesmo vírus com diferenças sutis em neurovi- rulência (Levenbook e outros, J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987). Camundongos em fase de amamentação provêem um modelo mais sensível do que animais mais velhos, uma vez que susceptibilidade a fla- vivírus neurotrópicos é dependente da idade (Monath e outros, J. Virol. 74:1742-1751, 2000). Os resultados confirmaram que a mutação de aminoácido Met^Lys única em E279 conferiu um aumento na virulência. Esta mutação está localizada na região "impedida" da proteína E, a qual é responsável pela mudança conformacional dependente do pH durante penetração do vírus a partir do endossoma no citoplasma de uma célula infectada (Reed e outros, Am. J. Hyg. 27:493-497, 1938). Importante, o camundongo em fase de amamentação mostrou prognosticar o perfil de virulência em macacos rhesus. Com base na detecção de uma mudança na neurovirulência conferida pela mutação por ponto, foi proposto que o camundongo em fase de amamentação é um hospedeiro apropriado para teste de segurança de candidatos de vacina de flavivírus para neurotropismo.

[0036] Enquanto aumentando a neurovirulência, a mutação de E279 parecia ter o efeito oposto sobre viscerotropismo, conforme medido através da viremia e resposta de anticorpo menores em macacos, marcadores aceitáveis deste trato viral (Wang e outros, J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995).

Materiais e Métodos Vírus

[0037] O desenvolvimento da vacina ChimeriVax®-JE começou com a clonagem de uma cópia de cDNA do genoma de 11 quilobase completo do vírus YF 17D (Chambers e outros, J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Para realizar isso, seqüências genômicas de YF 17D foram propagadas em dois plasmídeos, que codificam as seqüências de YF a partir do nucleotídeo (nt) 1-2276 e 8279-10,861 (plasmídeo YF5'3'IV) e do 1373-8704 (plasmídeo YFM5.2), respectivamente. Moldes de cDNA de comprimento completo foram gerados através de ligação de fragmentos de restrição apropriados derivados desses plasmídeos. Se- qüências de YF dentro de YF5'3'IV e YFM5.2 foram substituídas pelas seqüências de JE(SA14-14-2)pr-ME correspondentes, resultando na geração de plasmídeos de YF5'3'IV/JE (prM-E') e YFM5.2/JE (E'-E). Esses plasmídeos foram digeridos seqüencialmente com endonucleases de restrição NheI e BspEI. Fragmentos apropriados foram ligados com ligase de DNA T4, cDNA foi digerido com enzima XhoI para permitir transcrição, e RNA foi produzido a partir do promotor Sp6. Transfec- ção de células de pulmão de rhesus fetais diplóides (FRhL) com RNA de comprimento completo foi realizada através de eletroporação. So- brenadante contendo vírus foi coletado quando efeito citopático foi ob-servado (geralmente dia 3), purificado através de centrifugação em baixa velocidade e filtrado estéril a 0,22 μm. Soro bovino fetal (FBS) a 50% v/v de concentração final foi adicionado como um estabilizador. O vírus foi titulado através de ensaio em placa em célula Vero, conforme anteri-ormente descrito (Monath e outros., Vaccine 17:1869-1882, 1999). O vírus quimérico foi seqüencialmente passado em FRhL ou células Vero (Vero-PM, Aventis Pasteur, Marcy l'Étoile, France) em uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 0,001. Vacina da febre amarela 17D comercial (YF-VAX®) foi obtida da Aventis-Pasteur (anteriormente Pasteur-Mérieux-Connaught), Swiftwater, PA. Mutagênese Direcionada ao Local

[0038] Vírus contendo uma reversão Met^Lys em sítio único no resíduo E279 foi gerado através de mutagênese oligo-direcionada con-forme descrito (Arroyo e outros., J. Virol. 75:934-942, 2001). Em resu-mo, um plasmídeo (pBS/JE SA14-14-2) contendo a região do gene JE SA-14-14-2 E dos nucleotídeos 1108 a 2472 (Cecilia e outros, Virology 181:70-77, 1991) foi usado como molde para mutagênese direcionada ao local. Mutagênese foi realizada usando o estojo de mutagênese di-recionada ao local Transformer (Clontech, Palo Alto, CA) e iniciadores de oligonucleotídeos sintetizados na Life Technologies (Grand Island, NY). Os plasmídeos foram seqüenciados através da região E para verificar que a única mudança foi a mutação engenheirada. Uma região compreendendo a mutação de E279 foi então subclonada a partir do plasmídeo pBS/JE em pYFM5.2/JE SA14-14-2 (Cecilia e outros, Viro-logy 181:70-77, 1991) usando os sítios de restrição NheI e EheI (Kas I). Montagem de DNA de comprimento integral e transcrição de SP6 foram realizadas conforme acima descrito; no entanto, transfecção de RNA de células Vero foi realizada usando Lipofectina (Gibco, BRL). Seqüenciamento

[0039] RNA foi isolado de monocamadas infectadas por Trizol® (Life Technologies). Transcrição reversa foi realizada com Transcriptase Reversa Superscript II (RT) e um protocolo RT longo (Life Technologies), seguido por tratamento de RNaseH (Promega) e PCR longa (XL PCR, Perkin Elmer/ABI). RT, PCR e iniciadores de seqüen- ciamento foram designados usando a seqüência da cepa YF17D (número do acesso no GeneBank K02749) e seqüência da cepa JE- SA14-14-2 (número do acesso no GeneBank D90195) como referência. Produtos de PCR foram purificados com gel (estojo de extração de gel Qiaquick da Qiagen) e seqüenciados usando mistura de reação de seqüenciamento Corante-Terminador dRhodamine (Perkin-Elmer/ABI). Reações de seqüenciamento foram analisadas em um Analisador Ge nético modelo 310 (Perkin-Elmer/ABI) e seqüências de DNA foram avaliadas usando o software Sequencher 3.0 (GeneCodes). Ensaios de placa e teste de neutralização

[0040] Ensaios de placa foram realizados em placas de 6 cavidades de culturas de monocamada de células Vero. Após adsorção de vírus por 1 hora de incubação a 37° C, as células foram sobrepostas com agarose em meio nutriente. No dia 4, uma segunda sobrecamada foi adicionada contendo 3% de vermelho neutral. Testes de neutralização de redução de placa, diluição de soro, foram realizados conforme anteriormente descrito (Monath e outros, Vaccine 17:1869-1882, 1999). Modelo de camundongo desmamado

[0041] Grupos de 8 a 10 fêmeas de camundongos ICR de 4 se manas de vida (Taconic Farms, Inc. Germantown, N.Y.) foram inocula-dos IC com 30 μL de construtos de YF/JE SA14-14-2 (ChimeriVax®- JE) com (dose de 4,0 log10 PFU em) ou sem (3,1 log10 PFU) a mutação de E279. Um número igual de camundongos foi inoculado com YF- VAX® ou diluente. Os camundongos foram seguidos para doença e morte por 21 dias. Modelo de camundongo em fase de amamentação

[0042] Camundongos ICR fêmea grávidas (Taconic Farms) foram observados durante o parto a fim de se obter ninhadas de camundongos em fase de amamentação de idade exata. Camundongos em fase de amamentação de ninhadas múltiplas nascidos dentro de um intervalo de 48 horas foram agrupados e aleatoriamente redistribuídos para as mães em grupos de até 121 camundongos. As ninhadas foram inoculadas IC com 20 μl de diluições em série de dez vezes de vírus e seguido por sinais de doença e morte por 21 dias. Os inóculos do vírus foram titulados novamente. Valores de 50% de dose letal (LD50) foram calculados através do método de Reed e Muench (Morris-Downes e outros, Vaccine 19:3877-3884, 2001). Distribuições de sobrevivência univariada foram postas em gráfico e comparadas através do teste de classificação log. Modelo de macaco

[0043] O teste de neurovirulência de macaco foi realizado confor me descrito por Levenbook e outros (Levenbook e outros, J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987) e proscrito pelas regulações do WHO para teste de segurança de vírus de semente de YF 17D (Wang e outros, J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995). Este teste foi anteriormente aplicado para a avaliação de vacinas ChimeriVax®-JE, e os resultados dos testes em vírus FRhL3 foram descritos (Monath e outros, Curr. Drugs- Infect. Dis., 1:37-50; 2001; Monath e outros, Vaccine 17:1869-1882, 1999). Os testes foram realizados em Sierra Biomedical Inc. (Sparks, NV) de acordo com as regulações da U.S. Food and Drug Administration Good Laboratory Practice (GLP) (21 C.F.R., Parte 58). No dia 1, dez (5 machos, 5 fêmeas) macacos rhesus pesando 3,0-6,5 kg receberam uma única inoculação de 0,25 mL de vírus ChimeriVax®-JE não-diluído com ou sem a mutação Met^Lys de E279 ou YF-VAX® no lobo frontal do cérebro. Os macacos foram avaliados diariamente quanto a sinais clínicos e classificados como 0 (nenhum sinal), 1 (revestimento grosso, não come), 2 (voz de tom alto, inativo, movimento lento), 3 (movimento inseguros, tremores, falta de coordenação, fraqueza dos membros) e 4 (incapacidade de ficar de pé, paralisia dos membros, morte). A classificação clínica para cada macaco é a média das classificações diárias do animal, e a classificação clínica para o grupo de tratamento é a média aritmética das classificações clínicas individuais. Níveis de viremia foram medidos através de ensaio de placa em células Vero usando soros coletados nos dias 2-10. No dia 31, os animais foram eutanizados, perfundidos com solução salina isotôni- ca-ácido acético a 5% seguido por formalina a 10% tamponada-neutra e necrópsias foram realizadas. Cérebros e cordões espinhais foram fixados, seccionados e tingidos com galocianina. Neurovirulência foi avaliada através da presença e gravidade de lesões em várias forma-ções anatômicas do sistema nervoso central. A gravidade foi classificada dentro de cada bloco de tecido usando a escala especificada pelo WHO (Wang e outros, J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995):

[0044] Grau 1: Mínima: 1-3 infiltrados inflamatórios focais peque nos. Alguns neurônios podem ser mudados ou perdidos.

[0045] Grau 2: Moderada: infiltrados inflamatórios focais mais ex tensos. Mudanças neuronais ou perda afeta não mais do que um terço dos neurônios.

[0046] Grau 3: Grave: mudanças neuronais ou perda afetando 33 90% de neurônios; mudanças inflamatórias focais ou difusas moderadas.

[0047] Grau 4: Supercondução: mais de 90% dos neurônios são mudados ou perdidos, com infiltração inflamatória grave variável mas freqüente.

[0048] As estruturas envolvidas no processo patológico com mais freqüência e com maior gravidade foram chamadas 'áreas alvo', en-quanto essas estruturas discriminando entre o vírus de JE do tipo sel-vagem e ChimeriVax®-JE foram chamadas 'áreas de discriminação'. A substância negra constituía a área 'alvo' e o núcleo caudal, globos pá-lidos, putâmen, núcleo talâmico anterior/médio, núcleo talâmico lateral e cordão espinhal (aumentos cervical e lombar) constituíam as 'áreas de discriminação' (Monath e outros, Curr. Drugs Infect. Dis., 1:37-50, 2001), conforme anteriormente mostrado para YF 17D (Levenbook e outros, J. Biol. Stand. 15:305-313, 1987). Todas as avaliações neuro- patológicas foram feitas por um único pesquisador experiente que era cego para o código do tratamento. Classificações separadas para área alvo, áreas de discriminação e áreas alvo + de discriminação foram determinadas para cada macaco, e os grupos de teste comparados com relação às classificações médias. Outras áreas do tronco cerebral (núcleos do cérebro médio em adição à substância negra; pontes; me-dula; e cerebelo) e as leptomeninges foram também examinadas. Comparações estatísticas de classificações neuropatológicas médias (para a área alvo, áreas de discriminação e áreas alvo + de discrimi-nação) foram realizadas através teste t de Student, de 2 vias. Em adição ao exame neuropatológico, o fígado, o baço, glândulas adrenais, coração e rins foram examinados quanto a mudanças patológicas através de microscopia de luz. Estabilidade do Genoma

[0049] Para determinar a estabilidade genética do vírus quimérico de YF/JE, e para pesquisar por 'pontos quentes' no genoma da vacina que são suscetíveis à mutação, experimentos múltiplos foram realizados onde RNA foi usado para transfectar células e o vírus da progênie serialmente passado in vitro, com seqüenciamento parcial ou completo realizado em níveis de passagem baixo e alto. As séries de passagem foram realizadas começando com a etapa de transfecção em células FRhL ou Vero. A passagem serial do vírus foi realizada em MOI baixo em culturas celulares cultivadas em frascos T25 ou T75. Nos níveis de passagem selecionados, amostras em duplicata de RNA genômico foram extraídas, transcritas reversamente, amplificadas através de PCR e a região de prM-E ou seqüência genômica completa determinada. Resultados

[0050] Geração de vírus mutantes de local único através de pas sagem empírica

[0051] O vírus de YF/JESA14-14-2 (ChimeriVax®-JE) quimérico recuperado de células FRhL transfectadas (FRhL1) foi passado se- qüencialmente em culturas de fluido dessas células em um MOI de aproximadamente 0,001. Conforme descrito abaixo, na passagem 4 foi notada uma mudança na morfologia de placa, que foi subseqüente- mente mostrada estar associada com uma transversão T^G no nu- cleotídeo 1818 resultando em uma mudança de aminoácido (Met^Lys) na posição 279 da proteína E.

[0052] As placas foram caracterizadas em cada nível de passa gem e classificadas em 3 categorias baseado em seus tamanhos me-didos no dia 6 (grande, L ~ >1,0 mm, médio M ~ 0,5-1 mm e pequeno, S ~ <0,5 mm). A distribuição de tamanho de placa foi determinada contendo 100 placas. Vírus FRhL3 (3a passagem) continha 80-94% de placas L e 6-20% de S. No FRhL5 (5a passagem), uma mudança no tamanho da placa foi detectada, com a emergência de placas S compreendendo >85% da população de placa total (Figura 1). O vírus FRhL4 era intermediário, com 40% de placas grandes e 60% de pequenas. Seqüenciamento genômico completo do vírus FRhL5 demonstrou uma mutação única em E279. A seqüência de consenso de ge- noma integral da quimera FRhL5, com inspeção cuidadosa para heterogeneidade do códon, confirmou que esta era a única mutação detec- tável presente no vírus. A seqüência de consenso do genoma completa do vírus FRhL3 não revelou quaisquer mutações detectáveis comparado com o vírus quimérico de YF/JESA14-14-2 de origem (Arroyo e outros, J. Virol. 75:934-942, 2001) (Tabela 1).

[0053] Dez placas grandes, médias e pequenas foram pegas de FRhL3, -4 e -5, e amplificadas através de passagem em culturas de fluido de células de FRhL. Após amplificação, o fluido sobrenadante foi posto em placa em células Vero. Tentativas de isolar o fenótipo da placa S a partir de FRhL3 falharam e todas as placas de tamanho L ou S produziram a maioria de placas L após uma rodada de amplificação em células FRhL. Na passagem seguinte (FRhL4), onde 60% das placas eram de tamanho pequeno, era possível isolar essas placas através de amplificação em células FRhL. Em FRhL5, a maioria das placas (85-99%) era de tamanho pequeno, e a amplificação de ambas placas L e S individuais resultou na maioria de tamanho S. Seqüenciamento dos genes prM-E dos fenótipos de placa S e L de FRhL3 revelou se- qüências idênticas aos genes SA14-14-2 de origem usados para construção de ChimeriVax™-JE, enquanto que as placas S isoladas ou de vírus FRhL4ou FRhL5 revelou a mutação (Met^Lys) em E279. Protocolos de Animal

[0054] Todos os estudos envolvendo camundongos e prima tas não-humanos foram realizados de acordo com o USDA Animal Welfare Act (9 C.F.R., Partes 1-3) conforme descrito no Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Virulência para camundongos desmamados

[0055] Dez camundongos ICR fêmea de 4 semanas de vida foram inoculados IC com aproximadamente 3.0 log10 PFU de vírus FRhL3, -4, ou -5 em experimentos separados; em cada estudo, 10 camundongos receberam uma dose equivalente (aproximadamente 3,3 log10 PFU) de vacina de febre amarela comercial (YF-VAX®, Aventis Pasteur, Swif-twater PA). Nenhum dos camundongos inoculados com vírus quimérico mostrou sinais de doença ou morreram, enquanto que 70-100% de camundongos de controle inoculados com YF-VAX® desenvolveram paralisia ou morreram. Em um outro experimento, 8 camundongos foram inoculados IC com FRhL5 (3,1 log10 PFU) ou o agente de reversão de E279 de YF/JE de sítio único (4,0 log10 PFU) e 9 camundongos re-ceberam YF-VAX® (2,3 log10 PFU). Nenhum dos camundongos inocu-lados com os construtos quiméricos ficou doente, enquanto que 6/9 (67%) de camundongos inoculados com YF-VAX® morreram. Virulência para camundongos em fase de amamentação

[0056] Dois experimentos separados foram realizados, onde vírus quimérico de YF/JESA14-14-2 com e sem a mutação de E279 foram inoculados IC em doses medidas em camundongos em fase de ama-mentação (Tabela 2). YF-VAX® foi usado como o controle de referên- cia nesses experimentos. LD50 e os tempos de sobrevivência médios (AST) foram determinados para cada vírus.

[0057] No primeiro experimento usando camundongos de 8,6 dias de vida, vírus FRhL5 contendo a reversão de sítio único (Met^Lys) em E279 era neurovirulento, com um log10 LD50 de 1,64 enquanto que o vírus de FRhL3 sem esta mutação era quase avirulento, com apenas 1 a 10 camundongos morrendo nos grupos de dose mais alta (Tabela 2). Na dose mais alta (aproximadamente 3 log10 PFU), a AST do vírus FRhL5 era menor (10,3 dias) do que aquela do vírus FRhL3 (15 dias).

[0058] Um segundo experimento foi subseqüentemente realizado para verificar estatisticamente que uma mutação de sítio único no gene E é detectável através de teste de neurovirulência em camundongos em fase de amamentação. Neste experimento camundongos gerados de 4 dias de vida foram inoculados IC com doses medidas de ChimeriVax®-JE FRhL3 (nenhuma mutação), ChimeriVax®-JE FRhL5 (E279 Met^Lys), ou uma quimera de YF/JE onde uma única mutação de E279 (Met^Lys) foi introduzida através de mutagênese direcionada ao local (Arroyo e outros, J. Virol. 75:934-942, 2001). Os valores de LD50 dos dois vírus contendo a mutação de E279 eram >10 vezes menores do que o construto de FRhL3 sem a mutação (Tabela 2) indicando que a mutação Met^Lys de E279 aumentou a neurovirulência do vírus quimérico. Havia diferenças estatisticamente significantes entre os vírus nas distribuições de sobrevivência (Figura 2). Na dose menor (~ 0,7 log10 PFU), os vírus quiméricos de YF/JE eram significativamente menos virulentos do que YF-VAX® (classificação log p<0,0001). Os vírus com a mutação Met^Lys de E279 tinham curvas de sobrevivência similares que diferiam do vírus FRhL3 sem mutação), mas a diferença não atingiu significância estatística (classificação log p=0,1216). No entanto, em doses mais altas (~1,7 e ~2,7 log10 PFU), as distribuições de sobrevivência dos vírus mutantes E279 eram significantemen- te diferentes do vírus FRhL3.

[0059] Análise da razão de mortalidade pelo vírus revelou quedas similares e linhas de regressão paralelas (Figura 3). O vírus FRhL5 era 18,52 mais vezes mais potente (virulento) do que FRhL3 (limites fidu- ciais a 95% de 3,65 e 124,44, p<0,0001). Teste de neurovirulência de macaco

[0060] Nenhum dos 20 macacos inoculados com vírus Chimeri- Vax®-JE FRhL3 ou FRhL5 desenvolveu sinais de encefalite, enquanto que 4/10 macacos inoculados com YF-VAX® desenvolveram sinais de grau 3 (tremores) entre os dias 15-29, o que mudou dentro de 6 dias do início. Classificações clínicas média e média máxima eram signifi- cantemente mais altas no grupo de YF-VAX® do que nos dois grupos de ChimeriVax®-JE. Não havia nenhuma diferença na classificação clínica entre os grupos recebendo vírus ChimeriVax®-JE com e sem a mutação E279 (Tabela 3).

[0061] Não havia nenhuma diferença no peso durante o experimento entre os grupos em tratamento. Exame patológico não revelou quaisquer alterações de fígado, baço, rim, coração ou glândulas adrenais atribuíveis a vírus, e quaisquer diferenças entre grupos de tratamento.

[0062] Exame histopatológico do cérebro e cordão espinal revelou registros de lesão significantemente maiores para macacos inoculados com YF-VAX® do que para vírus ChimeriVax®-JE FRhL3 e FRhL5 (Ta-bela 3). Os registros de alvo + discriminador combinados (±SD) para YF-VAX® era 1,17 (±0,47). Os registros para ChimeriVax®-JE FRhL3 (E279 Met) e FRhL5 (E279 Lys) eram 0,29 (+ 0,20), (p= 0,00014 vs. YF- VAX®) e 0,54 (+ 0,28), (p=0,00248 vs. YF-VAX®), respectivamente.

[0063] O registro da área de discriminação e o registro da área alvo + discriminador combinados para ChimeriVax®-JE FRhL5 contendo a reversão Met^Lys em E279 eram significantemente mais altos do que os registros correspondentes para ChimeriVax®-JE FRhL3 (Tabela 3).

[0064] O principal sintoma em macacos inoculados com YF-VAX® era tremor, que pode refletir lesões do cerebelo, núcleo talâmico ou globo pálido. Nenhuma lesão histológica foi verificada no córtex cere- belar, N. dentado, ou outro núcleo cerebelar, enquanto que lesões inflamatórias estavam presentes no núcleo talâmico e globo pálido em todos os macacos positivos.

[0065] Interessantemente, houve uma relação inversa entre neu- rovirulência e viscerotropismo do reversor de E279, conforme refletido através de viremia. O teste de neurovirulência de macaco WHO inclui quantificação de viremia como uma medida de viscerotropismo (World Health Organization, "Requirements for yellow fever vaccine," Requi-rements for Biological Substances No. 3, revisado 1995, WHO Tech. Rep. Ser. 872, Annex 2, Geneva: WHO, 31-68, 1998). Isso é razoável, com base nas observações de que inoculação intracerebral resulta em semeadura imediata de tecidos extraneurais (Theiler, "The Virus," In Strode (ed.), Yellow Fever, McGraw Hill, New York, New York, 46-136, 1951). Nove (90%) de 10 macacos inoculados com YF-VAX® e 8 (80%) de 10 macacos inoculados com ChimeriVax®-JE FRhL3 ficaram virêmicos após inoculação IC. O nível de viremia tendia ser maior no grupo YF-VAX® do que no grupo ChimeriVax®-JE FRhL3, atingindo sig- nificância no dia 4. Em contraste, apenas 2 (20%) dos animais que receberam vírus FRhL5 (E279 Met ^ Lys) tinham viremias detectáveis, de baixo nível, (Tabela 4) e a viremia média era significantemente menor do que no vírus FRhL3 nos dias 3 e 4 (e quase significante no dia 5). Desse modo, o vírus reversor de FRhL5 mostrou neurovirulência maior, mas viscerotropismo menor comparado com vírus FRhL3. Soros de macacos inoculados com ChimeriVax®-JE FRhL3 e FRhL5 foram examinados quanto à presença de variantes de tamanho de placa. Apenas placas L foram observadas nos soros de macacos inoculados com o FRhL3, enquanto que o vírus no sangue de macacos inoculados com FRhL5 tinham a morfologia de placa S apropriada. Imunogenicidade

[0066] Todos os macacos em todos os três grupos desenvolveram anticorpos de neutralização homólogos 31 dias pós-inoculação para febre amarela (grupo YF-VAX®) ou ChimeriVax®-JE (grupos Chimeri- Vax®), com a exceção de 1 animal (FRhL5, RAK22F), que não foi testado devido à perda de amostra. No entanto, o título de anticorpo médio geométrico (GMT) era significantemente maior nos macacos inoculados com FRhL3 (GMT 501) do que com FRhL5 (GMT 169, p=0,0386, teste t). Estabilidade do genoma

[0067] Duas transfecções separadas de RNA de ChimeriVax®-JE foram realizadas em cada um dos dois tipos celulares, FRhL e Vero, e os vírus da progênie foram passados conforme mostrado na Figura 4. A série B da passagem de FRhL resultou no aparecimento da reversão de E279 em FRhL4 conforme acima descrito. Interessantemente, uma série de passagem separada (A) em células FRhL também resultou no aparecimento de uma mutação (Thr^Lys) em um resíduo adjacente a E281, e uma da série de passagem em células Vero resultou em uma mutação Val^Lys em E271. Outras mutações selecionadas em células Vero eram no domínio III ou dentro do domínio da transmembrana. Todos os vírus contendo mutações mostrados na Figura 2 foram avaliados no teste de neurovirulência de camundongo adulto e foram constatados ser avirulentos.

II. Quimera de Febre Amarela/Dengue Incluindo Mutação de Região Impedida Sumário

[0068] Vírus ChimeriVax™-DEN1 foi produzido usando os genes de prME de uma cepa do tipo selvagem do vírus do dengue [(Puo359) isolado em 1980 na Tailândia] inserido na estrutura principal do vírus da febre amarela (cepa 17D) (Guirakhoo e outros., J. Virol. 75:7290-7304, 2001). Durante a produção de um vírus Pre-Master Seed para ChimeriVax®-DEN1 em células Vero, um clone (clone E) contendo uma mudança de nucleotídeo única de A para G na posição 1590, que resultou em uma substituição de aminoácido de K para R na posição 204 na proteína envelope E, foi isolado e a placa purificada. O vírus exibiu atenuação para camundongos em fase de amamentação de 4 dias de vida e produziu uma viremia menor (viscerotropismo) do que seu vírus de origem (não-mutante) quando inoculado através de via subcutânea em macacos. Um outro clone (clone J-2) sem mutação foi selecionado, purificado em placa, e usado para produzir um estoque de vírus PMS na passagem 7 (P7). Este vírus não sofreu quaisquer mutações quando passado sob condições de laboratório até P10 em células Vero. No entanto, quando da passagem sob condições cGMP para produzir um vírus Master Seed (P8) de estoque de PMS, a mesma mutação na po-sição 1590 (A a G) emergiu. Similar ao clone E, o vírus P8 produziu placas maiores do que o vírus P7 e foi atenuado para camundongos em fase de amamentação. A posição E204, que é conservada em todos os vírus do dengue, pode ser então manipulada em vírus Chimeri- Vax®-DEN (sorotipos 1-4) para atingir um equilíbrio entre atenuação e imunogenicidade dos candidatos de vacina para humanos. Resultados e Discussão Produção de Pre-Master Seeds para Vírus ChimeriVax-DENI

[0069] A produção de vírus Pre-Master Seed (PMS) purificado de placa para DEN1 foi realizada como segue. Purificação de placa foi iniciada com o vírus na Passagem 2 (P2) pós transfecção de RNA. Dois vírus PMS (não-clonado em P2 e clonado em P7) foram produzidos em células Aventis Vero LS10 na passagem 142 usando um banco de célula qualificado obtido da Aventis na passagem 140. Os vírus clonados foram obtidos após 3 rodadas de purificação de placa e se- qüenciados no genoma completo para assegurar falta de mutações. Em geral, se um clone contivesse uma substituição de aminoácido, ele não seria usado como um candidato a vírus PMS. Outros clones foram preparados e seqüenciados até que um clone sem mutação foi identifi-cado, o qual foi então submetido à purificação e seqüenciamento de placa. Seqüenciamento

[0070] Para seqüenciamento, RNA viral foi extraído de cada amos tra de vírus de indivíduo (geralmente 0,25 ml) usando TRI-Reagent LS (Molecular Research Center) ou Trizol LS (um reagente similar da Gib- co) e dissolvido em 0,20 ml de água sem RNase. O RNA extraído foi então usado como um molde para RT-PCR. O genoma completo foi amplificado em cinco amplicons de sobreposição de ~2-3 kb de com-primento (fragmentos I a V) com o estojo Titan One-Tube RT-PCR (Roche). Os fragmentos de RT-PCR foram purificados usando um estojo de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen) ou purificados com gel de agarose usando o estojo QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Reações de seqüenciamento foram feitas usando o estojo CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman) e uma coleção de iniciadores de oligonucleotídeo específicos de YF de ambas orientações positiva e negativa para leitura de ambos filamentos dos amplicons. Produtos de reação de seqüenciamento foram purificados usando o estojo DyeEx Spin (Qiagen) e novamente determinados com um seqüenciador automático CEQ2000 (Beckman Coulter). Os dados de seqüenciamento gerados foram alinhados e analisados com o software Sequencher 3.0 (GeneCodes). Heterogeneidades de nucleotídeo foram registradas apenas quando um sinal heterogêneo foi observado em todos os cro- matogramas representando ambas reações de seqüenciamento de filamento mais ou menos.

[0071] Conforme mostrado na Tabela 5, o vírus P2 não-clonado não teve quaisquer mutações, mas adquiriu 5 mutações de aminoáci- dos (heterogeneidade) dentro da proteína envelope E por P5. Interessantemente, a única mutação que era estável (adicionalmente selecionada) em P15 era a mutação 204. Um experimento de passagem repetida começando do vírus P2 não-clonado (até P15) revelou a mesma mutação (K para R) na posição E204 sendo selecionada em células Vero.

[0072] Clones diferentes de ChimeriVax-DEN1 (A-J) foram seleci onados através de purificação de placa para placa direta e seqüencia- dos em vários estágios para identificar mutações. A mutação mais fre- qüente era a substituição de E251 (V>F), que aconteceu nos clones A, B, D e G seguido por E204 (K>R), que foi verificada nos clones E e F, bem como nos vírus não-clonados. A mutação em E311 (E>D) foi apenas verificada nos clones C e D. Interessantemente, o clone J estava livre de mutações até P10. No entanto, quando um Master Seed (MS) deste vírus foi produzido a partir de P7 (PMS) sob fabricação de cGMP, a mesma substituição em E204 ressurgiu (apenas após 1 passagem). Esta mutação era estável quando vírus P20 foi seqüenciado (Tabela 5). Clones contendo a mutação E204 produziram placas maiores (~2 mm de diâmetro) do que os vírus não-mutantes (~1mm de diâmetro) (Tabela 9). O construto original deste vírus em Vero P4 (anteriormente mostrado produzir um nível baixo de viremia em macacos) também continha a mesma mutação de E204 (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001). O papel desta mutação na biologia do vírus não poderia ser compreendido antes porque: a) o construto original continha uma mutação adicional (nucleotídeos A a G causando uma mudança de aminoácido de H para R) em M39 além da mutação de E204; b) a neurovirulência do construto original foi avaliada apenas em camundongos de 3-5 semanas de vida, que não são sensíveis o sufi-ciente para revelar atenuação de vírus ChimeriVax-DEN1 ou qualquer outro vírus ChimeriVax®-DEN (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001); e c) não havia nenhum vírus ChimeriVax®-DEN1 (sem mutação) disponível para comparação para determinar mudanças no fenótipo de neurovirulência ou viscerotropismo do vírus.

[0073] Uma vez que vírus quiméricos são atenuados para camun dongos de 3-4 semanas de vida, foi desenvolvido um teste mais sensível (usando camundongos em fase de amamentação de 4-8 dias de vida) para testar diferenças sutis na neurovirulência de clones diferentes. Neurovirulência de Camundongo

[0074] O teste de neurovirulência de camundongo, usando ca mundongos de 3-4 semanas de vida, é realizado como um teste de liberação para assegurar que a neurovirulência de quimeras não exceda aquela do vetor do vírus (YF-VAX®) usado para construir vírus ChimeriVax®. Devido ao fato de que todas as quimeras até agora construídas (com ou sem mutações) não serem virulentas para ca-mundongos adultos (3-4 semanas de vida), esses animais não podem ser usados para identificar mudanças sutis na neurovirulência de qui-meras associadas a substituições de aminoácido únicas. Em contraste, camundongos em fase de amamentação de 4-10 dias de vida são mais sensíveis a mudanças menores no genoma de quimeras, que estão envolvidas na virulência. Durante o desenvolvimento do vírus ChimeriVax®-DEN, várias mutações foram observadas no genoma de todas as 4 quimeras (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001). Essas mutações foram corrigidas em todas as quimeras, e os vírus reconstruídos (exceto pelas quimeras de DEN1) foram avaliados com sucesso quanto à segurança e imunogenicidade em macacos. Devido à instabilidade de plasmídeos de DEN1, a reconstrução desta quimera (sem mutação) não foi realizada a tempo, e não puderam então ser testadas em macacos. Durante a purificação de placa para produzir um PMS para quimera de DEN1, 10 clones diferentes (A-J) foram seqüenciados para identificar um clone sem mutações (Tabela 5). Todos exceto um clones (J) continham 1 ou 2 mutações dentro da proteína envelope E. Clones representativos de quimeras de DEN1 foram avaliados quanto à sua neurovirulência usando camundongos em fase de amamentação de 4 dias de vida (Tabela 6). Os animais foram inoculados através de via i.c. com duas diluições de 0,02 ml 1:10, ou 1:100, não-diluídas, de cada vírus de DEN1 quimérico e observados por 21 dias. As doses reais foram determinadas através de titulação nova de inócuos em um ensaio de placa. Conforme é mostrado na Tabela 6, clones exceto o clone E exibiram neurovirulência similar para camundongos de 4 dias de vida com tempos de sobrevivência médios (AST) significantemente menores do que aqueles de YF-VAX® (p<0,001 usando software JMP, Versão 4.0.2). O clone de E (E204K>R) era significantemente menos virulento do que todos os outros clones de DEN1 (p<0,0001). Interessantemente, uma das 2 mutações identificadas na quimera de DEN1 original era a substituição de E204 K>R. Este vírus induziu um nível baixo de viremia (título de pico médio 0,7 log10 PFU/ml) por 1,3 dia quando inoculado em macacos (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001). O clone de J, que não continha quaisquer mutações e foi mostrado ser significantemente menos virulento do que YF-VAX® em camundongos de 4 dias de vida, P=0,001, foi selecionado para produção do vírus cGMP MS. Segurança e imunogenicidade (viremia e respostas de anticorpo de neutralização) de vírus de DEN1 quiméricos em macacos

[0075] O efeito da mutação de E204 sobre o viscerotropismo (vi remia) do vírus foi avaliado através de inoculação de macacos com vírus ChimeriVax-DEN1 com (clone de E, P6) ou sem (clone de J, P7) a mutação de E204. A quimera de DEN1 original (ChimeriVax-DEN-1, P4 não-clonado, 1999, Grupo 1) foi selecionada como um controle, porque seus perfis de viremia e imunogenicidade já tinham sido avali-ados em macacos como uma vacina monovalente ou uma tetravalente (combinada com 3 outras quimeras) (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304, 2001).

[0076] Grupos de 4 macacos rhesus foram inoculados com 5 log10 PFU/0,5 ml de quimeras de DEN1 (Tabela 7). Viremia foi medida (através de ensaio de placa em células Vero) em soros obtidos no Dia 2 ao Dia 11 pós-infecção. Todos os macacos inoculados com vírus PMS DEN1 (Grupo 3) se tornaram virêmicos, enquanto que 3/4 e 2/4 de macacos inoculados com clone de E ou vírus não-clonados, respectivamente, se tornaram virêmicos (Tabela 8). O título do vírus de pico médio (2,5 log10 PFU/ml) e duração (8,5 dias) de viremia em macacos do Grupo 3 (PMS DEN1) era significantemente maior (p=0,024 e 0,0002 para título de vírus de pico e duração, respectivamente) do que os Grupos 1 e 2. Apesar da falta de viremia em alguns macacos, todos os animais desenvolveram títulos de anticorpo de neutralização contra vírus homólogos. Para ensaios de neutralização, soros de cada grupo de macacos eram inativados com calor e misturados com o vírus homólogo (o mesmo vírus que tinha sido usado para inoculação de animais em cada grupo). De acordo com o nível de viremia, os títulos de neutralização em macacos imunizados com vírus PMS (sem mutação) eram maiores do que os outros 2 grupos (p=0,0002). Os soros do Grupo de 1 de macacos (imunizados com uma quimera de DEN1 com 2 mutações nas proteínas envelope, prM e E) revelaram os menores títulos de neutralização (Tabela 9), indicando que a mutação de M39 pode ser ainda atenuada pelo vírus (p=0,0045). Esses experimentos demonstraram que poderia haver uma relação direta para vírus Chime- riVax®-DEN entre 1) a magnitude de viremia e o nível de anticorpos de neutralização em macacos, e 2) neurovirulência de quimera para camundongo e viremia/imunogenicidade em macacos (o clone de E foi atenuado por camundongos de 4 dias de vida e induziu um nível menor de viremia e anticorpos de neutralização do que o vírus PMS, que era neurovirulento para camundongos de idade similar).

[0077] Em resumo, a mutação no resíduo de E204 de Chimeri- Vax®-DEN1 controla a replicação da quimera de DEN1 em hospedeiros vertebrados, conforme mostrado por respostas de viremia e neu-tralização. Mutação deste resíduo, que é conservada em todos os so- rotipos de dengue (Tabela 10), pode então ser usada na construção de quimeras com fenótipos desejados apropriados para vacina do dengue humana. Tabela 1. Comparação das diferenças de aminoácido na proteína E de vírus ChimeriVax®-JE FRhL3 e ChimeriVax®-JE FRhL5 com seqüências publicadas de vacina de JE SA14-14-2, cepas de JE do tipo selvagem, SA14 de origem e vírus Nakayama. Os vírus ChimeriVax®-JE FRhL3 e FRhL5 foram seqüenciados em todo seus genomas e a mutação em E279 foi a única diferença encontrada.

1 Nitayaphan S. e outros 1990. Virology 177:541-552 2 Ni H. e outros 1994. J. Gen. Virol. 75:1505-1510; PDK=rim de cachorro primário 3 Aihara S. e outros 1991. Virus Genes 5:95-109; PHK= rim de hamster primário. 4 McAda P. e outros 1987. Virology 158:348-360 Tabela 2. Neurovirulência para camundongos em fase de amamentação de vírus ChimeriVax®-JE com e sem uma mutação na vacina de E279 e YF 17D

Tabela 3. Avaliação neuropatológica, macacos inoculados IC com Chi- meriVax®-JE FRhL3, FRhL5 ou 17D (YF-VAX®) de febre amarela, e ne- cropsiados no dia 30 pós-inoculação

(Continuação) Tabela 3. Avaliação neuropatológica, macacos inoculados IC com ChimeriVax®-JE FRhL3, FRhL5 ou 17D (YF-VAX®) de febre amarela, e ne cropsiados no dia 30 pós-inoculação

1 Nova titulação 2 Avaliação clínica: 0= sem sinais; 1=revestimento grosso, não come; 2= voz de tom alto, inativo, movimento lento; 3= tremor, falta de coordena- ção, movimentos trêmulos, fraqueza dos membros; 4= incapacidade de ficar de pé, paralisia, moribundo ou morto. A avaliação máxima em qualquer dia e a classificação média além do período de observação de 30 dias são mostradas. 3 Substância negra 4 Corpo estriado e tálamo, lados direito e esquerdo (N. caudal, globo pá- lido, putâmen, tálamos N. ant./lat. e tálamos N. lat.; aumentos cervical e lombar do cordão espinhal (6 níveis) 5 Teste t de Student, bilateral, heteroscedástico, comparando vírus de YF-VAX® e ChimeriVax®-JE. 6 Não feito Tabela 4. Viremia, macacos rhesus inoculados IC com vírus de YF- VAX® ou ChimeriVax®-JE FRHL3 e FRHL5 (quanto à dose inoculada vide Tabela 3) YF-VAX® Controle

ChimeriVax®-JE FRHL3 E279 Met

ChimeriVaxÒ-JE FRhL5 E279 Lys

1 - = Nenhuma viremia detectável; na maioria dos testes soro puro foi testado, a redução sendo de 1,0 log10 PFU/mL); em alguns casos, soro puro era tóxico para as células, e o soro diluído 1:2 ou 1:5 foi usado (redução de 1,3 ou 1,7 log10 PFU/mL). 2 Para o propósito de cálculo dos títulos médios e desvios padrão, 0,7 foi usado no lugar de <1,0, 1,0 foi usado no lugar de <1,3 e 1,4 foi usado no lugar de <1,7. 3 Comparação com YF-VAX® pelo teste t, 2 vias 4 Comparação com ChimeriVax®JE FRhL3 pelo teste t, 2 vias Tabela 5. Seqüências de nucleotídeo e aminoácido não-clonadas e vários clones de vírus ChimeriVax-DEN1 e suas estabilidades genéticas in vitro (passagens Vero)

Tabela 5. Seqüências de nucleotídeo e aminoácido não-clonadas e vários clones de vírus ChimeriVax-DEN1 e suas estabilidades genéticas in vitro (passagens Vero) (Continuação)

Tabela 5. Seqüências de nucleotídeo e aminoácido não-clonadas e vários clones de vírus ChimeriVax-DEN1 e suas estabilidades genéticas in vitro (passagens Vero) (Continuação)

a: A partir do início do genoma. b: A partir do N-terminal da proteína indicada; numeração de acordo com Rice e outros, Science 229:726-733, 1985. Clones com mutações de 204 são mostrados em letras em negrito. Petição 870210032461, de 09/04/2021, pág. 47/72 Tabela 6. Neurovirulência de clones diferentes de vírus de DEN1 qui-méricos em camundongos em fase de amamentação de 4 dias de vida

Tabela 7. Esl tudo de imunogenicidade em Macacos Rhesus, vírus de ChimeriVax®-DEN1, Estudo Sierra Biomedical NON-GLP

*: Quatro macacos (2M/2F) por grupo. **: Guirakhoo e outros, 2001 Tabela 8. Viremia em macacos imunizados com 5 log10 PFU (S.C.) de clones diferentes de vírus de ChimeriVax-

Tabela 9. Viremia e títulos de anticorpos de neutralização (50%) em macacos imunizados com 5 log10 PFU (S.C.) de clones diferentes de vírus de ChimeriVax-DEN1

Tabela 10. Posição de resíduos 204 em proteínas de ChimeriVax®- DEN1-4 E

Claims (5)

1. Flavivírus, caracterizado pelo fato de ser um vírus da dengue, em que o vírus da dengue compreende uma substituição da lisina na posição 204 ou 202 da proteína de envelope do vírus da dengue por arginina, para uso na indução de uma resposta imune ao referido vírus da dengue enquanto reduz o viscerotropismo e/ou neuroviru- lência relativa a um vírus da dengue correspondente sem a mutação.

2. Flavivírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de envelope do vírus da dengue é de um vírus da dengue-1, um vírus da dengue-2 ou um vírus da dengue-4, em que o flavivírus compreende uma substituição da lisina na posição 204 da proteína de envelope do vírus da dengue por argi- nina.

3. Flavivírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de envelope do vírus da dengue é de um vírus da dengue-3, em que o flavivírus compreende uma substituição da lisina na posição 202 da proteína de envelope do vírus da dengue por argi- nina.

4. Flavivírus de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de infecção por flavivírus ou na prevenção de infecção por flavivírus em um ser humano em risco de infecção.

5. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um flavivírus como definido em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

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