CN103555669A

CN103555669A - 黄病毒疫苗

Info

Publication number: CN103555669A
Application number: CN201210162177.2A
Authority: CN
Inventors: T·P·莫纳思; F·吉拉霍; J·阿罗约; K·普加切夫
Original assignee: Acambis Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Biologics LLC
Priority date: 2002-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2023-01-15
Also published as: EP1471873A4; WO2003103571A2; CA2473321A1; KR101194818B1; US20130189306A1; IL223457A0; IL223457A; EP2295023A1; EP3679915A1; FR23C1005I1; BRPI0306905B1; AU2003267937B2; US20190192649A1; US10172929B2; WO2003103571A3; BR0306905A; US20080274142A1; CA2473321C; US7459160B2; EP3679915B1

Abstract

本发明涉及黄病毒疫苗。本发明还提供了黄病毒疫苗的制备和使用方法。

Description

黄病毒疫苗

本申请是申请日为2003年1月15日的中国专利申请03805999.1“黄病毒疫苗”的分案申请。

技术领域

本发明涉及黄病毒疫苗。

背景技术

黄病毒是小的，有包膜的正链RNA病毒，其中一些构成了对全球公共健康的现行的或潜在的威胁。例如，黄热病病毒一直是在撒哈拉沙漠以南的非洲的某些丛林地带，以及在南美洲的某些地方的流行病的成因。尽管很多黄热病病毒感染是温和的，但所述疾病还可能导致严重的，威胁生命的疾病。所述疾病状态具有两种时期。起始或急性期通常以高热，寒战，头痛，背痛，肌肉痛，食欲下降，恶心和呕吐为特征。在3-4天之后，上述症状消失。在某些患者中，随着所述疾病进入它的所谓的毒性期，症状会再次出现。在此阶段，可再次出现高热，并可能导致休克，出血(例如，从口腔，鼻腔，眼睛，和/或胃中出血)，肾功能衰竭，和肝功能衰竭。实际上，肝功能衰竭可导致黄疸病，它是皮肤和眼睛的白色部分变黄，并因此获得了“黄热病”的名称。进入所述毒性期，大约一半的患者，会在10-14天内死亡。不过，从黄热病中恢复过来的人对再次感染具有终身的免疫性。在过去20年中，受黄热病病毒感染的人的数量一直在增加，现在每年有大约200,000个黄热病病例，有大约30,000人死亡。因此，黄热病病毒的再次出现，构成了严重的公共健康威胁。

登革热(DEN)病毒是黄病毒的另一个例子。登革热病毒是通过蚊子(主要是埃及伊蚊)传播给人类的，并且是世界范围内逐渐增长的公共健康问题的原因。每年有五千万到一亿人感染登革热病毒，并且，在某些地方业已观察到了高达6％的感染率(Gubler，＂登革热和登革出血热，＂CABI Publ.，New York，Chapter 1，pp.1-22，1997；Burke等，Am.J.Trop.Med.Hyg.38∶172-180，1988)。登革热病毒的四种血清型(登革热类型1-4)在加勒比海，亚洲，美洲循环。严重的潜在的致命形式的DEN感染[登革出血热/登革热休克综合征(DHF/DSS)]，是出现在患有不同DEN血清型的持续连续感染的个体内的免疫病理学疾病。在1980和1995年期间，报导了超过360万例DHF，并且由DHF导致了58,000人死亡(Halstead，″登革热和登革出血热，＂CABI Publ.，New York，Chapter 2，pp.23-44，1997)。由于DHF/DSS的致病性，通常认为最佳的登革热疫苗，可能需要同时对登革热病毒的所有四种血清型进行免疫，并且诱导长期免疫力。自从第二次世界大战以来，尽管业已为了开发有效的登革热疫苗进行了深入研究，但目前尚没有得到批准的登革热疫苗可供利用。

包括黄热病病毒和登革热病毒在内的黄病毒，具有两种主要的生物学特性，决定它们在人类和动物体内的对疾病状态的诱导。这两种特性中的第一种是神经嗜性，它是所述病毒入侵并且感染宿主的神经组织的倾向。嗜神经的黄病毒感染，可以导致脑和脊髓的感染和损伤(即脑炎)，意识受损，瘫痪和抽搐。黄病毒的第二种生物学特征是内脏嗜性，它是所述病毒入侵并且感染重要脏器的倾向，包括肝脏，肾脏和心脏。嗜内脏的黄病毒感染，可导致肝脏(肝炎)，肾脏(肾炎)，和心肌(心肌炎)的炎症和损伤，导致所述器官的衰竭或功能异常。神经嗜性和内脏嗜性，似乎是黄病毒的独特的和独立的特征。

某些黄病毒主要是嗜神经的(如西尼罗河病毒)，其他黄病毒主要是嗜内脏的(例如，黄热病病毒和登革热病毒)，而其他的病毒同时具备这两种特征[如贾萨努尔(Kyasanur)森林病病毒)。不过，神经嗜性和内脏嗜性，在所有黄病毒中都以某种程度出现。在宿主体内，有可能发生内脏嗜性和神经嗜性之间的相互作用，因为内脏的感染是在入侵中枢神经系统之前发生的。因此，神经嗜性取决于所述病毒在神经外器官(内脏)中的复制能力。这种神经外复制，产生了病毒血症，它接下来又决定了对大脑和脊髓的入侵。

开发抗黄病毒的疫苗的一种方法，是改变它们的毒力特征，以便所述疫苗病毒丧失对人类或动物的神经嗜性和内脏嗜性。对于黄热病病毒来说，业已开发了两种疫苗(黄热病17D和法国嗜神经组织的疫苗)(Monath，″黄热病″，In Plotkin and Orenstein，Vaccines，3rded.，1999，Saunders，Philadelphia，pp.815-879)。黄热病17D疫苗是通过在鸡胚胎组织中进行连续传代，产生神经嗜性和内脏嗜性明显减弱的病毒而开发的。通过在小鼠脑组织中进行连续传代开发了法国嗜神经组织的疫苗，并且导致了失去内脏嗜性，但保留了神经嗜性。神经学事件(疫苗后脑炎)的高发病率，与法国疫苗的使用相关。对于诸如登革热病毒，西尼罗河病毒，和鄂木斯克出血热病毒等具有内脏嗜性的很多医学上重要的黄病毒来说，目前还没有可供利用的得到批准的疫苗。

黄病毒的完全加工过的、成熟的毒粒，包括三种结构蛋白：衣壳(C)、膜(M)和包膜E(E)，和七种非结构蛋白。出现在受感染的细胞中的不成熟的黄病毒毒粒包括前膜(prM)蛋白，它是M蛋白的前体。所述黄病毒蛋白是通过单一的，长的开放读框的翻译产生的，以便制备多蛋白，然后，对所述多蛋白进行一系列复杂的翻译后蛋白水解裂解，以便产生成熟的病毒蛋白(Amberg等，J.Virol.73∶8083-8094，1999；Rice，＂黄病毒″，In Virology，Fields(ed.)，Raven-Lippincott，New York，1995，Volume I，p.937)。所述病毒结构蛋白以C-prM-E的顺序排列在所述多蛋白中。

发明内容

本发明提供了一种黄病毒，其包括能减弱所述黄病毒的内脏嗜性的一个或多个铰链区突变。例如，所述黄病毒可以是黄热病病毒(例如，黄热病病毒疫苗株)；嗜内脏的黄病毒，选自下组：登革热病毒，西尼罗河病毒，韦塞尔斯布朗病毒，贾萨努尔森林病病毒，和鄂木斯克出血热病毒；或嵌合黄病毒。在嵌合黄病毒的一种例子中，所述嵌合体包括第一种黄病毒(例如，黄热病病毒)的衣壳蛋白和非结构蛋白以及第二种黄病毒(例如，日本脑炎病毒或登革热病毒(例如，登革热病毒1，2，3，或4)的前膜蛋白和包膜蛋白，包括能减弱所述嵌合黄病毒的内脏嗜性的包膜蛋白突变。例如，对于登革热病毒来说，所述突变可发生在登革热包膜氨基酸的202或204号位置的赖氨酸上。例如，所述氨基酸可以被精氨酸取代。

本发明还提供了疫苗组合物，它包括本文所披露的任何病毒，以及可以药用的载体或稀释剂，还提供了在患者体内诱导对黄病毒的免疫应答的方法，包括给所述患者施用所述疫苗组合物。用所述方法治疗的患者可能没有黄热病感染，但存在发生黄病毒感染的危险，或可能患有黄病毒感染。另外，本发明包括将本发明的疫苗用于治疗黄病毒感染，以及用于制备用于所述目的的药品。

本发明还包括生产黄病毒疫苗的方法，包括向黄病毒内导入突变，这种突变会导致内脏嗜性减弱。另外，本发明包括鉴定黄病毒(例如，黄热病病毒或嵌合黄病毒)疫苗候选物的方法，包括(i)将突变导入黄病毒的铰链区；和(ii)与缺乏所述突变的黄病毒相比，包括所述铰链区突变的黄病毒是否具有减弱了的内脏嗜性。

本发明的黄病毒的优点在于具有减弱了的内脏嗜性，所以与它们的非突变对应体相比，在给患者施用时，能提供额外的安全度。所述病毒的其他优点是通过以下事实提供的，它们可以包括黄热病病毒株YF17D的序列(例如，编码衣壳和非结构蛋白的序列)，所述病毒株(i)具有业已确立了超过60年的安全性，在此期间，业已给人类施用了超过3亿5千万剂，(ii)在一次施用之后，可以诱导长期免疫性，和(iii)在接种数天之内迅速诱导免疫性。另外，本发明的疫苗病毒，能导致对受治疗患者的有效感染。由于免疫过的个体的细胞因子环境和先天免疫应答与天然感染类似，所以在所述宿主内的抗原质量的扩增，正确折叠的构像表位得到有效加工，获得性免疫应答是可靠的，并且建立了记忆。另外，在本发明的某些嵌合体中，源于所述目标病毒的prM和E蛋白，包括保护性体液和细胞免疫的重要抗原。

通过以下详细说明，附图和权利要求书，可以理解本发明的其他特征和优点。

附图说明

图1表示由ChimeriVax^TM-JE FRhL₃(大噬斑，照片A)和FRhL₅(小噬斑，照片B)产生的噬斑大小变异。用兔抗-JE抗血清对所述噬斑进行染色，然后，通过抗-兔IgG-辣根过氧化物酶染色。

图2是表示

和ChimeriVax^TM-JE构建体的存活分布的一系列曲线图，在E279上有和没有突变(M→K)。通过大脑内途径对4日龄的哺乳期小鼠进行接种，使用大约0.7log₁₀PFU(图2A)；(图2B)大约1.7log₁₀PFU；和(图2C)大约2.7log₁₀PFU。

图3是死亡率与病毒剂量的回归分析的曲线，表示有Met→Lys突变(FRhL₅)和没有Met→Lys突变(FRhL₃)的病毒具有类似的斜率和平行线，可以进行统计学比较。FRhL₅病毒的效力(毒力)比FRhL₃高18.52倍(p＜0.0001)。

图4表示ChimeriVax^TM-JE病毒在FRhL和Vero细胞中的独立的RNA转染和传代的结果。示出了通过传代水平在prME基因中出现的突变。

图5是黄病毒包膜糖蛋白胞外结构域的三维模型，表示随着在FRhL或Vero细胞中适应而出现在铰链区的突变的位置。将JE包膜糖蛋白的序列(菌株JaOArS982；Sumiyoshi等，Virology161∶497-510，1987)与TBE结构模板之一进行比对(Rey等，Nature 375：291-298，1995)，作为通过SegMod方法(片段匹配模拟)构建自动化同源性模拟的输入值，该方法使用LOOK软件(Molecular Application Group，Palo Alto，CA)。

具体实施方式

本发明提供了具有能导致内脏嗜性减弱的一种或多种突变的黄病毒(例如，黄热病病毒和嵌合黄病毒)，制备所述黄病毒的方法，以及使用所述黄病毒预防或治疗黄病毒感染的方法。出现在本发明黄病毒上的突变存在于包膜蛋白的铰链区，我们业已证实它在决定内脏嗜性中发挥作用。下面将对本发明的病毒和方法作进一步的说明。

可用于本发明中的黄病毒的一种例子是黄热病病毒。可以在野生型传染性克隆，例如Asibi传染性克隆或另一种野生型有毒力的黄热病病毒的传染性克隆的包膜的铰链区产生突变，然后可以在动物模型系统(例如仓鼠和/或猴模型系统)中测试所述突变体，以便确定影响内脏嗜性的位点。内脏嗜性的减弱是通过，例如，在所述模型系统中检测减轻了的病毒血症和/或肝脏损伤来判断的(其他细节参见下文)。然后，将能减弱所述野生型病毒的内脏嗜性的一种或多种突变导入疫苗株(例如，YF17D)，并且在动物模型系统(例如，在仓鼠和/或猴模型系统)中检测所述突变体，以便确定得到的突变体是否具有减弱了的内脏嗜性。然后，可以将发现具有减弱了的内脏嗜性的突变体，用作新的疫苗株，该疫苗株因为减弱了的内脏嗜性水平而具有较高的安全性。

可用于本发明中的其他黄病毒包括其他蚊子携带的黄病毒，如日本脑炎，登革热(血清型1-4)，Murray河谷脑炎，St.Louis脑炎，西尼罗河，Kunjin，Rocio脑炎，和Ilheus病毒；扁虱传播的黄病毒，如中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春-夏脑炎、贾萨努尔森林病、鄂木斯克出血热、跳跃病(louping ill)、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi、和Hypr病毒；以及来自肝病毒属的病毒(例如，丙型肝炎病毒)。所有这些病毒都具有某种感染内脏器官的倾向。这些病毒的内脏嗜性，可能不会导致重要脏器的功能异常，不过，所述病毒在这些器官中的复制，可能导致病毒血症，并因此导致入侵中枢神经系统。因此，通过诱变减弱所述病毒的内脏嗜性，能降低它们入侵大脑并导致脑炎的能力。

除了上文所列举的病毒，以及其他黄病毒之外，本发明还包括具有能减弱内脏嗜性的一种或多种的突变的嵌合黄病毒。所述嵌合体可以包括黄病毒(即，主链黄病毒)，其中的结构蛋白已被第二种病毒(即，测试或预定病毒，如黄病毒)的相应的结构蛋白所取代。例如，所述嵌合体可以包括主链黄病毒(例如，黄热病病毒)，其中，所述黄病毒的prM和E蛋白已被第二种测试病毒(例如，登革热病毒(1-4)，日本脑炎病毒，西尼罗河病毒，或其他病毒，如本文所提到过的任何病毒)(其E蛋白具有本文所述的铰链区突变)的prM和E蛋白所取代。所述嵌合病毒可以由病毒的任意组合制备。优选地，所插入的结构蛋白源自待免疫的病毒。

在本发明的疫苗中可以包括的嵌合病毒的一个具体例子是黄热病人疫苗株YF17D，其中，prM蛋白和E蛋白已被另一种黄病毒的prM蛋白和E蛋白(包括本文所述的铰链突变)所取代，所述另一种黄病毒如登革热病毒(血清型1，2，3，或4)、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、St.Louis脑炎病毒、Murray河谷脑炎病毒或任何其他黄病毒，如上文所列举的病毒之一。例如，可以将按照布达佩斯条约规定，交由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，Virginia，U.S.A保藏的，保藏日期为1998年1月6日的以下嵌合黄病毒用于制备本发明的病毒：嵌合黄热病17D/登革热2型病毒(YF/DEN-2；ATCC保藏号ATCC VR-2593)和嵌合黄热病17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JEA1.3；ATCC保藏号ATCC VR-2594)。例如，在以下文献中提供了制备可用于本发明的嵌合病毒的细节：国际申请PCT/US98/03894和PCT/US00/32821；和Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999，上述所有文献均完整引用作为参考。

正如上文所指出的，在本发明的病毒中所包含的突变能够减弱内脏嗜性。在一个实施例中，所述突变出现在所述黄病毒包膜蛋白的铰链区。所述包膜蛋白的多肽链折叠成三种不同的结构域：中央结构域(结构域I)，二聚化结构域(结构域II)，和免疫球蛋白样组件结构域(结构域III)。在病毒被受体介导的胞吞作用摄取之后，所述铰链区存在于结构域I和II之间，并且在接触酸性pH时，会发生构像改变(因此被称为“铰链”)，这种改变与病毒和核内体膜的融合相关。例如，存在于所述铰链区的各种包膜氨基酸包括黄热病病毒的48-61，127-131，和196-283号氨基酸(Rey等，Nature375：291-298，1995)。上述任何氨基酸，或紧靠它周围的氨基酸(在其他黄病毒包膜蛋白中的相应的氨基酸)，可以按照本发明的方法突变，并且检测所导致的内脏嗜性减弱。可以使用诸如定点诱变的标准方法，在所述铰链区进行突变。存在于本发明病毒中的突变类型的一种例子是取代，不过，也可以使用其他类型的突变，如缺失或插入。另外，如上文所述，所述突变可以是单独存在的，或者与一个或多个其他突变同时存在。

本发明的病毒(包括嵌合体)可以用本领域的标准方法制备。例如，可以将相当于所述病毒基因组的RNA分子导入原代细胞，鸡胚胎，或二倍体细胞系，可以从中(或从它的上清液中)纯化子代病毒。可用于生产所述病毒的另一种方法，采用异倍体细胞，如Vero细胞(Yasumura等，Nihon Rinsho21，1201-1215，1963)。在该方法中，将相当于所述病毒基因组的核酸分子(例如RNA分子)导入所述异倍体细胞，从培养所述细胞的培养基中收获病毒，用核酸酶(例如，能降解DNA和RNA的内切核酸酶，Benzonase^TM；美国专利号5,173,418)处理收获的病毒，并且浓缩用核酸酶处理过的病毒(例如，通过用截断分子量为500kDa的滤膜进行超滤浓缩)，然后，对浓缩的病毒进行配制，用于免疫接种目的。该方法的细节，披露在被收作本文参考的申请日为2002年1月15日的美国专利申请系列号60/348,565中。

本发明的病毒可以作为初始预防制剂给有感染危险的成年人或儿童施用，或者可以用作用于治疗受感染的患者的二级制剂。例如，对于黄热病/登革热嵌合体来说，可以将所述疫苗用于有发生登革热感染危险的成年人或儿童，或者可以用作治疗登革热感染患者的二级制剂。可以用本发明的登革热相关的疫苗和方法治疗的患者的例子包括(i)登革热流行地区，如亚洲，拉丁美洲和加勒比海的儿童，(ii)外国游客，(iii)军事人员，和(iv)登革热流行地区的患者。另外，业已观察到所述疾病在那里扩展的地区的居民(例如，阿根廷，智利，澳大利亚，非洲的某些部分，南欧，中东，以及美国南部)，或将来有可能出现所述疾病扩展的地区(例如，受埃及伊蚊影响的地区)可以按照本发明进行处理。

本发明的病毒的配制，可以用本领域的标准方法进行。用于疫苗制备的多种可以药用的溶液是众所周知的，并且可以由本领域技术人员方便地加以改进，以便用于本发明(例如，参见Remington′sPharmaceutical Sciences(18th edition)，ed.A.Gennaro，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA.)。在两个具体例子中，所述病毒是在含有7.5％的乳糖和2.5％的人血清白蛋白的最低必需培养基Earle′s盐(MEME)或含有10％山梨醇的MEME中制备的。不过，所述病毒可以用生理学上可接受的溶液，如无菌盐水或无菌缓冲盐水进行简单地稀释。在另一个例子中，所述病毒能够以与黄热病17D疫苗相同的方式施用和配制，例如，作为受感染的鸡胚胎组织的澄清的悬浮液，或从嵌合黄热病病毒感染的细胞培养物中收获的液体。

本发明的疫苗可以用本领域众所周知的方法施用，并且所施用疫苗的合适量可以由本领域技术人员方便地确定。例如，本发明的病毒可以配制成无菌水溶液形式，在0.1-1.0ml的剂量体积中含有10²-10⁷感染单位(例如，噬斑形成单位或组织培养感染剂量)，以便通过诸如肌内，皮下，或真皮内途径施用。另外，由于黄病毒可能能够通过诸如口服途径等粘膜途径感染人类宿主(Gresikova等，＂扁虱传播的脑炎″，In The Arbovirus，Ecology and Epidemiology，Monath(ed.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1988，Volume IV，177-203)，所述病毒也可以通过粘膜途径施用。另外，本发明的疫苗能够以单一剂量施用，或者，任选地，施用包括使用激发剂量，然后，例如在2-6个月之后施用由本领域技术人员认为合适的加强剂量。

任选地，为本领域技术人员所公知的佐剂，可以用于施用本发明的病毒。例如，可用于增强所述病毒免疫原性的佐剂包括脂质体制剂，合成佐剂，如(例如QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰脂A，或聚膦嗪。尽管所述佐剂通常被用于增强对失活疫苗的免疫应答，也可将其用于活的疫苗。对于通过诸如口服等粘膜途径施用的病毒来说，可以将诸如大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)或LT的突变衍生物的粘膜佐剂用作佐剂。另外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入所述病毒。因此，可以将编码诸如GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-13，或IL-5等细胞因子的基因与外源抗原基因一起插入，以便产生能导致免疫应答增强的疫苗，或调节更特异性针对细胞，体液，或粘膜反应的免疫性。

对于登革热病毒来说，针对它的最佳免疫可包括诱导针对所有四种登革热血清型的免疫性，可以将本发明的嵌合病毒用于制备四价疫苗。正如本文所披露的，用于所述四价制剂的任何或所有嵌合体可以包括能减弱内脏嗜性的突变。可以在制备的任何时间点混合所述嵌合体，以便生产四价制剂，或者可以系列施用。对于四价疫苗来说，为了降低病毒干扰的可能性，并因此获得平衡的免疫应答，存在于所施用疫苗中的每一种不同嵌合体的量可以改变。简单地讲，在所述制剂的一个例子中，使用相对其他嵌合体而言至少低5倍的登革热-2嵌合体(例如，低10，50，100，200，或500倍)。在本例子中，登革热-1，登革热-3，和登革热-4嵌合体的量可以相同或不同。在另一个例子中，登革热-4和/或登革热1病毒的量也可以降低。例如，除了使用较少的登革热-2嵌合体之外，可以使用相对登革热-1和登革热-3嵌合体而言，至少低5倍的登革热-4嵌合体(例如，低10，50，100，200，或500倍)；可以使用相对登革热-3和登革热-4嵌合体而言，至少低5倍的登革热-1嵌合体(例如，低10，50，100，200，或500倍)；或者可以使用相对登革热-3嵌合体而言，至少低5倍的登革热-1和登革热-4嵌合体。例如，当在所述嵌合体中不包括本文所披露的E204/E202突变时，可能特别希望相对登革热-3和/或登革热-4嵌合体而言，降低登革热-1嵌合体的量。

下面提供了包括对一种突变例子的详细表征，该突变出现在黄热病/日本脑炎病毒嵌合体的包膜蛋白的279号位置上。下面还提供了有关黄热病/登革热病毒嵌合体的细节，其中，登革热病毒包膜蛋白包括一个或多个能减弱内脏嗜性的突变。在所述突变的一个例子中，位于登革热-1，登革热-2，或登革热-4的包膜蛋白的204号位置上的赖氨酸，或位于登革热-3的包膜蛋白的202号位置上的赖氨酸被取代或缺失，后者比其他登革热血清型的包膜蛋白短两个氨基酸。例如，所述赖氨酸可以被精氨酸所取代。靠近包膜氨基酸204(对于登革热-3来说是202)的其他残基也可以突变，以便获得减弱了的内脏嗜性。例如，氨基酸200-208中的任意一个氨基酸或其组合可以突变。具体例子包括以下位置：登革热-1的202号位置(K)；登革热-2的202号位置(E)；登革热-3的200号位置(K)；和登革热-4的200号位置(K)，202号位置(K)，和203号位置(K)。所述残基可以用，例如，精氨酸取代。

实验结果

I.包括铰链区突变的黄热病/日本脑炎病毒嵌合体

概述

嵌合黄热病(YF)-日本脑炎(JE)疫苗(ChimeriVax^TM-JE)，是通过将来自减毒的JE SA14-14-2疫苗株的prM-E基因插入YF17D病毒的全长cDNA克隆构建的。在胚胎恒河猴肺(FRhL)细胞中传代，导致了含有在E279号位置上的单一Met→Lys氨基酸突变的小噬斑病毒的出现，将SA14-14-2中的该残基恢复成野生型氨基酸。还通过定点诱变构建了类似的病毒。E279突变位于E蛋白的铰链区的β-片层，在病毒从受感染细胞的核内体穿透到细胞质期间，它负责pH-依赖型构像改变。在FRhL或Vero细胞的独立转染-传代研究中，突变更常见的是出现在铰链区4(由氨基酸E266-E284界定)，体现了在该功能性重要区域的基因组不稳定性。E279回复导致了神经毒力的明显提高，这种提高是通过LD50以及哺乳期小鼠的存活分布，以及在恒河猴中通过组织病理学确定的。根据用猴子获得的结果的敏感性和可比性，所述哺乳期小鼠是用于神经嗜性的黄病毒疫苗候选物的安全性测试的合适的宿主。就在猴子体内的神经外复制而言，E279Lys病毒是有限的，因为与E279Met病毒相比，病毒血症和抗体水平(内脏嗜性的指标)明显降低。

背景

嵌合病毒的研究为研究毒力的分子机制提供了新角度，也为疫苗的开发提供了新前景。例如，已通过插入编码所述病毒包膜的结构基因以及参与中和、细胞附着、融合和内化的决定因素，对正链α病毒(Morris-Downes等，Vaccine19：3877-3884，2001；Xiong等，Science243：1188-1191，1991)和黄病毒(Bray等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10342-10346，1991；Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999；Guirakhoo等，J.Virol.75：7290-7304，2001；Huang等，J.Virol.74：3020-3028，2000)的分子克隆进行了修饰。所述嵌合病毒的复制是受非结构蛋白以及由亲本菌株表达的非编码末端控制的，而来自所述供体基因的结构蛋白提供了专一性免疫性。嵌合病毒的生物学特征，是由供体和受体病毒基因共同决定的。通过比较在供体基因之间具有核苷酸序列差异的构建体，可以剖析单个氨基酸残基在毒力和减毒方面的功能作用。

使用整合了来自日本脑炎(JE)的减毒菌株(SA14-14-2)的prM-E基因的嵌合黄热病(YF)病毒，对能够区分减毒的JE病毒和毒性、野生型JE Nakayama病毒的10个氨基酸突变的作用进行了详细研究(Arroyo等，J.Virol.75：934-942，2001)。所述毒力因子是通过单独或成组地将每一种突变恢复成野生型序列，并且确定对通过大脑内(IC)途径，用10⁴噬斑形成单位(PFU)接种过的幼年成体小鼠的神经毒力的影响。所有单一位点的回复病毒保留了高度减毒性，要回复神经毒性表型需要3或4个残基的回复。只有一个单一位点回复(E279Met→Lys)表现出了毒力改变的证据，在IC接种之后，8个动物中有一个死亡。

为了研究E279决定因素的其他功能作用，我们比较了该氨基酸残基不同的嵌合YF/JE病毒在哺乳期小鼠和猴子体内导致脑炎的能力。对猴子进行IC接种，通常被用作测试黄病毒和其他活疫苗的安全性的方法，对脑和脊髓组织的定量病理学检查，提供了分辨神经毒力具有微小差别的相同病毒的病毒株的灵敏方法(Levenbook等，J.Biol.Stand.15：305-313，1987)。哺乳期小鼠提供了比老年动物更灵敏的模型，因为对嗜神经组织的黄病毒的易感性，是年龄依赖型的(Monath等，J.Virol.74：1742-1751，2000)。以上结果证实了，在E279号位置上发生的单一的Met→Lys氨基酸突变，导致了神经毒力的提高。该突变位于E蛋白的‘铰链’区，在病毒穿透受感染细胞的核内体进入细胞质期间，它决定pH-依赖型构像改变(Reed等，Am.J.Hyg.27：493-497，1938)。重要的是，证实了哺乳期小鼠能够预测在恒河猴体内的毒力特征。根据对由点突变产生的神经毒力改变的检测，我们提出了哺乳期小鼠是对神经嗜性黄病毒疫苗候选物进行安全性检测的合适的宿主。

尽管增强了神经毒力，E279突变似乎对内脏嗜性具有相反的作用，它是通过在接受了这种病毒性状的标记的猴子体内的减弱了的病毒血症和抗体反应衡量的(Wang等，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)。

材料和方法

病毒

ChimeriVax^TM-JE疫苗的开发始于克隆YF17D病毒的完整11-kb基因组的一个cDNA拷贝(Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999)。为了实现这一目的，在两种质粒中扩增YF17D基因组序列，两种质粒分别编码从1至2276号和8279至10，861号核苷酸(nt)的YF序列(质粒YF5′3′IV)以及从1373至8704(质粒YFM5.2)的YF序列。通过连接源于所述两种质粒的合适的限制片段制备了全长的cDNA模板。YF5′3′IV和YFM5.2质粒的YF序列被相应的JE(SA14-14-2)pr-ME序列所取代，导致了YF5′3′IV/JE(prM-E′)和YFM5.2/JE(E′-E)质粒的产生。用限制性内切核酸酶NheI和BspEI依次消化所述质粒。用T4DNA连接酶连接合适的片段，用XhoI酶消化cDNA，以便能够转录，并且通过Sp6启动子产生RNA。具有全长RNA的二倍体胚胎恒河猴肺(FRhL)细胞的转染是通过电穿孔进行的。当出现细胞病理学效应时，收获含有病毒的上清液(一般为3天)，通过低速离心澄清，并且以0.22μm的孔度进行无菌过滤。添加最终浓度为50％v/v的胎牛血清(FBS)作为稳定剂。如以前所披露的(Monath等，疫苗17：1869-1882，1999)，在Vero细胞中，通过噬斑分析滴定所述病毒。将所述嵌合病毒依次在FRhL或Vero细胞(Vero-PM，AventisPasteur，Marcy1′

France)中进行传代，感染复数为大约0.001。商业化黄热病17D疫苗是从Aventis-Pasteur获得的(以前的名称为Pasteur-Merieux-Connaught)，Swiftwater，PA。

定点诱变

通过所公开的寡聚体定点诱变制备包括在E279号残基上的单一位点Met→Lys回复的病毒(Arroyo等，J.Virol.75∶934-942，2001)。简单地讲，将含有从1108到2472号核苷酸的JE SA-14-14-2E基因区的质粒(pBS/JE SA14-14-2)(Cecilia等，Virology181：70-77，1991)用作定点诱变的模板。诱变是用Transformer定点诱变试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)和由Life Technologies(GrandIsland，NY)合成的寡核苷酸引物进行的。在E区对质粒进行测序，以便证实仅有的改变是所述工程化突变。然后，将包括E279突变的区从pBS/JE质粒上亚克隆到pYFM5.2/JE SA14-14-2上(Cecilia等，Virology181∶70-77，1991)，使用NheI和EheI(KasI)限制位点。按上述方法进行全长DNA的组装和SP6转录；不过，Vero细胞的RNA转染是用Lipofectin(Gibco/BRL)进行的。

测序

通过

(Life Technologies)从感染的单层中分离RNA。用SuperscriptII逆转录酶(RT)和长-RT方法(Life Technologies)进行逆转录，然后进行RNaseH处理(Promega)和长-PCR(XL PCR，Perkin-Elmer/ABI)。RT、PCR和测序引物是使用YF17D株序列(GeneBank保藏号K02749)和JE-SA14-14-2株序列(GeneBank保藏号D90195)作为参考序列设计的。对PCR产物进行凝胶纯化(购自Qiagen的Qiaquick凝胶提取试剂盒)，并且，用染料-终止子d罗丹宁测序反应混合物(Perkin-Elmer/ABI)进行测序。在310型基因分析仪(Perkin-Elmer/ABI)上分析测序反应物，并且用Sequencher3.0(GeneCodes)软件评估DNA序列。

噬斑分析和中和实验

噬斑测定是在Vero细胞的单层培养物的6孔平板上进行的。在37℃下进行1小时的培养，以便吸附病毒，然后将所述细胞用具有琼脂糖的营养培养基被覆。在第4天，添加含有3％中性红的第二层。按以前披露的方法进行血清稀释，噬斑还原中和测试(Monath等，疫苗17∶1869-1882，1999)。

断奶的小鼠模型

将包括8-10只雌性4周龄ICR小鼠(Taconic Farms，Inc.Germantown，N.Y.)的组用30μl嵌合的YF/JE SA14-14-2(ChimeriVax^TM-JE)构建体进行IC接种，所述构建体有(剂量为4.0log₁₀PFU)或没有(3.1剂量log₁₀PFU)E279突变。用或稀释剂接种等数量的小鼠。在随后的21天内小鼠生病并且死亡。

哺乳期小鼠模型

通过分娩观察怀孕的雌性ICR小鼠(Taconic Farms)，以便获得具有相同年龄的哺乳期小鼠同窝崽。合并在48小时内出生的来自多个同窝崽的哺乳期小鼠，并且随机地将多达121只小鼠重新分配给母鼠。用20μL一系列10倍稀释的病毒的IC接种同窝崽，并且在随后的21天出现生病的体征和死亡。对所述病毒接种物进行反滴定。通过Reed和Muench的方法计算50％致死剂量(LD₅₀)值(Morris-Downes等，疫苗19：3877-3884，2001)。对单变量存活分布进行作图，并且通过对数秩检验进行比较。

猴子模型

通过Levenbook等(Levenbook等，J.Biol.Stand.15：305-313，1987)披露的方法进行猴子神经毒力测试，该方法被世界卫生组织有关安全性测试YF17D种子病毒的规定(Wang等，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)所禁止。该测试以前已应用于评估ChimeriVax^TM-JE疫苗，并且披露了对FRhL₃病毒进行实验的结果(Monath等，Curr.Drugs-Infect.Dis.，1∶37-50；2001；Monath等，Vaccine17∶1869-1882，1999)。测试是按照美国食品和药物管理良好实验室操作(GLP)条例(21C.F.R.，Part58)，在SierraBiomedical Inc.(Sparks，NV)进行的。在第1天，重量为3.0-6.5kg的10只(5只雄性，5只雌性)恒河猴在大脑的前叶接受0.25mL的未稀释过的有或没有E279Met→Lys突变的ChimeriVax^TM-JE病毒或

的1次接种。每天评估猴子的临床体征，并且按以下等级评分：0(无症状)，1(皮毛粗糙，不吃东西)，2(尖锐的声音，无活力，运动迟缓)，3(运动摇晃，战栗，不协调，肢体软弱)，和4(不能站立，肢体瘫痪，死亡)。每只猴子的临床得分是所述动物每天得分的平均值，并且治疗组的临床得分是每个个体临床得分的算术平均值。病毒血症水平是通过使用在第2-10天采集的血清在Vero细胞中进行的噬斑分析测定的。在第31天，对动物实施安乐死，用等渗盐水-5％乙酸灌注，然后用中性-缓冲的10％福尔马林灌注，并且进行尸体解剖。固定脑和脊髓，切片，并且用氰宁染色。通过在中枢神经系统的各种解剖组织中损伤的存在和严重性评估神经毒力。通过由世界卫生组织规定的等级，对每一个组织区内的严重性进行评分(Wang等，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)：

1级：轻微：1-3个小的局灶性炎性浸润。有少量的神经元可能改变或丧失。

2级：中等：更广泛的局部炎性浸润。神经元的改变或丧失影响不超过1/3的神经元。

3级：严重：神经元改变或丧失影响33-90％的神经元；出现中等局灶性或弥漫性炎性改变。

4级：非常严重：超过90％的神经元发生改变或丧失，具有程度不同的，但通常是严重的炎性浸润。

最常参予病变过程且损伤最严重的结构命名为‘目标区’，而能分辨野生型JE病毒和ChimeriVax^TM-JE的结构被命名为‘分辨区’。黑质构成了所述‘目标区’，而尾状核，苍白球，豆状核，前/中丘脑核，侧丘脑核，和脊髓(颈部和腰部膨大)构成了‘分辨区’(Monath等，Curr.Drugs Infect.Dis.，1∶37-50，2001)，正如以前针对YF17D所述的(Levenbook等，J.Biol.Stand.15∶305-313，1987)。所有神经病理学评估是由一个有经验的研究人员进行的，该研究人员不了解处理的代码。确定每一只猴子的目标区，分辨区，以及目标+分辨区的独立评分，并且将测试组与平均得分进行比较。还检查了脑干(中脑核以及黑质；脑桥；延髓；和小脑)的其他部位和软脑膜。通过双尾Student’st测验，进行平均神经病理学得分(对目标区，分辨区，和目标+分辨区)的统计学比较。除了神经病理学检查之外，还通过光学显微镜检查了肝脏，脾脏，肾上腺，心脏和肾脏的病理学改变。

基因组稳定性

为了确定YF/JE嵌合病毒的遗传学稳定性，并且在所述疫苗基因组中寻找容易发生突变的“热点”，进行了多次实验，其中，将RNA用于转染细胞，并且使子代病毒在体外系列传代，在低和高传代水平上进行部分或全面基因测序。连续传代始于在FRhL或Vero-PM细胞中进行的转染步骤。病毒的连续传代是以低的MOI，在生长在T25或T75烧瓶的细胞培养物中进行的。在特定的传代水平上，提取病毒基因组RNA的重复的样品，逆转录，通过PCR扩增，并且确定prM-E区或完整基因组序列。

结果

通过经验传代制备单一位点突变病毒

从转染过的FRhL细胞(FRhL₁)中回收的嵌合YF/JESA14-14-2(ChimeriVax^TM-JE)病毒，随后在所述细胞的液体培养物中连续传代，MOI为大约0.001。正如下面所披露的，在第4代，发现了噬斑形态学的改变，随后证实了这种改变与在1818号核苷酸上发生的T’→G的颠换相关，导致了在E蛋白的279号位置上的氨基酸改变(Met→Lys)。

在每一代的水平上表征噬斑，并且根据在第6天测定的它们的大小划分成三种类型(大，L～＞1.0mm，中等，M～0.5-1mm，和小，S～＜0.5mm)。噬斑大小分布是通过统计100个噬斑确定的。FRhL₃(第3代病毒)包括80-94％L和6-20％S噬斑。在FRhL₅(第5代)，检测到了噬斑大小的改变，S噬斑的出现构成＞85％的总的噬斑群体(图1)。FRhL₄病毒是中间的，具有40％的大噬斑和60％的小噬斑。对FRhL₅病毒进行的全面基因组测序，证实了在E279位置上有一个突变。对FRhL₅嵌合体的完整的基因组共有序列进行仔细检查，寻找密码子杂合性，证实了它是存在于所述病毒中的唯一可检测的突变。与亲本YF/JESA14-14-2嵌合病毒相比，FRhL₃病毒的完整基因组共有序列没有出现可检测的突变(Arroyo等，J.Virol.75∶934-942，2001)(表1)。

从FRhL₃，_-4和_-5中挑选10个大，中和小噬斑，并且通过在FRhL细胞的液体培养物中传代扩增。在扩增之后，将上清液铺放在Vero细胞上。试图从FRhL₃中分离S噬斑表型的努力失败了，所有分离的L或S型噬斑在FRhL细胞中经过一轮扩增之后，产生的主要是L噬斑。在下一代(FRhL₄)，其中60％的噬斑是小噬斑，可以通过在FRhL细胞中扩增分离这种噬斑。在FRhL₅，大部分噬斑(85-99％)是小噬斑，并且，L和S单个噬斑的扩增得到的主要是S噬斑。对来自FRhL₃的S和L噬斑表型的prM-E基因进行测序，发现了与用于构建ChimeriVax^TM-JE的亲本SA14-14-2基因相同的序列，从FRhL₄或FRhL₅病毒中分离的S噬斑，揭示了在E279号位置上的突变(Met→Lys)。

动物方案

涉及小鼠和非人灵长类的所有研究都是按照披露于实验室动物管理和使用指南中的USDA动物权益法案(9C.F.R.，Parts1-3)进行的。

对断奶小鼠的毒力

通过独立的实验，以大约3.0log₁₀PFU的FRhL₃，_-4，或_-5病毒通过IC接种4周龄的10只雌性ICR小鼠；在每一个研究中，10只小鼠接受相同剂量的(大约3.3的log₁₀PFU)商业黄热病疫苗

Aventis Pasteur，Swiftwater PA)。用嵌合病毒接种的小鼠没有出现生病的体征或死亡，而用

接种的对照小鼠中70-100％出现了瘫痪或死亡。在另一个实验中，8只小鼠IC接种FRhL₅(3.1log₁₀PFU)或YF/JE单一位点E279回复体(4.0log₁₀PFU)，9只小鼠接受

(2.3log₁₀PFU)。用所述嵌合构建体接种的小鼠无一发病，而用

接种的9只小鼠中有6只(67％)死亡。

对哺乳期小鼠的毒力

进行独立的实验，其中，有和没有E279突变的YF/JESA14-14-2嵌合病毒以分级的剂量通过IC接种到哺乳期小鼠体内(表2)。在所述实验中，将

用作参考对照。测定每一种病毒的LD₅₀和平均存活时间(AST)。

在使用8.6日龄小鼠的第一个实验中，在E279位置上包括单一位点的回复(Met→Lys)的FRhL₅病毒是神经毒性的，log₁₀LD₅₀为1.64，而缺少该突变的FRhL₃病毒几乎是无毒的，在最高剂量的组中，10只小鼠中只有1只死亡(表2)。在最高剂量下(大约3的log₁₀PFU)，FRhL₅病毒的AST(10.3天)短于FRhL₃病毒(15天)。

随后进行了第二个实验，以便从统计学上证实通过神经毒力测试在哺乳期小鼠体内可检测到E基因上的单一位点突变。在该实验中，用分级剂量的ChimeriVax^TM-JE FRhL₃(无突变)、ChimeriVax^TM-JEFRhL₅(E279Met→Lys)或YF/JE嵌合体[其中，通过定点诱变导入了单一突变E279(Met→Lys)]，通过IC对4日龄杂交繁殖的小鼠进行接种(Arroyo等，J.Virol.75∶934-942，2001)。包括E279突变的两种病毒LD₅₀值比没有突变的FRhL₃构建体的相应的值低10倍以上(表2)，表明了E279Met→Lys突变提高了所述嵌合病毒的神经毒性。在病毒的存活分布方面存在统计学上的显著差异(图2)。在最低剂量(大约0.7的log₁₀PFU)下，YF/JE嵌合病毒的毒力明显低于

(对数秩p＜0.0001)。具有E279Met→Lys突变的病毒具有类似的存活曲线，该曲线不同于没有突变的FRhL₃病毒，不过，所述差异没有达到统计学上显著的程度(对数秩p＝0.1216)。不过，在较高剂量下(大约1.7和大约2.7log₁₀PFU)，E279突变病毒的存活分布，明显不同于FRhL₃病毒。

通过病毒剂量分析死亡比例，发现了类似的斜率和平行回归线(图2)。FRhL₅病毒的效力(毒力)比FRhL₃高18.52倍(95％置信区间为3.65和124.44，p＜0.0001)。

猴子神经毒性实验

用ChimeriVax^TM-JE FRhL₃或FRhL₅病毒接种的20只猴子中无一出现脑炎的体征，而用

接种的10只猴子中有4只在第15-29天出现了三级体征(战栗)，这种体征在发作6天之后消失。在

组中的平均和最大平均临床得分，显著高于在两个ChimeriVax^TM-JE组中的得分。在接受了有和没有E279突变的ChimeriVax^TM-JE病毒的组之间，不存在临床得分的差异(表3)。

在处理组之间，在实验期间没有重量改变的差别。病理学检查没有发现因为所述病毒造成的肝脏，脾脏，肾脏，心脏，或肾上腺的改变，并且在处理组之间没有差别。

对脑和脊髓进行的组织病理学检查发现，用

接种的猴子的损伤得分，明显高于用ChimeriVax^TM-JE病毒FRhL₃和FRhL₅接种的猴子的损伤得分(表3)。

的组合的目标+分辨得分(±SD)为1.17(±0.47)。ChimeriVax^TM-JE FRhL₃(E279Met)和FRhL₅(E279Lys)的得分，分别为0.29(±0.20)，(与

比较，p＝0.00014)和0.54(±0.28)，(与

比较，p＝0.00248)。

ChimeriVax^TM-JE FRhL₅(在279位点含有Me t→Lys回复)的分辨区得分和组合的目标+分辨区得分明显高于ChimeriVax^TM-JE FRhL₃的相应的得分(表3)。

用

接种的猴子的主要症状是战栗，反映其小脑、丘脑核或苍白球的损伤。在小脑皮层、N.dentatus或其他小脑核中没有出现明显的组织学损伤，而在所有阳性猴子的丘脑核和苍白球中都存在炎性损伤。

有趣的是，正如通过病毒血症所体现的，在E279回复体的神经毒力和内脏嗜性之间存在相反的关系。WHO猴子神经毒力实验包括对病毒血症进行定量，作为内脏嗜性的指标(世界卫生组织，＂黄热病疫苗的要求″，Requirements for Biological Substances No.3，revised1995，WHO Tech.Rep.Ser.872，Annex2，Geneva：WHO，31-68，1998)。根据有关发现这是合理的：大脑内接种导致了神经外组织的立即接种(Theiler，＂The Virus″，In Strode(ed.)，黄热病，McGraw Hill，New York，New York，46-136，1951)。用接种的10只猴子中有9只(90％)以及用ChimeriVax^TM-JE FRhL₃接种的10只猴子中有8只(80％)在IC接种之后发展为病毒血症。

组的病毒血症的水平倾向于高于ChimeriVax^TM-JE FRhL₃组，在第4天达到显著。相反，使用FRhL₅病毒(E279Met→Lys)的动物中只有2只(20％)具有可检测的低水平的病毒血症(表4)，并且在第3天和第4天平均病毒血症低于FRhL₃病毒(且在第5天接近显著)。因此，与FRhL₃病毒相比，FRhL₅回复病毒表现出增强了的神经毒力，但是具有减弱了的内脏嗜性。检查了用ChimeriVax^TM-JE FRhL₃和FRhL₅接种的猴子的血清中噬斑大小变异的存在。在来自用FRhL₃接种的猴子的血清中只观察到了L噬斑，而在用FRhL₅接种的猴子血液中的病毒具有接近S噬斑的形态学。

免疫原性

在接种黄热病(

组)或ChimeriVax^TM-JE(ChimeriVax^TM组)31天之后，所有三个组中的所有猴子都产生了同源中和抗体，只有1只动物例外(FRhL₅，RAK22F)，由于缺少样品，没有对它进行实验。不过，用FRhL₃接种的猴子(GMT501)的几何平均抗体效价(GMT)明显高于用FRhL₅接种的猴子(GMT169，p＝0.0386，t-检验)。

基因组稳定性

对两种细胞株FRhL和Vero的每一个进行两次独立的ChimeriVax^TM-JE RNA转染，并且按表4所示进行子代病毒的传代。FRhL传代系列B导致了E279回复在FRhL₄上的出现，正如上文所披露的。有趣的是，FRhL细胞中独立的传代系列(A)还导致了在相邻的E281号残基上的突变(Thr→Lys)的出现，并且在Vero细胞中所述传代系列之一在E271上产生了Val→Lys突变。在Vero细胞中选择的其他突变出现在结构域III上或出现在跨膜结构域内。在成体小鼠神经毒力实验中对含有图2所示突变的所有病毒进行评估，发现是无毒的。

II.包括铰链区突变的黄热病/登革热嵌合体

概述

用登革热1病毒的野生型菌株[(Puo359)1980年在泰国分离]的prME基因生产ChimeriVax^TM-DEN1病毒，将其插入黄热病病毒(菌株17D)主链(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，2001)。在Vero细胞中生产ChimeriVax^TM-DEN1的Pre-Master接种病毒期间，分离了在1590号位置上包括发生了从A→G的单一核苷酸变化的克隆(克隆E)并且进行噬斑纯化，这种突变在包膜蛋白E的204号位置上产生了K→R的氨基酸取代。所述病毒对于4日龄的哺乳期小鼠表现出减毒作用，并且在通过皮下途径接种到猴子体内时，产生了比它的亲本(非突变体)更低的病毒血症(内脏嗜性)。选择没有突变的另一个克隆(克隆J-2)，进行噬斑纯化，并且用于在第7代(P7)生产PMS病毒原种。在实验室条件下，在Vero细胞中传代到P10时，该病毒没有发生任何突变。不过，在cGMP条件下进行一次传代以便由PMS原种产生MasterSeed病毒(P8)时，在1590号位置出现了相同的突变(A→G)。与克隆E类似，P8病毒能产生比P7病毒更大的噬斑，并且对于哺乳期小鼠来说是减毒的。因此，可以对ChimeriVax^TM-DEN(血清型1-4)病毒中在所有登革热病毒中保守的E204号位置进行操作，以便获得用于人类的疫苗候选物的减毒和免疫原性之间的平衡。

结果和讨论

生产ChimeriVax-DEN1病毒的Pre-Master接种物

按以下方法进行DEN1的噬斑纯化的Pre-Master接种物(PMS)病毒的生产。噬斑纯化始于RNA转染之后的第2代(P2)病毒。使用在第140代从Aventis获得的得到验证的细胞文库，在第142代，在Aventis Vero LSi0细胞中生产两种PMS病毒(在P2未克隆，而在P7克隆)，。克隆的病毒是在进行3轮噬斑纯化之后获得的，并且对整个基因组进行测序，以便确定突变的缺乏。一般，如果克隆包括氨基酸取代的话，就不将它用作PMS病毒候选物。对其他克隆进行制备和测序，直到鉴定没有突变的克隆。然后对它进行噬斑纯化和测序。

测序

为了测序，使用TRI-试剂LS(Molecular Research Center)或Trizol LS(购自Gibco的类似试剂)从每一种病毒样品(一般为0.25ml)提取RNA，并且溶解在0.20ml的无RNase的水中。然后将提取RNA用作RT-PCR的模板。使用Titan One-Tube RT-PCR试剂盒(Roche)，在长度为大约2-3kb的5个重叠的扩增子中扩增完整的基因组(片段I-V)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)，纯化所述RT-PCR片段，或使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行琼脂糖凝胶纯化。使用CEQ染料终止子循环测序试剂盒(Beckman)进行测序反应，并且，将一组正向和负向的YF-特异性寡核苷酸引物，用于对扩增子的两条链进行读码。用DyeEx Spin试剂盒(Qiagen)纯化测序反应产物，并且用CEQ2000自动测序仪(Beckman Coulter)分辨。使用Sequencher3.0(GeneCodes)软件对所产生的测序数据进行比对和分析。只有在代表正链和负链测序反应的层析谱中，都出现了异质信号时才确定核苷酸的异质性。

如表5所示，未克隆的P2病毒没有任何突变，不过，到P5代，在包膜蛋白E内获得了5个氨基酸突变(异质性)。有趣的是，只有在P15代稳定的突变(进一步选择的)是204突变。始于未克隆的P2病毒的重复的传代实验(高达P15代)在Vero细胞中选择的E204号位置上发现了相同的突变(K→R)。

通过直接的噬斑到噬斑的纯化来选择不同的ChimeriVax-DEN1(A-J)克隆，并且在不同阶段测序，以便鉴定突变。最常见的突变是E251(V＞F)取代，它出现在克隆A，B，D和G上，随后是E204(K＞R)，它出现在克隆E和F中，以及出现在未克隆的病毒中。在E311上的突变(E＞D)仅出现在克隆C和D中。有趣的是，到P10代克隆J都没有突变。不过，当该病毒的Master Seed(MS)是在cGMP生产条件下从P7(PMS)产生时，在E204号位置上再现了相同的取代(仅仅在一代之后)。在对P20病毒进行测序时，发现该突变是稳定的(表5)。含有E204突变的克隆所产生的噬斑(直径为约2mm)，大于非突变病毒的噬斑(直径为约1mm)(表9)。在Vero P4上的所述原始构建体(以前证实能在猴子体内产生低水平的病毒血症)，还包括相同的E204突变(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，2001)。该突变在所述病毒生物学方面的作用以前是无法理解的，因为a)所述原始构建体除了E204突变以外，在M39位置上包括其他的突变(核苷酸A→G，导致了氨基酸从H改变成R)；b)仅在3-4周龄的小鼠体内评估了所述原始构建体的神经毒力，它的灵敏度达不到揭示ChimeriVax-DEN1病毒或其他任何ChimeriVax^TM-DEN病毒的减毒作用(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，200l)；和c)没有ChimeriVax^TM-DEN1病毒(没有突变)可供比较，以便确定所述病毒的神经毒力或内脏嗜性表型的改变。

由于对于3-4周龄的小鼠来说，嵌合病毒是减毒的，因此开发了更为灵敏的测试(使用4-8日龄的哺乳期小鼠)，以便检测不同克隆在神经毒力方面的微弱的差异。

小鼠神经毒力

使用3-4周龄小鼠进行的小鼠神经毒力实验，是作为释放实验进行的，以便确保嵌合体的神经毒力不会超过用于构建ChimeriVax^TM病毒的病毒载体

的毒力。由于迄今为止，所构建的所有嵌合体(有或没有突变)对于成年小鼠(3-4周龄)来说是无毒的，因此不能将所述动物用于鉴定与单一氨基酸取代相关的嵌合体的神经毒力的微小改变。相反，4-10日龄的哺乳期小鼠对嵌合体基因组上的微小改变更为敏感，这种改变与毒力相关。在开发ChimeriVax^TM-DEN病毒的过程中，在所有4种嵌合体的基因组上都观察到了若干突变(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，2001)。所述突变在所有嵌合体中都是正确的，并且在猴子中对重建病毒(DEN1嵌合体除外)的安全性和免疫原性进行了成功地评估。由于DEN1质粒的不稳定性，该嵌合体(无突变)的重建没有按时完成，并因此不能在猴子体内实验。在为了生产DEN1嵌合体的PMS而进行噬斑纯化期间，对10个不同的克隆(A-J)进行了测序，以便鉴定没有突变的克隆(表5)。除了一个克隆(J)之外，所有克隆在包膜蛋白E中都包括1或2个突变。使用4日龄的哺乳期小鼠，评估了DEN1嵌合体的代表性克隆的神经毒力(表6)。通过i.c.途径用两种0.02ml的每一种嵌合DEN1病毒的未稀释过的、1∶10或1∶100稀释的稀释液接种动物，并且观察21天时间。在噬斑测定中，通过接种物的反滴定，确定实际剂量。如表6所示，除了克隆E之外，所有克隆对4日龄的小鼠都表现出类似的神经毒力，平均存活时间(AST)，明显低于

的存活时间(p＜0.001，使用JMP软件，Version4.0.2)。克隆E(E204K＞R)的毒力明显低于所有DEN1克隆(p＜0.0001)。有趣的是，在原始DEN1嵌合体中鉴定的两种突变之一就是E204K＞R取代。该病毒在接种到猴子体内之后，诱导了1.3天时间的低水平病毒血症(平均峰效价为0.7log₁₀PFU/m1)(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，2001)。不包含任何突变的克隆J，被证实在4日龄的小鼠中其毒力明显低于P＝0.001，选择它用于生产cGMP MS病毒。

嵌合DEN1病毒在猴子体内的安全性和免疫原性(病毒血症和中和抗体反应)

通过用有(克隆E，P6)或没有(克隆J，P7)E204突变的ChimeriVax-DEN1病毒接种猴子，评估E204突变对所述病毒的内脏嗜性(病毒血症)的影响。选择原始DEN1嵌合体(ChimeriVax-DEN-1，未克隆的P4，1999，第1组)作对照，因为它的病毒血症和免疫原性特征，在猴子体内已被评估为单价的或四价的(与其它3种嵌合体组合)疫苗(Guirakhoo等，J.Virol.75∶7290-7304，2001)。

用51og₁₀PFU/0.5ml的DEN1嵌合体接种第4组猕猴(表7)。用感染后第2-第11天获得的血清测定病毒血症(通过对Vero细胞进行噬斑分析)，用DEN1PMS病毒接种的所有猴子(第3组)都出现病毒血症，而分别用克隆E或未克隆的病毒接种的4只猴子中的3只和4只猴子中的2只出现病毒血症(表8)。第3组猴子的病毒血症的平均峰病毒效价(2.5log₁₀PFU/ml)和持续时间(8.5天)明显高于第1组和第2组(峰病毒效价和持续时间分别为p＝0.024和0.0002)。尽管在某些猴子体内缺乏病毒血症，但所有动物都产生了抗同源病毒的中和抗体效价。为了进行中和测定，对来自每一组猴子的血清进行加热，以便进行热灭活，并且与同源病毒(业已用于接种每一组动物的相同的病毒)混合。与病毒血症的水平一致，在用PMS病毒(没有突变)免疫的猴子体内的中和效价高于其他两个组(p＝0.0002)。第一组猴子(用包膜蛋白prM和E上具有两个突变的DEN1嵌合体免疫)的血清出现了最低的中和效价(表9)，表明M39突变可能使病毒进一步减毒(p＝0.0045)。以上实验证实了，对ChimeriVax^TM-DEN病毒来说，在1)在猴子体内的病毒血症的幅度和中和抗体的水平，和2)嵌合体对小鼠的神经毒力和在猴子体内的病毒血症/免疫原性之间可能存在直接相关性(对于4日龄的小鼠来说，克隆E是减毒的，并且与PMS病毒相比，诱导了较低水平的病毒血症和中和抗体，后者对于类似年龄的小鼠来说，是具有神经毒力的)。

总之，正如通过病毒血症和中和反应所证实的，在ChimeriVax^TM-DEN1的E204号残基上的突变，能控制DEN1嵌合体在脊椎动物宿主中的复制。因此，在所有登革热血清型中保守的该残基的突变(表10)，可用于构建适合人类登革热疫苗的具有所需表型的嵌合体。

表1：ChimeriVax^TM-JE FRhL₃和ChimeriVax^TM-JE FRhL₅病毒与JE SA14-14-2疫苗、野生型JE菌株、亲本SA14以及Nakayama病毒的公开序列的氨基酸差别的比较。对ChimeriVax^TM-JE FRhL₃和FRhL₅病毒的完整基因组进行测序，并且E279上的突变是所发现的唯一的差异。

¹Nitayaphan S.等1990.Virology177∶541-552

²Ni H.等1994.J.Gen.Virol.75∶1505-1510；PDK＝原代狗肾脏

³Aihara S.等1991.Virus Genes5∶95-109；PHK＝原代仓鼠肾脏

⁴McAda P.等1987.Virology158∶348-360

表2.在E279位点上有和没有突变的ChimeriVax^TM--JE病毒和YF17D疫苗对哺乳期小鼠的神经毒力

表3.用ChimeriVax^TM-JE FRhL₃，FRhL₅或黄热病17D

通过IC接种的猴子的神经病理学评估，并且在接种后第30天进行尸体解剖。

¹反滴定

²临床得分：0＝无体征；1＝粗糙的皮毛，不吃东西；2＝尖锐的声音，无活力，行动迟缓；3＝战栗，不协调，运动摇晃，肢体软弱；4＝不能站立，瘫痪，即将死亡或死亡。显示了任意一天的最大得分，以及30天观察期间的平均得分。

³黑质

⁴纹状体和丘脑，右侧和左侧(尾状核，苍白球，豆状核，前/侧丘脑核，侧丘脑核；脊髓的颈部和腰部膨大(6级)

⁵Student’s t测验，双侧，异方差的，比较

和ChimeriVax^TM-JE病毒。

⁶未进行

表4.用

或ChimeriVax^TM-JE FRHL₃和FRHL₅病毒通过IC接种的恒河猴的病毒血症(有关接种剂量参见表3)

对照

ChimeriVax^TM-JE FRHL₃E279Met

ChimeriVax^TM-JE FRhL₅E279Lys

¹＝没有可检测的病毒血症；在大部分测试中，检测到纯净的血清，截断值为1.0log10PFU/mL；在某些场合下，纯净的血清对细胞是有毒性的，使用以1∶2或1∶5的比例稀释的血清(截断值为1.3或1.7log₁₀PFU/mL)。

²为了计算平均效价和标准误差，用0.7取代＜1.0，用1.0取代＜1.3，并且用1.4取代＜1.7。

³通过双尾t检验与

比较

⁴通过双尾t检验与ChimeriVax^TMJE FRhL₃比较

表5.未克隆的以及ChimeriVax-DEN1病毒的各种克隆的核苷酸和氨基酸序列以及它们在体外(Vero传代)的遗传稳定性。

^a：从基因组的起点开始。^b：从所示蛋白的N-末端开始；按照以下文献披露的方法编号：Rice等，Science229∶726-733，1985。用粗体字母表示具有204突变的克隆。

表6.嵌合DEN1病毒的不同克隆在4日龄的哺乳期小鼠体内的神经毒力。

表7.在猕猴体内的免疫原性研究，ChimeriVax^TM-DEN1病毒，Sierra Biomedical NON-GLP研究

^*：每组四只猴子(2M/2F)。

^**：Guirakhoo等2001

表9.用51og₁₀PFU(S.C.)的ChimeriVax-DEN1病毒的不同克隆免疫的猴子的病毒血症和中和抗体效价(50％)

表10.在ChimeriVax^TM-DEN1-4E蛋白中位置204的残基

Claims

1.一种黄病毒，其是登革热病毒或其嵌合病毒，所述嵌合病毒包括黄热病病毒，其中黄热病病毒的膜和包膜蛋白被所述登革热病毒的膜和包膜蛋白取代，其中所述黄病毒的包膜蛋白包括突变，相对于缺乏所述突变的相应黄病毒，所述突变减弱黄病毒的内脏嗜性。

2.权利要求1的黄病毒，其是登革热病毒。

3.权利要求1的黄病毒，其是嵌合黄病毒。

4.权利要求1-3的任一项的黄病毒，其中所述黄热病病毒是黄热病病毒疫苗株YF17D。

5.权利要求1-4的任一项的黄病毒，其中所述突变存在于包膜蛋白的铰链区。

6.权利要求5的黄病毒，所述突变存在于包膜蛋白的202或204号位置的赖氨酸上。

7.权利要求1-6的任一项的黄病毒，其中所述登革热病毒是登革热-1、登革热-2、登革热-3或登革热-4病毒。

8.权利要求7的黄病毒，其中所述突变在黄病毒包膜蛋白的204号位置(登革热-1)、204号位置(登革热-2)、202号位置(登革热-3)或204号位置(登革热-4)。

9.权利要求6-8的任一项的黄病毒，其中所述突变是取代包膜蛋白中的202或204号位置上的赖氨酸残基。

10.权利要求9的黄病毒，其中所述突变是用精氨酸取代包膜蛋白中的202或204号位置上的赖氨酸残基。

11.权利要求7-10的任一项的黄病毒，其中所述登革热病毒是登革热-1病毒。

12.权利要求11的黄病毒，其中所述相应的登革热-1病毒是Puo359株。

13.权利要求11或12的黄病毒，其在M蛋白的39号位置不包含任何突变。

14.权利要求11-13的任一项的黄病毒，其包含1590号位置上的从A到G的单核苷酸改变，该改变导致包膜蛋白的204号位置上从K到R的氨基酸取代。

15.包含权利要求1-14的任一项的黄病毒的疫苗组合物。

16.权利要求15的四价疫苗组合物，其包含(i)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-1病毒的膜和包膜蛋白取代，(ii)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-2病毒的膜和包膜蛋白取代，(iii)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-3病毒的膜和包膜蛋白取代，和(iv)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-4病毒的膜和包膜蛋白取代，其中所述嵌合黄病毒的任何或全部都是根据权利要求1-14任一项的。

17.用于减弱黄病毒的内脏嗜性和/或神经毒力的方法，所述黄病毒是登革热病毒或包含黄热病病毒的其嵌合病毒，其中黄热病病毒的膜和包膜蛋白被登革热病毒的膜和包膜蛋白取代，该方法包括用精氨酸取代登革热病毒包膜蛋白的204或202号位置上的赖氨酸。

18.权利要求17的方法，用于减弱黄病毒的内脏嗜性和神经毒力，所述黄病毒是登革热病毒或包含黄热病病毒的其嵌合病毒，其中黄热病病毒的膜和包膜蛋白被登革热病毒的膜和包膜蛋白取代，该方法包括用精氨酸取代登革热病毒包膜蛋白的204或202号位置上的赖氨酸。

19.权利要求17或18的方法，其中所述黄病毒是嵌合病毒。

20.权利要求19的方法，其中所述黄热病病毒是黄热病病毒疫苗株YF17D。

21.权利要求18-20的任一项的方法，其中所述登革热病毒选自登革热-1病毒、登革热-2病毒、登革热-3病毒和登革热-4病毒。

22.权利要求21的方法，其中所述登革热病毒是登革热-1病毒，任选是Puo359株的登革热病毒。

23.权利要求17-22的任一项的方法，其中所述黄病毒是四价疫苗组合物，该组合物包含：(i)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-1病毒的膜和包膜蛋白取代，(ii)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-2病毒的膜和包膜蛋白取代，(iii)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒中的膜和包膜蛋白被登革热-3病毒的膜和包膜蛋白取代，和(iv)包含黄热病病毒的嵌合黄病毒，所述黄热病病毒的膜和包膜蛋白被登革热-4病毒中的膜和包膜蛋白取代，并且所述取代发生在所述嵌合黄病毒的任何或全部中。

24.权利要求17-22的任一项的方法，其中在小鼠神经毒力测试中测试嵌合黄病毒的神经毒力，所述测试采用4-10或任选4-8龄的哺乳期小鼠。

25.权利要求24的方法，包括比较4-10或任选4-8龄的哺乳期小鼠中的嵌合黄病毒的神经毒力与黄热病病毒株YF-17D

的神经毒力。