KR101074175B1

KR101074175B1 - 플라비바이러스 백신

Info

Publication number: KR101074175B1
Application number: KR1020047011000A
Authority: KR
Inventors: 토마스 피이. 모나쓰; 파쉐드 귀라쿠; 주안 아로요; 콘스탄틴 푸가체프
Original assignee: 사노피 파스테르 바이오로직스 씨오
Priority date: 2002-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2011-10-14
Also published as: EP1471873A4; WO2003103571A2; CA2473321A1; KR101194818B1; US20130189306A1; IL223457A0; IL223457A; EP2295023A1; EP3679915A1; FR23C1005I1; BRPI0306905B1; CN103555669A; AU2003267937B2; US20190192649A1; US10172929B2; WO2003103571A3; BR0306905A; US20080274142A1; CA2473321C; US7459160B2

Abstract

본 발명은 플라비바이러스 백신 및 이 백신의 제조 및 사용방법을 제공한다.

플라비바이러스, 황열병, 뎅기, 키메라 바이러스, 바이러스 혈증

Description

플라비바이러스 백신{FLAVIVIRUS VACCINES}

본 발명은 키메라 플라비바이러스 백신에 관한 것이다.

플라비바이러스는 소형의, 피복된, 양성-가닥 (enveloped positive-strand) RNA 바이러스로, 이들중 일부는 현재 또는 장래에 전세계 인류의 건강에 위협이 되거나 될 가능성이 있다. 예컨대 황열병 바이러스는 아프리카의 사하라 사막 이남의 특정 정글 지대 또는 남아프리카의 일부 지역에서 전염병의 원인이 되어 왔다. 다수의 황열병 감염은 심각한 것은 아니지만, 이러한 질병은 심각한, 생명을 위협하는 병을 초래할 수도 있다. 질병의 상태는 두 단계(phase)를 갖는다. 초기의 급성 단계(acute phase)는 고열, 오한, 두통, 요통, 근육통, 식욕 부진, 오심, 및 구토를 특징으로 한다. 3일 내지 4일 후, 이러한 증상들은 사라진다. 일부 환자의 경우에, 질병이 소위 발병력 단계(toxic phase)로 진입하게 되면, 이러한 증상들이 재발하기도 한다. 발병력 단계 중에는, 고열이 다시 나타나고 쇼크, 출혈 (예컨대, 입, 코, 눈, 및/또는 위로부터의 출혈), 신부전(kidney failure), 및 간부전(liver failure)이 초래될 수 있다. 실제로, 간부전은 피부가 황색으로 변하 고 눈이 하얗게 되는 황달을 초래하기 때문에, "황열"이라는 이름으로 불리운다. 발병력 단계로 진입한 환자 중 절반은 10일 내지 14일 이내에 사망한다. 그러나, 황열병으로부터 회복된 사람들은 평생 재감염에 대해서 면역된다. 지난 20년간 황열병 바이러스에 감염된 사람의 숫자는 점점 증가해 왔는데, 현재 황열병 감염 사례는 연간 약 200,000건이고, 해마다 약 30,000명이 사망에 이르고 있다. 따라서 황열병 바이러스의 재출현은 공중 보건에 심각한 위협이 된다.

뎅기(DEN) 바이러스는 플라비바이러스의 다른 예이다. 뎅기 바이러스는 모기(주로 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)에 의해 사람에게 전염되고 전세계적으로 점점 심각한 공중 보건 문제의 원인이 되고 있다. 해마마 1억명 중에 50명 정도가 뎅기 바이러스에 감염되고 있고 일부 지역에서는 6%나 되는 높은 감염율이 관찰되기도 하였다 (Gubler, "Dengue and Dengue Hemorrahagic Fever," CABI Publ., New York, Chapter 1, pp. 1-22, 1997; Burke et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 38:172-180, 1988). 4가지 항원형의 뎅기 바이러스(뎅기 타입 1-4)들이 카리브해, 아시아 및 아메리카 지역에 퍼져 있다. 심각하게 치명적일 가능성이 있는 DEN 감염[뎅기 출혈열/뎅기 쇼크 증후군(DHF/DSS)]은 서로 상이한 항원형의 DEN에 의해 순차적으로 감염된 개인에게서 발병되는 면역병리학적 질병이다. 3백6십만 이상의 DHF(dengue hemorrahagic fever) 및 DHF에 의한 58,000명의 사망자가 1980년과 1995년 사이에 보고되었다 (Halstead, "Dengue and Dengue Hemorrahagic Fever," CABI Publ., New York, Chapter 2, pp. 23-44, 1997). DHF/DSS의 병원성 때문에, 최적의 뎅기 백신은 네 가지 항원형 모두에 대해 동시에 면역을 제공하고 오래 지속되는 면역성을 부여할 필요가 있는 것으로 생각되어 왔다. 세계 제 2 차 대전 이래로 효과적인 뎅기 백신을 개발하기 위해 활발한 노력이 경주되어 왔지만, 현재 이용가능한 인가된 뎅기 백신은 존재하지 않는다.

황열별 바이러스와 뎅기 바이러스를 포함하는 플라비바이러스는 사람 및 동물에서 질병의 유도를 담당하는 두 가지 중요한 생물학적 특징들을 갖는다. 이러한 두 가지 특징 가운데 하나는 신경조직친화성(neurotropism)으로, 신경조직친화성이란 바이러스가 숙주의 신경 조직에 침투해서 감염시키는 경향을 의미한다. 신경조직친화성 플라비바이러스 감염은 뇌와 척수의 감염 및 손상(즉, 뇌염), 의식 불명, 마비, 경련을 야기할 수 있다. 플라비바이러스 감염의 두 번째 특징은 내장기관친화성, 즉, 바이러스가 간, 신장 및 심장을 포함하는 중요한 내장 기관에 침입해서 감염시키는 경향이다. 내장기관친화성 플라비바이러스 감염은 간(간염), 신장(신장염), 및 심장 근육(심근염)의 감염 및 손상을 초래하여, 이들 기관이 정상적으로 기능하지 못하게 한다. 신경조직친화성과 내장기관친화성은 플라비바이러스의 서로 상이한 별개의 특징으로 판단된다.

일부 플라비바이러스는 기본적으로 신경조직친화성(예컨대, 웨스트 나일 바이러스)이고, 나머지는 기본적으로 내장기관친화성(예컨대, 황열병 바이러스 및 뎅기 바이러스)이며, 또 다른 나머지는 두 가지 특성을 모두 시현한다(예컨대, 키아사누르 포레스트(Kyasanur Forest) 질병 바이러스). 그러나, 신경조직친화성 및 내장기관친화성 양자는 모든 플라비바이러스에서 어느 정도 존재한다. 숙주 내에서 신경조직친화성과 내장기관친화성 사이의 상호작용이 일어나는 것으로 보이는 데, 이는 내장 기관의 감염은 중추신경계의 공격 이전에 일어나기 때문이다. 따라서 신경조직친화성은 바이러스의 신경외 기관(내장)에서의 복제 능력에 의존한다. 이러한 신경외 복제(extraneural replication)는 바이러스혈증을 일으키고 이러한 바이러스혈증은 뇌 및 척수를 공격한다.

플라비바이러스에 대한 백신을 개발하기 위한 하나의 시도는 그들의 발병력 특성(virulence properties)을 변화시켜, 백신 바이러스가 사람 및 동물에 대한 그의 신경조직친화성 및 내장기관친화성을 상실하도록 하는 것이었다. 황열병 바이러스의 경우에, 두 가지 백신 (황열병 17D 및 프렌치 신경조직친화성 백신)이 개발되었다 (Monath, "Yellow Fever," In Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3^rded., 1999, Saunders, Philadelphia, pp. 815-879). 황열병 17D 백신은 계배아 조직에서의 연속 접종(serial passage)에 의해 신경조직친화성과 내장기관친화성이 현저하게 감소한 바이러스를 수득함으로써 개발되었다. 프렌치 신경조직친화성 백신은 마우스 뇌 조직에서의 연속 접종에 의해 신경조직친화성은 잔류하지만 내장기관친화성을 완전히 제거하여 개발되었다. 프렌치 백신의 사용시 높은 발생률의 신경계 사고(예방접종후 뇌염)가 수반되었다. 다른 여러 바이러스들 중에 뎅기, 웨스트 나일, 옴스크 출혈열 바이러스와 같은 내장기관친화성을 갖는 임상적으로 중요한 플라비바이러스에 대한 인가된 백신으로 현재 시판되는 것은 없다.

플라비바이러스의 완전히 처리된 성숙한 바이러스입자는 세 개의 구조 단백질, 캡시드(C), 막(M), 및 엔벨로프(E)와 7개의 비구조 단백질들을 포함한다. 감 염된 세포에서 발견되는 덜 성숙한 바이러스입자들은 M-단백질의 전구체인 프리-막(prM) 단백질을 포함한다. 플라비바이러스 단백질은 폴리프로테인(polyprotein)을 생산하는 단일의 긴 개방 해독 틀(open reading frame)의 해독(translation)에 의하여 생산되는데, 폴리프로테인은 해독 이후에 숙주와 바이러스의 단백질 분해효소의 조합(combination)에 의한 복잡한 일련의 해독후 단백질 가수분해 절단(post-translational proteolytic cleavages)을 거쳐 성숙한 바이러스 단백질을 생성한다 (Amberg 등, J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae", In Virology, Fields(ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume I, p.937). 바이러스의 구조 단백질은 폴리프로테인에서 C-prM-E의 순서로 배열된다.

[발명의 요약]

본 발명은 플라비바이러스의 내장기관친화성을 감소시키는 하나 이상의 힌지 영역 돌연변이(hinge region mutations)를 포함하는 플라비바이러스를 제공한다. 이러한 플라비바이러스들은, 예를 들어, 황열병 바이러스 (예컨대, 황열병 바이러스 백신 균주); 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 웨셀스브론 바이러스, 키아사누 포레스트 질병 바이러스, 및 옴스크 출혈열 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 내장기관친화성 플라비바이러스; 또는 키메라 플라비바이러스일 수 있다. 키메라 바이러스의 하나의 예에서, 키메라는 제 1 플라비바이러스(예컨대, 황열병 바이러스)의 캡시드와 비구조 단백질들 및 키메라 플라비바이러스의 내장기관친화성을 감소시키는 엔벨로프 단백질 돌연변이를 포함하는, 제 2 플라비바이러 스 (예컨대, 일본 뇌염 바이러스 또는 뎅기 바이러스(예컨대, 뎅기 바이러스 1, 2, 3 또는 4)의 prM (pre-membrane) 및 엔벨로프(E) 단백질을 포함한다. 뎅기 바이러스의 경우에, 돌연변이는, 예를 들어, 뎅기 엔벨로프 아미노산 위치 202 또는 204에 있는 리신에 존재할 수 있다. 이러한 아미노산은 예를 들어 아르기닌으로 대체될 수 있다.

본 발명은 본원에서 기술하는 임의의 바이러스 및 제약학상 허용가능한 담체또는 희석제를 포함하는 백신 조성물은 물론 환자에게 그러한 백신 조성물을 투여하여 환자에게서 플라비바이러스에 대한 면역을 유도하는 방법도 제공한다. 이러한 방법으로 치료된 환자들은 플라비바이러스에 감염될 위험은 갖고 있지만 실제로는 감염되지 않았거나 플라비바이러스 감염된 환자들이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 백신의 플라비바이러스 감염의 치료에 이용하는 용도 및 그러한 목적의 약물의 제조에 이용하는 용도를 포함한다.

또한, 본 발명은 플라비바이러스에서 내장기관친화성을 감소시키는 돌연변이를 유발하는 단계를 포함하는 플라비바이러스 백신의 제조방법도 제공한다. 더욱이, 본 발명은 (i) 플라비바이러스의 힌지 영역(hinge region)에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 (ii) 힌지 영역 돌연변이를 포함하는 플라비바이러스가 돌연변이를 포함하지 않는 플라비바이러스에 비해 감소된 내장기관친화성을 갖는지 판단하는 단계를 포함하는 플라비바이러스(예컨대, 황열병 바이러스 또는 키메라 바이러스)의 동정방법도 포함한다.

본 발명의 플라비바이러스는 감소된 내장기관친화성을 갖기 때문에 환자에게 투여시 그들의 돌연변이가 일어나지 않은 카운터파트에 비해 더 나은 레벨의 안전성을 제공할 수 있어 유리하다. 이러한 바이러스들의 추가적인 이점들은 바이러스들이 황열병 바이러스 균주 YF17D(예컨대, 캡시드와 비구조 단백질을 코드화하는 서열들)의 서열들을 포함할 수 있다는 사실에서부터 비롯되는데, 상기 서열은 (i) 60년 이상 안전성이 유지되어 왔고 그동안 3조5천억 용량이 사람에게 투여되어 왔으며, (ii) 단일 투여 이후에 장기간의 면역성을 제공하고, (iii) 접종후 수일 이내에 신속하게 면역성을 유도한다. 또한 본 발명의 백신 바이러스는 처리된 환자에게서 능동 감염(active infection)을 초래한다. 예방접종된 개인의 사이토카인 환경 및 선천면역반응(innate immune response)이 자연적인 감염의 그것과 유사하기 때문에, 항원이 광범위하게 숙주에서 퍼져, 적절하게 폴딩된 입체형태적 에피톱들이 효과적으로 처리되어, 적응형 면역반응(adaptive immune response)은 강해지고 면역기억이 이루어진다. 더 나아가, 본 발명의 특정 키메라에서는, 타겟 바이러스로부터 유래된 prM 및 E 단백질들은 보호성 체액 및 세포 면역에 중요한 항원들을 포함한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

도 1은 ChimeriVax™-JE FRhL₃ (큰 용균반, 패널 A) 및 FRhL₅ (작은 용균반, 패널 B)에 의해 생산된 용균반 크기 변이체를 도시한 것이다. 용균반들을 토끼-항-JE 항혈청으로 염색하고, 이어서 항-토끼 IgG-홍당무 과산화효소로 염색하였다.

도 2는 돌연변이 E279 (M→K)를 갖거나 갖지 않는, YF-VAX^® 및 ChimeriVax™-JE 구조물들의 생존 분포(survival distribution)를 나타내는 일련의 그래프들이다. 4일된-젖먹이 마우스에게 뇌내 경로(intracerebral route)를 통해서 약 0.7 log₁₀ PUF (도 2A), 약 1.7 log₁₀ PUF (도 2B); 및 ∼2.7 log₁₀ PUF (도 2C)를 접종하였다.

도 3은 회귀분석(regression analysis), 생존률 대 바이러스 도스를 도시한 그래프로서, Met에서 Lys으로의 돌연변이를 포함하는(FRhL₅) 및 포함하지 않는(FRhL₃) 바이러스들에 대해서 유사한 슬로프와 평행선을 나타내는데, 이러한 결과는 통계적 비교를 허용한다. FRhL₅ 바이러스는 FRhL₃ 보다 18.52배 더 발병력(병원성)이 강하였다.

도 4는 FRhL 및 Vero 세포에서의 ChimeriVax™-JE 바이러스의 독립적인 RNA 트랜스펙션 및 연속 접종(passage series)의 결과를 도시한 것이다. 계대 접종 레벨에서 prME 유전자 상의 돌연변이의 출현이 관찰되었다.

도 5는 FRhL 및 Vero 세포에서의 적응 과정을 거친 힌지 영역에서의 돌연변이 위치를 나타내는 플라비바이러스 엔벨로프 당단백질 엑토도메인(ectodomain)의 3차원 모델이다. LOOK 소프트웨어(Molecular Application Grup, Palo Alto, CA) 를 이용하여 SegMod (Segment Match Modeling) 방법에 의해 자동화 상동성 모델링 빌딩에 대한 입력으로서 TBE 구조 템플릿(Rey et al., Nature 375:291-298, 1995)들 중 하나와 JE 엔벨로프 당단백질의 서열(균주 JaOArS982; Sumiyoshi et al., Virology 161: 497-510, 1987)을 나란히 도시하였다.

본 발명은 내장기관친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 플라비바이러스(예컨대, 황열병 바이러스 및 키메라 플라비바이러스), 그러한 플라비바이러스의 제조방법, 및 이러한 플라비바이러스들을 플라비바이러스 감염 위협을 제거하는데 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 플라비바이러스의 돌연변이(들)은 본 발명자들이 내장기관친화성 결정에서 일정한 역할을 하는 것으로 확인한 엔벨로프 단백질의 힌지 영역에 존재한다. 이하에서 본 발명의 바이러스들 및 방법들을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용가능한 플라비바이러스의 일례는 황열병 바이러스이다. 돌연변이는 아시비(Asibi) 감염성 클론과 같은 일례의 야생형 감염성 클론 또는 발병력 황열병 바이러스와 같은 다른 야생형의 감염성 클론의 엔벨로프의 힌지 영역에서 발생할 수 있고, 이어서 돌연변이체는 내장기관친화성에 영향을 미치는 부위를 확인하기 위해 동물 모델 시스템(예컨대, 햄스터 및/또는 원숭이 모델 시스템)에서 시험될 수 있다. 내장기관친화성의 감소는 예를 들어 모델에서의 감소된 바이러스혈증 및/또는 간 손상으로 판단될 수 있다 (후술하는 상세한 설명 참조). 야생형 바이러스의 내장기관친화성을 감소시키는 것으로 확인된 하나 이상의 돌연변이들이 백신 균주(예컨대, YF17D)내에 도입되고, 이러한 돌연변이체들은 그 결과로 수득한 돌연변이체들이 감소된 내장기관친화성을 갖는지 확인하기 위해 동물 모델 시스템(예컨대, 햄스터 및/또는 원숭이 모델 시스템)에서 시험된다. 이어서 감소된 내장기관친화성을 갖는 것으로 확인된 돌연변이체들은 내장기관친화성이 감소되었기 때문에 높은 안전성을 갖는 새로운 백신 균주로 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 추가적인 플라비바이러스의 예로는, 일본 뇌염, 뎅기열(항원형 1-4), 머레이 벨리 뇌염(Murray valley encephalitis), 세인트 루이스 뇌염(St. Louis encephalitis), 웨스트 나일(West Nile), 쿤진(Kunjin), 로시오 뇌염(Rocio encephalitis) 및 일헤우스(Ilheus)와 같은 모기-매개 플라비바이러스(mosquito-borne flavivirus); 중부 유럽 뇌염(Central European encephalitis), 시베리아 뇌염, 러시아 봄-여름 뇌염(Russian Spring-Summer encephalitis), 키아사누 포레스트 질병(Kyasanur Forest Disease), 옴스크 출혈열(Omsk Hemorrhagic Fever), 도약병(Louping ill), 포와산(Powassan), 네기쉬(Negishi), 엡세타로프(Absettarov), 한살로바(Hansalova), 아포이(Apoi) 및 하이프르 바이러스(Hypr virus)와 같은 진드기-매개 바이러스; 헤파시바이러스 속(예를 들어, C형 간염 바이러스) 비이러스들을 포함할 수 있다. 이들 바이러스들은 모두 어느 정도의 내장기관을 감염시키는 성질을 갖는다. 이들 바이러스들의 내장기관친화성은 중요한 내장 기관의 기능장애는 일으키지 않고, 이들 기관에서의 바이러스의 복제는 바이러스혈증을 일으킬 수 있어 중추신경계 공격을 초래한다. 돌연변이에 의해 이 들 바이러스들이 내장기관친화성을 감소시키는 것은 이들 바이러스들이 뇌를 공격해서 뇌염을 일으키는 능력을 감소시킨다.

상술한 바이러스들 및 기타의 플라비바이러스 이외에, 내장기관친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스들도 본원에 포함된다. 이러한 키메라들은 구조 단백질(단백질들)이 제 2 바이러스(즉, 시험 또는 플라비바이러스와 같은 소정의 바이러스)의 대응하는 구조 단백질(단백질들)로 치환된 플라비바이러스(즉, 백본 플라비바이러스)로 구성된다. 예를 들어, 키메라는 prM 및 E 단백질이 시험 바이러스(예컨대, 뎅기 바이러스 (1-4)), 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스 또는 본원에 개시된 기타의 바이러스)의 prM 및 E 단백질(E 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 힌지 영역 돌연변이를 갖늦다)로 대체된 백본 플라비바이러스(예컨대, 황열병 바이러스)로 구성될 수 있다. 키메라 바이러스는 임의의 바이러스들의 조합에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게, 그 바이러스에 대해서 면역성을 얻고자 하는 바이러스는 삽입된 구조 단백질(inserted structural proteins)의 소스이다.

본 발명에 사용될 수 있는 타입의 키메라 바이러스의 구체적인 예는 황열병 사람 백신 균주인 YF 17D로서, prM 및 E 단백질이 뎅기 바이러스(항원형 1, 2, 3 또는 4), 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 세인트 루이스(St. Louis) 바이러스, 머레이 벨리(Murray valley) 뇌염 바이러스, 또는 위에서 나열된 것들중 임의의 하나와 같은 기타의 임의의 다른 플라비바이러스의 prM 및 E 단백질 (상술한 바와 같이 힌지 영역 돌연변이를 포함하는)로 대체된 것이다. 예 를 들어, 미국 버지니아주의 매나세스(Manassas)에 소재하는 ATCC(American Type Culture Collection)에 부다페스트 조약에 따라 1998년 1월 6일자로 기탁된 이하의 키메라 플라비바이러스가 본 발명의 바이러스 제조에 사용될 수 있다: 키메라 황열병 17D/뎅기 타입 2 바이러스(YF/DEN-2; ATCC 수탁번호 ATCC VR-2593); 및 키메라 황열병 17D/일본 뇌염 SA14-14-2 바이러스(YF/JE A1.3; ATCC 수탁번호 ATCC VR-2594)가 해당된다. 본 발명에서 사용가능한 카메라 제조방법과 관련된 자세한 내용은 국제특허출원 제 PCT/US98/03894 및 PCT/US00/32821호; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999에 개시되어 있는데, 이들 문헌들은 참고로서 본원의 일부로 편입된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바이러스에 도입되는 돌연변이는 내장기관친화성을 감소시킨다. 하나의 예에서, 이러한 돌연변이들은 플라비바이러스 엔벨로프 단백질의 힌지 영역에 존재한다. 엔벨로프 단백질의 폴리펩타이드 쇄는 3개의 서로 다른 도메인들로 폴딩된다: 중심 도메인(도메인 I), 이합체화 도메인(도메인 II) 및 면역글로불린-유사 모듈 도메인(도메인 III). 힌지 영역은 도메인 I과 II 사이에 존재하고, 산성 pH에 노출시, 수용체-매개 세포내이입에 의한 바이러스 흡수후 바이러스와 엔도좀 막(endosomal membrane)의 융합에 관련되는 입체형태적 변형(그래서 "힌지"라 한다)을 수행한다. 예를 들어, 황열병 바이러스의 아미노산 48-61, 127-131, 및 196-283를 포함하는, 힌지 영역에 존재하는 다수의 엔벨로프 아미노산들이 존재한다 (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). 이들 아미노산 들 중 임의의 것 또는 가깝게 인접하는 아미노산들(및 다른 플라비바이러스 엔벨로 프 단백질의 대응하는 아미노산들)은 본 발명에 따라 돌연변이유발될 수 있고, 내장기관친화성의 감소에 대해 시험될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발과 같은 표준 방법을 이용하여 힌지 영역에 돌연변이를 유발할 수 있다. 본 발명의 바이러스에 존재하는 돌연변이의 일례는 전좌가 이용될 수 있는데, 결실 및 삽입과 같은 다른 여러 가지 유형의 돌연변이들도 이용될 수 있다. 또한 상술한 바와 같이, 돌연변이들은 단독으로 존재하거나 하나 이상의 추가 돌연변이들의 군으로 존재할 수 있다.

키메라를 포함하는 본 발명의 바이러스들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스의 지놈에 상응하는 RNA 분자는 일차 세포(primary cells), 계 배아(chicken embryo), 또는 이배체세포주 내로 도입될 수 있고, 이들(또는 이들의 상청액)로부터 자손 바이러스(progeny viruses)가 정제될 수 있다. 다른 사용가능한 바이러스 제조방법은 Vero 세포(Yasumura et al., Nihon Rinsho 21, 1201-1215, 1963)와 같은 이상배수체 세포 (heteroploid cells)를 이용한다. 이 방법에서, 바이러스의 지놈에 해당하는 핵산 분자 (예컨대, RNA 분자)가 이상배수체 세포에 도입되고, 바이러스는 그러한 세포들이 배양된 배지로부터 회수되고, 회수된 바이러스는 핵산분해효소(예컨대, 미국특허 제 5,173,418호의 Benzonase™와 같은 DNA와 RNA를 모두 분해시키는 엔도뉴클레아제)에 의해 처리되고, 핵산분해효소-처리된 바이러스는 농축(예컨대, 500kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터를 이용한 원심분리에 의해)되며, 농축된 바이러스는 백신 용도로 사용되기 위해 제형화된다. 이러한 방법의 세부사항은 본원에 참 고에 의해 포함되는 2002년 1월 5일에 출원된 미국특허출원 제 60/348,565호에 개시되어 있다.

본 발명의 바이러스는 감염될 염려가 있는 성인 또는 어린이에게 일차 예방약(primary prophlylaxis agent)으로 투여되거나 감염된 환자를 치료하기 위한 2차 약제(secondary agent)로 투여될 수 있다. 예를 들어, 황열병 바이러스/뎅기 키메라의 경우에, 백신은 뎅기 감염 우려가 있는 성인 또는 어린이에게 사용되거나 뎅기-감염된 환자에게 2차 약제로 사용될 수 있다. 뎅기-관련 백신 및 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 환자의 예들은 (i) 아시아, 라틴 아메리카, 및 카리브해와 같이 뎅기가 전염되고 있는 지역의 어린이들, (ii) 해외 여행자, (iii) 군인들 및 (iv) 뎅기 전염 지역의 환자들을 포함한다. 더욱이, 병이 확산되는 것으로 관찰된 지역(예컨대, 아르헨티나, 칠레, 오스트레일리아, 아프리카 일부, 남유럽, 중동, 및 미국 남부)의 거주자들 또는 장래에 확산될 것으로 관찰되는 지역들(예컨대, 아데스 아에집트가 창궐하는 지역)은 본 발명에 따라 처치될 수 있다.

본 발명의 바이러스들의 제형화는 본 발명이 속하는 기술 분야의 표준 기술에 따라 수행될 수 있다. 백신 제조에 이용되는 수많은 제약학상 허용가능한 용액들은 잘 알려져 있고 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에 의해 본 발명에 적합하도록 개량될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 참조). 두 가지 구체적인 예에서, 바이러스는 7.5% 락토스와 2.5% 사람 혈청 알부민을 함유하는 MEME (Minimum Essential Medium Earle's Salt) 또는 10% 소르비톨을 함유하는 MEME 내에 제형화된다. 그러나, 바이러스는 단지 멸균 염수 또는 멸균 완충액과 같은 생리적으로 허용가능한 용액으로 희석되기만 할 수도 있다. 다른 예에서, 본 발명의 바이러스들은 예를 들어, 황열병 17D 백신에서와 동일한 방법으로 제형화되고 투여될 수 있는데, 예를 들어, 감염된 계 배아 조직(chicken embryo tissue)의 정제된 현탁액 또는 키메라 황열병 바이러스에 의해 감염된 세포 배양물로부터 수득된 유체(fluid)로서 투여되거나 제형화될 수 있다.

본 발명의 백신은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 양 및 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스들은 0.1 내지 1.0 ml 도스 용적 내에 10² 내지 10⁷ 감염 단위 (예컨대, 용균반-형성 단위 또는 조직 배양 감염 도스)를 포함하는 멸균 수용액으로 제형화될 수 있고, 예를 들어 근육내, 피하, 또는 피부내 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 플라비바이러스는 구강 경로와 같은 점막 조직을 통해 인간 숙주에 감염될 수도 있기 때문에 (Gresikova 등의 "Tick-borne Encephalitis", In The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1998, Vol. Ⅳ, 177-203), 벡터들도 점막 경로를 통해 투여될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 백신은 단일 용량(dose)로 투여되거나, 선택적으로, 투여는 1차 접종에 이어 약 2-6개월 후에 당업자에 의해 정해지는 적당한 추가접종 용량(booster dose)으로 투여될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 바이러스의 투여시 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 사람에게 알려진 아쥬반트(adjuvant)들이 사용될 수 있다. 바이러스의 면역원성을 고양시키는데 사용될 수 있는 아쥬반트들은 예를 들어, 리포좀 제재(liposomal formulations), 합성 아쥬반트 (예를 들어 QS21), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptides), 모노포스포릴 리피드 A 또는 폴리포스파진들을 포함한다. 이러한 아쥬반트들은 전형적으로 불활성화된 백신에서 면역반응을 향상시키기 위해 이용되지만, 이들은 생백신(live vaccine)에 대해서도 이용될 수 있다. 점막 루트, 예를 들어 경구,를 통해 운반되는 바이러스의 경우에는, 열에 불안정한 독소(toxin)인 이.콜라이(E. coli(LT)) 또는 LT의 돌연변이 유도체(mutant derivations)와 같은 점막 보조제가 아쥬번트로써 사용될 수 있다. 게다가, 아쥬번트 활성을 가지는 유전자 인코딩 사이토킨들이 바이러스들에 삽입될 수 있다. 또한, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, 또는 IL-5 같은 유전자 인코딩 사이토킨들은 향상된 면역 반응을 낳는 백신을 제조하거나, 또는 더욱 구체적으로는 세포질, 체액, 또는 점막 반응에 대한 면역성을 조절하기 위해서 유전자들과 함께 삽입될 수 있다.

모든 네가지 뎅기 혈청형(serotype)들에 대항하는 면역성의 유도를 포함할 수 있는 최적의 예방 접종(vaccination)에 대항하는 뎅기 (Dengue) 바이러스의 경우, 본 발명의 키메릭(chimeric) 바이러스들은 4가(tetravalent)의 백신들의 제형에 사용될 수 있다. 그러한 4가의 백신들의 제형에 사용되는 임의의 또는 모든 키메라(chimera)들은 명세서에서 기재된 바와 같이 내장기관친화성(viscerotropism) 을 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 키메라들은 4가의 조제약(preparation)을 형성하기 위해 제형을 하는 동안 임의의 시점에 혼합될 수 있고, 또는 연속하여 투여될 수 있다. 4가 백신의 경우에는, 바이러스의 간섭의 가능성을 줄이고 또한 균형 잡힌 면역 반응을 달성하기 위해서, 투여된 백신들 내에 존재하는 다른 키메라들의 각각의 양들은 다양할 수 있다. 간략하게, 한 실시예에서 다른 키메라들에 비해 뎅기-2 키메라 (예를 들어, 10, 50, 100, 200, 또는 500배 미만) 의 적어도 5배 미만인 그러한 제형이 사용된다. 이 실시예에서, 뎅기-1, 뎅기-3, 및 뎅기-4 키메라들의 양은 동량이거나 또는 다를 수 있다. 다른 실시예에서, 뎅기-4 및/또는 뎅기 1 바이러스의 양들은 또한 감소될 수 있다. 예를 들어, 적은 뎅기-2 키메라를 사용하는 외에도, 뎅기-1 및 뎅기-3 키메라들에 비하여 적어도 5배 미만의 뎅기-4 키메라(예를 들어, 10, 50, 100, 200, 또는 500 배 미만)가 사용될 수 있거나; 뎅기-3 및 뎅기-4 키메라들에 비하여 적어도 5배 미만의 뎅기-1 키메라(예를 들어, 10, 50, 100, 200, 또는 500배 미만)가 사용될 수 있거나; 또는 뎅기-3 키메라들과 비교하여 적어도 5배 미만의 뎅기-1 및 뎅기-4 키메라들 (예를 들어, 10, 50, 100, 200, 또는 500배 미만) 이 사용될 수 있다. 명세서에 기재된 E204/E202 돌연변이가 키메라 내에 포함되지 않을 때, 뎅기-3 및/또는 뎅기-4 키메라들의 양에 비해 뎅기-1의 양을 줄이는 것이, 특히 바람직할 수 있다.

황열병(yellow fever)/일본 뇌염(Japanese encephalitis) 키메라의 엔벨로프(envelop) 단백질의 위치 279에서 발생하는 것으로서 본 발명에 포함된 돌연변이의 한 예의 특성에 관한 상세한 설명은 하기에 제공된다. 또한, 그 안에 내장기관친 화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 뎅기 바이러스 엔벨로프 단백질이 있는 황열병/뎅기 바이러스 키메라들에 대한 상세한 설명이 하기에 제공된다. 그러한 돌연변이의 한 실시예에는, 뎅기-1, 뎅기-2, 또는 뎅기-4의 엔벨로프 단백질의 위치 204의 라이신, 또는 다른 뎅기 혈청형들의 엔벨로프 단백질들보다 두 개의 아미노산이 더 짧은 뎅기-3의 엔벨로프 단백질의 위치 202의 라이신이 대체되거나 삭제된다. 이 라이신은, 예를 들어, 아르기닌으로 치환될 수 있다. 또한, 엔벨로프 아미노산 204 (뎅기-3을 위한 202) 근처의 다른 잔기(residue)들은 감소된 내장기관친화성을 달성하기 위해서 돌연변이 될 수 있다. 예를 들어, 임의의 아미노산들 200-208 또는 이 아미노산들의 조합이 돌연변이 될 수 있다. 구체적인 예들은 다음을 포함한다: 뎅기-1의 위치 202 (K); 뎅기-2의 위치 202 (E); 뎅기-3의 위치 200; 및 뎅기-4의 위치들 200 (K), 202 (K), 및 203 (K). 이러한 잔기들은, 예를 들어, 아르기닌에 의해 치환될 수 있다.

실험 결과들

힌지 영역 (Hinge Region) 돌연변이를 포함하는 I. 황열병/일본 뇌염 키메라

요약

YF 17D 바이러스의 전장(full-length) cDNA 클론에 약독화된 JE SA14-14-2 백신 균주(strain)로부터 prM-E 유전자들을 삽입함으로써 키메릭 황열병 (YF) - 일본 뇌염 (JE) 백신(ChimeriVax^TM-JE)이 제작되었다. 태아 상태의 레수스(rhesus) 원숭이 폐(FRhL) 세포에서 계대배양함으로써 이 잔기를 SA14-14-2로부터 야생형(wild type) 아미노산으로 전환하는 E279의 단일 Met→Lys 아미노산 돌연변이를 포함하는 작은 용균반(plaque) 바이러스의 출현을 일으켰다. 또한, 유사한 바이러스가 지정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 제작되었다. E279 돌연변이는 바이러스가 엔도좀(endosome)으로부터 감염된 세포의 세포질(cytoplasm)로 침투하는 동안 pH-의존성 배좌 변화를 초래하는 E 단백질의 힌지 영역 내의 베타-시트(sheet) 내에 위치한다. FRhL 또는 베로(Vero) 세포들 내의 비의존성 트랜스펙션-통과 연구에 있어서, 돌연변이들은 이 기능적으로 중요한 부위 내의 게놈의 불안정성을 반영하는 힌지 4(아미노산들 E266 내지 E284에 의해 제한되는) 내에 가장 빈번하게 출현하였다. E279 전환은 LD50과 젖먹이 마우스들 내의 생존분포와 레수스 원숭이들 내의 조직 병리학(histopathology)에 의해서 판단할 수 있듯이, 신경발병력(neurovirulence)의 엄청난 증가를 가져왔다. 민감도와 원숭이들에 대한 결과들에 필적하는 결과에 기초하여, 젖먹이 마우스는 향신경성(neurotropism) 에 대한 플라비바이러스 백신 후보자(candidate)들의 안전 테스트에 적합한 숙주이다. E279 Lys 바이러스는 바이러스 감염과 항체 수준들(내장기관친화성의 마커들)이 E279 메트(Met) 바이러스와 비교하여 엄청나게 감소하였기 때문에, 원숭이들 내의 신경외 (extraneural) 복제에 대하여 제한되었다.

배경

키메라 바이러스들에 대한 연구는 발병력의 분자 기초에 대한 통찰과 백신 개발에 대한 새로운 전망들을 제공하였다. 예를 들어, 포지티브-스트랜드 알파바이러스들의 분자 클론들(Morris-Downes 외., Vaccine 19: 3877-3884, 2001; Xiong 외., Science 243: 1188-1191,1991) 및 플라비바이러스들(Bray 외.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 10342-10346,1991 ; Chambers 외., J. Virol. 73: 3095-3101, 1999; Guirakhoo 외., J. Virol. 75: 7290-7304,2001 ; Huang 외., J. Virol. 74: 3020- 3028,2000)은 바이러스성 엔벨로프을 인코딩하는 구조성 유전자들과 중화(neutralization), 세포 부착(cell attachment), 융합(fusion), 및 내재화(internalization)에 관여하는 결정인자(determinant)들의 삽입에 의해 변경되어 왔다. 공여자(donor) 유전자들에서 유래하는 구조성 단백질들이 특정 면역성을 제공하는 동안, 이러한 키메라 바이러스들의 복제는 비구조성 단백질들과 모(母)균주에 의해 발현되는 비-코딩 말단(termini)에 의해 제어된다. 키메라 바이러스들의 생물학적 특성들은 공여자와 수여자 바이러스 유전자들 양쪽에 의해 결정된다. 구조물들을 공여자 유전자들에 대한 뉴클레오타이드 서열과 비교함으로써, 발병력과 약독화(attenuation)에 있어서 개별적인 아미노산 잔기들의 기능적 역할들을 분해할 수 있다.

일본 뇌염 (JE) 의 약독화된 균주(SA14-14-2)로부터 prM-E 유전자들을 혼입하는 키메릭 황열병(YF) 바이러스를 사용하여, 발병력의, 야생형 JE 나까야마(Nakayama) 바이러스로부터 약독화된 JE 바이러스를 구별하는 10 아미노산 돌연변이체들의 역할에 대한 상세한 실험이 이루어졌다 (Arroyo 외. , J. Virol. 75: 934-942, 2001). 각각의 돌연변이를 단독 또는 클러스터들을 야생형 서열로 전환 하고 104 용균반(plaque)-형성 단위들(units)(PFU)로 대뇌(IC) 루트에 의해 접종된 젊은 성인 마우스들에 대한 신경발병력에 대한 영향들을 결정함으로써 규정되었다. 모든 단일-부위 복귀 돌연변이체(single-site revertant) 바이러스들은 매우 약독화된 상태로 남아 있고, 신경발병력 표현형(phenotype)을 복구하기 위해 3 또는 4 잔기들에서의 전환이 필요하였다. 단지 하나의 단일-사이트 전환 (E279 Met→Lys) 이 발병력 변화의 증거로 나타났고, IC 접종 후 8 마리 중 1 마리의 동물이 죽었다.

E279 결정인자의 기능적 역할을 더 연구하기 위해서, 젖먹이 마우스들과 원숭이들 내에서 뇌염을 유발하는 그들의 능력에 대해서 이 아미노산 잔기가 다른 키메릭 YF/JE 바이러스들을 비교하였다. 플라비바이러스와 다른 살아있는 백신들의 안전성 테스트로써 원숭이들의 IC 접종을 정기적으로 이용하였고, 뇌와 척추 조직의 정량적, 병리학적 검사는 신경발병력에 있어서 미세한 차이들을 갖는 같은 바이러스의 균주들을 구별하기 위한 민감한 방법을 제공한다 (Levenbook 외. , J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987). 젖먹이 마우스들은 나이든 동물들보다 더 민감한 모델을 제공하는데, 항신경성 플라비바이러스들에 의해 감염되기 쉬운 정도는 나이-의존적이기 때문이다 (Monath 외. , J. Virol. 74: 1742-1751, 2000). 결과들은 E279에서의 단일 Met→Lys 아미노산 돌연변이가 신경발병력의 증가를 부여하였다는 것을 확인시켜 주었다. 이 돌연변이는 엔도좀으로부터 감염된 세포의 세포질 내로 바이러스가 침투하는 동안 pH-의존성 구조 변화(conformational change)를 초래하는 E 단백질의 "힌지" 부위에 위치된다 (Reed 외., Am. J. Hyg. 27: 493-497, 1938). 중요하게는, 젖먹이 마우스 레수스 원숭이들 내에서의 발병력 프로파일을 예측하는 것으로 알려졌다. 점 돌연변이에 의해 부여된 신경발병력 변화의 탐지에 근거하여, 젖먹이 마우스가 향신경성에 대한 플라비바이러스 백신 후보자들의 안전성 테스트에 적합한 숙주라는 것을 제안한다.

신경발병력은 증가시키지만, E279 돌연변이는 이 바이러스성 특성의 마커들로 허용된 원숭이들 내에서의 감소된 바이러스 감염과 항체 반응에 의해 측정되었듯이, 내장기관친화성에 대해 역효과를 나타내는 것으로 나타났다 (Wang 외. , J. Gen. Virol. 76: 2749-2755, 1995).

재료 및 방법들

바이러스들

ChimeriVax^TM-JE 백신의 개발은 YF 17D 바이러스의 전체 11-킬로베이스(kilobase) 게놈의 cDNA 복사본을 클로닝함으로써 시작되었다 (Chambers 외. , J. Virol. 73:3095-3101, 1999). 이것을 달성하기 위해서, YF 17D 게놈 서열들은 뉴클레오타이드(nt) 1-2276 과 8279-10,861 (플라스미드 YF5'3'IV), 및 1373-8704 (플라스미드 YFM5.2)로부터 각각 YF 서열들을 인코딩하는 두개의 플라스미드들 내에서 증식되었다. 전장 cDNA 주형(template)들은 이러한 플라스미드들로부터 유래하는 적합한 제한 절편들의 라이게이션(ligation)에 의해 발생되었다. YF 5'3'IV 와 YFM5.2 플라스미드 내의 YF 서열들은 상응하는 JE (SA14-14-2) pr-ME 서열들로 치환되어 YF5'3'IV/JE (prM-E') 및 YFM5.2/JE (E'-E)플라스미드들의 발생을 낳았다. 이러한 플라스미드들은 제한 엔도뉴클레아제 NheI 및 Asp. EI.와 함께 연속적으로 절단(digest)된다. 적합한 절편들은 T4 DNA 라이게이즈(ligase)에 의해 라이게이션되었고, cDNA는 전사를 위해 XhoI 엔자임에 의해 절단되며, RNA는 Sp6 프로모터로부터 제조되었다. 전장 RNA를 이용한 태아 레수스 폐 (FRhL) 세포들의 배수 염색체의 트렌스펙션(transfection)은 전기영동(electroporation)에 의해 수행되었다. 바이러스를 함유하는 상등액은 세포변성(cytopathic) 효과가 관측되었을 때(일반적으로 3일) 수집되었으며(harvested), 저속 원심분리에 의해 맑아졌으며 0.22 ㎛에 살균-여과되었다. 최종 농도가 50% v/v인 우태아 혈청(fetal bovine serum(FBS)) 이 안정화제로써 첨가되었다. 바이러스는 베로 세포들 내에서 용균반 분석에 의해 상술한 바와 같이 적정되었다(Monath 외. , Vaccine 17: 1869-1882, 1999). 키메라 바이러스는 연속적으로 대략 0.001로 가지각색으로 감염된 FRhL 또는 베로 세포들(Vero-PM, Aventis Pasteur, Marcyl'Etoile, France)에서 계대배양 하였다. 시판되는 황열병 17D 백신 (YF-VAX (E))은 Aventis-Pasteur (이전에 Pasteur-Merieux-Connaught), Swiftwater, PA에서 입수하였다.

지정부위 돌연변이

잔기 E279에 단일-부위 Met→Lys 전환을 포함하는 바이러스는 Arroyo 외, J. Virol. 75: 934-942, 2001에 기재된 바와 같이 올리고-부위 돌연변이(oligo-directed mutagenesis)에 의해 발생되었다. 간략하게, 뉴클레오타이드 1108 부터 2472 까지의 JE SA-14-14-2 E 유전자 부위를 포함하는 플라스미드(pBS/JE SA14-14-2)(Cecilia 외. , Virology 181: 70-77,1991)가 지정부위 돌연변위의 주형으로 사용되었다. 돌연변이는 트랜스포머(transformer) 지정부위 돌연변위 키트(Clontech, Palo Alto, CA)와 Life Technologies(Grand Island, NY)에서 합성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 사용하여 수행되었다. 유일한 변화는 가공된(engineered) 돌연변이라는 것을 입증하기 위해서, 플라스미드들은 E 부위에 걸쳐서 시퀀싱되었다. 그 후, E279 돌연변이를 포함하는 부위는 NheI 와 EheI(Kas I) 제한 사이트들을 이용하여 pBS/JE 플라스미드로부터 pYFM5.2/JE SA14-14-2 (Cecilia 외., Virology 181: 70-77, 1991)로 서브클론 되었다. 전장 DNA와 SP6 전사(transcription)의 어셈블리(Assembly)는 상술한 바와 같이 수행되었지만, 베로 세포들의 RNA 트렌스펙션은 리포펙틴(Lipofectin (Gibco/BRL))을 사용하여 수행되었다.

시퀀싱

RNA는 Trizol^R(Life Technologies)에 의해 감염된 단일층들로부터 분리되었다. 슈퍼스크립트 II 역전사제(Superscript II Reverse Transcriptase (RT))와 긴-RT 프로토콜(Life Technologies)로 역전사가 수행되었고, RNaseH 처리(Promega) 와 긴-PCR(XL PCR, Perkin-Elmer/ABI)이 이어졌다. RT, PCR, 및 시퀀싱 프라이머들은 YF17D 균주 서열(Gene Bank Accession number K02749)과 JE-SA14-14-2 균주 서열(Gene Bank Accession number D90195)을 기준(reference)으로 사용하여 설계되었다. PCR 결과물들은 겔-정화되었고(Qiagen 사의 Qiaquick 겔-추출 키트) 염색-종결체(Dye-Terminator) 디로다민(dRhodamine) 시퀀싱 반응 믹스(Perkin-Elmer/ABI)를 사용하여 시퀀싱되었다.

시퀀싱 반응들은 모델 310 유전학적 분석기(model 310 Genetic Analyzer (Perkin- Elmer/ABI)) 상에서 분석되었고, DNA 서열들은 시퀀처 3.0 (GeneCodes) 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

용균반 분석과 중화 테스트들

용균반 분석들은 베로 세포들의 단층 배지(cultures)의 6 웰 플레이트들 내에서 수행되었다. 37 ℃에서 1시간 동안 항온 배양(incubation)하여 바이러스를 흡착한 후, 세포들을 영양소 배지(medium) 내의 아가로스와 함께 오버레이 하였다. 4일 째, 3% 중성 레드를 포함하는 제 2 오버레이가 첨가되었다. 세럼-희석, 용균반-환원 중성 테스트들은 상술한 바와 같이 수행되었다 (Monath 외., Vaccine 17: 1869-1882, 1999).

젖을 뗀(weaned) 마우스 모델

8 내지 10 마리의 4주령의 암컷 ICR 마우스들의 그룹(Taconic Farms, Inc. Germantown, N. Y. )에 E279 돌연변이를 포함하거나 (4.0 log₁₀ PFU 분량 포함) 또 는 포함하지 않는(3.1 log₁₀ PFU) 30 ㎕의 키메릭 YF/JE SA14-14-2 (ChimeriVax^TM-JE) 구조물을 IC 접종하였다. 같은 수의 마우스들에 YF-VAX^R 또는 희석액을 접종하였다. 마우스들은 병에 걸렸고 21일 째에 죽었다.

젖먹이 마우스 모델

한 배에서 태어난 젖먹이 마우스들의 정확한 나이를 얻기 위해 임신한 암컷 ICR 마우스들(Taconic Farms)을 분만하는 동안 관찰하였다. 다수의 어미들로부터 48 시간 간격으로 태어난 젖먹이 마우스들을 풀(pool)하고 무작위로 121 마우스들의 그룹들인 어머니들에게 재분배하였다. 새끼들에게 연속하여 열 배 희석한 바이러스 20㎕를 포함한 IC를 접종하였더니 아픈 증상을 나타내더니 21째 날에 죽었다. 바이러스 접종물들(inocula)을 역적정 하였다. Reed 와 Muench 법에 의해 50% 치사량 (LDso) 수치가 계산되었다(Morris-Downes 외., Vaccine 19: 3877-3884,2001). 단일변량(Univariate) 생존 분포들을 도표로 그리고 로그 랭크 테스트(log rank test)로 비교하였다.

원숭이 모델

원숭이 신경발병력 테스트는 Levenbook 외.(Levenbook 외., J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987년)에 기재된 바와 같이 수행되었고 YF 17D 씨드(seed) 바이러스 들(Wang 외. , J. Gen. Virol. 76: 2749- 2755, 1995)에 대한 안전성 테스트는 WHO 규제들에 의해 금지되었다. 이 테스트는 이전에 ChimeriVax^TM-JE 백신들의 평가에 적용되었고, FRhL3 바이러스에 대한 테스트들의 결과들은 Monath 외., Curr. Drugs-Infect. Dis., 1: 37-50; 2001; Monath 외., Vaccine 17: 1869-1882, 1999에 기재되어 있다. 테스트들은 미국 식품의약국 GLP 규제들(US Food and Drug Administration Good Laboratory Practice (GLP) regulations (21 C. F. R. , 파트 58)에 따라서 시에라 바이오메디칼사(Sierra Biomedical Inc. (Sparks, NV))에서 수행되었다.

1일 째, 몸무게 3.0-6.5 kg의 열 마리 (수컷 5, 암컷 5) 레수스 원숭이들에게 E279 Met→Lys 돌연변이를 포함하거나 포함하지 않는 희석하지 않은 ChimeriVax^TM-JE 바이러스 또는 YF-VAX^R(g) 0.25 ㎖를 뇌의 전두엽(frontal lobe)에 단일 접종하였다. 원숭이들의 임상 징후들을 매일 평가하였고 0(징후가 없음), 1(거칠은 외피, 먹지 않음), 2(높은 음조의 울음소리, 비활동성, 느린 움직임), 3(비틀거리는 움직임, 떨림, 운동 실조증(incoordination), 사지 약독화(limb weakness)), 및 4(설 수 없음, 사지 마비 (limb paralysis), 죽음)으로 점수를 매겼다. 각각의 원숭이에 대한 임상 점수는 원숭이의 매일 매일의 점수들의 평균이고, 처리군에 대한 임상 점수는 개별적인 임상 점수들의 산술적 평균이다.

바이러스 감염 수준들은 2-10 일째에 수집된 세럼들을 사용하여 베로 세포들 내에서의 용균반 분석에 의해 측정되었다. 31일째에, 동물들을 안락사시켰고, 등 장의 염수-5% 아세트산을 흩뿌리고 이어서 중성-완충된 10% 포르말린을 흩뿌리고, 부검(necropsies)을 수행하였다. 뇌와 척추를 고정시켰고, 절개하고 갈로시아닌(gallocyanin)으로 염색하였다. 중추신경계에 다양한 해부학상 장애들의 존재와 심한정도(severity)가 평가되었다. WHO에 의해 명세된 스케일을 사용하여 각각의 조직 블록 내의 심한 정도를 점수로 매겼다(Wang 외. , J. Gen. Virol. 76: 2749-2755,1995):

등급(Grade) 1: 최소: 1-3 작은 병소의(focal) 염증성(inflammatory) 침윤물(infiltrates). 몇몇 뉴런(neuron)들은 변형되거나 또는 결실될 수 있다.

등급(Grade) 2: 보통: 더욱 넓은 범위의 병소의 염증성 침윤물. 뉴런성 변형들 또는 결실은 뉴런들의 3분의 1을 이하에 영향을 미친다.

등급(Grade) 3: 중함: 뉴런성 변형들 또는 결실이 뉴런들의 33-90 %에 영향을 미침; 보통의 병소의 또는 흩어진 염증성 변형들

등급(Grade) 4: 압도적임; 90% 초과의 뉴런들이 변형 또는 결실되며, 가변성이지만 종종 심한 염증성 침윤(infiltration)

병리학적 과정에서 가장 종종 또한 아주 극심한 정도에 관여하는 구조들은 ‘표적 범위(target areas)'라고 칭하였으며, 한편, 와일드-타입 바이러스와 ChimeriVax^TM-JE 간을 구별하는 그러한 구조들을‘식별자 범위(discriminator areas)'라고 칭하였다. YF 17D(Levenbook 외., J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987)에 대해 미리 나타냈던 것처럼, 흑색질(substantia nigra)이‘표적 범위’를 구성하였고, 미상핵(caudate nucleus), 담창구(globus pallidus), 피각(putamen), 전방/내측 시상 핵(anterior/medial thalamic nucleus), 측면 시상 핵(lateral thalamic nucleus), 및 척추(경부 및 요부 확대들(cervical and lumbar enlargements))이 ‘식별자 범위'를 구성하였다(Monath 외., Curr. Drugs Infect. Dis., 1: 37-50, 2001). 모든 신경병리학적 평가들은 처리 코드에 대해 알지 못하는 한 명의 숙련된 연구자에 의해 실시되었다. 표적 범위, 식별자 범위, 및 표적 + 식별자 결합 범위들에 대한 개별적인 점수들은 각각의 원숭이들에 대해 판단되었고, 평균 점수들에 대해 테스트 그룹들과 비교되었다. 뇌줄기(brainstem)의 다른 지역들(흑색질 ; 뇌교(pons); 척수(medulla); 및 소뇌 (cerebellum)) 외에 중뇌의 핵들) 과 연뇌막염(leptomeninges) 또한 검사되었다. 평균 신경병리학적 점수의 통계학적 비교들 (목표 지역, 식별자 지역들, 및 목표 + 식별자 지역들에 대한) 이 학생들의 2-테일드(tailed) t-테스트에 의해 수행되었다. 신경병리학적 검사 외에, 간장, 비장 (spleen), 부신(adrenal glands), 심장, 및 콩팥들의 병리학적 변화들을 광학 현미경으로 검사하였다.

게놈 안정성

YF/JE 키메라 바이러스의 유전적 안정성을 확인하고, 돌연변이에 민감한 백신 게놈 내의 '핫 스팟들(hot spots)'을 찾기 위해서, 세포들을 형질전환하기 위해서 RNA가 사용되었고 낮고 높은 계대배양 수준의 부분 또는 완전 게놈 시퀀싱을 이용하여 생체 밖에서 자손 바이러스를 연속적으로 계대배양 하는 등 다양한 실험들 이 수행되었다. 계대배양 시리즈는 FRhL 또는 베로-PM 세포들 내에서 트렌스펙션 단계로부터 시작하여 수행되었다. 바이러스의 연속 계대배양은 T25 또는 T75 플라스크들 내에서 성장한 세포 배양물 내에서 낮은 MOI로 수행되었다. 선택된 계대배양 수준에서, 바이러스성 게놈 RNA의 복제(duplicate) 샘플들을 추출하고, 역전사하여 PCR을 이용하여 증폭하였으며, prM-E 부위 또는 전체 게놈 서열을 결정하였다.

결과들

실험적인 계대배양에 의한 단일-부위 돌연변이 바이러스들의 발생

형질전환된 FRhL 세포들(FRhL₁)로부터 회수된 키메릭 YF/JESA14-14-2 (ChimeriVax^TM-JE) 바이러스는 대략 0.001 MOI로 이러한 세포들의 유체 배양물 내에서 연속적으로 계대배양되었다. 하기에 기술된 바와 같이, 계대배양 4(passage 4)에서, 본 발명자들은 용균반 형태(morphology) 변화를 알 수 있었는데, 이것은 뉴클레오티드(1818)에서 T→G 변환(transversion)되어 E 단백질의 279 위치에서 아미노산 변화(Met→Lys)를 일으키는 것과 관련되어 있다.

용균반은 각각의 계대배양 수준에서 특징되어 지고, 6일째 관찰되는 크기에 기초하여 3가지 카테고리(대:L~>1.0mm, 중:M~0.5-1mm, 및 소:S~<0.5mm)로 분류되었다. 용균반 크기 분포는 100개의 용균반을 계수함으로써 결정되었다. FRhL₃(3번째 계대배양) 바이러스는 80-94%의 L 및 6-20%의 S 용균반을 포함하였다. FRhL₅(5번째 계대배양)에서, 전체 용균반 수의 85% 이상을 포함하는 S 용균반의 출현과 함께 용균반 크기의 변화가 감지되었다(도 1). FRhL₄ 바이러스는 40%의 L과 60%의 S 용균반을 갖는 중간체이다. FRhL₅ 바이러스의 전체 게놈 시퀀스가 E279에서 단일 돌연변이를 나타내었다. FRhL₅ 키메라의 전체 게놈 콘센서스(consensus) 시퀀스가 코돈 이질성(heterogeneity)을 위한 주의깊은 관찰을 통해 이것이 바이러스에서 유일하게 감지 가능한 돌연변이라는 것을 확인하였다. FRhL₃바이러스의 전체 게놈 교감 시퀀스는 모체 YF/JESA14-14-2 키메라 바이러스에 비해 감지할 수 없는 돌연변이를 나타내었다(참조: Arroyo 외., J. Virol. 75: 934-942, 2001)(표 1).

10개의 대, 중, 소 용균반을 FRhL₃, FRhL₄ 및 FRhL₅로부터 선별하고, FRhL 세포의 유체 배양물 내에서 계대배양(passage)함으로써 증폭하였다. 증폭 후에, 상청 플루이드를 베로(Vero) 세포에서 용균반을 형성하였다. FRhL₃으로부터 S 용균반 형태(phenotype)를 분리하기 위한 시도는 실패하였고, 모두 분리된 L 또는 S 크기 용균반은 FRhL 세포에서 증폭을 1 회전한 후, 다수의 L 용균반을 생산하였다. 60%의 용균반이 S 크기로 구성된 다음 계대배양(FRhL₄)에서, RFRhL 세포에서 증폭함으로써 이러한 용균반을 분리할 수 있었다. FRhL₅에서 다수의 플라크(85-99%)가 S 크기이고, L 및 S 각각의 용균반을 증폭하여 다수의 S 크기를 만들었다. FRhL₃으로부터 S 및 L 용균반 형태의 prM-E 유전자의 시퀀싱은 ChimeriVax^TM-JE의 형성을 위해 사용되는 모계 SA14-14-2 유전자와 동일한 시퀀스를 나타내었고, 이때 FRhL₄ 또는 FRhL₅ 바이러스 중 하나로부터 분리된 S 용균반은 E279에서 돌연변이(Met→Lys)를 나타낸다.

동물 협약

마우스 및 비인간 영장류를 포함하는 모든 연구는 실험실 동물의 보호 및 이용에 대한 지침서에 기술되어 있는 바와 같이 USDA 동물 보호 법령 (9 C. F. R., Parts 1-3)에 따라 수행되었다.

젖을 뗀 마우스에 대한 발병력

10마리의 4주령 암컷 ICR 마우스에 대해 분리된 실험으로 FRhL₃, FRhL₄ 또는 FRhL₅ 바이러스의 약 3.0 log₁₀ PFU로 IC 접종하였다; 상업적으로 구입 가능한 황열병 백신(YF-VAX^R, Aventis Pasteur, Swiftwater PA)을 동일한 양(약 3.3 log₁₀ PFU)으로 각각의 10마리 마우스에 투여하였다. 키메라 바이러스를 접종한 마우스는 모두 발병하지 않거나 사망하지 않은 반면, YF-VAX^R로 접종한 대조군 마우스의 70-100%는 마비상태(paralysis)로 발전하거나 사망하였다. 다른 실험에서, 8마리의 마우스를 FRhL₅(3.1 log₁₀ PFU) 또는 YF/JE 단일-부위 E279 복귀 돌연변이체 (revertant)(4.0 log₁₀ PFU)로 IC 접종하고, 9마리의 마우스는 YF-VAX^R(2.3 log₁₀ PFU)를 투여하였다. 키메라 구성물로 접종한 마우스는 모두 발병하지 않은 반면, YF-VAX^R로 접종한 마우스의 6/9(67%)는 사망하였다.

젖먹이 마우스에 대한 발병력

E279 돌연변이가 있는 것과 E279 돌연변이가 없는 YF/JESA14-14-2 키메라 바이러스를 마우스에 소정 투여량으로 IC 접종하는 2개의 분리된 실험을 수행하였다(표 2). YF-VAX^R이 이 실험에서 대조군으로 사용되었다. LD₅₀ 및 평균 수명시간(AST)을 각각의 바이러스에 대해 측정하였다.

8.6일 된 마우스를 사용한 첫 번째 실험에서, E279에서 단일 부위 전환(reversion)(Met-Lys)을 포함하는 FRhL₅ 바이러스는 1.64의 log₁₀ LD₅₀로 신경발병력(neurovirulent)인 반면, 이러한 돌연변이가 없는 FRhL₃ 바이러스는 최대 투여 군에서 마우스의 10분의 1만 사망하여, 거의 무발병력(avirulent)이었다(표 1). 최대 투여량(약 3log₁₀ PFU)에서, FRhL₅ 바이러스의 AST(10.3일)는 FRhL₃ 바이러스의 AST(15일)보다 짧았다.

E 유전자에서 단일 부위 돌연변이가 젖먹이 마우스에서 신경발병력 시험에 의해 감지가능한지 통계적으로 증명하기 위해 두 번째 실험이 후속하여 수행되었 다. 이 실험에서 외부에서 자란 4일된 마우스에 대해 ChimeriVax^TM-JE FRhL₃(돌연변이 없음), ChimeriVax^TM-JE FRhL₅ (E279 Met→Lys) 또는 지정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 단일 돌연변이 E279(Met→Lys)가 도입된 YF/JE 키메라를 소정의 투여량으로 IC 접종하였다(Arroyo 외, J. Virol.75: 934-942, 2001). E279 돌연변이를 포함하는 두 개의 바이러스의 LD₅₀ 값은 E279 Met→Lys 돌연변이가 키메라 바이러스의 신경발병력을 증가시키는 것으로 나타나 돌연변이가 없는 FRhL₃ 구조(표 2) 보다 >10-배 낮았다. 생존 분포에서 바이러스들 간에 통계적으로 현저한 차이가 있었다(도 2). 가장 낮은 투여량(~0.7 log₁₀ PFU)에서, YF/JE 키메라 바이러스가 YF-VAX^R 보다 현저하게 발병력이 낮았다(log rank p<0.0001). E279 Met→Lys 돌연변이를 갖는 바이러스는 돌연변이가 없는 FRhL₃ 바이러스와 달리 유사한 생존 곡선을 나타내지만, 그 차이는 통계적인 의미를 갖지는 않는다(log rank p=0.1216). 그러나, 높은 투여량에서(~1.7 및 ~2.7 log₁₀ PFU), E279 돌연변이 바이러스의 생존 분포는 FRhL₃ 바이러스와 현저하게 차이가 있었다.

바이러스 투여량에 의한 사망율(mortality ratio)의 분석은 유사한 기울기 및 평행 회귀라인(regression lines)을 나타내었다(도 3). FRhL₅ 바이러스는 FRhL₃ 보다 18.52배 더 효력(발병력)있었다(95% 기준한계 3.65 및 124.44, p < 0.0001).

원숭이 신경발병력 시험

ChimeriVax^TM-JE FRhL₃ 또는 FRhL₅ 바이러스로 접종한 20마리의 원숭이가 뇌염으로 진행하지 않은 반면, YF-VAX^R로 접종한 4/10의 원숭이가 15-29일 내에 3등급 증상(떨림, tremors)으로 진행하고, 발병 6일 이내에 분리되었다. 평균 및 최대 평균 임상수치가 2개의 ChimeriVax^TM-JE 군에서 보다 YF-VAX^R 군에서 현저하게 높았다. E279 돌연변이가 존재하는 것과 E279 돌연변이가 존재하지 않는 ChimeriVax^TM-JE 바이러스를 투여한 군 사이에 임상 스코어의 차이가 없었다(표 3).

실험을 수행하는 동안 치료군 사이에 중량 변화에서 차이가 없었다. 병리시험은 바이러스에 기인하는 간, 비장, 콩팥, 심장 또는 부신의 변화를 나타내지 않았고, 치료군 사이에 차이도 나타나지 않았다.

뇌와 척수의 조직병리학적(histopathologic) 시험은 ChimeriVax^TM-JE 바이러스 FRhL₃ 및 FRhL₅ 보다 YF-VAX^R로 접종한 원숭이에 대해서 현저하게 높은 질환 스코어를 나타내었다(표 3). YF-VAX^R에 대해 결합된 표적 + 결정인자 스코어(combined target + discriminator scores)(±SD)는 1.17(±0.47)이었다. ChimeriVax^TM-JE FRhL₃(E279 Met) 및 FRhL₅(E279 Lys)에 대한 스코어는 각각 0.29(± 0.20), (p=0.00014 vs. YF-VAX^R) 및 0.54(±0.28), (p=0.00248 vs. YF-VAX^R)이었다.

E279에서 Met→Lys 전환(reversion)을 포함하는 ChimeriVax^TM-JE FRhL₅에 대한 식별자 범위 스코어(discriminator area score) 및 표적 + 식별자 부위 결합 스코어(combined target + discriminator area score)는 ChimeriVax^TM-JE FRhL₃에 대응하는 수치보다 현저하게 높았다(표 3).

YF-VAX^R로 접종한 원숭이에서 주요 증상은 소뇌, 시상핵(thalamic nuclei) 또는 담창구(globus pallidus) 질환을 나타낼 수 있는 떨림(tremor)이었다. 소뇌피질(cerebellar cortex), 치상핵(N. dentatus) 또는 다른 소뇌핵(cerebellar nuclei)에서 명확한 조직학적 질환은 발견되지 않은 반면, 모든 양성 원숭이에서 염증성 질환이 시상핵 및 담창구에 존재하였다.

흥미롭게도, 바이러스 감염에 의해 밝혀진 바와 같이 E279 복귀돌연변이주(revertant)의 신경발병력 및 내장기관친화성(viscerotropism) 사이에 반비례 관계가 존재하였다. WHO 원숭이 신경발병력 시험은 내장기관친화성(viscerotropism)을 측정함으로써 바이러스 감염을 정량하는 것을 포함한다(World Health Organization, "Requirements for yellow fever vaccine, "Requirements for Biological Substances No.3, revised 1995, WHO Tech. Rep. Ser. 872, Annex 2, Geneva: WHO, 31-68,1998). 이것은 뇌내 접종이 신경외 조직의 즉각적인 접종(immediate seeding)을 일으키는 합리적인 관찰에 기초한다(Theiler, "The Virus," In Strode (ed.), Yellow Fever, McGraw Hill, New York, New York, 46-136,1951). YF-VAX^R로 접종한 10마리의 원숭이 중 9마리(90%) 및 ChimeriVax^TM-JE FRhL₃로 접종한 10마리의 원숭이 중 8마리(80%)가 IC 접종 후에 바이러스 감염되었다. 바이러스 감염 수준은 ChimeriVax^TM-JE FRhL₃ 군에서 보다 theYF-VAX^R 군에서 높은 경향을 나타냈으며, 4일째에 현저하게 나타났다. 반면, FRhL₅ 바이러스(E279 Met→Lys)를 주입한 동물 중 2마리(20%)만 감지가능한 낮은 수준의 바이러스 감염을 나타내었고(표 4), 평균 바이러스 감염은 3일 및 4일째(및 5일 째에 거의 현저하게) FRhL₃ 바이러스 보다 현저하게 낮았다. 따라서 FRhL₅ 복귀돌연변이주 바이러스는 증가된 신경발병력을 나타내지만, FRhL₃ 바이러스에 비해 감소된 내장기관친화성을 나타내었다. ChimeriVax^TM-JE FRhL₃ 및 FRhL₅로 접종한 원숭이의 혈청을 용균반 크기 변형체(plaque size variants)의 존재를 살펴보기 위해 시험하였다. FRhL₃로 접종한 원숭이의 혈청에서 L 용균반만 관찰된 반면, FRhL₅로 접종한 원숭이의 피에서 바이러스는 적절한 S 용균반 형태(morphology)를 가지고 있었다.

면역성

총 3개의 군의 모든 원숭이를 시료 손실로 시험하지 않은 1마리의 동물 (FRhL₅, RAK22F)을 제외하고는 동종 중화 항체를 31일 후 접종하여 황열병(YF-VAX^R군) 또는 ChimeriVax^TM-JE (ChimeriVax^TM 군)으로 진행시켰다. 그러나, 기하평균 항체가(the geometric mean antibody titer: GMT)는 FRhL₃로 접종한 원숭이(GMT 169, p=0.0386, t-test)보다 FRhL₅로 접종한 원숭이(GMT 501)에서 현저하게 높았다.

게놈 안정성

ChimeriVax^TM-JE RNA의 2개의 분리된 트랜스펙션이 각각의 2개의 세포 균주 FRhL 및 베로(Vero)에서 실시되고, 자손(progeny) 바이러스를 도 4에 나타낸 바와 같이 계대배양 하였다. FRhL 계대배양 시리즈 B는 상기에서 기술한 바와 같이 FRhL₄에서 E279 변환(reversion)을 일으켰다. 흥미롭게도, FRhL 세포에서 별개의 계대배양 시리즈(A)도 E281에서 인접한 잔기 돌연변이(Thr→Lys)를 일으켰고, 베로 세포에서 계대배양 시리즈 중 하나가 E271에서 Val→Lys 돌연변이를 일으켰다. 베로 세포에서 선택된 다른 돌연변이가 도메인(domain) III 또는 트랜스멤브레인(transmembrane domain) 내에 존재하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 돌연변이를 포함하는 모든 바이러스는 성숙한 마우스 신경발병력 시험을 실시하여 비발병력인 것이 밝혀졌다.

II. 힌지 영역 돌연변이를 포함하는 황열병/뎅기 키메라

요약

ChimeriVax^TM-DENl 바이러스를 [태국에서 1980년에 분리된 (Puo359)] 뎅기 1 바이러스의 야생형 균주의 prME 유전자를 사용하여 황열병 바이러스(균주 17D) 주쇄에 삽입함으로써 제조하였다(Guirakhoo 외, J. Virol.75: 7290-7304,2001). 베로 세포에서 ChimeriVax^TM-DENI에 대한 프리-마스터 씨드(Pre-Master Seed) 바이러스를 제조하는 동안, 엔벨로프 단백질 E(envelope protein E)의 204 위치에서 K에서 R로 아미노산 치환을 일으키는 1590 위치에서의 A에서 G로의 단일 핵산 변화를 포함하는 클론(클론 E)을 분리하여 용균반 정제하였다. 바이러스는 4일 된 젖먹이 마우스에서 약독화 현상을 나타내었고, 원숭이에 피하 경로(subcutaneous route)에 의해 접종되었을 때, 모체(nonmutant) 바이러스 보다 낮은 내장기관친화성(viscerotropism)를 나타냈다. 돌연변이가 없는 다른 클론(클론 J-2)을 선택하여 용균반을 정제하고, 계대배양 7(P7)에서 PMS 바이러스 원액(stock)을 생산하는데 사용하였다. 이 바이러스는 베로 세포에서 P10 이하의 실험실 환경하에서 계대배양하였을 때 다른 돌연변이를 나타나지 않았다. 그러나, PMS 원액으로부터 마스터 씨드(Master Seed) 바이러스 (P8)를 생산하기 위해 cGMP 조건하에서 한번의 계대배양을 하자마자, 1590 위치에서 동일한 돌연변이(A 에서 G)가 나타났다. 클론 E와 유사하게, P8 바이러스는 P7 바이러스 보다 큰 용균반을 생산하였고, 젖먹이 마우스에 대해 약독화되었다. 따라서, 모든 뎅기 바이러스를 보존하고 있는 E204 위치는 ChimeriVax^TM-DEN(serotypes 1-4) 바이러스에서 조절되어 인간에 대한 백신 후보물 질의 약독화 및 면역원성 사이의 균형을 이룰 수 있다.

결과 및 고찰

ChimeriVax-DENl 바이러스에 대한 프리-마스터 씨드(Pre-Master Seeds)의 생산

DEN1에 대한 용균반 정제된 프리-마스터 씨드(PMS) 바이러스의 생산은 하기와 같이 수행되었다. 용균반 정제는 계대배양 2(P2)에서 후 (post) RNA 트랜스펙션에 있는 바이러스 개시하였다. 2개의 PMS 바이러스(P2에서 클로닝되지 않고, P7에서 클로닝 됨)를 계대배양 140에서 아벤티스(Aventis)로부터 수득한 적절한 세포은행(cell bank)를 이용하여 계대배양 142에서 아벤티스 베로(Aventis Vero) LS10 세포에서 생산하였다. 클로닝된 바이러스는 용균반 정제 3회 후에 수득하였고, 돌연변이의 결함을 확인하기 위해 전체 게놈을 통해 시퀀싱하였다. 일반적으로, 클론이 아미노산 치환을 포함하면, PMS 바이러스 후보물질로 사용하지 않았다. 돌연변이가 없는 클론이 확인될(identified) 때까지 다른 클론을 제조하여 시퀀싱한 후, 용균반 정제하고 시퀀싱하였다.

시퀀싱

시퀀싱을 위해, 바이러스 RNA를 TRI-Reagent LS(Molecular Research Center) 또는 Trizol LS (유사한 시약, Gibco)을 사용하여 각각의 개별적인 바이러스 시료(일반적으로 0.25 ml)로부터 추출하고, 0.20 ml의 RNase-자유수(free water)에 용해 시켰다. 이어서, 추출된 RNA를 RT-PCR를 위한 주형(template)으로 사용하였다. 전체 게놈을 티탄 원-튜브(Titan One-Tube) RT-PCR 키트(Roche)로 길이(프래그먼트 I 에서 V) ~2-3kb의 5번 중복된 앰플리콘(amplicons)으로 증폭하였다. RT-PCR 단편들을 QIAquick PCR Purification kit(Qiagen)를 사용하여 정제하거나, 또는 QIAquick Gel Extraction kit(Qiagen)를 사용하여 아가로즈 겔-정제(agarose gel-purified)하였다. 시퀀싱 반응은 CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Beckman) 및 앰플리콘의 양쪽 스트랜드를 읽기 위를 양성 및 음성 방향 모두의 YF-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머(YF-specific oligonucleotide primers)에 대한 콜렉션을 사용하여 수행되었다. 시퀀싱 반응 생성물은 DyeEx Spin kit (Qiagen)을 사용하여 정제되었고, CEQ2000 자동화 서열분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분리되었다. 발생한 시퀀싱 데이타는 Sequencher 3.0 (GeneCodes) 소프트웨어를 사용하여 배열하고 분석하였다. 뉴클레오티드 이질성(Nucleotide heterogeneities)은 이질성 시그널(heterogeneous signal)이 플러스-및 마이너스-스트랜드 시퀀싱 반응 모두를 나타내는 모든 크로마토그래피에서 관찰될 때만 등록하였다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 클로닝되지 않은 P2 바이러스는 돌연변이를 갖지 않으나, P5에 의해 엔벨로프 단백질 E(envelope protein E) 내에 5개의 아미노산 돌연변이(이질성, heterogeneity)를 취득하였다. 흥미롭게도, P15에서 안정한(추가로 선택됨) 유일한 돌연변이는 204 돌연변이였다. 클로닝되지 않은 P2 바이러스로부터 개시한 (P15이하) 반복 패시지 실험은 베로 세포에서 선택된 E204 위치에서 동일한 돌연변이(K 에서 R)를 나타내었다.

ChimeriVax-DEN1(A-J)의 다른 클론은 직접적인 용균반 대 용균반 정제에 의해 선별하고, 돌연변이를 확인하기 위한 다양한 단계에서 시퀀싱하였다. 가장 빈도높은 돌연변이는 E251(V > F)치환으로서 클론 A, B, D 및 G에서 발생되며, 클로닝되지 않은 바이러스뿐만 아니라 클론 E 및 F에서 발견되는 E204(K > R)가 이후에 이어진다. E311(E > D)에서 돌연변이는 클론 C 및 D에서만 발견되었다. 흥미롭게도, 클론 J는 P10까지도 돌연변이가 일어나지 않았다. 그러나 이러한 바이러스의 마스터 씨드(Master Seed)(MS)가 cGMP 제조하에서 P7(PMS)로부터 제조되었을 때, E204에서 동일한 치환이 재출현하였다(단지 계대배양 1 이후). 이러한 돌연변이는 P20 바이러스가 시퀀싱되었을 때 안정하였다(표 5). E204 돌연변이를 포함하는 클론은 돌연변이 없는 바이러스(직경 ~lmm) 보다 큰 용균반(직경 ~2mm)을 생산하였다(표 9). 베로 P4에서 이러한 바이러스의 본래 구조물(원숭이에서 바이러스 감염을 낮은 수준으로 만들기 위해 미리 개시됨)도 동일한 E204 돌연변이를 포함한다(Guirakhoo 외, J. Virol.75:7290-7304, 2001). 바이러스의 생활사(biology)에서 이러한 돌연변이의 역할은 하기와 같은 이유 때문에 우선적으로 이해될 수 없었다: a) 본래 구조물이 E204 돌연변이 이외에 M39에서 부가적인 돌연변이(H로부터 R까지 아미노산 변화를 일으키는 뉴클레오티드 A 에서 G를 포함하였고; b) 본래 구조물의 신경발병력이 ChimeriVax-DEN1 바이러스 또는 다른 ChimeriVax^TM-DEN 바이러스의 약독화를 나타내기에 충분히 민감하지 않은 3-4주된 마우스에서만 평가되었으며 (Guirakhoo et al., J. Virol. 75: 7290-7304, 2001) ; 및 c) 바이러스의 신경발병력 또는 내장기관친화성(viscerotropism) 표현형에서의 변화를 결정하기 위해 비교될 수 있는 ChimeriVax^TM-DEN1 바이러스(돌연변이 없음)가 없었다.

키메라 바이러스가 3-4 주령 마우스에 대해 약독화되기 때문에, 다양한 클론의 신경발병력에서 미묘한 차이를 시험하기 위해 더 민감한 시험(4-8일된 젖먹이 마우스를 사용하여)을 수행하였다.

마우스 신경발병력

키메라의 신경발병력이 ChimeriVax^TM 바이러스를 구성하는데 사용되는 바이러스 벡터(YF-VAX)의 신경발병력을 초과하지 않는다는 것을 확인하기 위해 방출(release) 시험으로서 3-4주령 마우스를 이용하여 마우스 신경발병력 시험을 수행하였다. 모든 키메라가 너무 멀리 구성되기 때문에(돌연변이가 있거나 또는 없거나) 성숙한 마우스(3-4주령)에 대해서는 발병력이 없고, 따라서 이러한 동물은 단일 아미노산 치환과 관련된 키메라의 신경발병력의 미묘한 변화를 확인하기 위해 사용될 수 없다. 반면, 4-10일된 젖먹이 마우스는 바이러스 감염과 관련된 키메라의 게놈에서 작은 변화에 더 민감하다. ChimeriVax^TM-DEN 바이러스의 진행과정에서, 모든 4개의 키메라의 게놈에 걸쳐 몇몇의 돌연변이가 관측되었다(Guirakhoo 외, J. Virol. 75: 7290-7304, 2001). 이러한 돌연변이는 모든 키메라에서 수정되었고, 재구성된 바이러스(DEN1 키메라 제외)는 원숭이에서 안정성 및 면역성에 대해 성공적으로 평가되었다. DEN1 플라스미드의 불안정성 때문에, 이러한 키메라의 재구성(돌연변이 없는)은 적시에 달성될 수 없었고, 따라서 원숭이에서 시험될 수 없었다. DEN1 키메라에 대해서 PMS를 생산하기 위해 용균반 정제를 하는 동안, 10개의 다른 클론(A-J)이 돌연변이 없는 클론을 확인(identify)하기 위해 시퀀싱되었다(표 5). 하나의 클론(J)을 제외한 모든 클론은 엔벨로프 단백질 E(envelope protein E) 내에 1 또는 2개의 돌연변이를 포함하였다. DEN1 키메라의 대표적인 클론은 4일된 젖먹이 마우스를 사용하여 그들의 신경발병력을 평가하였다(표 6). 동물들은 각각의 키메라 DEN1 바이러스를 비희석, 1:10 또는 1:100으로 희석한 것을 2개의 0.02ml로 대뇌 경로를 통해 접종하고, 21일 동안 관찰하였다. 실제 투여량은 용균반 분석에서 접종원(inocula)의 후적정(back titration)에 의해 결정되었다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 클론 E를 제외한 모든 클론은 YF-VAX^R 보다 현저하게 낮은 평균 생존시간(AST)을 가지면서 4일 된 마우스에 대해 유사한 신경발병력을 나타내었다(p < 0.OOl JMP 소프트웨어, 버젼 4.0.2을 이용). 클론 E (E204K>R)는 다른 모든 DEN1 클론 보다 현저하게 낮게 발병력을 나타냈다(p<0.0001). 흥미롭게도, 본래 DEN1 키메라에서 확인(identified)된 2개의 돌연변이 중 하나가 E204 K > R 치환이었다. 이 바이러스는 원숭이에 접종되었을 때 1.3일 동안 낮은 수준의 바이러스혈증(평균 피크 적정, mean peak titer 0.7 log₁₀ PFU/ml)을 유도하였다(Guirakhoo 외, J. Virol. 75: 7290-7304, 2001). 임의의 돌연변이도 포함하지 않고, 4일 된 마우스에서 YF-VAX^R 보다 현저하게 낮은 발병력을 나타내는(P=0.001) 클론 J가 cGMP MS 바이러스를 생산하기 위해 선택되었다.

원숭이 체내에서의 키메라 DEN1 바이러스의 안정성 및 면역원성(바이러스혈증 및 중화 항체 반응)

바이러스의 내장기관친화성(viscerotropism: 바이러스혈증)에 E204 돌연변이의 효과는 원숭이에게 E204 돌연변이를 갖는 ChimeriVax-DEN1 바이러스(클론 E, P6) 또는 갖지 않는 ChimeriVax-DEN1 바이러스(클론 J, P7)를 접종함으로써 평가하였다. 원숭이 체내에서 단일가(monovalent) 또는 4가(tetravalent; 3개의 다른 키메라와 조합)로서 바이러스혈증 및 면역원성의 프로파일이 평가되어 있기 때문에, 원형 DEN1 키메라(ChimeriVax-DEN1, 클론되지 않은 P4, 1999, 그룹 1)은 대조군으로 선택되었다(Guirakhoo 등, J. Virol. 75:7290-7304, 2001년).

레수스 원숭이 그룹에게 5log₁₀PFU/0.5ml의 DEN1 키메라(표 7)가 접종되었다. 바이러스혈증은 감염 후 2일부터 11일째에 수득된 혈청에서 측정되었다(베로 셀의 용균반 분석에 의함). 클론 E 또는 클론되지 않은 바이러스가 각각 접종된 원숭이의 3/4 및 2/4에서 바이러스혈증이 나타난 반면(표 8), DEN1 PMS 바이러스가 접종된 모든 원숭이들(그룹 3)은 바이러스혈증을 나타냈다. 그룹 3 원숭이(DEN1 PMS) 체내에서 바이러스혈증의 평균 피크 바이러스가(virus titer: 2.5log₁₀PFU/ml) 및 지속성(8.5일)이 그룹 1 및 2보다 현저하게 높았다(각각, p=0.024 및 0.0002 피크 바이러스가 및 지속성). 일부 원숭이에서는 바이러스혈증이 없음에도 불구하 고, 모든 원숭이들이 동종(homologous) 바이러스에 대하여 중화 항체가를 갖게 되었다. 중화 분석에서, 각 원숭이 그룹으로부터 나온 혈청들은 열에 의해 불활성화되고, 동종 바이러스와 혼합되었다(각 그룹의 동물 접종에 사용되어온 것과 동일한 바이러스). 바이러스혈증 농도가 일정함에도 불구하고, PMS 바이러스(돌연변이 없음)로 면역화된 원숭이 체내의 중화가는 다른 2 그룹(p=0.0002)보다 높았다. 그룹 1 원숭이의 혈청(엔벨로프 단백질, prM 및 E에 2개의 돌연변이를 갖는 DEN1 키메라로 면역화됨)은 가장 낮은 중화가(표 9)를 나타내었고, M39 돌연변이가 바이러스에 의해 추가적으로 약독화(p=0.0045)될 수 있음을 보여주었다. 이러한 실험들은 ChimeriVax^TM-DEN 바이러스와 1)원숭이 내에서의 바이러스혈증 및 중화 항체가 농도의 최대값, 및 2) 마우스에 대한 키메라의 신경발병력 및 원숭이 내에서의 바이러스혈증/면역원성의 직접적인 관련을 나타낸다(클론 E가 4일된 쥐에서 약독화되었고, PMS 바이러스보다 낮은 농도의 바이러스혈증 및 중화 항체가를 유도하였으며, 동일하게 4일된 쥐에서 신경발병력을 나타내었다).

요약하면, ChimeriVax^TM-DEN1에서의 돌연변이는 바이러스혈증 및 중화 반응에서 본 것처럼, 척추동물 숙주에서의 DEN1의 복제를 조절한다. 따라서 모든 뎅기 혈청형(표 10)에서 보존되는 이러한 잔기들의 돌연변이는 인간의 뎅기 백신에 적합한 원하는 표현형을 갖는 키메라의 제작에 사용될 수 있다.

Claims

황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질(non-structural proteins)을 코딩하는 서열들과 뎅기 바이러스의 예비-멤브레인(pre-membrane) 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하고, 여기서 상기 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들은 플라비바이러스의 내장기관친화성(viscerotropism)을 감소시키는 엔벨로프 단백질 힌지 영역(hinge region) 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 및 상기 내장기관친화성(viscerotropism)을 감소시키는 돌연변이는 뎅기 바이러스의 엔벨로프 단백질의 아미노산 202(뎅기-3), 또는 204 (뎅기-1, 뎅기-2, 및 뎅기-4)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산에서의 돌연변이인 플라비바이러스.
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제 1항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 황열병 바이러스 백신 균주 YF17D인 것을 특징으로 하는 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 뎅기 바이러스는 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3, 또는 뎅기-4 바이러스인 것을 특징으로 하는 플라비바이러스.
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제 1항에 있어서, 상기 뎅기 엔벨로프 단백질에서의 상기 돌연변이는 아미노산 위치 202 또는 204에 있는 라이신(lysine)의 치환인 것을 특징으로 하는 플라비바이러스.
제 7항에 있어서, 상기 라이신은 아르기닌(arginine)에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 플라비바이러스.
상기 제 1항, 제4항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 하나의 항의 플라비바이러스 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 백신 조성물은 환자에 있어서 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위해 사용되는 것임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 환자는 상기 플라비바이러스에 감염되지 않고, 감염될 위험이 있는 상태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 환자는 상기 플라비바이러스에 감염된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
플라비바이러스에 내장기관친화성(viscerotropism)을 감소시키는 돌연변이를 유도하는 방법을 포함하는 플라비바이러스 백신의 생산 방법으로서, 상기 돌연변이가 도입되는 플라비바이러스는 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질(non-structural proteins)을 코딩하는 서열들과 뎅기 바이러스 또는 일본 뇌염 바이러스의 예비-멤브레인(pre-membrane) 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하고, 여기서 상기 내장기관친화성(viscerotropism)을 감소시키는 돌연변이는 뎅기 바이러스의 엔벨로프 단백질의 아미노산 202(뎅기-3), 또는 204 (뎅기-1, 뎅기-2, 및 뎅기-4)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산에서의 돌연변이이거나 또는 일본 뇌염 바이러스의 아미노산 279에서의 돌연변이인 키메라 플라비바이러스 백신의 생산 방법.
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제 9항에 있어서, 상기 백신 조성물은

(i) 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질을 코딩하는 서열들과 뎅기-1 바이러스의 멤브레인 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하는 키메라 바이러스;

(ii) 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질을 코딩하는 서열들과 뎅기-2 바이러스의 멤브레인 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하는 키메라 바이러스;

(iii) 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질을 코딩하는 서열들과 뎅기-3 바이러스의 멤브레인 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하는 키메라 바이러스; 및

(iv) 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질을 코딩하는 서열들과 뎅기-4 바이러스의 멤브레인 및 엔벨로프 단백질을 코딩하는 서열들을 포함하는 키메라 바이러스를 포함하는 4가 백신(tetravalent vaccine)이고,

여기서 상기 키메라 바이러스 가운데 하나 이상은 내장기관친화성을 감소시키는, 엔벨로프 아미노산 202(뎅기-3) 또는 204 (뎅기-1, 뎅기-2, 및 뎅기-4)에서의 돌연변이를 포함하는 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스는 뎅기-1 바이러스인 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스는 뎅기-2 바이러스인 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스는 뎅기-3 바이러스인 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스는 뎅기-4 바이러스인 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 각각의 키메라 바이러스가 상기 돌연변이를 포함하는 백신 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 아미노산 202 또는 204에서의 라이신의 치환인 백신 조성물.
제 22항에 있어서, 상기 라이신이 아르기닌으로 치환된 백신 조성물.
키메라 플라비바이러스와 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 키메라 플라비바이러스는 황열병 바이러스의 캡시드 및 비구조 단백질(non-structural proteins)과 일본 뇌염 바이러스의 예비-멤브레인(pre-membrane) 및 엔벨로프 단백질을 포함하고, 상기 플라비바이러스의 엔벨로프 단백질 힌지 영역의 279 위치에서의 돌연변이를 포함하며, 상기 돌연변이가 플라비바이러스의 내장기관친화성(viscerotropism)을 감소시키는 백신 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 돌연변이가 치환인 백신 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 치환이 메티오닌의 라이신으로의 치환인 백신 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 돌연변이가 결실인 백신 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 황열병 바이러스 균주 YF17D인 백신 조성물.
제24항에 있어서, 상기 돌연변이가 도입된 일본 뇌염 바이러스는 SA 14-14-1 백신 균주인 백신 조성물.
제24항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 황열병 바이러스 백신 균주 YF17D이고, 여기서 상기 일본 뇌염 바이러스는 일본 뇌염 백신 균주 SA 14-14-1이고, 돌연변이는 엔벨로프 힌지 영역에서의 메치오닌의 라이신으로의 치환인 백신 조성물.
제24항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 환자에 있어서 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위해 사용되는 백신 조성물.
제31항에 있어서, 상기 환자는 상기 플라비바이러스에 감염되지 않고, 감염될 위험이 있는 상태인 백신 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 환자는 플라비바이러스에 감염된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제24항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료용인 백신 조성물.
제 24항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 0.1 내지 1.0 ml 도스 용적 내에 10²과 10⁷ 사이의 용균반-형성 단위의 양으로 사용되는 백신 조성물.
제 35항에 있어서, 상기 백신 조성물이 근육내 투여용인 백신 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 백신 조성물이 단일 용량(dose)으로 투여되거나, 또는 (ii) 1차 접종에 이어 추가접종 용량으로 투여되는 백신 조성물.
제 37항에 있어서, 상기 추가 접종 용량이 1차 접종에 이어 2-6개월 후에 투여되는 백신 조성물.
(a) SA14-14-2 일본 뇌염 바이러스로부터의 prM-E 유전자들을 YF17D 바이러스의 전장 cDNA(full length cDNA) 클론 내에 삽입하는 단계;

(b) 엔벨로프 힌지 영역의 279 위치의 메치오닌을 라이신으로 치환하는 단계; 및

(c) 상기 바이러스를 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 제형화하는 단계를 포함하는 제30항의 백신 조성물의 제조방법.
제 24항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항의 백신 조성물의 제조방법으로서, 상기 방법이

(a) 상기 키메라 플라비바이러스의 지놈에 상응하는 RNA 분자를 일차 세포(primary cells), 계 배아(chicken embryo), 또는 이배체세포주 내로 도입하는 단계;

(b) 상기 세포들 또는 배아들 또는 이들의 상청액으로부터 자손 바이러스(progeny viruses)를 수득하여 정제하는 단계; 및

(c) 상기 바이러스를 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 제형화하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법.
제 24항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항의 백신 조성물의 제조방법.

(a) 상기 키메라 플라비바이러스의 지놈에 상응하는 핵산 분자를 이상배수체 세포 (heteroploid cells) 내에 도입하는 단계;

(b) 상기 세포가 배양된 배지로부터 자손 바이러스를 회수하는 단계;

(c) 상기 회수된 자손 바이러스를 DNA 및 RNA를 분해시키는 뉴클레아제로 처리하는 단계;

(d) 상기 뉴클레아제 처리된 바이러스를 농축하는 단계; 및

(e) 상기 바이러스를 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 제형화하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법.