CN1551782A

CN1551782A - 嵌合黄病毒载体

Info

Publication number: CN1551782A
Application number: CNA028149602A
Authority: CN
Inventors: H; H·克利恩托斯; L·奥罗斯; C·米勒
Original assignee: Acambis Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Biologics LLC
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2004-12-01
Also published as: CA2448971A1; PL371187A1; CA2448971C; ES2439724T3; WO2002102828A3; WO2002102828A2; US20030044773A1; EP1401859B1; JP2005501532A; EP1401859A2; KR100921592B1; EP1401859A4; BR0210907A; US20110014229A1; KR20040003043A; AU2002322026B2; US7569383B2

Abstract

本发明提供嵌合黄病毒载体和使用这些载体的方法，所述载体包含插入到该载体包膜蛋白中的外源肽。

Description

嵌合黄病毒载体

发明领域

本发明涉及嵌合黄病毒载体和使用这些载体的方法。

发明背景

黄病毒是小的有包膜正链RNA病毒。黄病毒蛋白是由一个长的可读框的翻译，产生多蛋白，再经由宿主和病毒蛋白酶的组合进行一系列复杂的翻译后蛋白酶切割所述多蛋白，形成成熟病毒蛋白而产生的(Amberg等，J.Virol.73：8083-8094，1999；Rice，″Flaviviridae(黄病毒科)″，载于Virology，Fields(主编)，Raven-Lippincott，New York，1995，第I卷，第937页)。该病毒结构蛋白在所述多蛋白上的排列顺序是C-prM-E，其中″C″是衣壳，″prM″是一种结合病毒包膜的M蛋白的前体，而″E″是包膜蛋白。这些蛋白位于该多蛋白的N末端区域，而非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)位于该多蛋白的C末端区域。

构建了一个包含黄热病病毒疫苗病毒株(YF 17D)的C蛋白和非结构蛋白以及减毒日本脑炎病毒病毒株(SA 14-14-2)的prM蛋白和E蛋白的嵌合黄病毒。该嵌合体被称为ChimeriVax^TM-JE，与未免疫的对照相比，显示出在经免疫的恒河猴体诱导产生抗JE的中和抗体，以及保护这些猴子在JE攻击后不发生临床性脑炎。已经表明，ChimeriVax^TM-JE符合人用疫苗的临床前安全性的要求(Monath等，J.Virol.74(4)：1742-1751，2000)。

构建了一个包含YF 17D的C蛋白和非结构蛋白以及登革-2病毒株的prM蛋白和E蛋白的类似嵌合体。该嵌合体被称为ChimeriVax-D2，与未免疫的对照相比，显示出在恒河猴体内诱导产生抗登革-2病毒的中和抗体，以及保护这些猴子在登革-2病毒攻击后不发生病毒血症。已表明，ChimeriVax-D2是安全的和遗传稳定的(Guirakhoo等，J.Virol.74(12)：5477-5485，2000)。

发明概述

本发明提供用于鉴定在嵌合黄病毒或遗传减毒黄病毒的包膜蛋白中允许外源肽插入的位点的方法。这些方法包括下述步骤：(i)将编码外源肽的核酸分子引入编码黄病毒包膜蛋白的基因中；(ii)产生一种包含由所述基因编码的包膜蛋白的黄病毒载体，其中所述包膜蛋白含有所述外源肽；和(iii)确定步骤(ii)产生的黄病毒载体是否允许所述插入。

所述黄病毒载体可以是包括例如第一种黄病毒的C蛋白和非结构蛋白以及第二种黄病毒的prM蛋白和E蛋白的嵌合黄病毒载体。所述第一种和第二种黄病毒可以选自日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus)、登革热病毒(Dengue virus)(血清型1、2、3或4)、黄热病病毒(Yellow fever virus)(例如YF 17D)、摩莱河谷脑炎病毒(Murray Valleyvirus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、西尼罗病毒(WestNile virus)、库宁病毒(Kunjin virus)、罗西欧脑炎病毒(Rocio encephalitisvirus)、伊利乌斯病毒(Ilheus virus)、蜱传脑炎病毒(ticke-borneencephalitis virus)、中欧脑炎病毒(Central European encephalitis virus)、西伯利亚脑炎病毒(Siberian encephalitis virus)、俄罗斯春夏型脑炎病毒(Russian Spring-Summer encephalitis virus)、库阿撒鲁尔森林病病毒(Kyasannur Forest Disease virus)、鄂木斯克出血热病毒(OmskHemorrhagic fever virus)、跳跃病病毒(Louping ill virus)、波瓦生病毒(Powassan virus)、勒几西病毒(Negishi virus)、阿布瑟塔罗夫病毒(Absettarov virus)、汉扎罗瓦病毒(Hansalova virus)、阿波衣病毒(Apoivirus)和Hypr病毒。

本发明载体中所插入的外源肽可包括来源于例如病毒、细菌或寄生虫病原体的抗原的表位，或者可包括来源于肿瘤相关抗原的表位。这些肽和其它肽的实例在下文提供。

按照本发明的方法例如随机通过转座子诱变，可以将所述核酸分子引入所述黄病毒的包膜基因中。另外，可例如通过分析(a)所述黄病毒载体的感染性，(b)所述载体经多次传代后所述外源蛋白序列的稳定性，(c)所述黄病毒载体的生长特性，和/或(d)所述黄病毒载体是否可以被抗所述第一种黄病毒包膜蛋白的抗体所中和，来确定本发明方法的步骤(ii)产生的黄病毒载体是否允许所述插入。本发明的方法还可以包括对所述黄病毒载体的分析与其来源的黄病毒的相似分析进行比较。

本发明也包括在其包膜蛋白中含有外源肽的黄病毒载体。所述黄病毒载体可以是包含第一种黄病毒的prM蛋白和E蛋白以及包含第二种黄病毒的C蛋白和非结构蛋白的嵌合黄病毒。所述第一种和第二种黄病毒可以选自日本脑炎病毒、登革热病毒(血清型1、2、3或4)、黄热病病毒(例如YF 17D)、摩莱河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、库宁病毒、罗西欧脑炎病毒、伊利乌斯病毒、蜱传脑炎病毒、中欧脑炎病毒、西伯利亚脑炎病毒、俄罗斯春夏型脑炎病毒、库阿撒鲁尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、勒几西病毒、阿布瑟塔罗夫病毒、汉扎罗瓦病毒、阿波衣病毒和Hypr病毒。所述黄病毒载体也可以是遗传减毒黄病毒，例如黄热病病毒YF 17D。

所述载体中所插入的外源肽可包含来源于病毒、细菌或寄生虫病原体的表位。或者，所述外源肽可包括来源于肿瘤相关抗原的表位。

本发明也包括含有上述黄病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂的药用组合物，以及通过给予患者所述组合物而将肽传递给所述患者的方法。例如当所述肽是抗原时可以进行这些方法，以诱导针对该抗原所来源的病原体或肿瘤的免疫应答。本发明也包括这些组合物在传递肽中的应用以及其在制备用于传递肽的药物中的应用。

本发明也包括含有上述黄病毒基因组的核酸分子或其互补序列。

本发明有几个优点。例如，可用于本发明的嵌合黄病毒载体是充分减毒的，所以是安全的，而且能够诱导对所述嵌合体包膜蛋白所来源的黄病毒的保护性免疫，特别是对所述嵌合体中所插入的表位的保护性免疫。新的安全性源自本发明所用的载体是嵌合载体的事实，因此消除了回复为野生型的可能性。本发明所用的载体的另一个优点是黄病毒在细胞质中复制，致使所述病毒复制策略不涉及所述病毒基因组整合到宿主细胞中，提供了一个重要的安全措施。另外，正如下面进一步讨论的，本发明的一种载体可用于传递来自一个抗原的多个表位，或者传递来源于不止一个抗原的多个表位。

根据下文的详细描述、附图和和权利要求书，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。

附图简述

图1是用JE包膜编码基因进行转座子诱变方法的示意图。

图2显示JE包膜编码基因的Tn5插入突变体的PCR分析结果。第1、2、8和10泳道显示在JE包膜内带有一个转座子的稳定克隆；第3泳道和第4泳道显示在pUC19载体内带有一个转座子的克隆；第5-7泳道和第9泳道显示在JE包膜内带有一个转座子的不稳定克隆；和第11泳道显示一个1千碱基标记。

图3显示选择突变质粒的PCR作图的结果。该分析证实JE包膜中插入片段的随机性质。第1-13泳道显示13个克隆的PCR产物，而第14泳道显示一个1千碱基标记。

图4显示根据Vero(非洲绿猴肾)细胞的转染选择的5个突变克隆的氨基酸序列。JE包膜序列以粗体表示，转座后的插入序列以下划线表示。每行中分别位于第一短划线左边和第二短划线左边的三个氨基酸组重复的序列是转座子诱变的人工产物。

图5是JE包膜糖蛋白的示意图，显示插入片段相对于该蛋白已确定构象表位的位置。箭头指示根据非洲绿猴肾细胞转染选择的5个独立JE包膜突变体的近似插入位点。括号内数字表示19个氨基酸插入片段前的JE包膜氨基酸。

图6显示cDNA的RT-PCR分析结果(2个重复)；所述cDNA是用从5个独特克隆制备的RNA转染的非洲绿猴肾细胞中提取的RNA合成的。从每个所述克隆扩增一个包括57个碱基对接头的1.9千碱基插入片段，并且证实产生了子代病毒。第1泳道是分级分离的一个1千碱基标记。第2-8泳道分别对应于克隆I-10-2、克隆I-10-3、克隆II-4-3、克隆II-4-6、克隆I-1、克隆III-6和克隆IV-8-1。

图7显示克隆I-10 cDNA在P2-P6的PCR分析结果(分别为第2-6泳道和第8-12泳道)。用JE包膜特异性引物获得左边的分级分离的样品，而用转座子特异性引物获得右边的分级分离的样品。第1泳道是分级分离的一个1千碱基标记，而第7泳道是分级分离的一个100碱基对标记。

图8显示感染性克隆I-10在P2-P6的RT-PCR产物的核苷酸序列，该序列在转染前与质粒I-10序列进行序列比对。箭头指示插入片段中有可能形成一个二硫键的两个半胱氨酸残基，可以稳定所述包膜蛋白上的肽并且将其在该分子表面展示。

图9是JE包膜糖蛋白三维结构的示意图，显示氨基酸位置287的允许位点位于中心结构域(I)和二聚化结构域(II)之间，并且似乎是表面暴露的。

图10是显示所述I-10感染性克隆生长特性的曲线图。带三角的曲线对应于转座子突变体I-10的滴度，而带方形的曲线对应于YF/JE亲代病毒的滴度。

图11是显示转座子突变体I-10的中和测定的结果。带菱形的曲线对应于与抗JE血清一起保温的样品的滴度，方形对应于与正常血清一起保温的样品，而虚线表示平均值。

图12是显示YF/JE参比的中和测定的结果。带菱形的曲线对应于与抗JE血清一起保温的样品的滴度，方形对应于与正常血清一起保温的样品，而虚线表示平均值。

详细描述

本发明提供鉴定嵌合黄病毒或遗传减毒黄病毒(例如YF 17D)的包膜蛋白中可以引入外源肽的位点的方法、具有包括所述肽的包膜蛋白的嵌合黄病毒载体以及通过给予所述载体而传递这些肽的方法，以便例如诱导针对引入肽所来源的病原体的免疫应答。这些载体、肽和方法的细节在下文提供。

嵌合黄病毒载体

可用于本发明的嵌合病毒是由第一种黄病毒(即骨架黄病毒)组成，其中所述第一种黄病毒的一种或多种结构蛋白已被第二种病毒的一种或多种相应结构蛋白所取代。例如，所述嵌合体可由第一种黄病毒组成，其中所述第一种黄病毒的prM蛋白和E蛋白已被第二种病毒的prM蛋白和E蛋白所取代。

可用于本发明的嵌合病毒可用任意组合的病毒制备。可用于本发明的特定黄病毒作为第一种或第二种病毒的实例包括蚊传黄病毒，例如日本脑炎病毒、登革热病毒(血清型1-4)、黄热病病毒、摩莱河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、库宁病毒、罗西欧脑炎病毒和伊利乌斯病毒；蜱传黄病毒，例如中欧脑炎病毒、西伯利亚脑炎病毒、俄罗斯春夏型脑炎病毒、库阿撒鲁尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、勒几西病毒、阿布瑟塔罗夫病毒、汉扎罗瓦病毒、阿波衣病毒和Hypr病毒；以及来自肝病毒属(Hepacivirus genus)的病毒(例如丙型肝炎病毒)。

在例如以下的文献中提供了可用于本发明的制备嵌合病毒的细节：美国专利申请顺序号09/007,664，09/121,587和09/452,638；国际申请PCT/US98/03894和PCT/US00/32821；和Chambers等，J.Virol.73：3095-3101，1999，每个文献都通过引用全部结合到本文中。

可用于本发明的一类嵌合病毒的一个具体实例是黄热病人类疫苗病毒株YF 17D，其中所述病毒的prM蛋白和E蛋白已被以下病毒的prM蛋白和E蛋白取代：另一种黄病毒，例如日本脑炎病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒、摩莱河谷脑炎病毒，登革热病毒或任何其它黄病毒，例如上面列出的那些黄病毒之一。例如，本发明可以使用以下的按照布达佩斯条约保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心((American Type Culture Collection)(ATCC)inManassas，Virginia，U.S.A.)并且授予保藏日为1998年1月6日的嵌合黄病毒：嵌合黄热病病毒17D/日本脑炎病毒SA14-14-2(YF/JE A1.3；ATCC保藏号为ATCC VR-2594)和嵌合黄热病病毒17D/登革热病毒2型(YF/DEN-2；ATCC保藏号为ATCC VR-2593)。

嵌合黄病毒包膜蛋白中允许位点的鉴定方法

允许外源序列插入的嵌合黄病毒包膜蛋白中的位点的鉴定如下进行。采用分子生物学的标准方法，将编码肽的核酸序列插入到包膜基因中。优选将这样的核酸序列随机插入到包膜基因中，以有助于创建一个插入突变体文库。然而，也可以将核酸序列插入到包膜基因的一个特定位点，并测试其功效。当一个特定位点已被鉴定为允许插入第一种外源序列并且最好证实其也允许插入可能例如在长度和预测的二级结构方面与所述第一种外源序列不同的第二种序列时，后一方法可能是最理想的。

例如可以采用转座子诱变方法，实现核酸序列的随机插入。例如，可以使用Tn5转座系统(Goryshin等，J.Biol.Chem.273：7367，1998)。作为一个具体的实例，可以使用由Epicentre Technologies(Madison，WI，U.S.A.)生产的EZ∷TN插入系统。下文进一步提供将该系统用于本发明中的细节。概括地说，使具有包括编码肽的序列的转座子的克隆黄病毒包膜基因经历诱变。产生在黄病毒包膜基因中包括随机整合的转座子的突变体文库，并且必要时对所述插入位点作图和/或测序。然后产生包括突变包膜基因的全长基因组RNA，并用其制备突变病毒，然后表征插入转座子的允许程度。可采用诸如测定感染性、基因组稳定性、生长特性和中和作用等方法，分析该病毒的允许程度。下文在嵌合黄病毒ChimeriVax^TM-JE(另见图1)一节中提供使用该转座子诱变系统的细节。然而，所述方法可以与任一本文所述嵌合体一起使用。

外源肽

本发明的载体可用来传递任何具有预防或治疗价值的肽或蛋白。例如，本发明的载体可用来诱导针对嵌合黄病毒包膜蛋白中插入了任何基于蛋白的抗原的免疫应答(预防性或治疗性)。优选这样的抗原不是来源于所述嵌合体的第二种黄病毒。所需要的一切就是编码所述抗原的核酸序列插入在嵌合黄病毒包膜基因的一个允许位点中，如本文所描述的。可以采用分子生物学的标准方法，将所述抗原编码核酸分子插入到嵌合体包膜基因的允许位点中，所述允许位点如本文描述的方法进行鉴定。

本发明的载体可分别包括一个表位。或者，可以将多表位插入到所述载体的一个位点(即作为多表位，其中不同的表位可以被一个柔软接头隔开，诸如氨基酸的一个多聚甘氨酸延伸)或不同位点或其任何组合。所述不同的表位可来源于一种病原体，或者可来源于不同的种和/或不同的属。

可用于本发明的抗原可来源于如病毒、细菌和寄生虫等感染性因子。例如，可使用来源于以下表2所列出的病原体的抗原。这些抗原的具体实例包括表3所列出的那些抗原。另外，可插入到本发明载体的表位的具体实例示于表4。如表4所示，本发明载体所用的表位可以是B细胞表位(即中和表位)或T细胞表位(即T辅助细胞和细胞毒性T细胞特异性表位)。

本发明的载体可用来传递除病原体来源的抗原之外的抗原。例如，本发明的载体可用来传递肿瘤相关抗原，以用于抗癌免疫疗法。本领域已知许多肿瘤相关抗原，并且可将其用于本发明中。癌症(和相应的肿瘤相关抗原)的实例如下：黑素瘤(NY-ESO-1蛋白(准确地讲是位于氨基酸位置157-165的CTL表位，)、CAMEL、MART1、gp 100、酪氨酸相关蛋白TRP1和2、和MUC1))；腺癌(ErbB2蛋白)；结肠直肠癌(17-1A、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌(PSA1和PSA3)。热激蛋白(hsp110)也可用作这样的抗原。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用编码需要免疫应答的变应反应诱导抗原表位的外源蛋白。另外，本发明的载体可包括用于靶向所述载体的配体，以将诸如抗原的肽传递至给予所述载体的受治疗者的特定细胞(例如包括所述配体的受体的细胞)。

本发明载体中所插入的肽或蛋白大小的长度范围可以例如为5-500个氨基酸，例如10-100个、20-55个、25-45个或35-40个氨基酸。可用本文描述的方法，容易地确定使用任一特定所需肽的可行性。

应用嵌合黄病毒载体传递外源肽

本发明的载体的给药量和使用方法可以容易地由本领域普通技术人员确定。所述载体可以例如与所述黄热17D疫苗相同的方式给予和配制为例如受感染鸡胚组织的澄清混悬液，或者从受所述嵌合黄热病病毒感染的细胞培养物中收获的液体。因此，本发明的载体可配制成含有100-1,000,000感染单位(例如噬斑形成单位或组织培养物感染剂量)的无菌水溶液，剂量体积为0.1-1.0ml，以通过例如肌内、皮下或皮内途径给予。此外，因为黄病毒可以能够通过粘膜途径(例如经口途径)感染人类宿主(Gresikova等，″Tick-borne Encephalitis(蜱传脑炎)″，载于：The Arboviruses，Ecology and Epidemiology，Monath(主编)，CRCPress，Boca Raton，Florida，1988，第IV卷，177-203)，所以所述载体可以通过粘膜途径给予。

当用于免疫方法时，可以将所述载体作为一级预防药给予有感染特定病原体危险的成人或儿童。所述载体也可以用作二级药物以通过刺激针对肽抗原所来源的病原体的免疫应答来治疗受感染患者。

对于疫苗应用，可以使用本领域技术人员已知的佐剂。可用于增强所述嵌合载体的免疫原性的佐剂包括例如脂质体制剂、合成佐剂例如(如QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A或聚磷腈。虽然这些佐剂通常用来增强针对灭活疫苗的免疫应答，但是它们也可以与活疫苗一起使用。在通过粘膜途径例如经口途径传递嵌合载体的情况下，可以用诸如大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)或来源于LT的突变体的粘膜佐剂作为佐剂。此外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入到所述载体中。因此，编码细胞因子如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13和IL-5的基因可以与外源抗原基因一起插入，以生产增强免疫应答或调节更特异性地针对细胞、体液或粘膜的免疫应答的疫苗。

除了用作疫苗外，正如本领域技术人员所容易理解的，本发明的载体可用于基因疗法，以将治疗基因产物引入患者的细胞中和用于癌症治疗。在这些方法中，将编码治疗基因产物的基因插入到所述载体的允许位点中。

实施例

以下实验实施例说明对ChimeriVax^TM-JE中允许位点的鉴定。本实施例中描述的方法也可与其它嵌合黄病毒一起使用，如上文描述的那些黄病毒。

所述黄热17D(YF 17D)减毒活疫苗病毒株在过去60年一直用于人类，有着良好的安全性纪录，并在给予一剂后提供长期持续的免疫。如上所述，ChimeriVax^TM-JE是重组减毒活疫苗病毒株，其中编码YF17D结构蛋白(PrME)的基因已被来自遗传减毒日本脑炎(JE)病毒SA14-14-2的相应基因所取代。负责该嵌合体胞内复制的两种衣壳和所有非结构(NS)基因都来源于所述YF 17D疫苗病毒株。如上所述，ChimeriVax^TM-JE(YF/JE)的一个感染性分子克隆先前已有描述。在下述实验中，评估ChimeriVax^TM-JE作为生物相关肽传递载体的适应性。

EZ∷TN In-Frame Linker Insertion Kit^(Epicentre)是一个用于将19个氨基酸的肽符合读框地随机插入到由克隆DNA编码的蛋白中的快速有效的方法，用于各种各样的应用。采用此方法，我们决定鉴定ChimeriVax^TM-JE的包膜基因内允许外源DNA的位点。正如下面进一步详细讨论的，对编码具有EZ∷TN的JE包膜蛋白的基因的大肠杆菌进行随机诱变，鉴定出一个携带编码所述19个氨基酸肽的57个碱基对片段的稳定插入突变体库。DNA列分析、限制性作图和PCR研究证实所述转座子的准确位置和插入的随机性质。对回复为ChimeriVax^TM-JE感染性克隆的突变JE包膜基因进行工程改造，使我们可以研究细胞培养物的感染并且提供应用重组黄病毒作为外源抗原的传递载体有价值的信息。我们鉴定出一批感染非洲绿猴肾细胞的突变克隆并且表征了其生物学特性。具体地说，我们将在细胞培养物中稳定感染克隆与亲代ChimeriVax^TM-JE嵌合体的生长特性以及其噬斑减少中和试验(PRNT)中被JE特异性多克隆抗血清中和的能力进行比较。我们鉴定出在所述JE包膜内允许外源DNA插入的位点，这些位点可以用来传递生物学有关表位。如下提供更详细的细节。

将编码JE包膜的基因克隆到pUC19中

采用Trizol试剂(Gibco BRL)，从受感染非洲绿猴肾细胞中提取YF/JE病毒RNA。在用FNOR反义引物(参见下文)合成cDNA后，用TN1.F/TN2.R引物(参见下文)通过XL-PCR扩增编码JE SA14-14-2包膜的基因，采用掺入在每个寡聚核苷5′端的KpnI和PstI识别序列，通过常规方法将其直接克隆到pUC19(New England Biologicals，NEB，U.S.A.)中，产生pJEel。用GeneAmp PCR System 2400(Perkin Elmer)进行PCR。

转座子诱变和插入位点的作图

采用EZ∷TN In-Frame Linker Insertion Kit(符合读框接头插入试剂盒)(EPICENTRE Technologies，U.S.A.)，按照生产商的说明，对pJEel进行插入诱变。所述EZ∷TN<NotI/Kan-3>转座子含有一个邻接Not I限制位点的卡那霉素抗性基因。正如下面进一步详细讨论的，在NotI消化和再连接后除去卡那霉素抗性基因，产生一个在所有三个读框中都可以被阅读的19个密码子的插入片段。

通过在加有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上进行选择，在大肠杆菌中鉴定出插入突变体。转座后对选择卡那霉素抗性克隆用TN1.F/TN2.R进行PCR，揭示出40％的克隆稳定地保持所述JE包膜中的转座子(图2)。用Tn5特异性引物TN1.F和NotI/KAN-3 RP-2，通过PCR(Pwo DNA Polymerase，Boehringer Mannheim/Roche)对插入位点作图，显示所述Tn5转座子随机插入到所述JE包膜中(图3)。根据测序和产生全长突变基因组RNA对独特克隆进行选择。

序列分析

根据非洲绿猴肾细胞的转染选出的5个突变克隆的氨基酸序列示于图4。所述插入片段相对于JE病毒包膜蛋白的已确定构型表位的位置示于图5。通过DNA测序确定所述插入位点，通过与JE包膜的预测三维结构(Kolaskar等，Virology 261：31-42，1999)进行比较，对插入片段定位。5个插入位点中有4个似乎是表面暴露的。用CEQ^TM 2000 DNA分析系统(Beckman Coulter)和CEQ 2000 Dye Terminator Cycle SequencingKit(染料终止子循环测序试剂盒)进行测序。运用SEQUENCHER^TMVersion 4.0.5(Gene Codes Corporation)，对数据进行分析。

构建含Tn5插入片段的感染性克隆

从稳定的大肠杆菌克隆中除去抗生素抗性标记，然后再连接，留下57个碱基对符合读框的插入片段，该插入片段包含一个侧翼为所述转座子的9个碱基对靶位点序列重复。含有再连接的JE包膜的样品克隆(n＝5)随后用NheI/NarI(NEB，U.S.A.)消化，以使之适合于克隆到前述两个质粒系统中，以产生全长YF/JE基因组(Chambers等，1999，参见上文)。

转录和转染

用AmpliScribeT^TM SP6 High Yield Transcription Kit(高产转录试剂盒)(EPICENTRE Technologies)，从SP6启动子，转录编码所述JE包膜的基因中含有外源DNA的线性化全长基因组DNA。在接种了非洲绿猴肾细胞的6孔板中，在LIPOFECTIN试剂(Life Technologies)存在下，用体外转录基因组RNA进行转染，然后将其保持在补充5％FBS(Hyclone)、NEAA(Life Technologies)和1％青霉素-链霉素(SigmaChemicals)的MEM(Life Technologies)中。每6天将细胞上清液(500ml)传代至新鲜细胞直到第6代(P6)，并且监测单层的细胞病变效应(CPE)。从各代的细胞单层和上清液中提取病毒RNA。

如图6所示，所有突变克隆在P2对非洲绿猴肾细胞都有感染性。具体地说，用TN1.F/TN2.R和对从细胞单层的RNA提取物合成的cDNA，通过RT-PCR扩增含有57个碱基对接头的1.9千碱基的插入片段，证实产生了子代病毒。克隆I-10从P2至P6的PCR分析显示该克隆直到P6都是稳定的，并且其在氨基酸287的插入位点允许外源DNA的插入。用JE包膜基因特异性引物(TN1.F/TN2.R)和转座子特异性引物(TN1.F/TMOS.R)，进行PCR(图7)。

确定P2-P6的RT PCR产物的DNA序列，如图8所示，各代的所述序列与原始克隆I-10的所述序列相同。有趣的是，所述I-10转座子插入片段含有有可能形成一个二硫键的两个半胱氨酸残基，该二硫键能稳定所述包膜蛋白上的所述外源肽并使之在所述分子表面展示。图9描绘了所述JE病毒包膜糖蛋白的三维结构，显示位置287位于中心结构域(I)和二聚化结构域(II)之间，并且似乎是表面暴露的。

测定转座子突变体I-10的生物学特性并与ChimeriVax^TM-JE的生物学特性进行比较。首先，测定克隆I-10的生长特性。如图10所示，所述突变感染性克隆I-10显示与ChimeriVax^TM-JE亲代相似的生长动力学，但生长滴度略低，为8e5PFU/ml，而对于YF/JE为le7PFU/ml。另外，发现所述突变感染性克隆I-10诱导非洲绿猴细胞的细胞病变效应，这与其YF/JE亲代相似。

随后进行噬斑减少中和试验(PRNT)。显示抗JE多克隆抗血清制备物能以同样浓度(1∶64,000)中和克隆I-10和ChimeriVax^TM-JE，证明外源DNA插入到所述JE嵌合体的包膜中而没有过度影响所述病毒包膜的结构完整性的可能性(图11和图12)。这些实验表明，ChimeriVaxTM-JE中所述JE包膜的氨基酸287位允许外源DNA的插入。我们也提供了氨基酸59、231、340和436位允许外源序列插入的证据。

表1-PCR引物

用于克隆到pUC19中：

TN1.F 5’-GCCGGTACCCACGATATCTCATGAAACTG-3’

TN2.R 5’-CTGCAGACCATCCCGAATTCTGGAAAATGG-3’

用于作图研究：

Not I/K AN-3 FP-2 5’-ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC-3’

Not I/K AN-3 RP-2 5’-TCCCGTTGAATATGGCTCATAAC-3’

TMOS.F 5’-CTGTCTCTTGTACACATCTTGCGGCCGC-3’

用SRPERSCRIPT ^TM II RNase H Reverse Trascriptase(Life Technologies)合成cDNA：

FNOR 5’-CCTGGGGAGAACACAAGGTTC-3’

YF 2，6-5，-AAGAGGCTTTCACTATTGATG-3’

表2-抗原/肽所来源的病原体的实例一览表

病毒：

黄病毒科(Flaviviridae)

黄热病病毒(Yellow Fever virus)

日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)

登革热病毒1型、2型、3型和4型(Dengue virus，types 1，2，3

&4)

西尼罗病毒(West Nile Virus)

蜱传脑炎病毒(Tick Borne Encephalitis virus)

丙型肝炎病毒(如基因型1a、1b、2a、2b、2c、3a、4a、4b、4c

和4d)(Hepatitis C virus(e.g.，genotypes la，1b，2a，2b，2c，3a，4a，

4b，4c，and 4d)

乳头多瘤空泡病毒科(Papoviridae)

乳头瘤病毒(Papillomavirus)

逆转录病毒科(Retroviridae)

人免疫缺陷病毒I型(Human Immunodeficiency virus，type I)

人免疫缺陷病毒II型(Human Immunodeficiency virus，type II)

猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency virus)

人嗜T淋巴细胞病毒I型和II型(Human T lymphotropic virus，

types I&II)

嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

小RNA病毒科(Picornaviridae)

甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)

鼻病毒(Rhinovirus)

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)

疱疹病毒科(Herpesviridae)

单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus，type I)

单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex virus，type II)

巨细胞病毒(Cytomegalovirus)

EB病毒(Epstein Barr virus)

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus)

披膜病毒科(Togaviridae)

甲病毒(Alphavirus)

风疹病毒(Rubella virus)

副粘病毒科(Paramyxoviridae)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)

副流感病毒(Parainfluenza virus)

麻疹病毒(Measles virus)

腮腺炎病毒(Mumps virus)

正粘病毒科(Orthomyxoviridae)

流感病毒(Influenza virus)

线状病毒科(Filoviridae)

马尔堡病毒(Marburg virus)

埃博拉病毒(Ebola virus)

轮状病毒科(Rotoviridae)

轮状病毒(Rotavirus)

冠状病毒科(Coronaviridae)

冠状病毒(Coronavirus)

腺病毒科(Adenoviridae)

腺病毒(Adenovirus)

弹状病毒科(Rhabdoviridae)

狂犬病毒(Rabiesvirus)

细菌：

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli)

肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli)

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

艰难梭菌(Clostridium difficile)

破伤风梭菌(Clostridium tetani)

酿脓链球菌(Streptococccus pyogenes)

百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)

淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoea)

嗜肺军团菌(Legionella neumophilus)

Clamydial spp。

嗜血菌(Haemophilus spp.)

志贺氏菌(Shigella spp.)

寄生虫：

疟原虫(Plasmodium spp.)

血吸虫(Schistosoma spp.)

锥虫(Trypanosoma spp.)

弓形虫(Toxoplasma spp.)

隐孢子虫(Cryptosporidia spp.)

肺囊虫(Pneumocystis spp.)

利什曼原虫(Leishmania spp.)

表3-从表中所列病毒中选择抗原的实例

病毒抗原

黄病毒科

黄热病病毒核衣壳，M和E糖蛋白

日本脑炎病毒 ″

登革热病毒1型、2型、3型和4型 ″

西尼罗病毒 ″

蜱传脑炎病毒 ″

丙型肝炎病毒核衣壳，E1和E2糖蛋白

乳头多瘤空泡病毒科

乳头瘤病毒 L1和L2衣壳蛋白，E6和

E7转化蛋白(原癌基因)

逆转录病毒科

人免疫缺陷病毒I型 gag，pol，vif，tat，vpu，env，

nef

人免疫缺陷病毒II型 ″

猿猴免疫缺陷病毒 ″

人嗜T淋巴细胞病毒I型和II型 gag，pol，env

表3-来自所列病毒/抗原的B和T细胞表位的实例

病毒抗原表位位置序列(5′-3′)

黄病毒科

丙型肝炎病毒核衣壳 CTL 2-9 STNPKPQR

35-44 YLLPRRGPRL

41-49 GPRLGVRAT

81-100 YPWPLYGNEGCGWAGWLLSP

129-144 GFADLMGYIPLVGAPL

132-140 DLMGYIPLV

178-187 LLALLSCLTV

E1糖蛋白 CTL 231-250 REGNASRCWVAVTPTVATRD

E2糖蛋白 CTL 686-694 STGLIHLHQ

725-734 LLADARVCSC

489-496 CWHYPPRPCGI

569-578 CVIGGVGNNT

460-469 RRLTDFAQGW

621-628 TINYTIFK

B细胞 384-410 ETHVTGGNAGRTTAGLVGLL

TPGAKQN

411-437 IQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGW

441-460 LFYQHKFNSSGCPERLASCR

511-546 PSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDV

FVLNNTRPPL

T辅助细胞 411-416 IQLINT

乳头多瘤空泡病毒科

HPV 16 E7 T辅助细胞 48-54 DRAHYNI

CTL 49-57 RAHYNIVTF

B细胞 10-14 EYMLD

38-41 IDGP

44-48 QAEPD

HPV 18 E7 T辅助细胞 44-55 VNHQHLPARRA

81-90 DDLRAFQQLF

序列表

<110>Acambis，Inc.

<120>Chimeric Flavivirus Vectors

<130>

<150>PCT/US02/17374

<151>2002-05-31

<150>60/295,265

<151>2001-06-01

<160>42

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>1

gccggtaccc acgatatctc atgaaactg 29

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>2

ctgcagacca tcccgaattc tggaaaatgg 30

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>3

acctacaaca aagctctcat caacc 25

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>4

tcccgttgaa tatggctcat aac 23

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>5

ctgtctcttg tacacatctt gcggccgc 28

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>6

cctggggaga acacaaggtt c 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>7

aagaggcttt cactattgat g 21

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>8

Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg

1 5

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>9

Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu

1 5 10

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>10

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr

1 5

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>11

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp

1 5 10 15

Leu Leu Ser Pro

20

<210>12

<211>16

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>12

Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu

1 5 10 15

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>13

Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val

1 5

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>14

Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val

1 5 10

<210>15

<211>20

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>15

Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Val Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Ala Thr Arg Asp

20

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>16

Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln

1 5

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>17

Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys

1 5 10

<210>18

<211>11

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>18

Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile

1 5 10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>19

Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr

1 5 10

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>20

Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala Gln Gly Trp

1 5 10

<210>21

<211>8

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>21

Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys

1 5

<210>22

<211>20

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>22

Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu

1 5 10 15

Val Gly Leu Leu

20

<210>23

<211>7

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>23

Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn

1 5

<210>24

<211>27

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>24

Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala

1 5 10 15

Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp

20 25

<210>25

<211>20

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>25

Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu

1 5 10 15

Ala Ser Cys Arg

20

<210>26

<211>26

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>26

Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr

1 5 10 15

Tyr Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val

20 25

<210>27

<211>10

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>27

Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu

1 5 10

<210>28

<211>6

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒

<400>28

Ile Gln Leu Ile Asn Thr

1 5

<210>29

<211>7

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株16

<400>29

Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile

1 5

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株16

<400>30

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210>31

<211>5

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株16

<400>31

Glu Tyr Met Leu Asp

1 5

<210>32

<211>4

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株16

<400>32

Ile Asp Gly Pro

1

<210>33

<211>5

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株16

<400>33

Gln Ala Glu Pro Asp

1 5

<210>34

<211>11

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株18

<400>34

Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala

1 5 10

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒株18

<400>35

Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe

1 5 10

<210>36

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>36

Thr Ser Pro Ser Ser Thr Cys Leu Leu Tyr Thr Ser Cys Gly Arg Leu

1 5 10 15

Met Cys Thr Arg Asp Ser Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu

20 25 30

Leu

<210>37

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>37

Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Ser Cys Thr His Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Arg Cys Val Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Gly

20 25 30

His

<210>38

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>38

Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Leu Leu Tyr Thr Ser Cys Gly Arg Leu

1 5 10 15

Met Cys Thr Arg Asp Ser Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr

20 25 30

Asp

<210>39

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>39

Gly Gly Val Phe Asn Ser Cys Leu Leu Tyr Thr Ser Cys Gly Arg Leu

1 5 10 15

Met Cys Thr Arg Asp Ser Phe Asn Ser Ile Gly Arg Ala Val His Gln

20 25 30

Val

<210>40

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>40

Thr Glu Lys Phe Ser Phe Cys Leu Leu Tyr Thr Ser Cys Gly Arg Leu

1 5 10 15

Met Cys Thr Arg Asp Ser Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Val Asp Thr

20 25 30

Gly

<210>41

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>41

ggagtactca agctctgtct cttgtacaca tcttgcggcc gcaagatgtg tacaagagac 60

agactcaagc tcagtga77

<210>42

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>42

Glu Tyr Ser Ser Ser Val Ser Cys Thr His Leu Ala Ala Ala Arg Cys

1 5 10 15

Val Gln Glu Thr Asp Ser Ser Ser Val

20 25

Claims

1.一种方法，所述方法用于鉴定嵌合黄病毒或遗传减毒黄病毒的包膜蛋白中允许外源肽插入的位点，所述方法包括下述步骤：

(i)将一种编码外源肽的核酸分子引入到一个编码黄病毒包膜蛋白的基因中；

(ii)产生包含一种由所述基因编码的包膜蛋白的一种黄病毒载体，其中所述包膜蛋白包含所述外源肽；和

(iii)确定步骤(ii)产生的黄病毒载体是否允许所述插入。

2.权利要求1的方法，其中所述黄病毒载体是一种包含第一种黄病毒的衣壳蛋白和非结构蛋白以及第二种黄病毒的前膜蛋白和包膜蛋白的嵌合黄病毒载体。

3.权利要求2的方法，其中所述第一种黄病毒或所述第二种黄病毒选自日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、登革热病毒1型(Dengue virus 1)、登革热病毒2型、登革热病毒3型、登革热病毒4型、黄热病病毒(Yellow fever virus)、摩莱河谷脑炎病毒(Murray Valleyencephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、库宁病毒(Kunjin virus)、罗西欧脑炎病毒(Rocioencephalitis virus)、伊利乌斯病毒(Ilheus virus)、蜱传脑炎病毒(ticke-borne encephalitis virus)、中欧脑炎病毒(Central European encephalitisvirus)、西伯利亚脑炎病毒(Siberian encephalitis virus)、俄罗斯春夏型脑炎病毒(Russian Spring-Summer encephalitis virus)、库阿撒鲁尔森林病病毒(Kyasannur Forest Disease virus)、鄂木斯克出血热病毒(OmskHemorrhagic fever virus)、跳跃病病毒(Louping ill virus)、波瓦生病毒(Powassan virus)、勒几西病毒(Negishi virus)、阿布瑟塔罗夫病毒(Absettarov virus)、汉扎罗瓦病毒(Hansalova virus)、阿波衣病毒(Apoivirus)和Hypr病毒，并且所述第一种和第二种黄病毒载体是不同的黄病毒。

4.权利要求1的方法，其中所述外源肽包含一种来源于病毒、细菌或寄生虫病原体的抗原的表位，或者包含一种来源于肿瘤相关抗原的表位。

5.权利要求1的方法，其中通过转座子诱变将所述核酸分子随机引入到所述包膜基因中。

6.权利要求1的方法，其中采用以下分析确定由步骤(ii)产生的所述黄病毒载体是否允许所述插入：(a)所述黄病毒载体的感染性，(b)所述载体经多次传代后所述外源蛋白序列的稳定性，(c)所述黄病毒载体的生长特性，或(d)所述黄病毒载体是否可被抗所述第一种黄病毒的所述包膜蛋白的抗体所中和。

7.权利要求6的方法，所述方法还包括将对所述黄病毒载体的分析与对其来源的黄病毒的相似分析进行比较。

8.权利要求1的方法，其中所述遗传减毒黄病毒是黄热病病毒YF 17D。

9.一种黄病毒载体，所述黄病毒载体包含一种含外源肽的包膜蛋白。

10.权利要求9的黄病毒载体，其中所述载体是一种包含第一种黄病毒的prM蛋白和E蛋白以及第二种黄病毒的C蛋白和非结构蛋白的嵌合黄病毒。

11.权利要求10的黄病毒载体，其中所述第一种黄病毒或所述第二种黄病毒选自日本脑炎病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、登革热病毒3型、登革热病毒4型、黄热病病毒、摩莱河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、库宁病毒、罗西欧脑炎病毒、伊利乌斯病毒、蜱传脑炎病毒、中欧脑炎病毒、西伯利亚脑炎病毒、俄罗斯春夏型脑炎病毒、库阿撒鲁尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、勒几西病毒、阿布瑟塔罗夫病毒、汉扎罗瓦病毒、阿波衣病毒和Hypr病毒。

12.权利要求9的黄病毒载体，其中所述外源肽包含一种来源于病毒、细菌或寄生虫病原体的抗原的表位，或者包含一种来源于肿瘤相关抗原的表位。

13.权利要求9的黄病毒载体，其中所述载体肽包含一种遗传减毒黄病毒。

14.权利要求13的黄病毒载体，其中所述遗传减毒黄病毒是黄热病病毒YF 17D。

15.一种药用组合物，所述药用组合物包含权利要求9的黄病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂。

16.权利要求15的药用组合物在将肽传递给患者中的应用。

17.权利要求16的应用，其中所述肽是一种抗原，并且给予所述组合物以诱导针对所述抗原来源的病原体或肿瘤的免疫应答。

18.一种核酸分子或其互补序列，所述核酸分子包含权利要求1的黄病毒的基因组。