CN101065145A - 嵌合g蛋白基狂犬疫苗 - Google Patents

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Abstract

根据策略设计了狂犬病毒的新型嵌合包膜蛋白质，以在转基因植物中高水平表达嵌合G蛋白。根据理论设计基因并化学合成以编码嵌合G蛋白并以高水平在植物组织中被表达。在转基因烟草植物中表达该基因以检测其针对狂犬病毒的感染的治疗效率。该嵌合G蛋白在植物膜中被富集。使用植物叶表达的G蛋白对BalbC小鼠进行免疫。商业上可以获得的灭活狂犬病毒疫苗作为阳性对照。植物衍生的嵌合G蛋白与商业的疫苗相比引起更高的免疫反应。当使用活病毒攻击小鼠时，小鼠表现了保护性的免疫。在植物叶中以高水平表达的嵌合G蛋白被证明作为商业上可以获得有价值的针对狂犬病毒感染的亚单位疫苗发挥功能。其对于控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病非常有价值。进一步，这类转基因植物的可食用部分或者被纯化的蛋白也可以用作口服疫苗。

Description

嵌合G蛋白基狂犬疫苗
发明领域
本发明涉及重组嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物组织中表达的SEQID No 1及其部分或其变体。
更具体的，本发明涉及SEQ ID No 2嵌合基因，其编码具有SEQ ID No 1的嵌合G蛋白基狂犬疫苗。
本发明还涉及产生大规模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的方法。
更具体的，本发明涉及对对象进行狂犬病的疫苗接种的方法。
发明的背景和现有技术
可以参考WHO，1989，WHO的狂犬病专家委员会：WHO技术报告(WHOTechnical Report)，WHO，Geneva，其报道狂犬病是最重要和广泛传播的人兽互传的疾病，并且除了少数国家外，狂犬病是真正的全球性问题。狂犬病是可怕的疾病，是人类已知的最古老的疾病之一。狂犬病由于被感染的动物的咬伤或者粘膜暴露而传播。一旦出现该症状，其被证明是致命的。
可以参考Holmes等人，2002；″Genetic Constraints and the AdaptiveEvolution of Rabies Virus in Nature″Virology 292，247-257，他们使用分子进化方法研究自然界中狂犬病病毒的适应。他们的分析揭示，与在被进行实验室传代的病毒中所观察到的非同义进化的高速率相反，天然病毒分离物的核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因的DNA序列是高度保守的，特别是在非同义位点。作为该观点的证据，Charlton等人，1997.″The long incubation period in rabies：Delayed progression of infection in muscle at the site of exposure″，ActaNeuropathologica.94，73-77报道，尽管狂犬病病毒具有强趋向神经性，但是体内的复制不会仅仅发生在神经细胞中。具体的，所述病毒在肌肉组织中复制，还在进入外周和中枢神经系统以及唾腺和其他非神经组织之前在接种的位置复制。这样的过程已经被Morimoto等人，1996.″Characterization of a uniquevariant of bat rabies virus responsible for newly emerging human cases in NorthAmerica″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，5653-5658所记载，其说明病毒糖蛋白(G)序列中的体外取代在狂犬病毒的细胞培养中积聚，并改变对神经组织的趋向性，进而改变了毒性。这表现了病毒的适应过程，这也在Kissi等人，1999″Dynamics of rabies′virus quasispecies during serial passages in heterologoushosts″，J.Gen.Virol.80，2041-2050的研究中所强调的，他们观察到来自由不同寄主物种传代的病毒的编码G蛋白的基因中的实质的遗传变化。
可以参考Patrick等人，1987.美国专利4,707,356，其中肽疫苗需要确定病毒上的抗原决定簇，其具有在不同株中高度保守的序列。发现了狂犬病毒包被糖蛋白的片断，其具有与箭毒样蛇毒神经毒素片段的保守序列同源的序列，所述片段包括所述毒素被认为是通过其结合到位于神经肌肉结合处的乙酰胆碱受体结合位点(AchR)的片断。Lentz等人在Science 226，847-848(1984)″Aminoacid sequence similarity between rabies virus glycoprotein and snake venomcuraremimetic neurotoxins″中报道狂犬病毒在神经肌肉结合处通过结合到在该结合处的乙酰胆碱受体上而聚集。Lenz等人所报道的发现是狂犬病毒在神经肌肉结合处的结合可以通过将含有这类结合的组织与已知会紧密结合到AchR的乙酰胆碱(Ach)结合位点的箭毒样蛇毒神经毒素，α-金环蛇毒素进行预孵育而阻断。
可以参考Dietzschold等人，1979.″Rabies virus strain.A comparative studyby polypeptide analysis of vaccine strain with different pathogenic patterns″Virology 98 63-75，其中通过胰蛋白酶肽分析检测了狂犬病毒株ERA、HEP、CVS和PM(血清型I)和Mokola(血清型3)的五个组成多肽，并揭示了在Mokola和四个血清型1株之间的共同相似性，而胰蛋白酶疫苗株的全面比较说明CVS和PM互相之间比与ERA或HEP是更接近的。
可以参考Slater 1977年8月9日美国专利4,040,904″Novel 30 rabies virusvaccine and processes″，其中狂犬病毒的ERA株衍生自SAD病毒株，其最初分离自患有狂犬病的狗，并在小鼠的脑和仓鼠肾细胞中进行传代，接着使其适应原代猪肾组织培养。狂犬病毒的ERA株的样品于1964年10月29日被保存在American Type Culture Collection，Washington，D.C.，并且记录为号码VR332。含有适应原代猪肾组织培养的疫苗被广泛应用于对包括狗、猫和家畜各种动物物种进行对狂犬病的免疫。根据该发明，提供了具有显著可再生引起细胞病变能力的狂犬病毒的改进的削弱株。用于该发明的改进的狂犬病毒株是从狂犬病毒的ERA株制备的。ERA狂犬病株已经被Abelseth，M.K.在″Propagationof Rabies virus in Pig Kidney Cell Culture″，Can.Vet.J.584-87(1964)以及Abelseth，M.G.，″An Attenuated Rabies Vaccine for Domestic Animals Produced inTissue Culture″，Can.Vet.J.5279-286(1964)中所鉴定，其衍生自被Fenje，P.在″Propagation of Rabies Virus in Cultures of Hamster Kidney Cells″.Can J.Microbiol，6379-484中所描述的狂犬病毒。
可以参考Thoulouze等人，1997，″Rabies virus infects mouse and humanlymphocytes and induces apoptosis″in Journal of Virology 71：10：7372-7380，他们表示狂犬病毒感染小鼠脾淋巴细胞和人类T淋巴细胞细胞系。Jurkat发现削弱的狂犬病毒株ERA比CVS更有效地感染共激活的脾细胞和T细胞系，其中CVS是高度神经毒性的狂犬病毒株，并且报道与CVS相反，ERA狂犬病毒和其他被削弱的病毒刺激强免疫反应，并能够是有效的活疫苗。失活和被削弱的病毒被用于进行免疫，但生产灭活病毒的成本是主要问题。第二，这样的疫苗应该是被完全灭活的，为了这样的目标，首要的是候选疫苗应该是病毒的无毒力株，但其应该是免疫原和遗传稳定的(Hooper等人，1998，Collaboration ofantibody and inflammation in the clearance of rabies virus from the CNS″inJournal of Virology；72：3711-9)。
Yang等人，1992在Journal of General Virology；73：895-900，″Basis ofneurovirulent rabies virus variant Av01 with sterotaxic brain inoculation in mice″中报道致病性不仅仅是病毒的功能，而且大大依赖于寄主的感染位置和免疫状态。尽管大部分被削弱的狂犬疫苗能够潜在地引起致命的脑脊髓炎，这暗示即使失活和被削弱的病毒仍不是进行疫苗接种的可靠来源。
可以参考Coslett等人，1980，″The structural proteins of rabies virus andevidence for their synthesis from separate monocistronic RNA species″在Journalof General Virology，49：161-180，他们报道狂犬病毒的基因组与水疱性口炎病毒的基因组是被相似组织的，其中水疱性口炎病毒被五种主要的蛋白质：核蛋白(N)、磷蛋白质(NS)和聚合酶(L)蛋白质所编码，其与基因组RNA共同形成核壳体，核壳体被含有跨膜糖蛋白G的膜(M)所包被。Conzelmann等人，1990在″Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabiesvirus SAD B19″Virology 175：485-499中克隆并测序了SAD B19狂犬病毒株的病毒基因组全核苷酸序列，其包括11,928个核苷酸，并编码五种病毒蛋白质N、NS M、G和L。这五种顺反子分别被2、5、5和24个核苷酸的基因间区域所分开。
可以参考Gaudin等人，1991″Rabies Virus Glycoprotein is a Trimer″Virology 187，627-632。他们研究了在病毒表面和经过使用去污剂溶解后的糖蛋白的低聚物结构。该研究表明该糖蛋白的原始四级结构是三聚体。然而在该研究中所使用的大部分去污剂会以单体的形式溶解G，只有CHAPS，一种两性离子去污剂能够使G以其原始的三体结构溶解，这是使用电子显微镜和去污剂溶解的G的沉降分析确定的。CHAPS溶解的G具有9S的沉降系数，而其他去污剂溶剂的G是以4S的单体形式。该研究证实了Whitt等人，1991″Membrane fusion activity，oligomerization and assembly of the rabies virusglycoprotein″in Virology 185，681-688所得到的结果，其中交联剂被用于从所克隆的cDNA研究在HeLa细胞中所表达的G。电子显微镜还说明原始的分子具有“头部”和“茎部”，并且提供了糖蛋白结构低分辨率模型的基础。
可以参考Dietzschold等人，1983″Characterization of an antigenicdeterminant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus″Proc.Natl.Acad.Sci.USA；80：70-74，他们报道糖蛋白333位置的氨基酸精氨酸在狂犬病毒的致病性中发挥了重要的作用。Benmansour等人，1991″Antigenicity of rabies virus glycoprotein″Journal of Virology：4198-4203通过利用单克隆抗体和中和抗性(MAR)突变体更精确地描述蛋白质的抗原性，而揭示抗原位置的相对重要性。在该研究中鉴定了226个中和的单克隆抗体，其中97％属于位点II和III，这首先是由Lafon等人，1990在″Human monoclonalantibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein″Journal ofGeneral Virology；71：1689-1696中所定义的。
可以参考Cox等人，1977″Rabies virus glycoprotein 11 Biological andserological characterization″ Infection Immunity 16，743-759，其中狂犬病毒的糖蛋白被鉴定为主要抗原，其诱导保护性的免疫，并诱导产生中和病毒的抗体，并提供对狂犬病毒致死力感染的免疫性。尽管对狂犬病毒感染的保护可能是许多寄主效应子相互作用的结果，但是根据Turner 1985，″Immune response afterrabies vaccination：basic aspects″Ann.Inst.Pasteur Virol.136E：453-460的研究，狂犬病毒G蛋白代表了开发亚单位疫苗的合理选择，其能够用于在人类和动物中对狂犬病进行免疫。这一方面，可以参考Cox等人，1980，″Preparation andcharacterization of rabies hemagglutinin″Infection Immunity 30，572-577。
可以参考Swamy等人，1984，″Neurological complication due to beta-propiolactone(BPL)-inactivated antirabies vaccination″Journal of theNeurological Sciences 63：1：111-128，他们研究患者中由于使用BPL疫苗进行抗狂犬病接种疫苗的并发神经症，这证明病毒不完全被β-丙内酯所失活，并可能具有健康的高风险，因为基本上所失活的狂犬病疫苗由含有被感染的动物的中枢神经组织的病毒悬浮液构成，例如兔或羊或被感染的鸭胎悬浮液。这种类型的疫苗还有另一个缺陷是，由于高含量的外源蛋白质，它们能够在注射的位点以及通常情况下引起非期望的副作用。当使用来自中枢神经组织的狂犬疫苗时，患者可能甚至会遭受具有永久损伤的神经并发症，主要由于一系列的注射对于充分保护免于狂犬病是必须的。而且，基于动物组织的疫苗可以携带类似朊病毒和类似HIV、鸡痘、疯牛病(Madcow)的病毒的传染性颗粒。
Anilionis等人1981，″Structure of the glycoprotein gene in rabies virus″Nature：294：275-278克隆了编码糖蛋白的基因，其使用从被狂犬病毒感染的BHK细胞提取的mRNA，经过寡聚(dT)纤维素色谱和蔗糖密度离心进行纯化，并确定糖蛋白cDNA的全部核苷酸序列。后来，Yelverton等人，1983在″Rabiesvirus glycoprotein analogs：biosynthesis in Escherichia coli″Science：219：614-620，在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了糖蛋白，但是该蛋白没有免疫学活性。这是因为抗原决定簇依赖于翻译后修饰例如糖侧链附加，即引入可靠的糖，因为它发生在真核细胞中，而在大肠杆菌(Escherichia coli)中达不到。各种其他的异源系统已经被用于表达狂犬糖蛋白。已经深入地试验了两种酵母以表达狂犬糖蛋白。它们是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Kelper等人，1993，Sakamoto等人，1999)和毕赤酵母(Pichia pastoris)(专利No.WO9000191，1990)。如根据使用狂犬特异性抗血清免疫印迹所检测的，酿酒酵母(Saccharomyces)转化体合成65～68kDa的多肽，它们以相同的分子量迁移作为真实狂犬病毒G蛋白种类。可以参考Sakamoto等人，1999，″Studies on thestructures and antigenic properties of rabies virus glycoprotein analogues producedin yeast cells″，Vaccine：17：205-218，其中鉴定了两种类型的狂犬病毒糖蛋白，其是在转染G-cDNA的酵母细胞中生产的。它们被称作YGI(66kDa)和YGII(56kDa)。YG1与多克隆抗G抗体反应，但不与构象抗原决定簇特异性的MAb反应。而在酿酒酵母(Saccharomyces)中表达的该蛋白质不会保护动物抵抗狂犬病毒，在毕赤酵母(Pichia)中表达的该蛋白质被宣称提供保护(WO90000191，日期1990)。然而，其细节没有被公开，毕赤酵母(Pichia)体系也没有被使用，因此毕赤酵母(Pichia)不是精选的体系。相同的G-cDNA被表达在动物细胞中，产生了单一的形式。这些结果得出结论大部分G蛋白分子不会在酵母细胞中被正常处理。Foley等人，2000″A recombinant rabiesvirus expressing vesicular stomatitis virus glycoprotein fails to protect againstrabies virus infection″Proc.Natl.Acad.Sci.：97；26：14680-14685确定了狂犬糖蛋白在保护中的重要作用，他们构建了重组RV(rRV)，其中狂犬病毒糖蛋白的胞外区和跨膜区被水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白的相应区域所替换，对免疫反应进行研究并与含有狂犬病毒糖蛋白亲代的rRV株进行比较。对两种病毒的内部病毒蛋白质相似的免疫反应说明了成功的感染，但所有接受rRV疫苗的小鼠都在挑战后存活了，而使用区域置换的rRV-VSV-G进行的免疫并没有诱导保护。这确认了狂犬病毒糖蛋白的关键和重要作用，也证明针对或狂犬病毒的免疫反应和免疫保护是两种不同的现象。
在昆虫细胞中由杆状病毒载体的狂犬糖蛋白基因表达提供了在感染48小时后达到18％总细胞蛋白质的蛋白质高产率。在一项研究中(Prehaud DH等人，1989)，编码CVS株G蛋白的基因被替换，在AcNPV多角体蛋白启动子的控制下，并以高水平通过衍生的重组病毒使用Spodoptera fugiperda细胞系所表达。昆虫衍生的蛋白质表现出稍快的电泳迁移率，因为多糖组分中的区别。通过昆虫衍生的糖蛋白进行疫苗接种，接着对小鼠进行测试，提供了延迟的死亡率，即对狂犬病的低水平保护。
在另一项研究中，Rupprecht等人(1993)证明衍生自重组杆状病毒感染的昆虫细胞的糖蛋白(ERA株)是有效地作为浣熊的口服疫苗。考虑到相对高成本的昆虫和哺乳动物细胞体系，这些不是作为开发针对狂犬病的疫苗策略的G蛋白表达的精选体系。
自从2000年，得到许可并在美国上市的某些重组痘病毒狂犬病糖蛋白基疫苗是(i)猫科(猫)狂犬病的Purevax-抵抗单种病毒的、活金丝雀痘载体(Merial.inc.)和(ii)浣熊的Raboral V-RG-口服活疫苗载体。
重组痘病毒(USPTO 5266313，1986；USPTO 05348741，1994)具有作为表达携带来自其他病毒的引起免疫抗原的基因的载体的许多有用的特征。它们容易生产并诱导细胞和体液免疫。然而，如果广泛地用于人类和动物，会有关于疫苗病毒安全性的考虑。
金丝雀痘病毒Alvac-RG(vCP65)被用作非禽类物种中的载体(Taylor等人，1995)以表达狂犬病糖蛋白G基因(USPTO 5843456日期1998)以解决关于疫苗病毒扩散到非目标种群特别是免疫受损个体。禽痘病毒也被开发为表达狂犬病糖蛋白基因的载体。禽痘病毒(金丝雀痘病毒)重组体(USPTO 6340462日期2002)经历了在非禽类细胞中的中止的复制，但能够达到表达外源基因产品以及将它们递呈给免疫系统，也没有病毒能够容易地适应在非禽类细胞中复制。体外研究已经显示在六种人类衍生的细胞系中没有检测到病毒的复制。在不存在可生产的病毒复制时，对所有的细胞系都检测到了狂犬病G蛋白的表达。在多种动物物种中测试了重组体(Alvac-RG；vCP65)的安全性和效率，接着对其进行一期临床测试，该研究显示了非复制型痘病毒作为人类中疫苗接种的载体的潜力(Fries等人，1996)。通过肌肉内和皮下路线，重组子是产生免疫的。在口服给药时，它们也是产生免疫的。
包括痘病毒(posvirus)载体的病毒载体为传播疫苗提供了方便的媒介。这还降低了从培养物中纯化蛋白质相关的成本。然而，由于安全性能的考虑，对人类有意义的病毒载体需要经历更严格的管理部门的审查才能许可。
基于细胞培养的狂犬病疫苗被限制于在细胞培养中生长病毒的无活性株。这些包括相对昂贵的人类双倍体细胞疫苗(HDCV)、纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(Verorab)以及更经济的原代鸡胚细胞培养疫苗(PCEV-Rabipur)。这些疫苗包括在细胞培养中生长的病毒。目前的生物技术方法的目标是表达狂犬病毒的包被蛋白质基因以开发安全的RGP，其能够被配置为活性疫苗。
最近几年，在细胞培养中蛋白质或者安全“亚单位疫苗”的表达是常规的方法。这类可以使用的寄主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138、幼仓鼠肾(BHK)、COS-7和MDCK细胞系。稳定的狂犬病毒糖蛋白的稳定表达被显示在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中(Burger等人，1991)。得到了全长的糖基化67K蛋白质，其与从病毒感染的细胞所分离的G蛋白质共迁移。
就大小和免疫活性而言，在不同细胞系中所表达的狂犬病糖蛋白与天然的蛋白质相似。这样产生的重组蛋白质提供了对蛋白质的生物学的理解，并提供了在选择适当的表达系统时所考虑的参数的线索。所述蛋白质是分析级的，并能够被纯化到高纯化程度。然而，基于这种方法的动物细胞系对于工业规模是非常昂贵的。为了决定通过经济上可行的替代品，该表达系统应该自身结合用于发酵罐水平放大(如在细菌中)，以及用于生产与原始形式相近似的完全糖基化蛋白质(如在细胞系中)。在植物中表达是这方面中有希望的替代品。
在包括安全性和生产系统方面，亚单位疫苗是比传统的削弱或被杀死的疫苗重要的改进。最近几年在植物中表达外源蛋白质已经成为吸引人的替代，因为其具有大量和低成本地生产重组蛋白质的潜力。在遗传工程领域最近的进展已经提供了将植物转化以表达外源基因的必要工具。农杆菌(Agrobacteriurntumefaciens)已经被证明对于将工业上有价值的外源基因表达入植物组织内是有效和高度通用的载体，正如在Hood等人(1999)″Plant-based production ofxenogenic proteins″Current Opinion in Biotechnology 10：382-386中所描述的。用于人类和动物疾病保护的疫苗包括基于植物的异种蛋白质最有竞争力的领域。在最近几年，植物作为生产外源蛋白质的表达载体的应用已经获得了关注。在植物中已经成功地表达了病毒蛋白质(HbsAg、Norwalk病毒壳体蛋白质、狂犬病糖蛋白、FMDV结构蛋白质VP1)、细菌毒素(LTB)、抗体分子和许多其它的工业和治疗上重要的蛋白质(Tacket等人，2000；Kong等人，2001)。在多数情况中，所表达的蛋白质作为抗原或者在配体识别中是完全功能的。重要的是，它们能有效地引起特定的免疫反应。在植物中生产免疫原可以是比基于动物细胞的生产体系用于开发疫苗的经济的替代。使用植物系统表达治疗上重要的蛋白质的最大的优点是在从植物制备的蛋白质制剂中，不存在人类或者动物病原体例如HIV、Fowl Fox、Mad Calf、朊病毒。而另一种可能是利用植物材料直接作为食物，这样产生可以食用的疫苗。尽管，对高水平蛋白质积聚、翻译后蛋白质修饰和下游处理有许多研究的范围，但是已经进行了充分的进展以引起在植物作为有力和经济上可行的体系的兴趣。
植物对阳光、水和矿物的简单需求使它们成为正确处理和表达能够是相当复杂的蛋白质的廉价工具。传统的亚单位疫苗对于生产是昂贵的，并且不是热稳定的，这就要求从在从制造商到接种疫苗需要“冷链”。这限制了它们的实用性和在发展中国家中低投资的卫生保健系统中的应用。然而在植物中表达的蛋白质通常是多年稳定，例如种子蛋白质。
如果将来自植物组织的粗蛋白质提取物进行口服给药，则在转基因植物中所生产的细菌抗原(大肠杆菌E.Coli肠毒素)能够有效地使小鼠产生免疫，正如Curtiss和Cardineau，1997在″Oral immunization by transgenic plants″美国专利5,686,079以及Haq等人，1995在″Oral immunization with a recombinantbacterial antigen produced in plants″Science 268：714-716所显示的。在临床试验之后，Haq及其同事的工作显示人类对以生食品释放的抗原产生免疫反应，正如Tackett等人，1998″Immunogenicity in humans of a recombinant bacterialantigen delivered in transgenic potato″.Nature Medicine 4：607-609所提到的。
可以参考McGarvey等人，1995″Expression of the rabies virus glycoproteinin transgenic tomatoes″ Bio/technology 13：1484-1487，它们将番茄植物(Lycopersicon esculentum)改造为表达在花椰菜花叶病毒35S′启动子的控制下表达狂犬病糖蛋白(G蛋白)。该蛋白质在番茄中被表达，并在免疫沉淀后在Western印迹中表现62和60KDa的分子量，而来自在BHK细胞中生长的病毒的G蛋白被观察到为66kDa。免疫沉淀的G蛋白的量被发现为可溶性蛋白质的大约1～10ng/mg，即：0.0001％到0.001％的可溶性蛋白质。低表达水平可能是由于使用了设计得很差的基因。例如，使用了原始的编码G蛋白的基因以及其原始的信号肽。发明人没有检测G蛋白的抗原性，因此不可能评价在番茄植物中所表达的G蛋白或者在该研究中所设计的基因的生物活性及应用，特别是用于药物目的。
通过将病毒抗原决定簇表达在植物病毒的表面，接着使用重组的被修饰的病毒感染易感寄主，报道了针对疾病的植物衍生的免疫反应，例如水貂肠炎和狂犬病，可以参考Modelska等人，1998″Immunization against rabies with plant-derived antigen″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2481-2485，以及Yusibov等人，2002，″Expression in plants and immunogenicity of plant virus-basedexperimental rabies vaccine″。从组织纯化植物病毒，并为测试动物进行给药。尽管该系统是非常有效的，但是可以在载体病毒的表面表达的抗原多肽的大小被限制为37个氨基酸。因此，抗原的抗原决定簇分布是该方法所必需的。抗原的这类全面的信息通常不是可用的，特别是全长蛋白质的表达可能是唯一选择的新发现的疾病。同时，许多抗原决定簇需要被鉴定和结合在一起，因为单一的抗原决定簇可能不提供可以接受的对病原病毒的保护。而且，防泄漏可以被认为是农业水平的显著问题，特别是当使用环境稳定的病毒例如TMV时。
发明目的
本发明的主要目的是提供重组嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物组织中表达的SEQ ID No1及其部分或其变体。
本发明的另一个目的是提供SEQ ID No2嵌合基因，其编码具有SEQ IDNo1的嵌合G蛋白基狂犬疫苗。
本发明的另一个目的是提供产生大规模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的经济方法。
本发明的另一个目的是提供对对象进行狂犬病的疫苗接种的方法。
发明内容
本发明处理重组嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物组织中表达的SEQID No1及其部分或其变体，其包括：在N-末端1～26位是PR-S信号肽的氨基酸残基，接着是27～32位六个六组氨酸标签残基，33～36位是因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，542～547位是将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的六个氨基酸长的残基。本发明还涉及产生大规模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的方法以及对对象进行狂犬病的疫苗接种的方法。
附图说明
图1代表基因序列(嵌合)与文献中所报道的基因序列(原始)的对比。
图2代表氨基酸序列(嵌合)与文献中所报道的氨基酸序列(原始)的对比。
图3代表在克隆载体中的合成的新型嵌合G蛋白基因，其用于构建大肠杆菌(E.coli)植物表达载体
图4代表用于在大肠杆菌(E.coli)中表达嵌合蛋白质的大肠杆菌(E.coli)表达框，其使用合成的嵌合基因。
图5代表在本研究中用于开发转基因植物的植物表达盒。
图6代表被经腹膜内注射狂犬病毒糖蛋白的Balb/c小鼠中的抗狂犬病免疫反应。
经腹膜内注射狂犬病毒糖蛋白在Balb/c小鼠中的抗狂犬病免疫反应。表示了第二次
Figure A20058003065000151
和第三次
Figure A20058003065000152
促进后的抗体效价。PIS(免疫前血清)、CON(对照小鼠，注射磷酸盐缓冲液)、PDP(注射烟草叶的植物衍生的糖蛋白部分)、V(注射购买的Rabipur疫苗的小鼠)。在每种情况中，5只小鼠被注射。
图7代表用活狂犬病毒对大脑内攻击后的Balb/c小鼠的免疫保护
用活狂犬病毒对大脑内攻击后的Balb/c小鼠的免疫保护。图7中表示5只小鼠的免疫反应，它们被活的CVS病毒攻击，所述病毒被保存在IndianVeterinary Research Institute，Izatnagar，India，表示了被免疫接种磷酸盐缓冲液
Figure A20058003065000153
植物衍生的狂犬病毒糖蛋白 和购买的Rabipur疫苗 的小鼠的存活百分比。
发明的详细描述
因此，本发明提供了重组嵌合G蛋白，其具有在植物组织中表达的SEQ IDNo1及其部分或其变体。
在本发明的一个实施方式中，蛋白质的长度包括547个氨基酸或其部分和其变体。
在本发明的另一个实施方式中，所述蛋白质包括：在N-末端在1～26位的PR-S信号肽氨基酸残基，接着是在27～32位的六个六组氨酸标签残基，在33～36位的因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，在542～547位的将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的六个氨基酸长的残基。
进一步，本发明提供重组嵌合G蛋白基狂犬疫苗，其具有在植物组织中表达的SEQ ID No1及其部分或其变体。
在本发明的一个实施方式中，在所述疫苗中，蛋白质的长度是547个氨基酸。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗蛋白质包括：在N-末端1～26位是PR-S信号肽的氨基酸残基，接着是27～32位六个六组氨酸标签残基，33～36位是因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，542～547位是将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的六个氨基酸长的残基。
在本发明的另一个实施方式中，重组的嵌合G蛋白基因编码具有针对活狂犬病毒的免疫保护活性的蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗提供对狂犬病毒100％的免疫保护。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病。
另外，本发明还提供了SEQ ID No2嵌合基因，其编码嵌合G蛋白基狂犬病疫苗。
在本发明的一个实施方式中，SEQ ID No2嵌合基因长度为1.67kb。
本发明还提供了一组SEQ ID No.3～54的52个引物，其可以用于合成SEQID No2嵌合基因。
在本发明的一个实施方式中，所有的寡聚核苷酸被化学合成并通过酶进行融合，以得到期望的双链DNA。
另外，本发明还提供了用于在植物中产生大规模嵌合G蛋白基狂犬疫苗的经济的方法，其通过表达新型嵌合基因SEQ ID No2，以控制狂犬病，其中所述方法包括以下步骤：
a)设计和构建由重组嵌合G蛋白质构成的基因，其中具有SEQ ID No1重组嵌合G蛋白质包括在N-末端1～26位是PR-S信号肽的氨基酸残基，接着是27～32位六个六组氨酸标签残基，33～36位是因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，542～547位是将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的六个氨基酸长的残基；
b)根据理论合成1.67kb的SEQ ID No.2嵌合基因，以编码步骤(a)中所提供的嵌合G蛋白；
c)引入34个单一的限制性位点，并在步骤(b)中所得到的所述基因的上游制造HindIII和XbaI限制性位点，在所述基因的下游制造BamHI和SacI位点；
d)将从步骤c)中所得到的所述基因克隆在质粒pBluescriptII SK(+)中，并将其命名为pSA17；
e)从pSA17切出重组G蛋白质的HindIII-SacI片段；
f)使用Ti双向载体pBI101在HindIII-SacI位点连接从步骤(e)得到的片段，并将其命名为pSA5，其中Ti双向载体pBI101包括CaMV35S启动子，其具有两个增强子和Nos转录终止子；
g)通过已知的方法将从步骤(f)获得的质粒载体pSA5转化到A.tumenifaciens株LBA4404(pAL4404)。
h)将从步骤(g)中所得到的A.tumenifaciens株转化到Nicotiana tabacum(烟草)植物；
i)获得表达重组嵌合G蛋白质基因的烟草转基因植物；
j)通过分子鉴定确认在从步骤(i)中所得到的转基因植物中出现重组嵌合G蛋白质基因。
在本发明的实施方式中，狂犬病病毒株选自由ERA株、CVS株等所组成的组。
在本发明的另一个实施方式中，PR-S信号肽被其它相当的信号肽例如PR-1或任何其它信号肽所替代，这依赖于植物表达系统，以将蛋白质转运到内质网。
在本发明的另一个实施方式中，所述蛋白质的长度是547个氨基酸。
本发明的另一个实施方式中，六组氨酸残基能够被任何其它选自由具有与基质的亲和力的纤维素结合结构域、链霉亲和素琼脂糖结合结构域、谷胱甘肽-S-转移酶融合等所组成组的肽，以进行纯化。
在本发明的另一个实施方式中，四个用于切割的氨基酸残基可以被任何选自由牛肠激酶、凝血酶、因子Xa等所组成组的内切蛋白质酶替代。
在本发明的另一个实施方式中，在组氨酸残基的下游引入四个氨基酸残基的多肽可以在金属螯和亲和柱上纯化嵌合G-蛋白之后，对所述组氨酸残基进行酶切。
在本发明的另一个实施方式中，其他相似应用的氨基酸残基例如Asp AspAsp Asp Lys↓，Leu Val Pro Arg↓ Gly Ser，Ile Glu Glu Arg↓等能够替代SEQID No.1蛋白质疫苗的切割位点氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方式中，在嵌合蛋白质的C末端引入六肽以将其保持在内质网的腔内，其中任何其它的保持信号可以是同等良好的，以将嵌合的G蛋白靶向和积聚在液泡、高尔基体、微管和微粒体或其它细胞器中。
在本发明的另一个实施方式中，重组的嵌合G蛋白基因编码具有对活狂犬病毒免疫保护活性的蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病。
在本发明的另一个实施方式中，用于表达重组G蛋白基因的植物选自由烟草、玉米、豆类、蔬菜和/或其它植物和选自任何藻类的低级植物，其中豆类如鹰嘴豆、木豆、落花生，大豆、蔬菜如番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、菠菜、花椰菜、甘蓝、红辣椒、辣椒、胡萝卜。
在本发明的另一个实施方式中，新型的嵌合G蛋白质从来自转基因烟草植物的叶子的全部可溶蛋白质中被部分纯化。
在本发明的另一个实施方式中，与灭活的病毒相比，所述蛋白质的免疫原高2～4倍，如在实施例2在表3以及图6中所提供的。
在本发明的另一个实施方式中，疫苗的表达是植物中全部可溶性蛋白质的大约0.2％。
另外，本发明还提供了对对象进行接种免疫狂犬病的方法，其中所述方法包括为对象给药药物有效量的重组嵌合G蛋白基因疫苗，其中所述疫苗是在转基因植物中生产和表达的，并根据情况还同时为对象给药药物上可以接受的添加剂。
在本发明的一个实施方式中，所述对象是人类、宠物和野生生物。
在本发明的另一个实施方式中，给药植物表达的疫苗是通过选自口服、经腹膜内等途径进行的。
在本发明的另一个实施方式中，所述重组嵌合G蛋白基因疫苗被以ng～μg浓度的量进行给药，这依赖于蛋白质的纯度。μg量的数据在实施例2和3中被提供。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗对于给药是安全的。
在本发明的另一个实施方式中，当疫苗被表达在不同的植物部分和组织特别是种子、块茎、根、叶等时，所述疫苗被认为是长时间稳定的。例如已知储存在种子中的蛋白质能够稳定多年。
在本发明的另一个实施方式中，经过第2次加强剂量后，所述蛋白质的抗体效价在0.365±0.20的范围内，经过第3次加强剂量后，为0.833±0.20，如实施例2所表示的。
在本发明的另一个实施方式中，所述疫苗提供了100％的免疫保护。
本发明涉及狂犬病毒ERA株的嵌合G蛋白以及编码根据策略设计的重组蛋白质的合成基因。长度为547个氨基酸的嵌合G蛋白，这里被称作嵌合G蛋白，是根据策略设计的，其通过将狂犬病毒ERA株(EMBL：RHRBGP)的原始信号多肽(位点1～19)替换为烟草的PR-S信号肽(位点1～26)。ERA(EvelynRokitniki Abelseth)是熟知的狂犬病疫苗株，其是野生型狂犬病毒株SAD(StreetAlbama Duffering)的衍生物。SAD属于血清型I，大部分经典的狂犬病毒株都被分组到血清型I。已经确定狂犬病的ERA株在鼠大脑内致死剂量50％(MCLD50)方面作为最有效的疫苗发挥作用。其在各种组织培养细胞系中产生数量级为105-107MICLD50/0.03ml的效价。因此，ERA株的G蛋白基因被选择用于该研究。因此，为了开发基于植物的疫苗，ERA是很好的狂犬病毒株之一。相应于其它株如CVS等的基因也将适合开发基于植物的疫苗技术。
表示因子Xa的切割位点的全部六个组氨酸残基和四肽被设计在信号肽和成熟的G蛋白质之间。在嵌合蛋白质的C末端包括将嵌合蛋白质保持在内质网内的六肽。以这种方式，嵌合G蛋白包括：1～26位是烟草的PR-S信号肽的氨基酸残基，27～32位是六个组氨酸残基，33～36位是因子Xa的切割位点，37～541位是狂犬病毒ERA株的成熟G蛋白，542～547位是用于在内质网内定位的六肽。
表1：设计植物内高表达水平的编码狂犬病糖蛋白基因所遵循的参数
参数     狂犬病糖蛋白基因
    原始的     设计的
GC含量     47.5％     53.6％
TA末端密码子     30     4
CG末端密码子     11     3
带有ΔG的发夹环，其低于-4.0千卡/摩尔     22     0
公知的多聚腺嘌呤化&RNA不稳定序列(剪接位点，A/T串(string))     12     0
翻译起始环境     未知 TAAACA ATG
额外的3′密码子 不应用 编码SEKDEL的18个核苷酸
5′信号肽 原始的19个残基 26个残基烟草PRs
根据理论设计了1.67kb的核苷酸序列以编码上述嵌合G蛋白。编码这类嵌合蛋白质的基因被设计为在植物中高水平表达。每个氨基酸植物优选的密码子平均分布以辅助有效的翻译。在植物中适合达到基因高水平表达的翻译起始环境(TAAACAATGAAC)被包括在5’末端，在嵌合蛋白质阅读框的末端引入两个翻译终止密码子。以40～80bp的跨度，在基因的全部长度中均一地引入总共34个单一限制性位点。在基因的上游行成HindIII和XbaI限制性位点，在基因的下游形成BamHI和SacI以辅助其克隆。使用之间长度为10～16个碱基的缺口，将该基因分为50个重叠的寡聚核苷酸(长48～50个核苷酸)。每个寡聚核苷酸与互补链上直接相邻的寡聚核苷酸具有长度为13～18个核苷酸的重叠。互补重叠被设计为将Tm值保持在48～50℃之间。寡聚核苷酸是在DNA合成仪(Gene Assembler Special，Pharmacia，瑞典)以200纳摩的规模合成的，并在变性尿素-PAGE上被纯化。所有的50个寡聚核苷酸被连接为1.67kb的双链DNA，即这里所述的嵌合G蛋白基因，其根据Singh等人(1996)的无连接基因合成方法，如图3所表示的。使用HindIII和SacI限制性酶消化该DNA，并克隆在pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。将该质粒命名为pSA17(图3)。通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems Model 377A)对所克隆的合成DNA测序以确认所合成DNA的核苷酸序列。
构建一种框，以在大肠杆菌(E.coli)中在T7lac启动子的控制下表达经过修饰的基因。分别设计适当的引物组以扩增编码成熟G蛋白的DNA(1545bp)并形成NdeI和BamHI限制性位点。扩增质粒pSA17；使用限制性酶NdeI和BamHI对DNA进行消化，并克隆在表达载体pET-19b(Novagen，Madison WI)中。该质粒被命名为pSA33(图4)。使用构建pSA33转化大肠杆菌(E.coli)BL21DE3株。通过引入适当浓度的IPTG(1mM)表达重组的蛋白质。在37℃下进行该表达不同的时间。使用SDS PAGE上样缓冲液(loadingbuffer)将大肠杆菌(E.coli)细胞裂解，并在10％的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。大肠杆菌(E.coli)DE3 BL21(pSA33)表达具有期望分子大小(即60.65kDa)的重组蛋白质，这与使用网站 http://www.cbio.psu.edu通过蛋白质分子分析程序确定的被修饰基因的蛋白质分子量相当。这确认了G蛋白的合成基因被正确开发。
这里来所使用的，参考“嵌合G蛋白”的意思是PR-S信号肽、组氨酸标记、因子Xa的切割位点、标记内质网保持信号的成熟G蛋白，其显示了在小鼠中对活病毒挑战的高免疫保护活性。
本领域技术人员能够使用任何其它适当的植物、动物、病毒、昆虫、微生物信号肽来表达嵌合G蛋白。可以在各自的系统中表达这类蛋白质。关键的，包括组氨酸标记和因子Xa的切割位点以辅助从植物叶子提取物中纯化嵌合G蛋白。这对于免疫保护不是关键的，并且能够被其它的可替换策略所替代以辅助蛋白质纯化。在纯化之后，这类分子可以用作控制宠物、野生生物和人类中狂犬病的亚单位疫苗。同样的，可以提供这类亚蛋白疫苗，或者与DNA疫苗和/或灭活病毒的结合。这类嵌合蛋白质也可以用作口服疫苗。
根据本发明的目标，所述基因和嵌合G蛋白是有用的，并且不仅包括在植物中表达的长度为547个氨基酸的蛋白质，还包括其部分序列、变体和突变体，其具有成熟G蛋白特别是这里所举例的高免疫保护活性。这里所使用的，基因的“变体”和“变化”是指核苷酸序列，其编码相同的嵌合蛋白质，或者其编码就免疫反应和免疫保护而言在小鼠和其它动物中具有较低或者等价生物活性的嵌合蛋白。在一些氨基酸的少量变化、增加、缺失或可接受的取代能够提供等价效率的狂犬病疫苗。这里所使用的，术语“等价生物活性”是指嵌合蛋白质，其在诊断、治疗和预防的应用中具有相似或者基本相同的免疫生物或者免疫保护活性。
参考SEQ ID No1，许多其变体被认为是功能上有活性的，因为它们可以导致从一个氨基酸变化为另一个相近关联的氨基酸。这样的替代通常不导致任何蛋白质活性的影响。相似的，几个氨基酸的缺失或者增加可能不导致蛋白质功能的显著影响。表2中提供了通常不影响蛋白质功能的氨基酸替代的例子。这样的替代将几乎没有或者没有影响，特别是如果这些是在氨基酸序列中不参与蛋白质“功能”或“活性位点”的位置。
表No.2表示蛋白质中可以接受的氨基酸替代的矩阵。沿着排和列提供了氨基酸的单个字母密码
C G P S A T D E N Q H K R V N I L F Y W
  C   12   -3   -3   0   -2   -2   -5   -5   -4   -5   -3   -5   -4   -2   -5   -2   -6   -4   0   -1
  G   -3   5   -1   1   1   0   1   0   0   -1   -2   -2   -3   -1   -3   -3   -4   -5   -5   -7
  P   -3   -1   6   1   1   0   -1   -1   -1   0   0   -1   0   -1   -2   -2   -3   -5   -5   -6
S 0 1 1 1 1 1 0 0 1 -1 -1 0 0 -1 -2 -1 -3 -3 -3 -2
  A   -2   1   1   1   2   1   0   0   0   0   -1   -1   -2   0   -1   -1   -2   -4   -3   -6
  T   -2   0   0   1   1   3   0   0   0   -1   -1   0   -1   0   -1   0   -2   -3   -3   -5
  D   -5   1   -1   0   0   0   4   3   2   2   1   0   -1   -2   -3   -2   -4   -6   -4   -7
  E   -5   0   -1   0   0   0   3   4   1   2   1   0   -1   -2   -2   -2   -3   -5   -4   -7
  N   -4   0   -1   1   0   0   2   1   2   1   2   1   0   -2   0   -2   -3   -4   -2   -4
  Q   -5   -1   0   -1   0   -1   2   2   1   4   3   1   1   -2   -1   -2   -2   -5   -4   -5
  H   -3   -2   0   -1   -1   -1   1   1   2   3   6   0   2   -2   -2   -2   -2   -2   0   -5
  K   -5   -2   -1   0   -1   0   0   0   1   1   0   5   3   -2   0   -2   -3   -5   -4   -3
  R   -4   -3   0   0   -2   -1   -1   -1   0   1   2   3   6   -2   0   -2   -3   -4   -5   2
  V   -2   -1   -1   -1   0   0   -2   -2   -2   -2   -2   -2   -2   4   2   4   2   -1   -2   -6
  N   -5   -3   -2   -2   -1   -1   -3   -2   0   -1   -2   0   0   2   6   2   4   0   -2   -4
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5 2 1 -1 -5
  L   -6   -4   -3   -3   -2   -2   -4   -3   -3   -2   -2   -3   -3   2   4   2   6   2   -1   -2
  F   -4   -5   -5   -3   -4   -3   -6   -5   -4   -5   -2   -5   -4   -1   0   1   2   9   7   0
  Y   0   -5   -5   -3   -3   -3   -4   -4   -2   -4   0   -4   -5   -2   -2   -1   -1   7   10   0
  W   -1   -7   -6   -2   -6   -5   -7   -7   -4   -5   -3   -3   2   -6   -4   -5   -2   0   0   17
  C   G   P   S   A   T   D   E   N   Q   H   K   R   V   N   I   L   F   Y   W
矩阵中正数表示所提供的替代是可以接受的。负数表示是不可以接受的。例如，半胱氨酸(C)只能被其自身替代(评分＝12)，而不能被任何其它的氨基酸所替代(所有的评分都是负的，例如半胱氨酸变为甘氨酸G为-3，因此是不能被接受的)。另一方面，甘氨酸(G)能够被其自身所替代(评分5)，同时也可以被丝氨酸-S(评分1)，丙氨酸-A(评分1)和天冬氨酸-D(评分1)所替代。正值的程度暗示替代能够成功的可靠程度(Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.“A model of evolutionary change in proteins.”In“Atlasof Protein Sequence and Structure”5(3)M.O.Dayhoff(ed.)，345-352.NationalBiomedical Research Foundation，Washington.
参考SEQ ID No2以及在SEQ ID No3～54的相应引物，一些DNA序列的变体将不会造成核酸功能的变化。例如，表3给出了编码相同氨基酸的密码子列表。这类密码子在基因中可以被另外的所替代，而对基因所编码的蛋白质序列没有任何影响。
表No.3：DNA序列中可以接受的密码子的替代
氨基酸 氨基酸的单个字母密码 可以被另一个替代的DNA密码子
异亮氨酸     I  ATT，ATC，ATA
亮氨酸     L  CTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG
缬氨酸     V  GTT，GTC，GTA，GTG
苯丙氨酸     F  TTT，TTC
甲硫氨酸     M  ATG
半胱氨酸     C  TGT，TGC
丙氨酸     A  GCT，GCC，GCA，GCG
甘氨酸     G  GGT，GGC，GGA，GGG
脯氨酸     P  CCT，CCC，CCA，CCG
苏氨酸     T  ACT，ACC，ACA，ACG
丝氨酸     S  TCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC
酪氨酸     Y  TAT，TAC
色氨酸     W  TGG
谷氨酰胺     Q  CAA，CAG
天冬酰胺     N  AAT，AAC
组氨酸     H  CAT，CAC
谷氨酸     E  GAA，GAG
天冬氨酸     D  GAT，GAC
赖氨酸     K  AAA，AAG
精氨酸     R  CGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
终止密码子     终止  TAA，TAG TGA
参考文献：任何遗传学或者分子生物学的教科书，例如J.D.Watson等人的“Molecular Biology of the Gene”。
制造编码相同或者基本相同的蛋白质的替代DNA序列是本领域技术人员熟知的。这些变体DNA序列是在本发明的主题范围内。这里所使用的，引用“基本相同”的序列是指具有氨基酸替代、缺失、增加或者插入，但不实质影响免疫保护活性的序列。保持免疫保护活性的片段也被包括在这个定义之内。
这里已经具体举例了本发明主题的新型嵌合G蛋白。应该容易清楚的是本发明的主题包括具有与在植物或者植物细胞中所表达的举例的嵌合蛋白质相同或者相似免疫保护活性的变体或者等价蛋白质(以及编码等价蛋白质的核苷酸序列)。等价蛋白质与所举例的蛋白质具有氨基酸的同源性。通常这种氨基酸同源性将高于75％，优选高于90％，最优选高于95％。在嵌合蛋白质的关键区域(抗原决定簇)，这种氨基酸同源性将是最高的，该区域负责免疫保护活性，或者参与三维构象的确定，其最终负责其生物活性。在这点上，某些氨基酸替代是可以接受的并且是可以被期待的，如果这些替代是在生物活性方面不重要的区域，或者是保守的氨基酸替代的区域，这将不影响分子的三维构象。例如，氨基酸可以被分为以下类：非极性、不带电极性、碱性和酸性。通过将一个类别的氨基酸替换为相同类别的氨基酸的保守替代将落在本发明主题的范围内，只要所述替代不实质改变狂犬病G蛋白的生物学活性。表4提供了属于这些类别氨基酸的例子的列表。
表4
氨基酸类别 氨基酸的例子
非极性 Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp
不带电极性 Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln
酸性 Asp，Glu
碱性 Lys，Arg，His
在某些情况中，也可以制造非保守替代。关键的因素是这些替代不能显著降低该嵌合蛋白的生物学活性。蛋白质工程领域的技术人员熟知在许多位置进行将嵌合G蛋白的氨基酸替代为丙氨酸，因为这通常不改变蛋白质的构象。这样的替代也在本发明的范围内。
可以将本发明主题的编码嵌合G蛋白的基因引入宽范围的植物病毒载体，嵌合基因的表达导致细胞内的生产，并维持免疫保护蛋白质。这类病毒可以用作产生和纯化嵌合G蛋白的体系。适当的病毒寄主是杆状病毒(Badnavirus)、花椰菜花叶病毒、SbCMV样病毒、CsVMV样病毒、RTBV样病毒、牵牛花叶脉透明样病毒、玉米线条病毒(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒(Curtovirus)、菜豆金黄花叶病毒(Begomovirus)、苜蓿花叶病毒(Alfamovirus)或者Ilarivirus(Koprowski等人，2000：美国专利6,042,832和2002：美国专利6：448070)、Cumovirus、线形病毒组、Crnivirus、豇豆花叶病毒、蚕豆病毒(Fabavirus)、Nepovirus、马铃薯Y病毒(Potyvirus)、黑麦草花叶病毒、大麦黄花叶病毒、伴生病毒、矮化病毒(Waikavirus)、香石竹斑驳病毒(Carmovirus)、香石竹病毒(Dianthovirus)、玉米褪绿斑驳病毒、坏死病毒、番茄丛矮病毒、毛状病毒、隐潜病毒、耳突花叶病毒、真菌传杆状病毒、大麦病毒、悬钩子病毒、黄矮病毒、玉米细线病毒属、马铃薯X病毒(Potexvirus)、南方菜豆花叶病毒、纤细病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、发状病毒、芜菁黄化病毒、幽影病毒、细胞质弹状病毒、细胞核弹状病毒、番茄斑萎病毒、α隐潜病毒、β-隐潜病毒属、斐济病毒、植物呼肠孤病毒、水稻病毒以开发嵌合G蛋白的生产系统。构建植物转化载体以开发转基因植物。使用HindIII消化质粒pPK201(其具有带双增强子的CaMV35S启动子)以切出带双增强子的CaMV35S启动子。使用HindIII和SacI对质粒pSA17进行限制性消化以切除嵌合基因(图3)。进行三体连接以将上述两个片段克隆在pBI 101双向载体中(New EnglandBiolabs)。所得到的质粒即pSA5(图5)在嵌合基因的上游具有带双增强子的CaMV35S启动子，在嵌合基因的下游具有nos转录终止子。通过PstI限制性酶的消化对带有双增强子的启动子CaMV35S到嵌合基因的正确方向进行检查。nos转录终止子被克隆在嵌合基因的下游。表达框由被克隆在Ti双向载体中的具有带双增强子的启动子CaMV35S的合成基因构成。带双增强子的启动子CaMV35S的HindIII-HindIII片段被从克隆pPK201切出，嵌合G蛋白的HindIII-SacI片段被从克隆pSA17切除，并将两个片段在HindIII-SacI位点进行三体连接到Ti双向载体pBI101，其替换了质粒的HindIII-SacI(uidA基因)片断。该双向载体被命名为pSA5。为了研究该嵌合G蛋白在植物中的效率，选择烟草进行表达。根据Cangelosi等人(1991)所讨论的修改的“农杆菌Agrobacteriu电穿孔”方案，使用双向pSA5转化农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株LBA4404(pAL4404)，并在抗生素链霉素、利福平和卡那霉素上选择被转到的菌落。根据Horsch等人，1985的方法，进行农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana tabacum cv.Patit Havana)转化，并在抗生素卡那霉素上选择转基因植物。使用PCR和Southern分析确认编码嵌合G蛋白的基因的存在，使用RT-PCR确认转基因的表达，并通过利用ABIPRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystem)、Western分析和ELISA通过实时PCR分析转录子水平。Western分析显示嵌合蛋白质的表达占所选择转基因系中全部可溶性叶子蛋白质的0.2％。在该项研究中所得到的这样高水平的表达与前面所提到的McGarvey等人(1995)的报道相反。这是设计新型合成基因的结果，其中许多涉及达到植物中高表达水平的方面是被独有地使用。在本项研究中所使用的植物优选的翻译起始环境、密码子、基因序列、信号序列等已经在达到增强植物叶子中的表达方面发挥重要的作用。在这个方面，本发明的基因和构建是新型的。
通过说明的方式提供下面的实施例，因此不应当被认为限制本发明的范围。
实施例1
在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达嵌合基因
编码长度为547个氨基酸残基的嵌合G蛋白的基因，这里被称作嵌合G蛋白是根据策略设计的(SEQ ID NO.1)。将G蛋白的原始多肽区(位点1～19)替换为烟草的信号肽PR-S(位点1～26)。之后，将六肽的组氨酸氨基酸残基和含有氨基酸残基IEGR的四肽以其顺序包括在该基因的N-末端。在编码G蛋白的序列之后，将编码SEKDEL以将嵌合G蛋白保持在内质网的六肽的序列包括在该嵌合基因的C-末端(SEQ ID NO.1)。根据理论设计1.67kb的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)以编码上述所提到的嵌合G蛋白。在该设计的基因中形成许多6碱基的切割子(cutter)限制性酶位点。在所设计的基因的5’末端形成HindIII和SalI限制性位点，在其3’末端形成SacI。将该基因分为50个重叠的寡聚核苷酸(长40～58个核苷酸)。每个寡聚核苷酸与互补链上直接相邻的寡聚核苷酸具有长度为13～18个核苷酸的重叠(Tm在48～50℃之间)。寡聚核苷酸是在DNA合成仪(Gene Assembler Special，Pharmacia，Sweden)以200纳摩的规模合成的，并在变性尿素-PAGE上被纯化。所有的50个寡聚核苷酸被连接为双链DNA，即这里所述的嵌合G基因，其根据Singh等人(1996)的无连接基因合成方法。使用HindIII和SacI限制性酶消化该DNA，并克隆在pBluescriptII SK(+)(Stratagene)中。将该质粒命名为pSA17(图3中所示)。通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems Model 377A)对所克隆的合成DNA进行测序确认所合成DNA的核苷酸序列。在本研究中所设计的合成基因的核苷酸序列是新型的，并且与之前所报道的基因序列有实质性的区别。
构建一种框，以在大肠杆菌(E.coli)中在T7lac启动子的控制下表达嵌合毒素。为了这个目的，通过两个引物扩增质粒pSA17，并在扩增子的上游和下游形成NdeI和BamHI位点，并克隆在表达载体pET-19b(Novagen)中的相同位点中。该质粒被命名为pSA33(图4中所示)。DNA编码成熟嵌合G蛋白，其带有因子Xa的切割位点，以及载体编码的长度为10个组氨酸残基的标记，接着是在嵌合G蛋白上游的肠激酶位点。使用构建pSA33转化大肠杆菌(E.coli)BL21DE3株。通过引入IPTG表达嵌合G蛋白。
在37℃下进行该表达不同的时间。在SDS PAGE上样缓冲液(loadingbuffer)中将大肠杆菌(E.coli)细胞裂解，并在10％的变性胶上进行分析。SDS PAGE的结果和Western的结果显示大肠杆菌(E.coli)表达具有期望分子大小60.65kDa的重组蛋白质，这与使用网站 http://www.cbio.psu.edu通过蛋白质分子分析程序确定的无糖基化修饰的蛋白质分子量相当，这确认了合成基因即嵌合G蛋白的基因被正确开发和表达。所设计的用于在大肠杆菌(E.coli)和植物中表达的嵌合G蛋白的氨基酸序列是新型的，并且与之前所报道的蛋白质序列有实质性的区别。
实施例2
使用植物衍生的疫苗对BalbC小鼠进行免疫为了确立新型嵌合G蛋白在植物中的效率，构建了植物转化载体以开发转基因植物。使用HindIII消化质粒pPK201(其具有带双增强子的CaMV35S启动子)以切出带双增强子的CaMV35S启动子。根据在实施例1中所描述的，制备质粒pSA17，其含有克隆在BluescriptII SK+(Stratagene，La Jolla，CA)的HindIII-SacI的嵌合G蛋白。该嵌合基因依次由下列构成：烟草PRS信号肽的26个氨基酸残基，接着是6个组氨酸残基，因子Xa切割位点的四个氨基酸残基，成熟的ERA狂犬病糖蛋白的505个氨基酸残基，以及在嵌合G蛋白基因的C’末端用于保持在内质网的6个氨基酸残基(SEQ ID NO.1)。使用植物优选的密码子根据理论设计1.67Kb的序列，以达到上述嵌合G蛋白的高水平表达。将新型的翻译起始环境(TAAACA ATGAAC)包括在5’末端，两个终止密码子TGA，TGA引入到该嵌合G蛋白阅读框的末端。将该基因分成50个重叠的寡聚核苷酸，并根据Singh等人(1996)的无连接基因合成的方法连接成1.67kb的双链DNA。在基因的上游形成HindIII和XbaI限制性位点，并在基因的下游形成BamHI和SacI位点以辅助克隆。将该嵌合G蛋白克隆在BluescriptII SK+的HindIII-SacI限制性位点，进行测序并命名为pSA17。使用HindIII和SacI对克隆pSA17进行消化，以切出1.67kb的片断，其具有完成的嵌合G蛋白基因(SEQ ID NO.2)。进行三体连接以克隆两个片断，即：克隆pPK201的HindIII片断(其具有带双增强子的CaMV35S启动子)，以及具有嵌合基因的HindIII-SacI片断。将所得到的克隆命名为pSA17。将上述两个片断在HindIII-SacI三体连接到pBI101，替换(-葡糖苷酸酶框。植物表达框在嵌合基因的上游具有带双增强子的CaMV35S启动子，以及在嵌合基因的下游具有260bp的片断，其含有来自胭脂氨酸合成酶基因(Nos-ter)转录终止子的多聚腺酸化信号。该表达框具有在Nos启动子控制下的卡纳霉素抗性的NPTII基因。通过限制性分析对带有双增强子的CaMV35S的正确方向进行确认。将克隆在pBI101Ti双向载体HindIII-SacI具有正确的E-35S到嵌合G蛋白方向的表达框(具有E-35S启动子的合成嵌合G蛋白基因)命名为pSA5(如图5所示)。该构建具有多聚核苷酸序列TAAACA ATG AAC作为植物优选的翻译起始环境。在合成基因中引入两个终止密码子 TGA， TGA用于翻译的终止。根据Cangelosi等人(1991)所讨论的修改的“农杆菌Agrobacteriu电穿孔”方案，使用双向pSA5转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404(pAL4404)，并在抗生素链霉素、利福平和卡那霉素上选择被转到的菌落。根据Horsch等人，1985的方法，进行农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana tabacum cv.Patit Havana)转化，并在抗生素卡那霉素上选择转基因植物。使用PCR和Southern分析确认编码嵌合G蛋白的基因的存在，使用RT-PCR、实时PCR、Western分析和ELISA确认转基因的表达。Western结果显示毒素蛋白的表达占所选择用于这些实验的转基因系中可溶性叶子蛋白质的0.2％。这样高水平的表达使基因的新设计具体化，其中我们选择的植物优选密码子、优选翻译起始环境、内质网保持信号，以及我们设计的其他特征在表达方面发挥了重要作用。嵌合G蛋白被部分从高水平表达合成基因的烟草植物的叶子纯化。将100gm烟草的新鲜叶子在液氮中进行清洗、冷冻，使用研钵进行磨碎并捣碎，在Polytron混合仪中在冰冷的提取缓冲液{100mMTris-HCl pH8.0、150Mm NaCl、150mM山梨醇、2mM DTT、0.1％deica、1mMPMSF、0.1％亮抑酶肽、2％聚乙烯聚吡咯烷酮、0.05％植物蛋白酶抑制剂混合物(sigma)}中进行匀浆。在3ml/gm提取缓冲液中对叶组织进行匀浆。在匀浆之后，通过一层尼龙网将混合物进行过滤，并在4℃下1800xg离心5分钟。在4℃下在38000xg下将上清离心1小时。分离上清，并在冰上将沉淀溶解在缓冲液中1小时，并在4℃下38000xg离心1小时，其中该缓冲叶含有50mMTris pH8.0、2Mm DTT、2.5％甘油、1Mm PMSF、0.05％PPIC(植物蛋白酶抑制剂混合物)、1％脱氧胆酸钠。将上清上样到离子交换柱琼脂糖(SepharoseQ)快流速(fast flow)，使用低盐缓冲液(50mM tris pH8、0.1％triton X100、0.1％BME)对柱子进行清洗，通过NaCl的线性梯度对所结合的蛋白质进行洗脱。收集ELISA阳性部分，并上样在抗体亲和柱上{连接到CNBr活化的Sepharose4B的抗狂犬病人IgG(Pharmacia Biotech)}。收集ELISA阳性部分，并通过采用BSA作为标准的Bradford染色(Biorad)对蛋白质进行定量，并通过Western使用抗狂犬病马IgG抗体检测蛋白质的大小。在每组中，通过注射25(g每种膜蛋白对Balb C小鼠进行接触抗原，以及商业上可以获得的被杀死的狂犬病毒疫苗(作为正对照)即Aventis Pharma Ltd.所制备的Rabipur，以及磷酸盐缓冲液盐水(作为阴性对照)。在第7天，第14天和第28天进行三次加强注射。在第二次和第3次加强之后7天，收集血清。通过ELISA检测抗体效价(表5)，血清中抗体效价的结果被提供在表3中，并表示在图6中。这些表明植物膜蛋白质显示了在小鼠中高水平的免疫反应。与商业上可以获得的被杀死的狂犬病毒疫苗相比，其免疫原高2～3倍。
表5
被注射小鼠的总数目 第2次加强后的抗体效价 第3次加强后的抗体效价
免疫前血清     0.03   0.03
仅PBS的对照小鼠     4     0.04±0.007   0.139±0.004
富含G蛋白的转基因植物衍生的膜部分     4     0.365±0.20   0.833±0.20
商业上可以得到的疫苗(Aventis Pharina Ltd.的灭活病毒)     5     0.097±0.009   0.241±0.01
实施例3
被免疫小鼠的免疫保护分析
通过将富含G蛋白的植物膜部分注射入小鼠，并使用活狂犬病毒攻击它，来研究植物衍生的G蛋白在免疫保护中的效率。经经腹膜对小鼠进行注射转基因烟草叶的富含G蛋白的膜部分，商业上可以得到的被杀死的狂犬病毒疫苗(Aventis Pharma Ltd.的Rabipur作为阳性对照)和磷酸缓冲液盐水(作为阴性对照)。如实施例2所描述的，在第7天，第14天和第28天进行三次加强注射。在每个阶段，注射总共25μg蛋白质。第3次加强之后，使用10xLD50的活狂犬病毒通过经腹膜进行攻击小鼠，并观察综合症的出现。在攻击的第13天之后，记录下所得到的攻击，并表示在表6和图7中。
表6
小鼠的总数目 存活的小鼠 保护百分率
对照小鼠     6     0     0
富含G蛋白的植物衍生的膜部分     3     3     100％
商业上可以得到的疫苗(AventisPharina Ltd.的灭活病毒)     2     2     100％
在攻击实验之后所得到的结果清楚地表明G蛋白定位在植物细胞膜，其引起了高水平的免疫反应，并且是高度免疫保护的。
优点
本发明的主要优点是：
1.本发明提供了与灭活的病毒相比非常安全的疫苗用于控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病。
2.其不需要对活病原病毒进行操作，没有疫苗回复成具有感染性的病毒颗粒的风险。
3.狂犬病G蛋白被根据理论设计为在新型寄主中以高水平表达，所述寄主包括转基因植物和植物细胞系、如大肠杆菌和酵母的微生物、动物和动物细胞系重组动物和植物病毒。这样，不需要操作病原病毒，因为这种免疫原抗原能够被在新型寄主细胞中表达。
4.具体的，嵌合G蛋白被特别设计为在植物细胞中高水平表达。具有适当信号肽的G蛋白被制成在植物细胞的膜上积聚。可以使用相似的信号以在特异性的区室内积聚。靶蛋白在特异的细胞器例如膜上的富集能够开发较便宜和常规的方法以大规模地在动物细胞系和酵母中制备靶蛋白。
5.在N-末端设计六组氨酸标记用于进一步辅助在固定的金属亲和柱上纯化嵌合蛋白。由于针对组氨酸标记的单特异性抗体是商业上可以获得的，因此该组氨酸标记也可以用于在各种纯化的阶段鉴定并标记的嵌合蛋白质。因子Xa切割位点被包括在组氨酸标记的下游，用于如果该标记不是治疗应用中所期望，在纯化后将其切除。
6.SEKDEL保持信号被设计在C-末端，其增强嵌合G蛋白在细胞的内质网中的积聚。异源蛋白在内质网中的区室化能够增强它们的稳定性和整体的积聚。这使得纯化过程更简单和有效。进一步，膜定位防止了靶蛋白被细胞溶质中所出现的蛋白质水解酶的影响。同时，膜定位能够导致目标蛋白功能上重要的修饰。
7.与商业上可以获得的灭活的狂犬病毒疫苗相比，嵌合G蛋白所引起的免疫反应要高数倍。被免疫的动物表现出了对活病毒攻击的免疫保护作用。定位在烟草叶细胞膜中的G蛋白的高免疫反应反映了蛋白质的新型设计，因为它能够使G蛋白采用免疫活性的构象。
8.采用用于控制狂犬病的从植物纯化的嵌合G蛋白将是非常安全的，因为该疫苗制剂将不含类似HIV、禽痘、疯牛病、朊病毒等的动物病原体。
9.如果嵌合G蛋白是被表达在类似叶子、谷粒等植物的可食用部分的话，其可以用作口服疫苗。之前，如果为实验动物通过口服提供狂犬病毒，其将表现出免疫刺激/免疫保护。因此，在植物叶子中表达功能活性的狂犬病外壳G蛋白提供了开发廉价疫苗的机会，如果以种子、谷粒、植物存储组织等形式进行转运的话，其被认为是安全的，并且不需要冷链。
                            序列表
<110>COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH
<120>A CHIMERIC G PROTEIN BASED RABIES VACCINE
<130>FP 1937
<140>1502/DEL/2004
<141>2004-08-22
<160>54
<170>PATENTIN VERSION 3.3
<210>1
<211>547
<212>PRT
<213>狂犬病疫苗
<400>1
MET ASN PHE LEU LYS SER PHE PRO PHE TYR ALA PHE LEU CYS PHE GLY
1               5                   10                  15
GLN TYR PHE VAL ALA VAL THR HIS ALA ALA HIS HIS HIS HIS HIS HIS
            20                  25                  30
ILE GLU GLY ARG LYS PHE PRO ILE TYR THR ILE LEU ASP LYS LEU GLY
        35                  40                  45
PRO TRP SER PRO ILE ASP ILE HIS HIS LEU SER CYS PRO ASN ASN LEU
    50                  55                  60
VAL VAL GLU ASP GLU GLY CYS THR ASN LEU SER GLY PHE SER TYR MET
65                  70                  75                  80
GLU LEU LYS VAL GLY TYR ILE LEU ALA ILE LYS MET ASN GLY PHE THR
                85                  90                  95
CYS THR GLY VAL VAL THR GLU ALA GLU ASN TYR THR ASN PHE VAL GLY
            100                 105                 110
TYR VAL THR THR THR PHE LYS ARG LYS HIS PHE ARG PRO THR PRO ASP
        115                 120                 125
ALA CYS ARG ALA ALA TYR ASN TRP LYS MET ALA GLY ASP PRO ARG TYR
    130                 135                 140
GLU GLU SER LEU HIS ASN PRO TYR PRO ASP TYR ARG TRP LEU ARG THR
145                 150                 155                 160
VAL LYS THR THR LYS GLU SER LEU VAL ILE ILE SER PRO SER VAL ALA
                165                 170                 175
ASP LEU ASP PRO TYR ASP ARG SER LEU HIS SER ARG VAL PHE PRO SER
            180                 185                 190
GLY LYS CYS SER GLY VAL ALA VAL SER SER THR TYR CYS SER THR ASN
        195                 200                 205
HIS ASP TYR THR ILE TRP MET PRO GLU ASN PRO ARG LEU GLY MET SER
    210                 215                 220
CYS ASP ILE PHE THR ASN SER ARG GLY LYS ARG ALA SER LYS GLY SER
225                 230                 235                 240
GLU THR CYS GLY PHE VAL ASP GLU ARG GLY LEU TYR LYS SER LEU LYS
                245                 250                 255
GLY ALA CYS LYS LEU LYS LEU CYS GLY VAL LEU GLY LEU ARG LEU MET
            260                 265                 270
ASP GLY THR TRP VAL ALA MET GLN THR SER ASN GLU THR LYS TRP CYS
        275                 280                 285
PRO PRO ASP GLN LEU VAL ASN LEU HIS ASP PHE ARG SER ASP GLU ILE
    290                 295                 300
GLU HIS LEU VAL VAL GLU GLU LEU VAL ARG LYS ARG GLU GLU CYS LEU
305                 310                 315                 320
ASP ALA LEU GLU SER ILE MET THR THR LYS SER VAL SER PHE ARG ARG
                325                 330                 335
LEU SER HIS LEU ARG LYS LEU VAL PRO GLY PHE GLY LYS ALA TYR THR
            340                 345                 350
ILE PHE ASN LYS THR LEU MET GLU ALA ASP ALA HIS TYR LYS SER VAL
        355                 360                 365
ARG THR TRP ASN GLU ILE LEU PRO SER LYS GLY CYS LEU ARG VAL GLY
    370                 375                 380
GLY ARG CYS HIS PRO HIS VAL ASN GLY VAL PHE PHE ASN GLY ILE ILE
385                 390                 395                 400
LEU GLY PRO ASP GLY ASN VAL LEU ILE PRO GLU MET GLN SER SER LEU
                405                 410                 415
LEU GLN GLN HIS MET GLU LEU LEU GLU SER SER VAL ILE PRO LEU VAL
            420                 425                 430
HIS PRO LEU ALA ASP PRO SER THR VAL PHE LYS ASP GLY ASP GLU ALA
        435                 440                 445
GLU ASP PHE VAL GLU VAL HIS LEU PRO ASP VAL HIS ASN GLN VAL SER
    450                 455                 460
GLY VAL ASP LEU GLY LEU PRO ASN TRP GLY LYS TYR VAL LEU LEU SER
465                 470                 475                 480
ALA GLY ALA LEU THR ALA LEU MET LEU ILE ILE PHE LEU MET THR CYS
                485                 490                 495
CYS ARG ARG VAL ASN ARG SER GLU PRO THR GLN HIS ASN LEU ARG GLY
            500                 505                 510
THR GLY ARG GLU VAL SER VAL THR PRO GLN SER GLY LYS ILE ILE SER
        515                 520                 525
SER TRP GLU SER HIS LYS SER GLY GLY GLU THR ARG LEU SER GLU LYS
    530                 535                 540
ASP GLU LEU
545
<210>2
<211>1647
<212>DNA
<213>合成的DNA
<400>2
ATGAACTTCC TCAAGTCCTT CCCATTCTAC GCATTCCTTT GCTTCGGACA ATACTTTGTT      60
GCTGTGACTC ATGCTGCACA CCACCATCAC CACCATATCG AGGGCAGGAA GTTCCCTATC     120
TACACTATCC TCGACAAGTT GGGCCCTTGG TCCCCTATCG ACATCCATCA TCTCAGCTGC     180
CCTAACAATT TGGTTGTCGA GGACGAGGGC TGCACAAACT TGTCTGGATT CAGCTACATG     240
GAGCTTAAGG TTGGCTACAT CCTCGCTATC AAGATGAACG GTTTTACTTG CACAGGCGTC     300
GTTACTGAGG CCGAGAACTA CACCAACTTC GTGGGTTACG TTACTACCAC TTTCAAGAGG     360
AAGCACTTCC GGCCGACTCC AGACGCATGC CGCGCTGCCT ACAACTGGAA GATGGCTGGT     420
GACCCACGTT ACGAGGAGAG TCTACACAAC CCATACCCTG ACTACAGATG GTTACGTACC     480
GTCAAGACTA CTAAGGAGTC CCTCGTCATC ATTTCCCCAT CCGTGGCCGA TCTCGATCCA     540
TACGATAGGT CCTTACATTC TAGGGTTTTC CCATCCGGTA AGTGCTCCGG CGTGGCTGTC     600
TCCTCCACTT ACTGCTCCAC CAACCATGAC TACACTATCT GGATGCCTGA GAACCCTAGG     660
TTGGGTATGT CCTGCGATAT CTTCACTAAC TCGCGAGGTA AGAGGGCCAG CAAGGGTTCC     720
GAGACCTGCG GTTTCGTCGA TGAGAGAGGT TTGTACAAGT CCCTCAAGGG CGCCTGCAAG     780
CTCAAGTTGT GCGGTGTCCT CGGTCTTAGG TTGATGGACG GTACCTGGGT CGCTATGCAA     840
ACTAGTAACG AGACTAAGTG GTGCCCACCA GACCAATTGG TCAACCTCCA CGACTTCCGG     900
TCCGACGAGA TCGAGCACTT GGTCGTGGAG GAACTCGTTA GGAAGAGGGA GGAATGCTTG     960
GATGCTCTCG AGTCCATTAT GACTACTAAG TCCGTCTCTT TCAGAAGGCT CAGCCATCTC    1020
AGGAAGTTGG TTCCAGGTTT CGGCAAGGCC TATACCATTT TCAACAAGAC TTTGATGGAG    1080
GCTGACGCTC ACTACAAGTC CGTCCGGACC TGGAACGAGA TCCTCCCATC CAAGGGCTGC    1140
CTTAGGGTTG GCGGCCGCTG CCATCCACAC GTTAACGGTG TCTTTTTCAA CGGCATTATC    1200
CTCGGCCCCG ACGGCAACGT TTTGATCCCA GAGATGCAGT CCTCCCTCTT GCAGCAGCAC    1260
ATGGAGTTGC TCGAAAGCTC TGTTATCCCA TTGGTCCATC CATTGGCTGA CCCTTCCACT    1320
GTCTTCAAGG ATGGCGACGA GGCCGAGGAC TTCGTGGAGG TGCATTTGCC AGACGTTCAC    1380
AACCAGGTTT CCGGAGTGGA CCTCGGTCTC CCAAACTGGG GTAAGTACGT CTTGCTCTCC    1440
GCAGGCGCGC TCACTGCCTT GATGTTGATC ATCTTCCTCA TGACTTGCTG CAGAAGGGTC    1500
AACAGGTCCG AGCCAACTCA GCATAACTTG AGGGGCACCG GTAGGGAGGT CTCCGTTACT    1560
CCACAGTCCG GAAAGATTAT ATCCTCTTGG GAGTCCCATA AGTCCGGAGG CGAGACGCGT    1620
TTGTCCGAGA AGGATGAGTT GTGATGA                                          1647
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>引物
<400>3
CCAAGCTTTC TAGATAAACA ATGAACTTCC TCAAGTCATT C                            41
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>引物
<400>4
TCCTTTGCTT CGGACAATAC TTTGTTGCTG TGAC                                    34
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>5
CCATCACCAC CATATCGAGG GAAGGAAGTT CCCTATCTAC                              40
<210>6
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>6
CTCGACAAGT TGGGCCCTTG GTCCCCTATC GACATCCATC ATCTCAGC                     48
<210>7
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>7
GTCGAGGACG AGGGCTGCAC AAACTTGTCT GGATTCAGCT ACATGGAGC                    49
<210>8
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>8
CATCCTCGCT ATCAAGATGA ACGGTTTTAC TTGCACAGGC GTCGTTAC                     48
<210>9
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>9
CCAACTTCGT GGGTTACGTT ACTACCACTT TCAAGAGGAA GCACTTCC                       48
<210>10
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>10
CCGCGCTGCC TACAACTGGA AGATGGCTGG TGACCCACGT TACGAGG                        47
<210>11
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>11
TACCCTGACT ACAGATGGTT ACGTACCGTC AAGACTACTA AGGAGTC                        47
<210>12
<211>65
<212>DNA
<213>引物
<400>12
ATCCGTGGCC GATCTCGATC CATACTCCTC AGGGAGCAGT AGTAAAGGGG TAGGCACCGG          60
CTAGG                                                                      65
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>13
CTCCGGCGTG GCTGTCTCCT CCACTTACTG CTCCACCAAC CATGACTACA                     50
<210>14
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>14
GAACCCTAGG TTGGGTATGT CCTGCGATAT CTTCACTAAC TCGCGAGG                       48
<210>15
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>15
TTCCGAGACC TGCGGTTTCG TCGATGAGAG AGGTTTGTAC AAGTCCCTC                      49
<210>16
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>16
CAAGTTGTGC GGTGTCCTCG GTCTTAGGTT GATGGACGGT ACCTGGGT                       48
<210>17
<211>58
<212>DNA
<213>引物
<400>17
AGACTAAGTG GTGCCCACCA GACCAATTGG TCAACCTCCA CGACTTCCGG TCCGACGA            58
<210>18
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>18
TGGTCGTGGA GGAACTCGTT AGGAAGAGGG AGGAATGCTT GGATGC                         46
<210>19
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>19
GACTACTAAG TCCGTCTCTT TCAGAAGGCT CAGCCATCTC AGGAAG                         46
<210>20
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>20
GGCCTATACC ATTTTCAACA AGACTTTGAT GGAGGCTGAC GCTCACT                        47
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>引物
<400>21
TGGAACGAGA TCCTCCCATC CAAGGGCTGC CTTAGGGTTG GCGGCCGCTG C                   51
<210>22
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>22
GTCTTTTTCA ACGGCATTAT CCTCGGCCCC GACGGCAACG TTTTGATCC                      49
<210>23
<211>52
<212>DNA
<213>引物
<400>23
TCTTGCAGCA GCACATGGAG TTGCTCGAAA GCTCTGTTAT CCCATTGGTC CA                  52
<210>24
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>24
TGACCCTTCC ACTGTCTTCA AGGATGGCGA CGAGGCCGAG GACTTCGTG                      49
<210>25
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>25
CGTTCACAAC CAGGTTTCCG GAGTGGACCT CGGTCTCCCA AACTGGGGTA                     50
<210>26
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>26
CGCAGGCGCG CTCACTGCCT TGATGTTGAT CATCTTCCTC ATGACTTGCT                     50
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>引物
<400>21
TGGAACGAGA TCCTCCCATC CAAGGGCTGC CTTAGGGTTG GCGGCCGCTG C                   51
<210>22
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>22
GTCTTTTTCA ACGGCATTAT CCTCGGCCCC GACGGCAACG TTTTGATCC                      49
<210>23
<211>52
<212>DNA
<213>引物
<400>23
TCTTGCAGCA GCACATGGAG TTGCTCGAAA GCTCTGTTAT CCCATTGGTC CA                  52
<210>24
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>24
TGACCCTTCC ACTGTCTTCA AGGATGGCGA CGAGGCCGAG GACTTCGTG                      49
<210>25
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>25
CGTTCACAAC CAGGTTTCCG GAGTGGACCT CGGTCTCCCA AACTGGGGTA                     50
<210>26
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>26
CGCAGGCGCG CTCACTGCCT TGATGTTGAT CATCTTCCTC ATGACTTGCT                     50
TGAGCGCGCC TGCGGAGAGC AAGACGTACT TACCCCAGTT TGGGAGA                        47
<210>33
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>33
AACCTGGTTG TGAACGTCTG GCAAATGCAC CTCCACGAAG TCCTCGGCC                      49
<210>34
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>34
AGACAGTGGA AGGGTCAGCC AATGGATGGA CCAATGGGAT AACAGAGC                       48
<210>35
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>35
CTGCTGCAAG AGGGAGGACT GCATCTCTGG GATCAAAACG TTGCCGT                        47
<210>36
<211>51
<212>DNA
<213>引物
<400>36
ATGCCGTTGA AAAAGACACC GTTAACGTGT GGATGGCAGC GGCCGCCAAC C                   51
<210>37
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>37
GGAGGATCTC GTTCCAGGTC CGGACGGACT TGTAGTGAGC GTCAGCC                        47
<210>38
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>38
GAAAATGGTA TAGGCCTTGC CGAAACCTGG AACCAACTTC CTGAGATGGC                     50
<210>39
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>39
GACGGACTTA GTAGTCATAA TGGACTCGAG AGCATCCAAG CATTCCTCCC                     50
<210>40
<211>58
<212>DNA
<213>引物
<400>40
TTCCTCCACG ACCAAGTGCT CGATCTCGTC GGACCGGAAG TCGTGGAGGT TGACCAAT            58
<210>41
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>41
CACCACTTAG TCTCGTTACT AGTTTGCATA GCGACCCAGG TACCGTC                        47
<210>42
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>42
GACACCGCAC AACTTGAGCT TGCAGGCGCC CTTGAGGGAC TTGTACAAA                      49
<210>43
<211>47
<212>DNA
<213>引物
<400>43
GCAGGTCTCG GAACCCTTGC TGGCCCTCTT ACCTCGCGAG TTAGTGA                        47
<210>44
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>44
ACCCAACCTA GGGTTCTCAG GCATCCAGAT AGTGTAGTCA TGGTTGGTG                      49
<210>45
<211>50
<212>DNA
<213>引物
<400>45
CAGCCACGCC GGAGCACTTA CCGGATGGGA AAACCCTAGA ATGTAAGGAC                     50
<210>46
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>46
GATCGGCCAC GGATGGGGAA ATGATGACGA GGGACTCCTT AGTAGT                         46
<210>47
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>47
CATCTGTAGT CAGGGTATGG GTTGTGTAGA CTCTCCTCGT AACGTGGG                       48
<210>48
<211>48
<212>DNA
<213>引物
<400>48
GTAGGCAGCG CGGCATGCGT CTGGAGTCGG CCGGAAGTGC TTCCTCTT                       48
<210>49
<211>53
<212>DNA
<213>引物
<400>49
AACGTAACCC ACGAAGTTGG TGTAGTTCTC GGCCTCAGTA ACGACGCCTG TGC                 53
<210>50
<211>45
<212>DNA
<213>引物
<400>50
TTGATAGCGA GGATGTAGCC AACCTTAAGC TCCATGTAGC TGAAT                          45
<210>51
<211>49
<212>DNA
<213>引物
<400>51
CCCTCGTCCT CGACAACCAA ATTGTTAGGG CAGCTGAGAT GATGGATGT                      49
<210>52
<211>44
<212>DNA
<213>引物
<400>52
CCAAGGGCCC AACTTGTCGA GGATAGTGTA GATAGGGAAC TTCC                           44
<210>53
<211>45
<212>DNA
<213>引物
<400>53
ATATGGTGGT GATGGTGGTG TGCAGCATGA GTCACAGCAA CAAAG                          45
<210>54
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>54
GCAAAGGAAT GCGTAGAATG GGAATGACTT GAGGAAGTTC                                40

Claims (32)

1.一种重组嵌合G蛋白，其具有SEQ ID No 1的序列和其部分或其变体。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合G蛋白，其中蛋白质的长度包括547个氨基酸或其部分或其变体。
3.根据权利要求1所述的重组嵌合G蛋白，其中所述蛋白质包括在N-末端在1～26位的PR-S信号肽的氨基酸残基，接着是在27～32位六个六组氨酸标签的残基，在33～36位的因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，542～547位是将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的长度六个氨基酸的残基。
4.一种重组嵌合G蛋白基狂犬病疫苗，其具有SEQ ID No 1的序列和其部分或其变体。
5.根据权利要求4所述的狂犬病疫苗，其中蛋白质的长度包括547个氨基酸或其部分或其变体。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗蛋白质包括在N-末端在1～26位的PR-S信号肽的氨基酸残基，接着是在27～32位六个六组氨酸标签的残基，在33～36位的因子Xa蛋白质水解切割位点的四肽氨基酸残基，在37～541位的狂犬病毒ERA株的成熟糖蛋白G的氨基酸残基，542～547位是将嵌合G蛋白保持在内质网的位于嵌合蛋白的C末端的长度六个氨基酸的残基。
7.根据权利要求4所述的疫苗，其中重组嵌合G蛋白基因编码针对活狂犬病毒具有免疫保护活性的蛋白质。
8.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗提供针对狂犬病毒的100％的免疫保护。
9.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述疫苗控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病。
10.SEQ ID No 2的嵌合基因，其编码权利要求1中所述的嵌合G-蛋白。
11.根据权利要求10所述的嵌合基因，其中所述基因的长度为1.67kb。
12.一组SEQ ID No.3～54的52个引物，其用于合成权利要求10中所述的SEQ ID 2的嵌合基因。
13.一种在植物中大规模产生嵌合G蛋白基狂犬病疫苗的方法，其通过表达新型的嵌合基因SEQ ID No 2以控制狂犬病，其中所述方法包括步骤：
a.使用编码SEQ ID No.1和其部分或其变体的嵌合G蛋白的SEQ ID No.2的DNA分子转化植物，其在该DNA被表达，并且该嵌合G蛋白被生产并被定位于植物内质网内的条件下，以及
b.分离和纯化嵌合G蛋白以对适当的对象进行免疫。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的商业上可以获得的狂犬病毒株是选自由ERA株和CVS株所组成的组。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白质的长度是547个氨基酸。
16.根据权利要求13所述的方法，其中PR-S信号肽被其他相当的信号肽例如PR-1或者任何其它信号肽所替代，这依赖于植物表达系统，以将蛋白质转运至内质网。
17.根据权利要求13所述的方法，其中六个组氨酸残基可以被从由具有与基质的亲和力的纤维素结合结构域、链霉亲和素琼脂糖结合结构域、谷胱甘肽-S-转移酶融合等所组成组中选择的任何其它肽所替代，以用于纯化。
18.根据权利要求13所述的方法，其中用于切割的四个氨基酸残基可以被从由牛肠激酶、凝血酶和因子Xa所组成组中选择的任何内切蛋白质酶替代。
19.根据权利要求13所述的方法，其中相同类别的其他氨基酸残基能够替代SEQ ID No.1的蛋白质疫苗的氨基酸残基。
20.根据权利要求13所述的方法，其中重组嵌合G蛋白基因编码针对活狂犬病毒的具有免疫保护活性的蛋白质。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述疫苗控制人类、宠物和野生生物中的狂犬病。
22.根据权利要求13所述的方法，其中用于表达重组G蛋白基因的植物选自由烟草、玉米、豆类、蔬菜和/或其它植物和选自任何藻类的低级植物所组成的组，其中豆类如鹰嘴豆、木豆、落花生、大豆，蔬菜如番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、菠菜、花椰菜、甘蓝、红辣椒、辣椒、胡萝卜。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白质与灭活的病毒相比免疫原高2～4倍。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述的疫苗表达是植物中总可溶性蛋白的大约0.2％。
25.一种对对象进行狂犬病疫苗接种的方法，其中所述方法包括为对象给药药物有效量的权利要求4中所述的重组嵌合G蛋白基因疫苗，其中所述疫苗在转基因植物中被生产和表达，可选择地同时为对象给药药物上可以接受的添加剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述对象为人类、宠物和野生生物。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述给药是通过选自口服、经腹膜内给药等的路线。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述重组嵌合G蛋白基因疫苗的浓度为从至少ng开始的范围内。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述疫苗对于给药是安全的。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述疫苗由于在种子、块茎、根、叶和其他植物部分内，因此所述疫苗稳定多年。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质的抗体效价在经过第2次强化剂量后在0.365±0.20的范围内，经过第3次强化剂量后为0.833±0.20。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述疫苗提供100％的免疫保护。
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