CN1930293A

CN1930293A - 具有降低的饱和脂肪酸水平的转基因植物及其制备方法

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Publication number: CN1930293A
Application number: CNA2004800417669A
Authority: CN
Inventors: 萨利赫乌扎曼·山; 兰德尔·韦塞尔卡
Original assignee: Alberta Research Council
Current assignee: Alberta Research Council
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2024-12-17
Also published as: EP1709179A1; AU2004299534A1; CN1930293B; US20080092254A1; DE602004023126D1; ATE442442T1; EP1709179A4; CA2550028A1; US8063269B2; AU2004299534B2; JP2007514420A; CA2450000A1; EP1709179B1; JP4755109B2; WO2005059140A1

Abstract

本发明提供在种子油中具有降低的饱和脂肪酸水平的转基因植物及其生产方法。通过这种方法培养的转基因植物由于与内质网驻留和回收信号序列可操作地连接的原核Δ－9去饱和酶(即一种在饱和脂肪酸的Δ－9位置引入顺式双键的酶)的表达，在种子油中含有低水平的饱和脂肪酸。本发明的一个实施例为表达与KKSS(SEQ ID No.5)内质网驻留和回收信号序列可操作地连接的来源于藻青菌属蓝细菌的异种Δ－9去饱和酶的植物，所述的Δ－9去饱和酶将脂质结合16:0和18:0脂肪酸转化成相应的16:1和18:1。

Description

具有降低的饱和脂肪酸水平的转基因植物及其制备方法

参照相关申请

本发明要求于2003年12月18日提交的加拿大专利申请号为2,450,000，题目为“在种子油中具有降低的饱和脂肪酸水平的植物的制备方法”的优先权。

技术领域

本发明大致涉及转基因植物领域。更具体而言，本发明涉及用于改变植物中脂肪酸代谢，用于降低由这种植物制备的种子油的饱和脂肪酸含量的分子技术。该技术例如在由产油植物获得具有提高了营养价值的种子油的商业生产中具有实用性。

背景技术

为了研制出用于特殊目的而设计的植物油，改变植物中脂肪酸(FA)代谢已引起极大的兴趣。油的性质由影响营养成份和氧化稳定性的其脂肪酸组成决定。

在各种类型的脂肪和油中，饱和FA的水平是主要的健康关注点。因此，在市场上提供具有较低的饱和FA含量的植物油已变得越来越紧迫。在大部分植物油中饱和脂肪酸的主要组成为16:0(棕榈酸)和18:0(硬脂酸)。

在植物油市场，具有小于7％饱和FA含量的油可以标为“低脂”，而具有小于3.5％饱和FA含量的油可以标为“无脂”。芸苔(Brassicanapus)种子油的饱和脂肪酸一般较低，但是也难以使饱和脂肪酸水平低于界限为7％饱和FA含量的“低脂”。

之前，为了解决上述问题，已经进行了尝试。例如，已经制备了包含参与脂肪酸代谢的异种植物基因的转基因植物(参见如：Shah S，Weselake R(2003)Farming For the Future，AARI project #19990032，Final Report，pp.1-82；和Yao等人，Plant Biotech J 2003，1：221)。然而，这些转基因植物显示转基因植物中饱和脂肪酸少量下降或没有下降。例如，Yao等人(2003)报道了与拟南芥(Arabidopsis)的ADS1基因在雪里红(B.juncea)种子中的表达相关的1～2％饱和FA水平的下降。

在本文中，原核基因提供了一种引人注目的对植物基因的替代，然而，原核蛋白在植物背景中经常表现有限的活性或没有活性(参见如，Hahn JJ，Eschenlauer AC，Narrol MH，Somers DA，Srienc F(1997)Growth kinetics，nutrient uptake，and expression of the A lcaligenesentrophus poly(β-hydroxybutyrate)synthesis pathway in transgenic maizecell suspension cultures.Biotech Prog 13：347-354)。

先前已经说明，可以通过制备表达异种Δ-6去饱和酶(得自于藻青菌、琉璃苣或月见草)的转基因植物，以实现亚油酸(C₁₈Δ^9，12)、聚不饱和脂肪酸转化为γ-亚油酸(GLA，C₁₈Δ^6，9，12)来提高植物种子油的营养价值(参见美国专利第5552306、5614393、5663068、5789050、6355861、6683232号，和美国专利申请公开第20040078845号)。亚油酸(C₁₈Δ^9，12)为基本饮食成分，其不能被脊椎动物合成且通常由植物来源获取；脊椎动物细胞可以在脂肪酸的Δ-9位置引入双键，但是不能在脂肪酸链的Δ-9双键和甲基端之间引入另外的双键。哺乳动物可以将亚油酸转化为γ-不饱和酸(GLA，C₁₈Δ^6，9，12)，其然后可以被转化为多数前列腺素的基本前体花生四烯酸(20:4)。

因此，仍然需要能够提供具有较低的饱和脂肪酸水平的种子油的转基因植物。

发明内容

本发明提供降低由植物制备的种子油中饱和脂肪酸水平的分子技术。具体地，本发明的分子技术以对降低由所述的植物制备的种子油中饱和脂肪酸含量有效的水平，在植物中表达具有Δ-9去饱和酶活性的酶(即，其使脂肪酸在Δ-9位置去饱和)。

所以，在本发明的一个技术方案中提供了一种包括与内质网驻留和回收信号(endoplasmic reticulum retention and retrieval signal)序列可操作地连接的来自于原核生物的Δ-9去饱和酶的重组多肽。

所述的Δ-9去饱和酶来自于原核生物，例如藻青菌，如蓝细菌(Anacystis nidulans)。

在实施方案中，所述的Δ-9去饱和酶包括：

(a)具有SEQ ID No.列出的氨基酸序列的多肽；(b)与(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去饱和酶活性的(a)所限定的多肽的变异体或同源物；

(c)与(a)中限定的多肽具有至少50个相同的连续氨基酸，且具有Δ-9去饱和酶活性的(a)中所限定的多肽的片断。

在一个实施方案中，所述的Δ-9去饱和酶包括具有SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列的多肽，且内质网膜驻留和回收信号具有氨基酸序列KKSS(SEQ ID No.5)。

本发明还提供：编码如上所限定的重组多肽的核酸分子；包括与启动子可操作地连接的所述核酸分子的载体；用这种载体转化的宿主细胞；和一种转基因植物细胞包括包含与导致重组多肽在所述的转基因植物细胞中表达的启动子可操作地连接的上述核酸分子的转基因元件。

本发明进一步提供一种制备转基因植物的方法，包括：(a)用上述核酸分子或包括这种核酸的载体转化植物细胞，其中，所述的核酸与实现重组多肽在所述的植物细胞中表达的启动子可操作地连接；和(b)由步骤(a)中制备的转化植物细胞再生植株。

本发明还提供了一种转基因植物，该转基因元件包括包含与导致重组多肽在所述的转基因植物中表达的启动子可操作地连接的上述核酸分子的转基因元件。

与相同种类的野生型植物相比，本发明的转基因植物和植物细胞例如在具有降低的饱和脂肪酸含量的种子油的生产中具有实用性。

具体实施方式

作为本发明的实施例，本发明的中请人开发了转基因芸苔植物，与目前市售的品种相比，证明了饱和脂肪酸百分含量约下降了40％。这是通过在芸苔植物中表达包括与内质网(ER)回收和驻留信号KKSS(SEQ ID No.5)融合的SEQ ID No.2的Δ-9去饱和酶的重组多肽实现的。申请人发现，融合到KKSS(SEQ ID No.5)的Δ-9去饱和酶的表达使芸苔种子油的饱和FA含量显著下降，而单独的去饱和酶基因(即，没有融合到KKSS(SEQ ID No.5))在降低芸苔种子油的饱和脂肪酸水平上不是很有效。与从野生型芸苔得到的种子油的约7.2％饱和脂肪酸含量相比，这里描述的转基因芸苔品系含有低至约4.3％的饱和脂肪酸。在这些品系中，芸苔中主要的饱和脂肪酸(16:0和18:0)均降低。

在本文中，脂肪酸中双键的位置由在符号“Δ(delta)”后从羧基端到具有双键的碳的碳数表示。双键总数在总碳数之后的冒号后表示。例如，亚油酸表示为18:2Δ^9，12，其由下面的结构式表示：CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇COOH。但是，本领域中也使用其它命名脂肪酸的习惯，如，双键的位置可以由在符号“ω(omega)”后从脂肪酸的甲基端到具有双键的碳的碳数表示。

在本文中，“本发明的多肽”为具有与内质网驻留和回收信号序列可操作地连接的、来自于原核生物的Δ-9去饱和酶的重组多肽。

在本文中，“本发明的核酸分子”为编码本发明的多肽的重组核酸分子。

在本文中，“野生型”植物或植物细胞为未经改造以表达本发明的多肽的植物或植物细胞。

在本文中，“Δ-9去饱和酶活性”指在饱和脂肪酸的Δ-9位置引入双键的能力，如16:0、18:0、20:0或22:0饱和脂肪酸或其任意组合。

术语“重组体”指某物已被重组，所以当对于核酸构建体时，该术语指包括通过分子生物学技术连接或构建的核酸序列的分子。当对于蛋白质或多肽时，术语“重组体”指使用通过分子生物学技术构建的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。当对于遗传组成时，术语“重组体”指具有亲代基因组中没有出现的新的等位基因组合的配子、后代、细胞或基因组。重组核酸构建体可以包括连接到、或被处理而连接到核酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列在自然界不与核酸序列连接，或该核苷酸序列在自然界于不同的位置与核酸序列连接。所以，对于构建为“重组体”的核酸，是指已经使用基因工程，即通过人介入处理的核酸分子。重组核酸构建体可以如通过转化引入宿主细胞。这种重组核酸构建体可以包括来源于相同的宿主细胞物种或不同的宿主细胞物种的序列，其已被分离并再引入到宿主物种的细胞中。作为宿主细胞的初始转化结果，或者作为随后的重组和/或修复事件的结果，重组核酸构建体序列可以整合到宿主细胞基因组中。

Δ-9去饱和酶

本发明的实施例中使用的Δ-9去饱和酶来源于蓝细菌，其为一种藻青菌(Ishizaki-Nishizawa等人，1996)且具有SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列。这种蛋白质在与脂质结合的饱和脂肪酸的Δ-9位置引入顺式双键(或去饱和)。它对于16:0脂肪酸具有较高的特异性，但也使如18:0的较大的饱和脂肪酸去饱和。在Nishizawa等人的美国专利第6,043,411号、在Nature Biotechnology 14：1003-1006中详细描述了该蛋白，并以入藏登记号X77367在EMBL GeneBank中登记，所有这些参考文献在这里作为参考。编码该去饱和酶的基因这里指“来源于蓝细菌的des9(SEQ ID No.1)”，但在本领域有时称为DSG基因。

从其它原核来源得到的Δ-9去饱和酶可以用于本发明。例如，在本发明中可能有用的Δ-9去饱和酶的合适的原核来源包括但不限于细菌，如属于水花微囊藻属、粗集胞属(Synechocystis)、鱼腥藻属、隐球藻属(Aphanocapsa)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、菱形藻属(Nitzchia)、聚球藻属(Synechococcus)和螺旋藻属的藻青菌。

高等植物含有16:0 FA的量大于18:0 FA。所以，具有与16:0FA底物高亲和力的Δ-9去饱和酶优选用于实施本发明。

本发明多肽的Δ-9去饱和酶成分可以是天然Δ-9去饱和酶的变异体，例如：缺失，包括平截和片断；插入和添加，包括标记多肽和融合蛋白；和替代，如定位突变体和等位变异体。例如可以通过替代、去除或添加天然Δ-9去饱和酶或其片断中的一个或多个氨基酸残基，并筛选生物活性来制备变异体。

用于实施本发明的合适的变异体可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的与天然去饱和酶的同一性，且具有Δ-9去饱和酶活性。

Δ-9去饱和酶还可以是已知Δ-9去饱和酶(如来自于蓝细菌的Δ-9去饱和酶SEQ ID No.2))的同源物。可以使用标准分子生物学技术或通过寻找存放在遗传数据库中的同源序列而鉴定同源物。

用于实施本发明的合适的同源物可以具有如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的与天然去饱和酶(如来自于蓝细菌的Δ-9去饱和酶(SEQ ID No.2))的同一性，且具有Δ-9去饱和酶活性。

用于实施本发明的合适的片断可以具有至少50个与天然Δ-9去饱和酶相同的连续氨基酸，且具有Δ-9去饱和酶活性。例如，合适的片断可以具有至少约50、100、150、200或250个与天然Δ-9去饱和酶相同的连续氨基酸。

内质网驻留和回收信号

在产油植物中，脂质结合脂肪酸的油合成和去饱和发生在细胞的ER中，尤其是种子中细胞的ER中。因此，通过将酶定位于ER可以提高在真核细胞中参与脂肪酸代谢的原核酶(如去饱和酶)的活性。

在真核细胞中，许多跨膜蛋白被加工并转运到细胞表面。通过向所述蛋白质中加入适当的信号序列可以在内质网(ER)中回收并驻留这些蛋白质中的一些。例如，下面的氨基酸序列可以起到ER驻留和回收信号序列的作用：

(a)KDEL(SEQ ID No.4(参见，如Van den Broeck等人，(1985)Nature 313，358；和Michaelis等人，(1982)Ann.Rev.Microbiol.36，425)；

(b)KKXX(SEQ ID No.3)，其中，X为任一氨基酸，特别是KKSS(SEQ ID NO：5)(Vincent等人，(1998)J.Biol.Chem.273：950-6)；

(c)HDEF(SEQ ID No.6)(Lehmann K.等人。(2001)Plant Physiol.Oct；127(2)：436-49)；

(d)KEEL(SEQ ID No.7)和KDQL(SEQ ID No.8)(Manabu Murakami，Takayoshi Ohba，Feng Xu，Seiji Shida，Eisaku Satoh，Kyoichi Ono，IchiroMiyoshi，Hiroyuki Watanabe，Hiroshi Ito，和Toshihiko Iijima“Genomicorganization and functional analysis of murine PKD2L1”(2004)JBCPapers in Press.2004年11月17日出版，原稿号为M411496200)。

本发明的实施例证明，可以通过将原核Δ-9去饱和酶(如SEQ IDNo.2)与ER驻留和回收信号序列(如KKSS(SEQ ID No.5))可操作地连接而提高植物(如芸苔)中该酶的活性，从而使由植物制备的种子油的饱和脂肪酸水平显著下降。

尽管本发明的实施例使用KKSS(SEQ ID No.5)作为ER驻留和回收信号序列，但是其它ER驻留和回收信号序列(如KKXX，其中X为不是“S”的氨基酸)可以用于在ER中回收并驻留蛋白质。本发明的范围不限于任何特别的原核Δ-9去饱和酶或任何特别的信号序列，或其任何特别的组合。这就是说，本发明可以使用其它Δ-9去饱和酶及其它ER驻留和回收信号序列。

所以，用于实施本发明的适当的ER驻留和回收信号序列的例子包括但不限于：KDEL(SEQ ID No.4)、KKSS(SEQ ID No.5)、HDEF(SEQ IDNo.6)、KEEL(SEQ ID No.7)和KDQL(SEQ ID No.8)。

术语“可操作地连接”是指将对于编码序列的表达必要的调节序列及ER回收和驻留信号序列以相对于编码序列适当的位置和正确的读码框置于DNA构建体中，以实现基因的表达。

为了有效的连接，将ER驻留和回收信号序列加到Δ-9去饱和酶的羧基端。ER驻留和回收信号序列可以在本发明多肽的最后的羧基端部分，或者其后可以接另外的氨基酸。可以通过编码Δ-9去饱和酶的基因的基因工程加上所述的信号序列。

核酸分子

术语“DNA构建体”这里指用于转化细胞的DNA基因序列。

术语“表达盒(expression cassette)”这里指包括已在其5′和3′端连接有启动子和终止子调节序列的编码区以实现基因和基因产物在转化植物细胞中适当表达的DNA序列。

在本发明的实施例中，申请人构建了一种DNA构建体，其包含两个表达盒：第一组件包括与编码信号KKSS(SEQ ID No.5)的核苷酸序列可操作地连接的蓝细菌的des9基因(SEQ ID No.1)，来自于芸苔的种子特异性napin启动子，和来自于豌豆的rbcs3′转录终止子；和第二表达盒包括表达有助于鉴定和筛选转化植物细胞和植物的基因产物的启动子、编码区和终止子。第二表达盒为可选择的，因为其它方法可以用于鉴定和选择转化体。

可以采用任何适当的筛选方法进行筛选，例如：抗生素筛选(如卡那霉素、庆大霉素、潮霉素)；在植物中不存在的特异性糖的代谢标记基因(如Syngenta公司的Positech^TM筛选系统；和磷酸甘露糖异构酶)；除草标记基因(如拜耳公司的pat和bar，和Monsanto公司的EPSPS)；可见筛选标记，如绿色荧光蛋白等。在本发明的情况中，使用卡那霉素抗性进行筛选。

在本发明的实施方案中，申请人使用强效的种子特异性贮藏蛋白napin启动子。但是其它种子特异性启动子可以用于本发明中，包括但不限于：十字花科蛋白(cruciferin)启动子、羟化酶启动子、豆球蛋白启动子(Shasany AK等人，(2000)Indian J Exp Biol.Apr；38(4)：363-72)、菜豆球蛋白启动子和玉米醇溶蛋白启动子。可能使用不是种子特异性的启动子，但是这种启动子在降低植物种子油产品的饱和FA含量方面不那么有效。

在本发明的实施例中，编码区也在3′端与作为调节序列的rbcs3′转录终止子可操作地连接。其它也可用于本发明中的有用的3′调节序列包括但不限于：胭脂碱合成酶聚腺苷酸化区(NOS)和章鱼碱聚腺苷酸化区(OCS)。

所述的DNA构建体可以方便地于适合在细菌宿主中繁殖的第一载体中构建，然后被切断并连接到用于引入到植物宿主中的第二载体。用于引入到植物宿主中的适当载体的例子包括pCAMBIA(国际农业分子生物学应用中心(CAMBIA))载体系列、pBI载体系列(BD生物科学公司的Clontech部)和基于pKYLX71的载体(Scharld等人，(1987))。载体的选择部分取决于预期的转化机理，即农杆菌介导的转化或直接的基因转移。

转化和转基因植物和植物细胞

可以使用本领域的技术人员公知的任何DNA导入(参见，例如“Plant genetic transformation and gene expression；a laboratorymanual(植物遗传转化和基因表达，实验手册)”Draper J等人，Eds.Blackwell Scientific Publications，1988)产生包括本发明的核酸的转化植物细胞和转基因植物。这些DNA导入包括但不限于：农杆菌介导的转染、基因枪(biolistic)DNA导入、原生质体电穿孔、直接DNA摄取、PEG处理原生质体、UV激光微光束、双生病毒(Gemini virus)载体、脂质体介导的DNA摄取、磷酸钙处理原生质体、和以包覆有转化DNA的微珠搅动细胞悬浮液。在这些DNA导入当中，由于农杆菌的使用能保证稳定的转化，所以其优选用于如芸苔的双子叶植物。使用农杆菌的方法包括使用野生型肿瘤质粒的中间载体法(nature，287(1980)p.654；Cell，32(1983)p.1033；EMBO J.，3(1984)P.1525)，使用缺乏T-DNA肿瘤形成基因区的载体的中间载体法(EMBO J.，2(1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)p.629)，二元载体法(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983)p.179；Nucl.Acids Res.，12(1984)p.8711)等。可以使用这些方法中的任一方法。用农杆菌感染植物的方法包括对培养细胞直接接种、原生质体共培养和叶盘(leaf-disk)法。叶盘法在许多情况中便于用在直接且容易地制备大量转化植物。

可以通过在如Murashige-Skooge培养基的已知培养基中培养转化植物细胞而再生植株，所述的培养基可以添加筛选抗生素和/或植物生长激素。将生根幼苗移植到土壤中并培养，以长成再生植株。

在下述实施例中，使用农杆菌T-DNA介导的植物转化将上述DNA构建体引入到芸苔植株的基因组中。简要地说，使用农杆菌二元载体系统，植物细胞核的转化通过以下步骤完成：a)将来自于蓝细菌的des9基因(SEQ ID No.1)及回收和驻留信号KKSS(SEQ ID No.5)插入到载体中，b)将载体引入到农杆菌中，c)共培养从幼苗切下的绒毛叶与重组农杆菌的悬浮液，随后在非选择性培养基中接种，d)将植物组织转移到选择性培养基中以鉴定转化组织，e)鉴定转化组织和f)从转化组织再生植株。

转基因的表达水平可以根据其插入到核基因组的位置和数目而变化。所以，应再生几个转化体，并应检验转基因的表达和改变的脂肪酸构成。可以用本领域中任何适当的技术分析脂肪酸构成，例如：

(a)气相色谱(GC)：脂肪酸甲基酯(FAME)、丁基/丁醇酯、2-丙醇(propan-2-ol)酯(参见，例如，国际标准化组织方法参考号ISO 5508：1990(E)，“Animal and vegetable fats and oils-Analysis by gaschromatography of methyl esters of fatty acids(动物和植物脂肪和油-用脂肪酸甲基酯的气相色谱分析”)；

(b)高效液相色谱(HPLC)：吸附色谱、手性色谱、银离子色谱、反相色谱；

(c)质谱(MS)：皮考啉基酯、二甲基唑啉(DMOX)、吡咯烷、二甲基二硫化物衍生物(DMSO)；

(d)红外光谱(IR)；和

(e)傅立叶变换红外光谱(FTIR)。

一般而言，只有那些证明其种子油的饱和脂肪酸含量显著下降的转基因植物(即其中，与同种野生型植株相比，种子油的饱和脂肪酸含量降低了约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％或更多)是所希望的，且将被筛选用于进一步培养。

本发明的实施例证明，用与ER回收和驻留信号可操作地连接的藻青菌Δ-9去饱和酶转化芸苔(欧洲油菜(Brassica napus))，导致了种子油的总饱和脂肪酸含量下降。然而，油合成的生物化学(如脂肪酸的去饱和)和这些代谢反应的亚细胞定位与其它油种子农作物相似。所以，本发明的分子技术可以应用于其它双子叶和单子叶油种子植物，包括但不限于：大豆、玉米、花生、向日葵、橄榄、棕榈、椰子、红花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鳄梨和亚麻。

本发明还提供前述转基因植物的细胞和组织(特别是种子)。

前述转基因植物和其后代可以用于通过杂交和筛选将感兴趣的基因转移到其它基因型、栽培种、变种等。所以，本发明提出的分子技术可以用于产生大量携带本发明的重组核酸的杂种植物，以制备具有降低的饱和脂肪酸水平的种子油。

与明确且单独地指明各个公开或专利申请作为参考引用一样，本说明书中在这里引用的公开和专利申请用于参考。

引用任何公开是由于其公开日早于申请日，不应理解为由于现有的发明，本发明没有资格早于这种公开。

通过以下实施例现在将更详细地说明本发明，这些实施例决不是要限制本发明的范围。

实施例

实施例1：没有ER信号的基因构建：

使用在起始和终止密码子紧邻的外侧的两个引物中引入XhoI位点的下列引物，从蓝细菌(聚球藻属，ATCC#33912)扩增des9基因(SEQ IDNo.1；837bp)的开放读码框：

DSG-XhoI-5′：

CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQ IDNo.9)

和DSG-XhoI-3′：

CCCCCCTCGAGTTAGTTGTTTGGAGACGCCACTTTG(SEQ IDNo.10)。

凝胶纯化PCR产物，用XhoI消化并连接到大肠杆菌载体pBluescript(BS/KS)，然后测序以确定其同一性。然后通过XhoI从BS/KS切除des9基因(SEQ ID No.1)并连接到植物载体pKYLX-Napin中。该载体是通过用来自于芸苔的种子特异性Napin启动子代替载体pKYLX71(Scharld等人，1987)的双35S启动子而构建的。通过限制性酶切消化分析几个重组载体以鉴定对于启动子和终止子具有正确的des9基因插入方向的克隆。重组载体(pC7)被测序以确定适当的连接，且在植物载体中引入的des9基因插入没有重排。

实施例2：用ER信号构建基因：

使用在起始和终止密码子紧邻的外侧的两个引物中引入XhoI位点的下列引物，从蓝细菌(聚球藻属，ATCC#33912)扩增des9基因(SEQ IDNo.1)的ORF(837bp)：

DSG-XhoI-5′：

CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(SEQ IDNo.9)

和des9-3′-ER：

CCCCCCCTCGAGTTAAGAAGACTTTTTGTTGTTTGGAGACGCCAC(SEQ ID No.11)

在des9-3′-ER引物中，des9基因的终止密码子被转化成氨基酸K，并且其后再加上三个氨基酸(KSS)，之后是一个新的终止密码子和XhoI位点。凝胶纯化PCR产物(由于增加4个氨基酸，现为849bp)，用XhoI消化，连接到BS/KS并测序以确定其同一性。然后通过XhoI从BS/KS切除des9基因并连接到植物载体pKYLX-Napin中。分析几个重组载体以鉴定对于启动子和终止子具有正确的des9基因插入方向的克隆。重组载体(pC8)被测序以确定适当的连接，且在植物载体中引入的des9基因插入没有重排。

实施例3：载体引入到农杆菌中：

然后通过三亲交配将两个构建体(pC7和pC8)均从大肠杆菌DH5α转移到根瘤农杆菌GV3101中。使用大肠杆菌HB101中的pRK2013作为辅助质粒(Ditta等人，1980)。在50mg/L的利福平、20mg/L的庆大霉素和15mg/L的四环素平板上几轮筛选转接合子。为了确定没有重排发生，从转接合子提取质粒，用限制性内切核酸酶消化，并与从大肠杆菌DH5α纯化的质粒对比。

实施例4：芸苔转化：

使用由Moloney等人(1989)开发的实验方案用pC7和pC8基因构建体转化芸苔品种“Wester”。简而言之，尽可能接近顶端分生组织但不包括它，用快刀从五天龄幼苗切下包括叶柄的充分展开的绒毛叶。将叶柄的剪切端短暂地浸入到1ml含有des9基因构建体的根瘤土壤杆菌的液体培养物(OD约0.5)中。然后将叶柄埋入培养皿中的MMO-BA共培养培养基[具有苄基腺嘌呤(BA)的Murashige最小有机物(MMO，Invitrogen公司，伯灵顿，加拿大)]中，以使外植体垂直竖立。平板用橡皮膏密封，并在25℃、16h亮/8h暗、70～80mE下置于生长室中2～3天。通过将外植体转移到含有300mg/L特美汀(Timentin)(GlaxoSmithKline，密西沙加，加拿大)的MMO-BA培养基中诱导愈伤组织。

实施例5：完整植株的筛选和再生：

通过将外植体转移到含有300mg/L特美汀和20mg/L卡那霉素的MMO-BA培养基的平板中而诱导从愈伤组织形成芽。将芽从外植体上切下并放入含有具有抗生素(但没有BA)的MMO培养基的品红容器中。当芽以正常的形态和顶端优势长出时，将其转移到生根培养基[含有抗生素和萘乙酸(NAA)的Murashige and Skoog(MS)培养基]中。一旦形成良好的根系，则将植物从容器中移出，用流水清洗掉大部分琼脂，并转移到潮湿的盆栽土中，用罐遮盖以避免干燥。然后将它们放入湿度箱中，并缓慢移开遮盖物以使更多空气进入，使植物强壮。

实施例6：转化体的鉴定：

使用des9基因特异性引物通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定作为转基因植物的再生植株。将从再生转化植株得到的T1种子胚切成较小的块并置于含有卡那霉素的筛选平板中。从转基因植物得到的胚或都为绿色，或为绿色和灰白色的结合(比例取决于整合的转基因的数量)，而从非转基因植物得到的种子都为灰白色。这是由于二元载体被构建为携带与des9基因串连的新霉素磷酸转移酶(NptII)基因。

通过DNA(Southern)印迹分析确定des9基因整合到芸苔基因组中。根据Dellaporta等人(1983)分离从幼叶得到的基因组DNA。用只在二元载体的表达盒一端剪切的限制性内切酶消化10μg基因组DNA。然后被消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，按照厂商的指导转移至尼龙膜(Amersham加拿大有限公司，渥克维尔，多伦多)，并用通过随机引物标记而标记有[α-32P]-dCTP的des9基因(生命技术公司(LifeTechnologies)，格兰德艾兰，纽约)探测。按照Sambrook等人(1989)，在65℃下进行杂交和清洗印记。

des9基因在转基因芸苔植物中的表达通过RT-PCR和RNA(Northern)印迹由RNA分析而确定。按照Verwoerd等人(1989)中描述的方法从幼叶提取总RNA。该RNA在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行电泳，在尼龙膜上印迹并与des9基因探针杂交。杂交和清洗条件与DNA杂交的条件相同。

实施例7：种子的脂肪酸分析：

按照国际标准化组织方法参考号ISO 5508：1990(E)，“Animal andvegetable fats and oils-Analysis by gas chromatography of methyl esters offatty acids(动物和植物脂肪和油-通过气相色谱分析脂肪酸的甲基酯)”确定从成熟种子得到的总酰基脂质的脂肪酸组成。在5mL聚丙烯瓶中的1mL石油醚中用钢棒碾碎50～100mg种子。粗粉沉降后，将0.5mL上清液转移到含有1.2mL甲基化溶液(2％甲氧基钠的甲醇溶液)的玻璃管中。彻底混合后，溶液在室温下孵化30分钟。向上述溶液中加入1mL双蒸水，充分混合并在室温下放置10分钟以使相分离。分离后，从上层取200μL，在GC自动取样瓶中用另外300μL石油醚稀释，并取1μL注入到GC柱中。

以氦为载气于28.0mL/分钟的流速下，在装有30m×0.25mm(i.d.)柱(HP-INNOWAX，交联聚乙二醇)的火焰离子化气相色谱仪(型号6890，Hewlett Packard，密西沙加，多伦多)上进行FAME的分离。箱温度为以5℃/分钟的速度从180℃升至230℃，并在230℃保持13分钟。通过与FAME标准品的保留时间比较来确定峰，且FAME的相对比例测定为总峰面积的百分比。

表1：携带与编码KKSS(SEQ ID No.5)ER回收和驻留信号连接的来源于蓝细菌的des9基因(SEQ ID No.1)的转基因芸苔植物(C8-19.1)、只携带des9基因的转基因植物(C7-15)和非转化植物(WT)的种子的脂肪酸含量(mol％)。

	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	18:3	20:0	20:1	22:0	22:1	饱和的
	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	18:3	20:0	20:1	22:0	22:1	饱和的	WT	4.1	0.3	2.0	66.2	17.6	7.2	0.7	1.2	0.4	0.1	7.2
C7	4.0	0.4	1.9	66.4	17.8	7.0	0.6	1.2	0.4	0.1	6.9	WT	4.1	0.3	2.0	66.2	17.6	7.2	0.7	1.2	0.4	0.1	7.2
C7	4.0	0.4	1.9	66.4	17.8	7.0	0.6	1.2	0.4	0.1	6.9	C8	2.1	2.0	1.2	67.2	18.0	7.1	0.6	1.2	0.3	0.1	4.3

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U.S.patent No.：6,683,232.

US patent application publication No.：20040078845.

序列表

<110>阿尔伯达研究理事会股份公司(Alberta Research Council Inc.)

<120>具有降低的饱和脂肪酸水平的转基因植物及其制备方法

<130>IP06-0944-XC34

<140>PCT/CA2004/002156

<141>2004-12-17

<150>CA 2,450,000

<151>2003-12-18

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>837

<212>DNA

<213>蓝细菌(Anacystis nidulans)

<400>1

atgacccttg ctatccgacc caagcttgcc ttcaactggc cgaccgccct gttcatggtc 60

gccattcaca ttggagcact gttagcgttc ctgccggcca actttaactg gcccgctgtg 120

ggcgtgatgg ttgcgctgta ttacattacc ggttgttttg gcatcaccct aggctggcac 180

cggctaattt cgcaccgtag ctttgaagtt cccaaatggc tggaatacgt gctggtgttc 240

tgtggcacct tggccatgca gcacggcccg atcgaatgga tcggtctgca ccgccaccat 300

cacctccact ctgaccaaga tgtcgatcac cacgactcca acaagggttt cctctggagt 360

cacttcctgt ggatgatcta cgaaattccg gcccgtacgg aagtagacaa gttcacgcgc 420

gatatcgctg gcgaccctgt ctatcgcttc tttaacaaat atttcttcgg tgtccaagtc 480

ctactggggg tacttttgta cgcctggggc gaggcttggg ttggcaatgg ctggtctttc 540

gtcgtttggg ggatcttcgc ccgcttggtg gtggtctacc acgtcacttg gctggtgaac 600

agtgctaccc acaagtttgg ctaccgctcc catgagtctg gcgaccagtc caccaactgc 660

tggtgggttg cccttctggc ctttggtgaa ggctggcaca acaaccacca cgcctaccag 720

tactcggcac gtcatggcct gcagtggtgg gaatttgact tgacttggtt gatcatctgc 780

ggcctgaaga aggtgggtct ggctcgcaag atcaaagtgg cgtctccaaa caactaa 837

<210>2

<211>278

<212>PRT

<213>蓝细菌(Anacystis nidulans)

<400>2

Met Thr Leu Ala Ile Arg Pro Lys Leu Ala Phe Asn Trp Pro Thr Ala

1 5 10 15

Leu Phe Met Val Ala Ile His Ile Gly Ala Leu Leu Ala Phe Leu Pro

20 25 30

Ala Asn Phe Asn Trp Pro Ala Val Gly Val Met Val Ala Leu Tyr Tyr

35 40 45

Ile Thr Gly Cys Phe Gly Ile Thr Leu Gly Trp His Arg Leu Ile Ser

50 55 60

His Arg Ser Phe Glu Val Pro Lys Trp Leu Glu Tyr Val Leu Val Phe

65 70 75 80

Cys Gly Thr Leu Ala Met Gln His Gly Pro Ile Glu Trp Ile Gly Leu

85 90 95

His Arg His His His Leu His Ser Asp Gln Asp Val Asp His His Asp

100 105 110

Ser Asn Lys Gly Phe Leu Trp Ser His Phe Leu Trp Met Ile Tyr Glu

115 120 125

Ile Pro Ala Arg Thr Glu Val Asp Lys Phe Thr Arg Asp Ile Ala Gly

130 135 140

Asp Pro Val Tyr Arg Phe Phe Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Val Gln Val

145 150 155 160

Leu Leu Gly Val Leu Leu Tyr Ala Trp Gly Glu Ala Trp Val Gly Asn

165 170 175

Gly Trp Ser Phe Val Val Trp Gly Ile Phe Ala Arg Leu Val Val Val

180 185 190

Tyr His Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr

195 200 205

Arg Ser His Glu Ser Gly Asp Gln Ser Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala

210 215 220

Leu Leu Ala Phe Gly Glu Gly Trp His Asn Asn His His Ala Tyr Gln

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Arg His Gly Leu Gln Trp Trp Glu Phe Asp Leu Thr Trp

245 250 255

Leu Ile Ile Cys Gly Leu Lys Lys Val Gly Leu Ala Arg Lys Ile Lys

260 265 270

Val Ala Ser Pro Asn Asn

275

<210>3

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<220>

<221>SITE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa为任一氨基酸

<220>

<221>SITE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa为任一氨基酸

<400>3

Lys Lys Xaa Xaa

1

<210>4

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<400>4

Lys Asp Glu Leu

1

<210>5

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<400>5

Lys Lys Ser Ser

1

<210>6

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<400>6

His Asp Glu Phe

1

<210>7

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<400>7

Lys Glu Glu Leu

1

<210>8

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>内质网驻留和回收信号序列

<400>8

Lys Asp Gln Leu

1

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

cccccctcga gatgaccctt gctatccgac ccaag 35

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>10

cccccctcga gttagttgtt tggagacgcc actttg 36

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ccccccctcg agttaagaag actttttgtt gtttggagac gccac 45

Claims

1、一种重组多肽，包括与内质网驻留和回收信号序列可操作地连接的来源于原核生物的Δ-9去饱和酶。

2、根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述的原核生物为细菌。

3、根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述的原核生物为属于选自包括水花微囊藻属、粗集胞属和鱼腥藻属的组的属的藻青菌蓝绿藻。

4、根据权利要求3所述的重组多肽，其中所述的藻青菌为蓝细菌(Anacystis nidulans)。

5、根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述的Δ-9去饱和酶包括：

(a)具有SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列的多肽；

(b)与(a)中所限定的多肽具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，且具有Δ-9去饱和酶活性的(a)所限定的多肽的变异体或同源物；和

(c)与(a)中限定的多肽具有至少约50个相同的连续氨基酸，且具有Δ-9去饱和酶活性的(a)所限定的多肽的片断。

6、根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述的Δ-9去饱和酶具有SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列。

7、根据权利要求1～6的任一项所述的重组多肽，其中所述的内质网膜驻留和回收信号具有选自包括以下氨基酸序列的组的氨基酸序列：

(a)KDEL，SEQ ID No.4；

(b)KKXX，SEQ ID No.3，其中X为任一氨基酸；

(c)HDEF，SEQ ID No.6；

(d)KEEL，SEQ ID No.7；和

(e)KDQL，SEQ ID No.8。

8、根据权利要求7所述的重组多肽，其中所述的内质网膜驻留和回收信号具有氨基酸序列KKSS，SEQ ID No.5。

9、一种编码权利要求1～8的任一项中所限定的重组多肽的核酸分子。

10、一种包括与启动子可操作地连接的权利要求9的核酸分子的载体。

11、一种用权利要求10的载体转化的宿主细胞。

12、根据权利要求11所述的宿主细胞，来源于油种子植物。

13、根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述的油种子植物选自包括芸苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄榄、棕榈、椰子、红花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鳄梨和亚麻的组。

14、根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述的油种子植物为芸苔。

15、一种转基因植物细胞，包括包含与导致重组多肽在所述的转基因植物细胞中表达的启动子可操作地连接的权利要求9的核酸分子的转基因元件。

16、根据权利要求15所述的转基因植物细胞，来源于油种子植物。

17、根据权利要求16所述的转基因植物细胞，其中所述的油种子植物选自包括芸苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄榄、棕榈、椰子、红花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鳄梨和亚麻的组。

18、根据权利要求16所述的转基因植物细胞，其中所述的油种子植物为芸苔。

19、一种生产转基因植物的方法，包括：

(a)用权利要求9的核酸或包括这种核酸的载体转化植物细胞，其中，所述的核酸与导致重组多肽在所述的植物细胞中表达的启动子可操作地连接；和

(b)由步骤(a)中产生的转化植物细胞再生植株。

20、根据权利要求19所述的方法，其中所述的植物细胞来源于油种子植物。

21、根据权利要求20所述的方法，其中所述的油种子植物选自包括芸苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄榄、棕榈、椰子、红花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鳄梨和亚麻的组。

22、根据权利要求20所述的方法，其中所述的油种子植物为芸苔。

23、一种转基因植物，包括含有与导致重组多肽在所述的转基因植物中表达的启动子可操作地连接的权利要求9的核酸分子的转基因元件。

24、根据权利要求23所述的转基因植物为油种子植物。

25、根据权利要求24所述的转基因植物，其中所述的油种子植物选自包括芸苔、大豆、玉米、花生、向日葵、橄榄、棕榈、椰子、红花、棉籽、芥菜、芝麻、大麻、蓖麻、鳄梨和亚麻的组。

26、根据权利要求24所述的转基因植物，其中所述的油种子植物为芸苔。

27、根据权利要求23～26的任一项所述的转基因植物，其与相同品种的野生型植株相比，产生了具有降低的饱和脂肪酸含量的油。

28、根据权利要求27所述的转基因植物，其中所述的种子油的饱和脂肪酸含量与所述的野生型植株相比，降低了约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％或更多。

29、权利要求23～28的任一项所述的转基因植物在生产与相同品种的野生型植株相比具有降低的饱和脂肪酸含量的种子油中的应用。

30、根据权利要求29所述的应用，其中所述种子油的饱和脂肪酸含量与所述的野生型植株相比，降低了约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％或更多。

31、根据权利要求29所述的应用，其中所述的转基因植物为芸苔。

32、根据权利要求31所述的应用，其中所述的种子油具有低于约7mol％的饱和脂肪酸含量。

33、根据权利要求31所述的应用，其中所述的种子油具有约4.0％～约4.5％的饱和脂肪酸含量。