ES2525212T3 - Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la producción de compuestos de la siguiente fórmula general I**Fórmula** en planta que produce aceite transgénica con un contenido de al menos el 1 % en peso de dichos compuestos referido al contenido en lípidos total de dicha planta que produce aceite que comprende las siguientes etapas: a) introducción de al menos un ácido nucleico en una planta que produce aceite transgénica, que codifica una Δ-9-elongasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 3, e b) introducción de al menos un segundo ácido nucleico que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 1 y c) si es necesario introducción de al menos un tercer ácido nucleico, que codifica una Δ-5-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.ºs: 5, 7 o 9, y d) cultivo y cosecha de dicha planta que produce aceite; y donde las variables y sustituyentes en fórmula I tienen los siguientes significados: R1 >= hidroxil-, Coenzima A-(Tioéster), fosfatidilcolina-, fosfatidil-etanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido- o un residuo de fórmula general II:**Fórmula** R2 >= hidrógeno-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido- o -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, R3 >= hidrógeno-, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientes el uno del otro son un residuo de la fórmula Ia:**Fórmula** n >= 3, 4 o 6, m >= 3, 4 o 5 y p >= 0 o 3.

Description

Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados
La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado de producción específica de ácidos grasos ω-3 y ω-6 poliinsaturados y a un procedimiento para la producción de triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, en particular ácidos grasos ω-3 y ω-6 que tienen al menos dos enlaces dobles y una longitud de cadena de 20 o 22 átomos de carbono. La invención se refiere a la producción de un aceite transgénico que produce una planta, que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que contienen ácidos grasos de C20 o de C22 con un doble enlace Δ5, 7, 8, 10, debido respectivamente a la expresión de una Δ8-desaturasa y una Δ9-elongasa de organismos tales como plantas preferentemente algas como Isochrysis galbana o Euglena gracilis. Además la invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido Eicosapentaenoico, Araquidónico, Docosapentaenoico o Docosahexaenoico por la coexpresión de una Δ-8-desaturasa, una Δ-9-elongasa y una Δ-5 desaturasa en organismos tales como plantas.
La invención adicionalmente se refiere al uso de secuencias de ácidos nucleicos específicas que codifican para las proteínas mencionadas anteriormente con actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa o Δ-5-desaturasa, construcciones de ácidos nucleicos, vectores y organismos que contienen dichas secuencias de ácidos nucleicos. También se describen ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de al menos el 1 % en peso de ácidos grasos insaturados y uso de los mismos.
Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria alimentaria, la nutrición animal, los cosméticos y el sector farmacéutico. Dependiendo de si son ácidos grasos saturados o insaturados libres o triglicéridos con un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para las aplicaciones más variadas; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados (= PUFA) se añaden a preparado para lactantes para incrementar su valor nutricional. Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente a partir de microorganismos tales como Mortierella o de plantas que producen aceite tales como soja, colza oleaginosa, girasol y otras, donde se obtienen usualmente en forma de sus triglicéridos. Alternativamente, se obtienen ventajosamente de animales, tales como el pescado. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente por hidrólisis.
Si se prefieren los aceites con ácidos grasos insaturados o con ácidos grasos saturados depende del propósito deseado; así, por ejemplo, los lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente con ácidos grasos poliinsaturados, se prefieren en nutrición humana dado que tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre y así en la posibilidad de enfermedad cardíaca. Se usan en una diversidad de productos alimenticios dietéticos
o medicamentos. Además PUFA se usan comúnmente en alimentación, piensos y en la industria cosmética. Los ácidos grasos poliinsaturados ω-3 y/o ω-6 son una parte importante de los piensos para animales y de la alimentación humana. Debido a la composición común de los ácidos grasos ω-3 poliinsaturados de alimentación humana, que son un componente esencial del aceite de pescado, deberían añadirse a la alimentación para incrementar el valor nutricional de la alimentación; así, por ejemplo, se añaden ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido docosahexaenoico (= DHA, C22:6Δ4,7,10,13,16,19) o ácido eicosapentaenoico (= EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17) como se menciona anteriormente a preparado para lactantes para incrementar su valor nutricional. Tomando en cuenta que DHA tiene un efecto positivo en el desarrollo cerebral de los bebés. La adición de ácidos grasos ω-3 poliinsaturados se prefiere
Δ5,8,11,14)
como la adición de ácidos grasos ω-6 poliinsaturados como ácido araquidónico (= ARA, C20:4a la alimentación común tiene un efecto indeseado por ejemplo en enfermedades reumáticas tales como artritis reumatoide. Los ácidos grasos ω-3 y ω-6-poliinsaturados son precursores de una familia de hormonas paracrinas llamadas eicosanoides tales como prostaglandinas que son productos del metabolismo de ácido Dihomo-γ-linoleico, ARA o EPA. Los eicosanoides están implicados en la regulación de lipolisis, la iniciación de respuestas inflamatorias, la regulación de la circulación de la sangre y otras funciones centrales del cuerpo. Los eicosanoides comprenden prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos y prostaciclinas. Los ácidos grasos ω-3-parecen evitar aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares principalmente regulando los niveles de diferentes eicosanoides. Otros Eicosanoides son los tromboxanos y leucotrienos que son productos del metabolismo de ARA o EPA.
Principalmente microorganismos tales como Mortierella o plantas que producen aceite tales como soja, colza o girasol
o algas tales como Crytocodinium o Phaeodactylum son una fuente común de aceites que contienen PUFA, donde se obtienen usualmente en forma de sus triacilglicéridos. Alternativamente, se obtienen ventajosamente de animales, tales como el pescado. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente por hidrólisis con una base fuerte tal como hidróxido de potasio o de sodio. Ácidos grasos poliinsaturados superiores tales como DHA, EPA, ARA, ácido Dihomo-γ-linoleico (C20:3Δ8,11,14) o ácido Docosapentaenoico (= DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19) no se producen por plantas productoras de aceite tales como soja, semilla de colza, cártamo o girasol. Una fuente natural para dichos ácidos grasos son pescados por ejemplo arenque, salmón, sardina, gallineta, anguila, carpa, trucha, fletán, caballa, lucioperca o atún o algas.
A causa de sus propiedades positivas no ha habido escasez de intentos en el pasado para hacer disponibles genes que participan en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos que tienen un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, en el documento WO 91/13972 y su equivalente de los EE.UU. se describe una Δ-9-desaturasa. En el documento WO 93/11245 se reivindica una Δ-15-desaturasa y en el documento WO 94/11516 se reivindica una Δ-12-desaturasa. El documento WO 00/34439 divulga una Δ-5-y una
Δ-8-desaturasa. Se describen otras desaturasas, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 550162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. Hasta la fecha, sin embargo, las diversas desaturasas se han caracterizado bioquímicamente solo inadecuadamente dado que las enzimas en forma de proteínas unidas a membranas son aislables y caracterizables solo con dificultad muy grande (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Generalmente, las desaturasas unidas a membrana se caracterizan por medio de introducción en un organismo adecuado que se investiga para actividad enzimática por medio de análisis de materiales y productos de partida. Las Δ-6-desaturasas se describen en los documentos WO 93/06712, US 5.614.393, US 5614393, WO 96/21022, W00021557 y WO 99/27111 y su aplicación a producción en organismos transgénicos se describe también, por ejemplo en los documentos WO 9846763, WO 9846764 y WO 9846765. Al mismo tiempo se describen y reivindican también la expresión de diversos genes de biosíntesis de ácidos grasos, como en el documento WO 9964616 o en el documento WO 9846776 y la formación de ácidos grasos poliinsaturados.
Se conocen a partir del documento US2002/0138874 A1 la identificación y los usos de varios genes implicados en la elongación de ácidos grasos monoinsaturados, especialmente una elongasa funcionalmente activa, que utiliza un ácido graso monoinsaturado como un sustrato. El documento WO 02/077213 A3 describe un gen de elongasa que codifica un polipéptido que elonga ácido α-linolénico en al menos dos átomos de carbono mientras que el ácido γ-linolénico no se elonga.
Con respecto a la efectividad de la expresión de desaturasas y a su efecto en la formación de ácidos grasos poliinsaturados puede destacarse que por la expresión de desaturasas y elongasas como se describe hasta la fecha solo se han logrado contenidos bajos de ácidos grasos poliinsaturados/lípidos, tales como a modo de ejemplo ácido eicosapentaenoico o ácido araquidónico. Por lo tanto, es deseable una ruta alternativa y más efectiva con rendimiento de producto más alto.
De acuerdo con lo anterior, existe aún una gran demanda de genes nuevos y más adecuados que codifican enzimas que participan en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y hacen posible producir ciertos ácidos grasos específicamente en una escala industrial sin formación de subproductos indeseados. En la selección de genes para biosíntesis dos características sobre todo son particularmente importantes. Por un lado, hay como siempre una necesidad de procedimientos mejorados para obtener los contenidos más altos posibles de ácidos grasos poliinsaturados.
De acuerdo con lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar genes adicionales de enzimas desaturasa y elongasa para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados en organismos preferentemente en microorganismos y plantas y para usarlos en un procedimiento comercial para la producción de ácidos grasos poliinsaturados. Dichos procedimientos incrementarían contenido de PUFA en organismos tanto como sea posible preferentemente en semillas de una planta que produce aceite.
Los presentes inventores han encontrado que este objeto se logra por un procedimiento para la producción de compuestos de la siguiente fórmula general
en planta que produce aceite transgénica con un contenido de al menos el 1 % en peso de dichos compuestos referido
al contenido en lípidos total de dicha planta que produce aceite que comprende las siguientes etapas: a) introducción de al menos una secuencia de ácido nucleico en una planta que produce aceite transgénica, que codifica una Δ-9-elongasa que tiene una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEC ID N.º: 3 e
b) introducción de al menos una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene
una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEC ID N.º: 1 y c) si es necesario introducción de al menos una tercera secuencia de ácido nucleico, que codifica una Δ-5-desaturasa que tiene una secuencia de ácido nucleico representada en SEC ID N.º: 5, 7 o 9 y
d) cultivo y cosecha de dicha planta que produce aceite; y donde las variables y sustituyentes en fórmula I tienen los siguientes significados:
R1 = hidroxil-, Coenzima A-(Tioéster), fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-o un residuo de fórmula general II:
en la que los sustituyentes en fórmula II tienen los siguientes significados: R2 = hidrógeno-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-,
fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido-o -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, R3 = hidrógeno-, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientes el uno del otro son un residuo de fórmula la:
n = 3, 4 o 6, m = 3, 4 o 5 y p = 0 o 3, preferentemente n = 3, m = 4 o 5 y p = 0 o 3.
R1 indica en la fórmula I hidroxil-, Acetil-Coenzima A-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-o un residuo de fórmula general II
Los residuos anteriormente mencionados para R1 están siempre acoplados a compuestos de la fórmula general I en forma de su éster o tioéster.
R2 indica en estructuras de fórmula general II hidrógeno, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido-o residuos -alquilcarbonil C2-C24 saturados o insaturados,
Los radicales alquilo que se pueden mencionar son cadenas de -alquilcarbonil C2-C24 sustituidas o no sustituidas, saturadas o insaturadas tales como etilcarbonil-, n-propilcarbonil-, n-butilcarbonil-, n-pentilcarbonil-, n-hexilcarbonil-, nheptilcarbonil-, n-octil-carbonil-, n-nonilcarbonil-, n-decilcarbonil-, n-undecilcarbonil-, n-dodecilcarbonil-, n-tridecilcarbonil-, n-tetradecilcarbonil-, n-pentadecilcarbonil-, n-hexadecilcarbonil-, n-heptadecilcarbonil-, n-octadecil-carbonil-, n-nonadecilcarbonil-, n-eicosilcarbonil-, n-docosanilcarbonil-o n-tetracosanilcarbonil-, que contienen uno o más dobles enlaces. Se prefieren residuos -alquilcarbonil C10-C22 saturados o insaturados tales como n-decilcarbonil-, n-undecil-carbonil-, n-dodecilcarbonil-, n-tridecilcarbonil-, n-tetra-decilcarbonil-, n-pentadecilcarbonil-, n-hexadecilcarbonil-, n-heptadecilcarbonil-, n-octadecilcarbonil-, n-nonadecilcarbonil-, n-eicosilcarbonil-, n-docosanil-carbonil-o n-tetracosanilcarbonil-, que contienen uno o más dobles enlaces. En particular se distinguen residuos -alquilcarbonil C10-C22 saturados o insaturados como residuo -alquilcarbonil C10, -alquilcarbonil C11, -alquilcarbonil C12, -alquilcarbonil C13, -alquilcarbonil C14, -alquilcarbonil C16, -alquilcarbonil C18, -alquilcarbonil C20, -alquilcarbonil C22 o -alquilcarbonil C24, que contienen uno o más dobles enlaces. En particular se distinguen residuos -alquilcarbonil C16-C22 saturados o insaturados como residuo de -alquilcarbonil C16, -alquilcarbonil C18, -alquilcarbonil C20 o -alquilcarbonil C22, que contienen uno o más dobles enlaces. Los residuos contienen en particular dos, tres, cuatro o cinco enlaces dobles. En particular se prefieren residuos de 20 o 22 átomos de carbono que tengan hasta cinco enlaces dobles, preferentemente tres, cuatro o cinco enlaces dobles. Todos los residuos se derivan de los ácidos
grasos correspondientes mencionados.
R3 indica en estructuras de fórmula general II hidrógeno, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado.
Los residuos -alquilcarbonil C2-C24 sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados son por ejemplo etilcarbonil-, n-propilcarbonil-, n-butilcarbonil-, n-pentilcarbonil-, n-hexil-carbonil-, n-heptilcarbonil-, n-octilcarbonil-, n-nonil-carbonil-, n-decilcarbonil-, n-undecilcarbonil-, n-dodecilcarbonil-, n-tridecilcarbonil-, n-tetradecilcarbonil-, n-pentadecilcarbonil-, n-hexadecilcarbonil-, n-heptadecilcarbonil-, n-octadecilcarbonil-, n-nonadecilcarbonil-, n-eicosil-carbonil-, n-docosanilcarbonil-o n-tetracosanilcarbonil-, que tienen uno o más dobles enlaces. Se prefieren residuos -alquilcarbonil C10-C24 saturados o insaturados como n-decilcarbonil-, n-undecilcarbonil-, n-dodecilcarbonil-, n-tridecil-carbonil-, n-tetradecilcarbonil-, n-pentadecilcarbonil-, n-hexadecilcarbonil-, n-heptadecilcarbonil-, n-octadecilcarbonil-, n-nonadecilcarbonil-, n-eicosilcarbonil-, n-docosanilcarbonil-o n-tetracosanilcarbonil-, con uno o más dobles enlaces. En particular residuos -alquilcarbonil C10-C24 saturados o insaturados como residuos C10-alquilcarbonil-, C11-alquil-carbonil-, C12-alquilcarbonil-, C13-alquilcarbonil-, C14-alquilcarbonil-, C16-alquilcarbonil-, C18-alquilcarbonil-, C20-alquil-carbonil-, C22-alquilcarbonil-o C24-alquilcarbonil-con uno o más dobles enlaces. En particular se prefieren residuos -alquilcarbonil C16-C22 saturados e insaturados como residuos C16-alquilcarbonil-, C18-alquilcarbonil-, C20-alquilcarbonil-o C22-alquilcarbonil-, con enlaces dobles múltiples. Se prefieren en particular residuos C18-alquilcarbonil-, que contienen uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces y C20-alquilcarbonil-, con tres, cuatro
o cinco enlaces dobles. Todos los residuos se derivan de los ácidos grasos correspondientes.
R2 y R3 indican en estructuras de fórmula general II independientes una de otra un residuo de fórmula general la
mientras que las variables en las fórmula I y la se definen como: n = 3, 4 o 6, m = 3, 4 o 5 y p = 0 o 3. En particular: n = 3, m = 4 o 5 y p = 0 o 3.
Los residuos mencionados anteriormente R1, R2 y R3 pueden sustituirse con grupos hidroxilo o epoxi o podrían contener también enlaces triples.
De acuerdo con la invención las secuencias de ácidos nucleicos usadas son secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican para polipéptidos que tienen actividad C20-Δ5-o Δ-8-desaturasa o C18-Δ9-elongasa.
El procedimiento de acuerdo con la invención sintetizó sustancias de fórmula I que contienen como residuo R1 el residuo de fórmula II contiene preferencialmente una mezcla de residuos R2 o R3 diferentes. Los residuos se derivan de diferentes moléculas de ácidos grasos como ácidos grasos de cadena corta con 4 a 6 átomos de carbono, ácidos grasos de cadena media que tienen 8 a 12 átomos de carbono y ácidos grasos grasos de cadena larga con 14 a 24 átomos de carbono, aunque se prefieren los ácidos grasos de cadena larga. Dichos ácidos grasos de cadena larga se derivan preferencialmente de ácidos grasos poliinsaturados C18-o C20-que tienen ventajosamente entre dos y cinco dobles enlaces. Además el armazón de fórmula I se deriva también de un ácido graso tal mencionado anteriormente que ventajosamente es también diferente de R2 y R3. Eso quiere decir que compuestos que se producen por el procedimiento de la invención son en un aspecto de la invención triglicéridos de ésteres o tioésteres de ácidos grasos sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados.
También se divulgan ésteres de ácidos grasos poliinsaturados (de la fórmula I) con longitud de cadena de 18, 20 o 22 átomos de carbono de ácidos grasos con al menos dos dobles enlaces, preferentemente tres, se prefieren particularmente cuatro o cinco.
En particular se prefieren las moléculas de ácidos grasos con tres, cuatro o cinco dobles enlaces para la síntesis de ácido eicosadienoico, ácido eicosatrienoico, ácido eicosatetraenoico (ácido araquidónico) y ácido eicosapentanoico (C20:2n-6, Δ11, 14; C20:3n-6, Δ8, 11, 14; C20:4n-6, Δ5, 8, 11, 14, C20:3n-3, Δ11, 14, 17; C20:4n-3, Δ8, 11, 14, 17; C20:5n-3, Δ5, 8, 11, 14, 17) en el procedimiento de la invención, mientras que son los más preferidos el ácido araquidónico y el ácido eicosapentaenoico. Los presentes inventores han encontrado que este objeto se logra ventajosamente por la expresión combinada de tres secuencias de ácidos nucleicos aisladas de acuerdo con la invención que codifican para polipéptidos que tienen las siguientes actividades: un polipéptido con actividad C20-Δ-8-desaturasa, una actividad C18-Δ-9-elongasa y una actividad C20-Δ-5-desaturasa. Este objetivo se logró en particular por la co-expresión de la secuencias de ácidos nucleicos aisladas de acuerdo con la invención. Los ácidos grasos C18 con un enlace doble en posición Δ-9 se elongan por la Δ-9-elongasa usada ventajosamente en el procedimiento de la invención. Por medio de la Δ-8-desaturasa usada en el procedimiento se introduce un enlace doble en posición Δ-8 en ácidos grasos C20. Además un doble enlace puede introducirse en las moléculas de ácidos
grasos en posición Δ-5 por la Δ-5-desaturasa.
El éster de ácidos grasos de ácidos grasos poliinsaturados de C18, C20 y/o C22 sintetizados en el procedimiento de la invención ventajosamente en forma de sus triglicéridos como éster o tioésteres se puede aislar a partir del organismo productor por ejemplo a partir de un microorganismo o una planta en forma de un aceite, lípido o mezcla de lípidos por ejemplo como esfingolípidos, fosfoglocéridos, lípidos, glucolípidos tales como glucoesfingolípidos, fosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol, o como monoacilglicérido, diacilglicérido o triacilglicérido o como otros ésteres de ácidos grasos tales como tioéster de acetil-Coenzima A, que contiene ácidos grasos saturados e insaturados preferentemente ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos preferentemente al menos tres enlaces dobles en la molécula de ácido graso. Además de en la forma de los ácidos grasos unidos a ésteres mencionada anteriormente también se pueden producir ácidos grasos unidos en otros compuestos o también se pueden producir ácidos grasos libres por el procedimiento de la invención.
En general las plantas que producen aceite transgénicas usadas en el procedimiento de la invención contienen ésteres de ácidos grasos o ácidos grasos en una distribución de aproximadamente el 80 al 90 % en peso de triacilglicéridos, diacilglicéridos al 2 al 5 % en peso, monoacilglicéridos al 5 al 10 % en peso, ácidos grasos libres al 1 al 5 % en peso y fosfolípidos al 2 al 8 % en peso, considerando que la cantidad total de los compuestos mencionados anteriormente son todos juntos un 100 % en peso.
En el/los procedimiento(s) de la invención [el singular incluirá el plural y viceversa] se produce al menos el 1 % en peso, preferentemente al menos el 2, 3, 4 o 5 % en peso, más preferentemente al menos el 6, 7, 8, o 9 % en peso, lo más preferentemente al menos el 10, 20 o 30 % en peso de los compuestos de fórmula I referidos al contenido en lípidos total del organismo usado en el procedimiento. El material preferido de partida para el procedimiento de la invención es ácido linoleico (C18:2) y/o ácido linolénico (C18:3) que se transforman en los productos finales preferidos ARA o EPA. Como para el procedimiento de la invención se usan organismos el producto del procedimiento no es una sustancia pura per se. Es una mezcla de diferentes sustancias de fórmula I donde uno o más compuestos son el producto principal y otros están contenidos solo como productos secundarios. En el caso en que en un organismo usado en el procedimiento estén disponibles ácido linoleico y ácido linolénico el producto final es una mezcla de ARA y EPA. Ventajosamente los productos secundarios no excederán el 20 % en peso referido al contenido en lípidos totales del organismo, preferentemente los productos secundarios no excederán el 15 % en peso, más preferentemente no excederán el 10 % en peso, lo más preferentemente no excederán el 5 % en peso. Preferentemente se usan organismos en el procedimiento que contienen como material de partida bien ácido linoleico o bien ácido linolénico de tal forma que como producto final del procedimiento solo se producen ARA o EPA. En el caso de que EPA y ARA se produzcan juntos, se deberían producir en una proporción de al menos 1:2 (EPA:ARA), preferentemente de al menos 1:3, más preferentemente de al menos 1:4, lo más preferentemente de al menos 1:5. En el caso en que una mezcla de ácidos grasos diferentes tales como ARA y EPA sea el producto del procedimiento de la invención dichos ácidos grasos se pueden purificar adicionalmente por procedimiento conocido por una persona experta en la técnica tal como destilación, extracción, cristalización a temperaturas bajas, cromatografía o una combinación de dichos procedimientos.
En principio todos los organismos huéspedes se pueden usar en el procedimiento de la invención por ejemplo organismos transgénicos tales como plantas como musgos; algas verdes, rojas, pardas o azules; monocotiledóneas o dicotiledóneas. Ventajosamente las algas, musgos o plantas transgénicos que producen aceite se usan en los procedimientos de la invención descritos en el presente documento (para la invención el singular incluirá el plural y viceversa). Los organismos adicionales ventajosamente son plantas o partes de las mismas. Se usan preferentemente plantas, muy en particular preferentemente plantas tales como plantas oleaginosas que contienen cantidades altas de compuestos lipídicos tales como colza oleaginosa, amapola, mostaza, cáñamo, semilla de ricino, sésamo, aceituna, caléndula, granado, avellana, almendra, macadamia, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, onagra, canola, cacahuete, linaza, soja, cártamo, girasol, borraja o plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodón, tubérculos del género Manihot, pimienta, clavel moro, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies del género Vicia, guisante, alfalfa, plantas tupidas (café, cacao, té), especies del género Salix, árboles (palma de aceite, cocotero) y hierbas perennes y cultivos forrajeros. En particular las plantas preferidas de la invención son las plantas oleaginosas colza oleaginosa, amapola, mostaza, cáñamo, semilla de ricino, sésamo, aceituna, caléndula, granado, avellana, almendra, macadamia, aguacate, calabaza, laurel, pistacho, onagra, canola, cacahuete, linaza, soja, cártamo, girasol, borraja o árboles (palma de aceite, cocotero). Las más preferidas son las plantas ricas en ácidos grasos C18:2-y/o C18:3 tales como cáñamo, sésamo, linaza, amapola, calabaza, nuez, tabaco, algodón, cártamo o girasol.
Dependiendo del ácido nucleico y/o del organismo usado en los procedimientos de la invención se pueden sintetizar diferentes compuestos de la fórmula general I. Además dependiendo de la planta usada en el procedimiento se pueden producir diferentes mezclas de compuestos de fórmula I o compuestos individuales tales como ácido araquidónico o ácido eicosapentaenoico en forma libre o unida. En el caso en el que en los procedimientos de la invención se usen organismos que tengan como precursor de la síntesis de ácidos grasos preferentemente ácidos grasos C18:2 o C18:3 se pueden sintetizar ácidos grasos poliinsaturados diferentes por ejemplo se pueden producir partiendo de ácidos grasos C18:2 ácido γ-linoleico, ácido dihomo-γ-linoleico o ácido araquidónico o se pueden producir partiendo de ácidos grasos C18:3 ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico.
Influenciando la actividad de los diferentes genes o de sus productos génicos se pueden producir diferentes compuestos individuales o mezclas de compuestos. Ya que se usan organismos vivos en el procedimiento de la invención la materia prima que significa lípidos en bruto y/o aceites en bruto aislados a partir de los organismos contiene preferentemente al menos algunos compuestos de partida tales como ácidos grasos C18:2-o C18:3 o su combinación en el producto y dependiendo de la actividad de las secuencias de ácidos nucleicos y sus productos génicos intermedios de ácidos grasos de la cadena de biosíntesis. Dichos compuestos o intermedios de partida están en el producto en una concentración de menos del 20 o 15 % en peso, preferentemente menos del 10, 9, 8, 7 o 6 % en peso, más preferentemente menos del 5, 4, 3, 2 o 1 % en peso de los ácidos grasos totales aislados a partir del organismo usado.
Plantas transgénicas se debe entender como que significa células de plantas individuales y sus cultivos en medios sólidos o en cultivo líquido, partes de plantas o plantas enteras tales como cultivos de células vegetales, protoplastos de plantas, cultivos de callos o tejidos vegetales tales como hojas, brotes, semillas, flores, raíces etc. Dichas plantas transgénicas se pueden cultivar por ejemplo en medio de cultivo sólido o líquido, en suelo o en hidroponia.
Después del cultivo las plantas transgénicas que se usan en el procedimiento de la invención pueden salir al mercado sin aislar compuestos de la fórmula general I. Preferentemente los compuestos de la fórmula general I se aíslan de los organismos en la forma de sus ácidos grasos libres, sus lípidos o sus aceites. La purificación puede hacerse por procedimientos convencionales tales como exprimido y extracción de las plantas u otros procedimientos en lugar de la extracción tales como destilación, cristalización a temperaturas bajas, cromatografía o una combinación de dichos procedimientos. Ventajosamente las plantas se muelen, calientan y/o vaporizan antes del procedimiento de exprimido y extracción. Se usan como disolvente para la extracción disolventes tales como hexano. Los aceites aislados se purifican adicionalmente por acidificación con por ejemplo ácido fosfórico. Los ácidos grasos libres se producen a partir de dichos aceites o lípidos por hidrólisis. Se usan carbón activo o tierra de diatomeas para eliminar tintes del fluido. En otra realización preferida del procedimiento de la invención el éster de alquilo de los ácidos grasos se produce a partir de los aceites y lípidos por transesterificación con una enzima o con química convencional. Un procedimiento preferido es la producción del éster de alquilo en presencia de los alcoholatos de los alcoholes inferiores correspondientes (alcoholes C1 a C10 tales como metanol, etanol, propanol, butanol, hexanol etc.) tales como metanoato o etanoato. Por lo tanto como el trabajador experto sabe el alcohol en presencia de una cantidad catalítica de una base tal como NaOH o KOH se añade a los aceites o lípidos.
Se divulga también que los lípidos se pueden obtener de la manera usual después de que los organismos se han cultivado. Para este fin, los organismos pueden primero recogerse y después romperse, o pueden usarse directamente. Es ventajoso extraer los lípidos con disolventes adecuados tales como disolventes apolares, por ejemplo hexano, o disolventes polares, por ejemplo etanol, isopropanol, o mezclas tales como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, a temperaturas entre 0 ºC y 80 ºC, preferentemente entre 20 ºC y 50 ºC. Como una regla, la biomasa se extrae con un exceso de disolvente, por ejemplo con un exceso de disolvente frente a biomasa de
1:4. El disolvente se retira subsiguientemente, por ejemplo por destilación. La extracción puede también llevarse a cabo con CO2 supercrítico. Después de la extracción, el resto de la biomasa se puede retirar, por ejemplo, por filtración. Los procedimientos estándar de la extracción de ácidos grasos de plantas y microorganismos se describen en Bligh et al. (Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1959: 911-917) o Vick et al. (Plant Physiol. 69, 1982: 1103-1108).
El aceite en bruto se puede purificar después adicionalmente, por ejemplo eliminando turbidez añadiendo disolventes polares tales como acetona o disolventes apolares tales como cloroformo, seguido por filtración o centrifugación. La purificación adicional por medio de columnas u otras técnicas también es posible.
Para obtener los ácidos grasos libres a partir de los triglicéridos, los últimos se hidrolizan de la manera habitual, por ejemplo usando NaOH o KOH.
En el procedimiento se producen aceites, lípidos y/o ácidos grasos libres o fracciones de los mismos. Dichos productos se pueden usar para la producción de productos de piensos y de alimentación, cosméticos o productos farmacéuticos.
En principio todos los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa se pueden usar en el procedimiento de la invención. Preferentemente las secuencias de ácidos nucleicos se pueden aislar por ejemplo a partir de microorganismo o plantas tales como hongos tales como Mortierella, algas como Euglena, Crypthecodinium o Isochrysis, diatomeas como Phaeodactylum o musgos como Physcomitrella o Ceratodon, pero también animales no humanos tales como Caenorhabditis son posibles como fuente para las secuencias de ácidos nucleicos. Secuencias de ácidos nucleicos ventajosas que codifican polipéptidos que tienen una actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa se originan de microorganismos o plantas, ventajosamente Phaeodactylum tricomutum, Ceratodon purpureus, Physcomitrella patens, Euglena gracilis o Isochrysis galbana. Euglena gracilis o Isochrysis galbana son específicos para la conversión de ácidos grasos ω-3 u ω-6. Así, la coexpresión de una Δ-9 elongasa y una Δ-8-desaturasa específica de C20 conduce a la formación de ácido eicosatrienoico (C20:6n-Δ8, 11, 14) y ácido eicosatetraenoico (C20:3n-4, Δ8, 11, 14, 17). La coexpresión de un tercer gen que codifica para una Δ5-desaturasa específica de C20 conduce a la producción de ácido Araquidónico (C20:6n-4, Δ5, 8, 11, 14) o ácido Eicosapentaenoico (C20:3n-5, Δ5, 8, 11, 14, 17).
La invención divulga la secuencia de nucleótidos SEC ID, N.º: 1 y la secuencia de polipéptidos SEC ID N.º: 2. El/los
derivados de las secuencias de acuerdo con la invención es/son por ejemplo, homólogo(s) funcional(es) de los polipéptidos o enzimas codificadas por SEC ID N.º: 2, pero no es/son parte de la invención. También se divulgan los derivados de SEC ID N.º: 4; SEC ID N.º: 6; SEC ID N.º: 8 o SEC ID N.º: 10 que presentan la misma actividad enzimática específica citada, pero no son parte de la invención. Esta actividad enzimática específica permite ventajosamente la síntesis de ácidos grasos insaturados que tienen más de tres dobles enlaces en la molécula de ácidos grasos. Por ácidos grasos insaturados se quiere decir en lo que sigue ácidos grasos diinsaturados o poliinsaturados que poseen enlaces dobles. Los dobles enlaces pueden ser conjugados o no conjugados. Las citadas secuencias codifican enzimas que presentan actividad Δ-9 elongasa, Δ-8-desaturasa o -Δ5-desaturasa.
Cualquiera de las enzimas, Δ-9 elongasa, Δ-8-desaturasa o -Δ5-desaturasa, alarga ventajosamente cadenas de ácidos grasos con 18 átomos de carbono (véase SEC ID N.º: 2) o introduce un doble enlace en residuos de ácidos grasos de glicerolípidos, ácidos grasos libres o acil-CoA ácidos grasos en posición C8-C9 (véase SEC ID N.º: 4) o en posición C5-C6 (véase SEC ID N.º: 6; SEC ID N.º: 8 o SEC ID N.º: 10).
La(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención (para fines de la aplicación el singular abarca el plural y viceversa) o fragmentos de las mismas pueden usarse ventajosamente para aislar otras secuencias genómicas por medio de revisión de homología.
Las variantes alélicas incluyen en particular variantes funcionales obtenibles por deleción, inserción o sustitución de nucleótidos en .las secuencias representadas en SEC ID N.º: 1; SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 5; SEC ID N.º: 7 o SEC ID N.º: 9 reteniéndose la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas derivadas.
Empezando a partir de la secuencia de ADN descrita en SEC ID N.º: 1; SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 5; SEC ID N.º: 7 o SEC ID N.º: 9 o partes de dichas secuencias tales secuencias de ADN se pueden aislar usando, por ejemplo, procedimientos de hibridación normales o la técnica de PCR a partir de otros eucariotas tales como aquellos identificados anteriormente por ejemplo. Estas secuencias de ADN hibridan en condiciones convencionales con las citadas secuencias. Para hibridación se hace uso ventajosamente de oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas de una longitud promedio de aproximadamente 15 a 70 pb, preferentemente de aproximadamente17 a 60 pb, más preferentemente de aproximadamente 19 a 50 pb, lo más preferentemente de aproximadamente 20 a 40 pb, por ejemplo, que se pueden determinar por comparaciones con otros genes de desaturasas o de elongasas de la manera conocida por aquellos expertos en la técnica. Las secuencias de cajas de histidina se emplean ventajosamente. Sin embargo, fragmentos más largos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o las secuencias completas se pueden usar también para hibridación. Dependiendo del ácido nucleico empleado: oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa, o dependiendo de que tipo de ácido nucleico. ADN o ARN, se usa para hibridación estas condiciones convencionales varían. Así, por ejemplo, las temperaturas de fusión de híbridos ADN:ADN son aproximadamente 10 ºC más bajas que aquellas de híbridos ADN:ARN de la misma longitud.
Por condiciones convencionales se quiere decir, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico en cuestión temperaturas entre 42 ºC y 58 ºC en una solución tampón acuosa que tiene una concentración de entre 0,1 y 5 x SSC (SSC 1 X = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de formamida al 50 %, tal como a modo de ejemplo 42 ºC en SSC 5 x, formamida al 50 %. Las condiciones de hibridación para híbridos ADN:ADN son ventajosamente SSC 0,1 x y temperaturas entre aproximadamente 20 ºC y 45 ºC, preferentemente entre aproximadamente 30 ºC y 45 ºC. Para híbridos ADN:ARN las condiciones de hibridación son ventajosamente SSC x 0,1 y temperaturas entre aproximadamente 30 ºC y 55 ºC, preferentemente entre aproximadamente 45 ºC y 55 ºC. Estas temperaturas especificadas para hibridación son valores de temperaturas de fusión calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido de G + C del 50 % en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para hibridación del ADN se describen en libros de texto de genética relevantes tales como a modo de ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 y se pueden calcular por fórmulas conocidas para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo como una función de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido en G + C. Aquellos expertos en la técnica pueden utilizar los siguientes libros de texto para información adicional sobre hibridación: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press, Oxford.
Por homologos de las secuencias SEC ID N.º: 1; SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 5; SEC ID N.º: 7 y la SEC ID N.º: 9 se quiere decir derivados tales como a modo de ejemplo variantes de promotores. Estas variantes se pueden modificar por uno o más intercambios nucleotídicos, por inserción/inserciones y/o por deleción/deleciones sin, no obstante, afectar adversamente la funcionalidad o eficiencia de los promotores. Además, los promotores pueden tener su eficiencia incrementada alterando su secuencia o pueden reemplazarse completamente por promotores más efectivos incluso de organismos exógenos.
Por derivados se quiere decir ventajosamente variantes cuyas secuencia de nucleótidos se ha alterado ventajosamente en la región desde -1 hasta -2000 delante del codón de partida de tal modo que la expresión génica y/o la expresión proteica se modifican, preferentemente se incrementan. Además, por derivados se quiere decir también variantes que se han modificado en el extremo 3'.
Las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que codifican una Δ-8-desaturasa, una Δ-5-desaturasa y/o una Δ-9-elongasa se pueden producir por síntesis o se pueden obtener de forma natural o pueden contener una mezcla de componentes de ADN sintéticos y naturales así como consistir en diversos segmentos de genes de Δ-8-desaturasa, Δ-5-desaturasa y/o Δ-9-elongasa heterólogos de diferentes organismos. En general, las secuencias de nucleótidos sintéticas se producen con codones que se prefieren por los organismos huéspedes correspondientes, plantas por ejemplo. Esto da como resultado usualmente expresión óptima del gen heterólogo. Estos codones preferidos por plantas se pueden determinar a partir de codones que tienen la frecuencia de proteínas más alta que se expresa en la mayoría de las especies de plantas de interés. Un ejemplo que concierne a Corynebacterium glutamicum se proporciona en Wada et al. (1992), Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Tales experimentos se pueden llevar a cabo usando procedimientos estándar y se conocen por la persona experta en la técnica.
Además, las secuencias de ADN artificial son adecuadas, dado que, como se describe anteriormente, median la propiedad deseada, por ejemplo un incremento en el contenido de dobles enlaces de Δ-8 y/o Δ-5 en ácidos grasos, aceites o lípidos en organismos por sobreexpresión del gen de Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa en plantas de cultivo preferentemente. Tales secuencias de ADN artificiales pueden presentar actividad Δ-8 y/o Δ-5-desaturasa y/o Δ-9-elongasa, por ejemplo por retrotraducción de proteínas construidas por medio de elaboración de modelos moleculares, o pueden determinarse por selección in vitro. Las posibles técnicas para evolución in vitro de ADN para modificar o mejorar las secuencias de ADN se describen en Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) o en Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). En particular son adecuadas secuencias de ADN codificantes que se obtienen por retrotraducción de una secuencia polipeptídica de acuerdo con el uso de codones específico para la planta huésped. Aquellos expertos en la técnica familiarizados con los procedimientos de genética de plantas pueden determinar fácilmente el uso de codón específico por análisis de computadoras de otros genes conocidos de la planta a transformarse.
Otras secuencias de ácidos nucleicos equivalentes adecuadas que se pueden mencionar son secuencias que codifican proteínas de fusión, siendo un componente de la proteína de fusión un polipéptido de Δ-8-y/o un polipéptido de Δ-5-desaturasa y/o un polipéptido de Δ-9 elongasa o una parte funcionalmente equivalente de los mismos. La segunda parte de la proteína de fusión puede ser, por ejemplo, otro polipéptido que tiene actividad enzimática o una secuencia polipeptídica antigénica por medio de la que es posible demostrar expresión de Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa o Δ-9-elongasa (por ejemplo etiqueta de myc o etiqueta de his). Preferentemente, sin embargo, esta es una secuencia de proteína reguladora, tal como a modo de ejemplo una secuencia señal para el retículo endoplásmico (= ER) que dirige la proteína Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa y/o la proteína Δ-9-elongasa al punto de acción deseado, o secuencias reguladoras que influyen en la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, tales como promotores o terminadores. En otra realización preferida la segunda parte de la proteína de fusión es una secuencia de etiquetado plastidial como se describe por Napier J.A. [Targeting of foreign proteins to the chloroplast, Methods Mol. Biol., 49, 1995: 369-376]. Un vector usado preferido que comprende dicha secuencia de marcado de vector plastidial se divulga por Colin Lazarus [Guerineau F., Woolston S., Brooks L., Mullineaux P. "An expression cassette for targeting foreign proteins into chloroplast; Nucleic. Acids Res., diciembre 9, 16 (23), 1988: 11380].
Ventajosamente, los genes de la Δ-8-desaturasa y la Δ-9-elongasa y/o la Δ-5-desaturasa en el procedimiento de acuerdo con la invención se pueden combinar con otros genes para biosíntesis de ácidos grasos. Ejemplos de tales genes son los de aciltransferasas, otras desaturasas o elongasas tales como Δ-4-, Δ-5-o Δ-6-desaturasas o desaturasas específicas de ω-3-y/o de ω-6-tales como Δ-12 (para ácidos grasos C18), Δ-15 (para ácidos grasos C18) o Δ-19 (para ácidos grasos C22) y/o tales como Δ-5-o Δ-6-elongasas. Para síntesis in vivo y especialmente para síntesis in vitro es ventajosa la combinación con por ejemplo NADH citocromo B5 reductasas que pueden aceptar o liberar equivalentes de reducción.
Por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la invención se quiere decir proteínas que contienen una secuencia de aminoácidos representada en la secuencia SEC ID N.º: 2. También se divulgan las secuencias SEC ID N.º: 4; SEC ID N.º: 6; SEC ID N.º: 8 y la SEC ID N.º: 10. Para la estimación de una actividad enzimática que "no está sustancialmente reducida" o que tiene la "misma actividad enzimática" se determina la actividad enzimática de las secuencias derivadas y se compara con las actividades enzimáticas de tipo silvestre. Al hacer esto, por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden reemplazar por otros que tienen propiedades fisicoquímicas similares (rellenado de espacios, basicidad, hidrofobicidad, etc.). Por ejemplo, los residuos de arginina se intercambian por residuos de lisina, residuos de valina por residuos de isoleucina o residuos de ácido aspártico por residuos de ácido glutámico. Sin embargo, uno o más aminoácidos pueden cambiarse, añadirse o retirarse en la secuencia o una pluralidad de estas medidas se pueden combinar unas con otras. La presente invención también abarca aquellas secuencias de nucleótidos que se obtienen por modificación de la secuencia de nucleótidos de la Δ-8-desaturasa, la secuencia de nucleótidos de la Δ-5-desaturasa y/o la secuencia de nucleótidos de la Δ-9-elongasa usadas en el procedimiento de la invención. El objetivo de una modificación tal puede ser, por ejemplo, unir adicionalmente la secuencia codificante contenida en el presente documento o también. por ejemplo, insertar interfases de enzimas de restricción adicionales.
Los equivalentes funcionales incluyen también aquellas variantes cuya función por comparación como se describe anteriormente con el gen inicial o fragmento génico está debilitada (= no sustancialmente reducida) o reforzada (= la actividad enzimática es más alta que actividad de la enzima inicial, es decir está actividad es más alta que el 100 %,
preferentemente más alta que el 110 %, particularmente preferentemente más alta que el 130 %).
Al mismo tiempo la secuencia de ácidos nucleicos puede, por ejemplo, ser ventajosamente una secuencia de ADN o de ARN. Las secuencias codificantes adecuadas para inserción en un casete de expresión de acuerdo con la invención incluyen a modo de ejemplo aquellas que codifican una Δ-8-desaturasa, una Δ-5-desaturasa y/o una Δ-9-elongasa con las secuencias descritas anteriormente y prestan al huésped la capacidad de sobreproducir ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces en la posición Δ-8 y en la posición Δ-5, siendo ventajoso cuando al mismo tiempo se producen los ácidos grasos que tienen al menos cuatro dobles enlaces. Estas secuencias pueden ser de origen homólogo o heterólogo.
Por la casete de expresión (= construcción de ácidos nucleicos o construcción de fragmentos o genes) de acuerdo con la invención se quieren decir las secuencias especificadas en SEC ID N.º: 1. También se divulga la casete de expresión con SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 5; SEC ID N.º: 7 y/o con SEC ID N.º: 9 que resulta del código genético y/o de los derivados del mismo que están funcionalmente unidos con una o más señales de regulación ventajosamente para incrementar la expresión génica y que controlan la expresión de la secuencia codificante en la célula huésped. Estas secuencias reguladoras permitirían la expresión selectiva de los genes y la expresión de proteínas. Dependiendo del organismo huésped esto puede querer decir, por ejemplo, que el gen se expresa y/o se sobreexpresa solo después de inducción o que se expresa y/o se sobreexpresa inmediatamente. Ejemplos de estas secuencias reguladoras son secuencias a las que se unen inductores o represores y de este modo regulan la expresión del ácido nucleico. Además de estas nuevas secuencias de regulación o en lugar de estas secuencias puede estar presente todavía la regulación natural de estas secuencias delante de los genes estructurales reales y opcionalmente haberse modificado genéticamente de tal forma que la regulación natural se desactivó y la expresión de los genes se incrementó. Sin embargo, la construcción génica puede también construirse de una forma más simple, es decir no se insertan señales de regulación adicionales delante de la secuencia de ácidos nucleicos o derivados de la misma y el promotor natural con su regulación no se retira. En vez de esto la secuencia de regulación natural se muta de una manera que no continúa la regulación adicionalmente y/o la expresión génica se eleva. Estos promotores modificados en forma de parte de secuencias (= promotor que contiene partes de las secuencias aminoacídicas de acuerdo con la invención) pueden también inducirse por ellos mismos delante del gen natural para incrementar la actividad. Además, la construcción génica puede ventajosamente contener también una o más así llamadas secuencias promotoras unidas funcionalmente al promotor que permiten expresión potenciada de la secuencia de ácidos nucleicos. En el extremo 3' de las secuencias de ADN se pueden insertar secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores o terminadores adicionales. El gen de Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa y/o el gen de Δ-9-elongasa pueden estar presentes en una o más copias en la casete de expresión (= construcción génica).
Como se describe anteriormente, las secuencias reguladoras o los factores reguladores pueden influir preferentemente de forma positiva y así incrementar la expresión génica de los genes introducidos. Así, el refuerzo de los elementos reguladores ventajosamente en el nivel de la transcripción se puede efectuar usando señales de transcripción poderosas tales como promotores y/o potenciadores. Sin embargo, además es posible refuerzo de la traducción, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm.
Los promotores adecuados en el casete de la expresión son en principio todos los promotores que pueden controlar la expresión de genes ajenos en organismos tales como microorganismos como protozoos tales como ciliados, algas tales como algas verdes, pardas, rojas o azules tales como Euglena, bacterias tales como bacterias gram-positivas o gram-negativas, levaduras tales como Saccharomyces, Pichia o Schizosaccharomyces u hongos tales como Mortierella, Thraustochytrium o Schizochytrium o plantas tales como Aleuritia, ventajosamente en plantas u hongos. Se hace uso preferentemente en particular de promotores de plantas o promotores derivados de un virus vegetal. Secuencias de regulación ventajosas para el procedimiento de acuerdo con la invención se encuentran por ejemplo en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR o en promotores λ-PL que se emplean ventajosamente en bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas se encuentran, por ejemplo, en los promotores de gram-positivas amy y SPO2, en los promotores de levaduras o de hongos ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de plantas CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Promotor de Nopalina Sintasa)
o en el promotor de ubiquitina o de faseolina. El casete de expresión puede también contener un promotor químicamente inducible por medio del que la expresión del gen exógeno de Δ8-y/o Δ-5-desaturasa y/o del gen Δ-9-elongasa en los organismos se puede controlar ventajosamente en las plantas en un momento particular. Los promotores vegetales ventajosos de este tipo son a modo de ejemplo el promotor PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], un promotor inducible por bencenosulfonamida (documento EP 388 186), un promotor inducible por tetraciclina [Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404], un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443), un promotor inducible por ácido abcísico (documento EP 335 528) y un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (documento WO93/21334). Otros ejemplos de promotores vegetales que se pueden usar ventajosamente son el promotor de FBPasa citosólica de patata, el promotor de ST-LSI de patata (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), el promotor de amidotransferasa fosforribosil pirofosfato de Glycine max (véase también número de acceso del banco de genes U87999) o un promotor específico de nodieno según se describe en el documento EP 249 676. En particular son ventajosos aquellos promotores de plantas que aseguran la expresión en tejidos o partes/órganos de las plantas en los que la biosíntesis de ácidos grasos o las fases precursoras de la misma ocurren de este modo, como en el endospermo o en el embrión en desarrollo por ejemplo. Particularmente notables
son promotores ventajosos que aseguran expresión específica de semillas tales como a modo de ejemplo el promotor USP o derivados del mismo, el promotor LEB4, el promotor de faseolina o el promotor de napina. El promotor de USP particularmente ventajoso citado de acuerdo con la invención o sus derivados median expresión de genes muy temprana en desarrollo de semillas [Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67]. Otros promotores específicos de semillas ventajosos que se pueden usar para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas son los promotores adecuados para dicotiledóneas tales como promotores del gen de napina, asimismo citados a modo de ejemplo, a partir de la colza oleaginosa (documento US 5.608.152), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), el promotor de Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980) o el promotor de leguminosas B4 (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239) o promotores adecuados adecuados para monocotiledóneas tales como los promotores del gen Ipt2 o del gen Ipt1 en cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de oricina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina blanca, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo o el gen de secalina de centeno que se describe en el documento WO99/16890.
Además, se prefieren en particular aquellos promotores que aseguran la expresión en tejidos o partes de la planta en los que, por ejemplo, la biosíntesis de ácidos grasos. aceites y lípidos o las fases precursoras de la misma tienen lugar. Son particularmente notables promotores que aseguran una expresión específica de semillas. Son notables los promotores del gen de napina de colza oleaginosa (documento de los US 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (USP = proteína de semilla desconocida, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), el promotor del gen de oleosina de Arabidopsis (documento WO98/45461), el promotor de faseolina (documento US 5.504.200) o el promotor del gen de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Otros promotores que se pueden mencionar son aquellos del gen Ipt2 o Ipt1 de cebada (documentos WO95/15389 y WO95/23230) que median expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas. Otros promotores específicos de semilla son promotores tales como promotores de arroz, maíz o trigo divulgados en el documento WO 99/16890 o Amy32b, Amy6-6 o aleuraína (documento US 5.677.474), Bce4 (colza, documento US 5.530.149), glicinina (semilla de soja, documento EP 571 741), fosfoenol piruvato carboxilasa (semilla de soja, documento JP 06/62870), ADR12-2 (semilla de soja, documento WO 98/08962), isocitratlilasa (colza, documento US 5.689.040) o β-amilasa (cebada, documento EP 781 849).
Como se describe anteriormente, la construcción de expresión (= construcción génica, construcción de ácido nucleico) puede contener aún otros genes que se pueden introducir dentro de los organismos. Estos genes se pueden someter a regulación separada o se pueden someter a la misma región de regulación como el gen de Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa y/o el gen de Δ-9-elongasa. Estos genes son a modo de ejemplo otros genes de biosíntesis, ventajosamente para biosíntesis de ácidos grasos, que permiten síntesis incrementada. Ejemplos que se pueden mencionar son los genes de Δ-15-Δ-12-, Δ-9-, Δ-5-, Δ-4-desaturasa, α-cetoacil reductasas, α-cetoacil sintasas, elongasas o las diversas hidroxilasas y acil-ACP tioesterasas. Los genes de desaturasa se usan ventajosamente en la construcción de ácido nucleico.
En principio todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación se pueden usar como aquellos mencionados anteriormente para el casete de expresión de acuerdo con la invención y el procedimiento de acuerdo con la invención. Además de esto, los promotores de síntesis pueden usarse ventajosamente.
En la preparación de un casete de expresión se pueden manipular diversos fragmentos de ADN con el fin de obtener una secuencia de nucleótidos que se lee de forma útil en la dirección correcta y está equipada con un ráster de lectura correcto. Para conectar los fragmentos de ADN (= ácidos nucleicos de acuerdo con la invención) unos con otros los adaptadores o engarces pueden estar unidos a los fragmentos.
Las regiones promotora y terminadora se pueden proporcionar de forma útil en la dirección de la transcripción con un enlazador o polienlazador que contiene uno o más puntos de restricción para la inserción de esta secuencia. Generalmente, el enlazador tiene 1 a 10, mayoritariamente 1 a 8, preferentemente 2 a 6, puntos de restricción. En general el tamaño del enlazador dentro de la región reguladora es menos de 100 pb, frecuentemente menos de 60 pb, pero al menos de 5 pb. El promotor puede ser tanto nativo como homólogo así como ajeno o heterólogo al organismo huésped, por ejemplo para la planta huésped. En la dirección de transcripción 5'-3' el casete de expresión contiene el promotor, una secuencia de ADN que codifica un gen de Δ-8-desaturasa, un gen de Δ-5-desaturasa y/o un gen de Δ-9-elongasa y una región para terminación de transcripción. Las regiones de terminación diferentes pueden intercambiarse unas con otras en cualquier modo determinado.
Además, se pueden emplear manipulaciones que proporcionan interfases de restricción adecuadas o que eliminan ADN en exceso o se pueden emplear interfases de restricción. Donde las inserciones, deleciones o sustituciones, tales como transiciones y transversiones, se tienen en cuenta, se pueden usar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción o ligazón. En manipulaciones adecuadas tales como restricción, se pueden proporcionar para la ligazón chewing back o carga de salientes para extremos complementarios de extremos romos de los fragmentos.
Para una expresión ventajosamente alta la unión de la señal de retención en el retículo endoplásmico específica SEKDEL entre otras puede ser de importancia (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792). De este modo el nivel de expresión promedio se triplica o incluso se cuadruplica. Otras señales de retención que se dan de forma
natural en las proteínas de plantas y animales localizadas en el retículo endoplásmico se pueden emplear para la construcción del casete. En otra realización preferida se usa una secuencia de marcado plastidial como se describe por Napier J.A. [Targeting of foreign proteins to the chloroplast, Methods Mol. Biol., 49, 1995: 369-376]. Un vector usado preferido que comprende dicha secuencia de marcado plastidial se divulga por Colin Lazarus [Guerineau F., Woolston S., Brooks L., Mullineaux P. "An expression cassette for targeting foreign proteins into chloroplast; Nucleic. Acids Res., diciembre 9, 16 (23), 1988: 11380].
Señales de poliadenilación preferidas son señales de poliadenilación de plantas, preferentemente aquellas que corresponden sustancialmente a señales de poliadenilación de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, en particular gen 3 del ADN-T (octopina sintasa) del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 y siguientes) o equivalentes funcionales correspondientes.
Un casete de expresión se produce por fusión de un promotor adecuado con una secuencia de ADN Δ-8-y/o Δ-5-desaturasa adecuada y/o una secuencia de ADN de Δ-9-elongasa conjuntamente con una señal de poliadenilación por recombinación común y técnicas de clonación según se describe, por ejemplo, por T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como por T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
En la preparación de un casete de expresión se pueden manipular diversos fragmentos de ADN para producir una secuencia de nucleótidos que se lee de forma útil en la dirección correcta y está equipada con un ráster de lectura correcto. Los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos para unir los fragmentos de ADN.
Las regiones promotora y terminadora se pueden proporcionar de forma útil en la dirección de la transcripción con un enlazador o polienlazador que contiene uno o más puntos de restricción para la inserción de esta secuencia. Generalmente, el enlazador tiene 1 a 10, mayoritariamente 1 a 8, preferentemente 2 a 6, puntos de restricción. En general el tamaño del enlazador dentro de la región reguladora es menos de 100 pb, frecuentemente menos de 60 pb, pero al menos de 5 pb. El promotor puede ser tanto nativo como homólogo así como ajeno o heterólogo al organismo huésped, por ejemplo para la planta huésped. En la dirección de transcripción 5'-3' el casete de expresión contiene el promotor, una secuencia de ADN que codifica cualquiera de un gen de Δ-8-desaturasa y/o un gen de Δ-5-desaturasa y/o un gen de Δ-9-elongasa y una región para terminación de transcripción. Las regiones de terminación diferentes pueden intercambiarse unas con otras en cualquier modo determinado.
En la preparación de un casete de expresión se pueden manipular diversos fragmentos de ADN para producir una secuencia de nucleótidos que se lee de forma útil en la dirección correcta y está equipada con un ráster de lectura correcto. Los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos para unir los fragmentos de ADN.
Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de ácidos nucleicos usadas en los procedimientos de la invención tales como la Δ-8-desaturasa de Euglena gracilis, la Δ-9-elongasa de Isochrysis galbana y/o la Δ-5-desaturasa por ejemplo de Caenorhabditis elegans, Mortierella alpina, Borage officinalis o Physcomitrella patens contienen todas las características de secuencia necesarias para lograr la localización correcta del sitio de biosíntesis de ácidos grasos, lípidos o aceites. De acuerdo con ello, no se necesitan per se secuencias que dirijan adicionales. Sin embargo, una localización tal puede ser deseable y ventajosa y así modificada o reforzada ventajosamente de forma que tales construcciones de fusión son también una realización ventajosa preferida de la invención.
En particular se prefieren secuencias que aseguran determinación de objetivo en plástidos. En ciertas circunstancias la determinación de objetivo en otros compartimentos (comunicada en: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) puede ser deseable, por ejemplo en vacuolas, la mitocondria, el retículo endoplásmico (ER), peroxisomas, estructuras lipídicas o debido a la carencia de secuencias operativas correspondientes en el compartimento de origen, el citosol.
Ventajosamente, las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o la construcción génica junto con al menos un gen comunicador se clonan en un casete de expresión que se introduce dentro del organismo por medio de un vector o directamente dentro del genoma. Este gen comunicador debería permitir la detección fácil por medio de un ensayo de crecimiento, fluorescencia, producto químico, bioluminiscencia o resistencia o por medio de una medida fotométrica. Ejemplos de genes indicadores que se pueden mencionar son genes de resistencia a antibióticos o herbicidas, genes de hidrolasa, genes de proteínas de fluorescencia, genes de bioluminiscencia, genes metabólicos de azúcares o nucleótidos o genes de biosíntesis tales como el gen Ura3, el gen IIv2, el gen de la luciferasa, el gen de la β-galactosidasa, el gen de gfp, el gen de la 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa, el gen de la β-glucuronidasa, el gen de la β-lactamasa, el gen de la neomicina fosfotransferasa, el gen de la higromicina fosfotrasferasa o el gen BASTA (= resistencia a glufosinato). Estos genes permiten medida fácil y cuantificación de la actividad de transcripción y así de la expresión de los genes. De este modo se pueden identificar las posiciones del genoma que presentan productividad diferente.
En una realización preferida un casete de expresión comprende corriente arriba, es decir en el extremo 5' de la secuencia codificante, un promotor y corriente abajo, es decir en el extremo 3', una señal de poliadenilación y
opcionalmente otros elementos reguladores que están operativamente unidos a la secuencia codificante que interviene para secuencia de ADN de Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa. Por un engarce operable se quiere decir la disposición secuencial del promotor, secuencia codificante, terminador y opcionalmente otros elementos reguladores de tal modo que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función en la expresión de la secuencia codificante a su debida manera. Las secuencias preferidas para engarce operable son secuencias de determinación de objetivo para asegurar la localización subcelular en plástidos. Sin embargo, las secuencias de dirección para localización subcelular en la mitocondria, en el retículo endoplásmico (= ER), en el núcleo, en corpúsculos de aceite u otros compartimentos se pueden emplear así como promotores de traducción tales como la secuencia líder 5' en el virus del mosaico del tabaco (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Un casete de expresión puede, por ejemplo, contener un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido (preferentemente el promotor USP o el promotor de napina) el gen a expresarse y la señal de retención de ER. Para la señal de retención de ER la secuencia de aminoácidos de KDEL (lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina) o la secuencia de aminoácidos de KKX (lisina-lisina-X-parada, en la que X quiere decir cualquier otro aminoácido) se emplea preferentemente.
Para expresión en un organismo huésped procariota o eucariota, por ejemplo un microorganismo tal como un hongo o una planta la casete de expresión se inserta ventajosamente en un vector tal como a modo de ejemplo un plásmido, un fago u otro ADN que permita expresión óptima de los genes en el organismo del huésped. Ejemplos de plásmidos adecuados son: en E. coli pLG338, pACYC184, serie de pBR tal como por ejemplo pBR322, serie de pUC tal como pUC18 o pUC19, serie de M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 o pBdCl; en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium pSA77 o pAJ667; en hongos pALS1, pIL2 o pBB116; otros vectores fúngicos ventajosos se describen por Romanos, M.A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] y por Van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi"] así como por More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., páginas 396-428: Academic Press: San Diego] y en "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991), en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]. Ejemplos de promotores de levaduras ventajosos son 2μM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23. Ejemplos de promotores de algas o de plantas son pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH o pDH51 (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988). Los vectores identificados anteriormente o derivados de los vectores identificados anteriormente son una selección pequeña de los posibles plásmidos. Se conocen bien plásmidos adicionales por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Vectores de plantas adecuados se describen entre otros sitios en "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), capítulo 6/7, páginas 71-119. Los vectores ventajosos se conocen como vectores lanzadera o vectores binarios que se replican en E. coli y Agrobacterium.
Por vectores se quiere decir con la excepción de plásmidos todos los otros vectores conocidos por aquellos expertos en la técnica tales como a modo de ejemplo fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular. Estos vectores se pueden replicar autónomamente en el organismo huésped o se pueden replicar cromosómicamente, prefiriéndose la replicación cromosómica.
En una realización adicional del vector el casete de expresión de acuerdo con la invención se puede introducir también ventajosamente dentro de los organismos en forma de un ADN lineal y se puede integrar en el genoma del organismo huésped por medio de recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal puede estar compuesto de un plásmido linealizado o solo del casete de expresión como vector de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.
En una realización ventajosa adicional la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se puede introducir en un organismo por sí misma.
Si además de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se pueden introducir genes adicionales en el organismo, todo junto con un gen indicador en un vector individual o cada gen individual con un gen comunicador en un vector en cada caso se puede introducir en el organismo, por lo que los diferentes vectores se pueden introducir simultáneamente o sucesivamente.
El vector contiene ventajosamente una copia de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y/o el casete de expresión (= construcción génica) de acuerdo con la invención.
A modo de ejemplo el casete de expresión de plantas puede instalarse en el vector de transformación de pRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 y siguientes).
Alternativamente, un vector recombinante (= vector de expresión) puede también transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando el promotor de T7 y la ARN polimerasa de T7.
Los vectores de expresión empleados en procariotas frecuentemente hacen uso de sistemas inducibles con y sin
proteínas de fusión u oligopéptidos de fusión o hacen uso frecuentemente de sistemas inducibles con y sin proteínas de fusión u oligopéptidos de fusión, en los que estas fusiones pueden seguir tanto de manera N-terminal como de manera C-terminal o en otros dominios útiles de una proteína. Tales vectores de fusión usualmente tienen los siguientes propósitos: i.) incrementar la velocidad de expresión de ARN; ii.) incrementar la velocidad de síntesis de proteína lograble; iii.) incrementar la solubilidad de la proteína; iv.) o simplificar purificación por medio de una secuencia de unión usable para cromatografía de afinidad. Se introducen frecuentemente puntos de escisión proteolítica por medio de proteínas de fusión que permiten escisión de una parte de la proteína de fusión y purificación. Tales secuencias de reconocimiento para proteasas se reconocen, por ejemplo factor Xa, trombina y enterocinasa.
Los vectores de fusión y expresión ventajosos típicos son pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que contienen glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa o proteína A.
Otros ejemplos de vectores de expresión de E. coli son pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] y vectores de pET [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, The Netherlands].
Otros vectores ventajosos para usar en levaduras son pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) y derivados de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores para usar en hongos filamentosos se describen por: Van den Hondel, C. A. M.J. J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativamente, los vectores de expresión de células de insectos se pueden utilizar ventajosamente, por ejemplo para expresión en células Sf 9. Estos son por ejemplo los vectores de la serie de pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie de pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).
Además, las células de plantas o las células de algas se pueden usar ventajosamente para expresión génica. Ejemplos de vectores de expresión de plantas se pueden encontrar en Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 o en Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos se pueden expresar en células de mamíferos, ventajosamente en células de mamíferos no humanos. Ejemplos de vectores de expresión correspondientes son pCDM8 y pMT2PC referidos por: Seed, B. (1987) Nature 329:840 o en (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Al mismo tiempo los promotores preferidos para uso son de origen vírico, tales como a modo de ejemplo promotores de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus o virus de simio 40. Otros sistemas de expresión procariota y eucariota se describen en los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
El organismo huésped (= organismo transgénico) ventajosamente contiene al menos una copia del ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o de la construcción del ácido nucleico de acuerdo con la invención.
La invención de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, la casete de expresión o el vector en organismos, plantas por ejemplo, puede hacerse en principio por todos los procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La introducción de las secuencias de ácidos nucleicos da lugar a organismos recombinantes o transgénicos.
En el caso de microorganismos, aquellos expertos en la técnica pueden encontrar procedimientos apropiados en los libros de texto por Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, por F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, por D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), por Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.
La transferencia de genes exógenos en el genoma de una planta se llama transformación. En hacer esto los procedimientos descritos para la transformación o regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas se utilizan para transformación transitoria o permanente. Los procedimientos adecuados son transformación de protoplastos por captación de ADN inducida por polietilenglicol, el procedimiento "biolístico" usando el cañón de genes -referido también como el procedimiento de bombardeo de partículas-, electroporación, la incubación de embriones secos en solución de ADN, la microinyección y la transferencia génica mediada por Agrobacterium. Dichos procedimientos se describen a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción a expresarse se clonan preferentemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por un vector tal se pueden usar de manera conocida para la transformación de plantas, en particular de plantas de cultivo tales como a modo de ejemplo plantas de tabaco, por ejemplo bañando hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y después cultivándolas en medios adecuados. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens
se describe, por ejemplo, por Hofgen and Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce entre otras cosas de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15-38.
Las agrobacterias transformadas por un vector de expresión de acuerdo con la invención se pueden usar asimismo de manera conocida para la transformación de plantas tales como plantas de prueba como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como cultivos de cereales, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, canola, girasol, linaza, cáñamo, patatas, tabaco, tomates, zanahorias, pimentón, colza oleaginosa, tapioca, mandioca, arrurruz, claveles moros, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, frutos secos y vides, en particular de plantas de cultivo que contienen aceites tales como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza oleaginosa, cocotero, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o grano de cacao, por ejemplo bañando hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y después se cultivan en medios adecuados. Para la producción de PUFA, son ventajosamente adecuados por ejemplo ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, borraja, linaza, girasol, cártamo, o primuláceas. Otros organismos adecuados para la producción de por ejemplo ácido γ-linoleico, ácido dihomo-γ-linoleico o ácido araquidónico son por ejemplo linaza, girasol o cártamo.
Las células vegetales genéticamente modificadas se pueden regenerar por todos los procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los procedimientos apropiados se pueden encontrar en las publicaciones mencionadas anteriormente por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o por Höfgen y Willmitzer.
De acuerdo con ello, un aspecto adicional de la invención se refiere a organismos transgénicos transformados por al menos una secuencia de ácidos nucleicos, casete de expresión o vector de acuerdo con la invención así como células, cultivos celulares, tejidos, partes -tales como, por ejemplo, hojas, raíces, etc. en el caso de organismos vegetales -o materiales reproductivos derivados de tales organismos. Los términos "organismo huésped", "célula huésped", "organismo (huésped) recombinante" y "célula (huésped) transgénica" se usan en la presente memoria de forma intercambiable. Por supuesto, estos términos se refieren no solo al organismo huésped en particular o a la célula diana en particular sino también a los descendientes potenciales de estos organismos o células. A partir de entonces, debido a la mutación o a los efectos ambientales pueden surgir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas, estos descendientes no necesitan ser necesariamente idénticos a las células parentales pero no obstante están aún comprendidos por el término como se usa en la presente memoria.
Para los fines de la invención "transgénico" o "recombinante" quieren decir con respecto por ejemplo a una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión (= construcción génica, construcción de ácidos nucleicos) o un vector que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o un organismo transformado por las secuencias de ácidos nucleicos, el casete de expresión o el vector de acuerdo con la invención todas aquellas construcciones producidas por procedimientos de ingeniería genética en los que bien
a) la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEC ID N.º: 1; SEC ID N.º: 3; SEC ID N.º: 5; SEC ID N.º: 7; SEC ID N.º: 9 o bien
b) una secuencia de control genético funcionalmente unida a la secuencia de ácido nucleico descrita en (a), por ejemplo una secuencia de control genético 3'-y/o 5'-tal como un promotor o terminador, o bien
c) (a) y (b)
no se encuentran en su ambiente natural, genético o se han modificado por procedimientos de ingeniería genética, en los que la modificación puede ser a modo de ejemplo una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos nucleotídicos. Ambiente natural genético quiere decir el locus natural genómico o cromosómico en el organismo de origen o dentro del organismo huésped o presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos está preferentemente retenido al menos en parte. El ambiente limita con la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, en particular preferentemente al menos 1.000 pb, lo más en particular preferentemente al menos 5.000 pb. Un casete de expresión que se da en la naturaleza -por ejemplo la combinación que se da en la naturaleza del promotor natural de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención con el gen de la Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa correspondiente-se vuelve un casete de expresión transgénica cuando el último se modifica por procedimientos no naturales, sintéticos ("artificiales") tales como a modo de ejemplo una mutagenización. Se describen procedimientos apropiados a modo de ejemplo en el documento US 5.565.350 o en el documento WO 00/15815.
Los organismos adecuados o los organismos huéspedes para el ácido nucleico, el casete de expresión o el vector de acuerdo con la invención son ventajosamente en principio todos los organismos que son capaces de sintetizar ácidos grasos, especialmente ácidos grasos insaturados o son adecuados para la expresión de genes recombinantes como se describe anteriormente. Ejemplos adicionales que pueden mencionarse son plantas tales como Arabidopsis, asteráceas tales como Calendula o plantas de cultivo tales como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza oleaginosa, cocotero, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o grano de cacao. Se da preferencia a organismos que pueden sintetizar aceites de forma natural en cantidades relativamente grandes tales como plantas
tales como soja, colza oleaginosa, cocotero, palma de aceite, cártamo, lino, ricino, Calendula, cacahuete, grano de cacao o girasol y se da preferencia particular a soja, lino, colza oleaginosa, girasol o Calendula.
Células huéspedes útiles adicionales se identifican en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Las cepas de expresión usables, por ejemplo aquellas que presentan una actividad de proteasa relativamente baja, se describen en: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Un objeto adicional de la invención se refiere al uso de una casete de expresión que contiene secuencias de ADN que codifican un gen de Δ-8-desaturasa, un gen de Δ-9-elongasa y/o un gen de Δ-5-desaturasa o secuencias de ADN que hibridan con las mismas para la transformación de células de plantas, tejidos o partes de plantas. El objetivo del uso es incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen un contenido incrementado de dobles enlaces.
En hacer tal cosa, dependiendo de la elección de promotor, un gen de Δ-8-desaturasa, un gen de Δ-9-elongasa y/o un gen de Δ-5-desaturasa se pueden expresar específicamente en las hojas, en las semillas, los nódulos, en las raíces, en el tallo o en otras partes de la planta. Aquellas plantas transgénicas que sobreproducen ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen al menos tres dobles enlaces en la molécula de ácidos grasos, el material reproductivo de los mismos, conjuntamente con las células de plantas, tejidos o partes de las mismas son un objeto adicional de la presente invención.
El casete de expresión o las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que contienen una secuencia génica de Δ-8-desaturasa, una secuencia génica de Δ-9-elongasa y/o una secuencia génica de Δ-5-desaturasa pueden, además, emplearse también para la transformación de los organismos identificados a modo de ejemplo tales como bacterias, cianobacterias, levaduras, hongos filamentosos, ciliados y algas con el objetivo de incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que poseen al menos tres enlaces dobles.
Dentro del marco de la presente invención, incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que poseen al menos tres enlaces dobles quiere decir, por ejemplo, el rasgo artificialmente adquirido de realización biosintética incrementada debido a la sobreexpresión funcional del gen de la Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa en los organismos de acuerdo con la invención, ventajosamente en las plantas transgénicas de acuerdo con la invención, por comparación con las plantas iniciales no modificadas genéticamente al menos durante la duración de al menos una generación de plantas.
La ubicación preferida de biosíntesis, de ácidos grasos, aceites o lípidos por ejemplo, es generalmente la semilla o las capas celulares de la semilla de tal forma que una expresión específica de semilla del gen de la Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa es apropiada. Es, sin embargo, obvio que la biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos no necesita estar limitada al tejido de la semilla sino que más bien puede tener lugar en todas las otras partes de la planta en forma específica de tejidos -en células de la epidermis o en los nódulos por ejemplo.
Una expresión constitutiva del gen exógeno de Δ-8-desaturasa, de Δ-9-elongasa y/o de Δ-5-desaturasa es, además, ventajosa. Por otro lado, sin embargo, puede parecer también deseable una expresión inducible.
La eficiencia de la expresión del gen de Δ-8-desaturasa, de Δ-9-elongasa y/o de Δ-5-desaturasa se puede determinar, por ejemplo, in vitro por propagación del meristemo de brote. Además, una expresión del gen de la Δ-8-desaturasa, de la Δ-9-elongasa y/o de la Δ-5-desaturasa modificada en naturaleza y nivel y en su efecto en la actuación de biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos se puede someter a ensayo en plantas de ensayo en pruebas de invernadero.
Un objeto adicional de la invención comprende plantas transgénicas transformadas por un casete de expresión que contiene un gen de Δ-8-desaturasa, un gen de Δ-9-elongasa y/o un gen de Δ-5-desaturasa de acuerdo con la invención o secuencias de ADN que hibridan con los mismos, así como células transgénicas, tejido, partes y material de reproducción de tales plantas. Se da preferencia particular en este caso a plantas de cultivos transgénicos tales como a modo de ejemplo cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza oleaginosa y canola, girasol, lino, cáñamo, cardo, patatas, tabaco, tomates, tapioca, mandioca, arrurruz, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, nueces y vides.
Para los fines de la invención las plantas son plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, musgos o algas.
Un refinamiento adicional de acuerdo con la invención son plantas transgénicas como se describen anteriormente que contienen una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o un casete de expresión de acuerdo con la invención.
También se divulgan:
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Un procedimiento para la transformación de una planta que comprende la introducción de casetes de expresión de acuerdo con la invención que contienen una secuencia génica de Δ-8-desaturasa, una secuencia génica de Δ-9-elongasa y/o una secuencia génica de Δ-5-desaturasa derivada de algas tales como Euglena o Isochrysis, hongos
tales como Mortierella o musgos tales como Physcomitrella o secuencias de ADN que hibridan con las mismas en una célula vegetal, en tejidos de callos, una planta entera o protoplastos de plantas.
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Un procedimiento para producir PUFA, en el que el procedimiento comprende el crecimiento de un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento o un vector que codifica una Δ-8-desaturasa, una Δ-9-elongasa y/o una Δ-5-desaturasa que sintetiza específicamente ácidos grasos poliinsaturados con al menos tres dobles enlaces en la molécula de ácidos grasos.
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Uso de una secuencia génica de ADN de Δ-8-desaturasa, una secuencia génica de ADN de Δ-9-elongasa y/o una secuencia génica de ADN de Δ-5-desaturasa o secuencias de ADN que hibridan con las mismas para la producción de plantas que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen al menos tres dobles enlaces debido a la expresión de dicha secuencia de ADN de Δ-8-desaturasa, de Δ-9-elongasa y/o de Δ-5-desaturasa en plantas.
También se divulga un procedimiento para producir ácidos grasos insaturados que comprende: introducir al menos una secuencia de ácidos nucleicos citada descrita en el presente documento o al menos una construcción de ácidos nucleicos o vector que contiene dicha secuencia de ácidos nucleicos en un organismo que preferentemente produce aceite tal como una planta o un hongo, cultivando dicho organismo, aislando aceite contenido en dicho organismo; y liberando los ácidos grasos presentes en dicho aceite. Estos ácidos grasos insaturados contienen ventajosamente al menos tres dobles enlaces en la molécula de ácidos grasos. Los ácidos grasos se pueden liberar a partir de los aceites
o lípidos, por ejemplo por hidrólisis básica, por ejemplo usando NaOH o KOH o por hidrólisis ácida preferentemente en presencia de un alcohol tal como metanol o etanol. Tal liberación de ácidos grasos conduce a los ácidos grasos libres
o a los ésteres de alquilo correspondientes de los ácidos grasos. En principio una hidrólisis enzimática por ejemplo con una lipasa como enzima también es posible. Partiendo de dichos ácidos grasos libres o ésteres de alquilo de ácidos grasos se pueden sintetizar mono-, di-y/o triglicéridos bien química o bien enzimáticamente. En otra realización preferida del procedimiento de la invención el éster de alquilo de los ácidos grasos se produce a partir de los aceites o lípidos por transesterificación con una enzima o con química convencional. Un procedimiento preferido es la producción del éster de alquilo en presencia de los alcoholatos de los alcoholes inferiores correspondientes (alcoholes C1 a C10 tales como metanol, etanol, propanol, butanol, hexanol etc.) tales como metanoato o etanoato. Por lo tanto según el trabajador experto sabe el alcohol en presencia de una cantidad catalítica de una base tal como NaOH o KOH se añade a los aceites o lípidos.
Un procedimiento para producir triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados que comprende: introducir al menos una secuencia de ácidos nucleicos citada de acuerdo con la invención o al menos una casete de expresión de acuerdo con la invención dentro de un organismo que produce aceite; cultivando dicho organismo; se enumera también dentro de los objetos de la invención.
También se divulga un procedimiento para producir triglicéridos que tengan un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados ventajosamente que tengan un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados es un procedimiento en el que los ácidos grasos se liberan de los triglicéridos con la ayuda de hidrólisis básica conocida por aquellos expertos en la técnica o por medio de una enzima tal como una lipasa.
Los procedimientos especificados anteriormente ventajosamente permiten la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos que contienen al menos tres dobles enlaces en la molécula de ácidos grasos.
Los procedimientos identificados anteriormente permiten ventajosamente la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos que contienen al menos tres enlaces dobles, en los que el sustrato usado para la reacción de la Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa es preferentemente -ácido linoleico (C20:2Δ9,12) y/o ácido α-linolénico (C18:2 Δ9,12,15). De esta manera el procedimiento identificado anteriormente permite ventajosamente en particular la síntesis de ácidos grasos derivados de ácido linoleico (C20:2Δ9,12), ácido α-linolénico (C18:2Δ9,12,15), ácido γ-linoleico (C18:3Δ6,9,12), ácido estearidónico (C18:4 Δ6,9,12,15), ácido dihomo-γ-linoleico (C20:3Δ8,11,14) o tal como a modo de ejemplo ácido eicosapentaenoico y ácido araquidónico.
Ejemplos de organismos para los citados procedimientos como se describen anteriormente son plantas tales como Arabidopsis, Primulaceae, borraja, cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza oleaginosa y canola, girasol, lino, cáñamo, patatas, tabaco, tomates, colza, tapioca, mandioca, arrurruz, alfalfa, cacahuete, ricino, cocotero, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o grano de cacao, algas o protozoos tales como dinoflagelados como Crypthecodinium. Se da preferencia a organismos que pueden sintetizar aceites de forma natural en cantidades relativamente grandes tales como plantas tales como soja, colza oleaginosa, cocotero, palma de aceite, cártamo, ricino, Calendula, cacahuete, grano de cacao o girasol y se da preferencia particular a soja, colza oleaginosa, girasol, lino, primuláceas, borraja o Carthamus.
Dependiendo del organismo huésped, los organismos usados en los procedimientos se crían o cultivan en la manera conocida por aquellos expertos en la técnica. Microorganismos tales como hongos o algas se cultivan usualmente en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, usualmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levaduras o sales tales como sulfato de
amonio, elementos traza tales como hierro, sales de magnesio o manganeso y opcionalmente vitaminas a temperaturas de entre 10 ºC y 60 ºC, preferentemente entre 15 ºC y 40 ºC con exposición a oxígeno gaseoso. En hacer tal cosa el pH del líquido nutriente puede mantenerse a un valor fijado, esto es durante el cultivo el pH está o no está regulado. El cultivo puede continuar en modo por lotes, en modo semicontinuo o de forma continua. Los nutrientes pueden proporcionarse al comienzo de la fermentación o suministrarse de manera semicontinua o de manera continua.
Después de transformación las plantas se regeneran primero de todo como se describe anteriormente y después se crían o cultivan como normales.
Después de cultivar los lípidos se aíslan de los organismos de la manera usual. Para este propósito, después de cosechar los organismos pueden primero de todo digerirse o usarse directamente. Los lípidos se extraen ventajosamente usando disolventes adecuados tales como disolventes apolares como hexano o etanol, isopropanol o mezclas tales como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico a temperaturas de entre 0 ºC y 80 ºC, preferentemente entre 20 ºC y 50 ºC. La biomasa se extrae usualmente con un exceso de disolvente, por ejemplo un exceso de disolvente frente a biomasa de 1:4. El disolvente se retira después, por ejemplo por destilación. La extracción puede hacerse también usando CO2 supercrítico. Después de la extracción el resto de la biomasa se puede retirar, por ejemplo por filtración.
El aceite en bruto aislado de esta manera puede purificarse adicionalmente, por ejemplo eliminando turbidez por tratamiento con disolventes polares tales como acetona o cloroformo y después por filtración o centrifugación. También es posible purificación adicional a través de columnas.
Con el fin de obtener los ácidos libres a partir de los triglicéridos los últimos se saponifican de la forma habitual.
También se divulgan ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados producidos por los procedimientos identificados anteriormente y el uso de los mismos para producir alimentos, piensos para animales, cosméticos o productos farmacéuticos. Para este propósito los últimos se añaden en cantidades habituales a la alimentación, los piensos para animales, los cosméticos o los productos farmacéuticos.
Dichos ácidos grasos insaturados así como triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados producidos por los procedimientos identificados anteriormente son el resultado de la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en los diversos organismos huéspedes. Esto resulta generalmente en una modificación de la composición de los compuestos en la célula huésped conteniendo ácidos grasos insaturados por comparación con las células huésped de partida originales que no contienen los ácidos nucleicos. Estas modificaciones están más marcadas en organismos huéspedes, por ejemplo células de plantas, que no contienen de forma natural las proteínas o enzimas codificadas por los ácidos nucleicos que en los organismos huéspedes que naturalmente contienen las proteínas o enzimas codificadas por los ácidos nucleicos. Esto da lugar a organismos huéspedes que contienen aceites, lípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, glucolípidos, triacilgliceroles y/o ácidos grasos libres que tienen un contenido más alto de PUFA con al menos tres dobles enlaces. Para los fines de la invención, por un contenido incrementado se quiere decir que los organismos huéspedes contienen al menos el 5 %, ventajosamente al menos el 10 %, preferentemente al menos el 20 %, en particular preferentemente al menos el 30 %, lo más en particular preferentemente al menos el 40 % más ácidos grasos poliinsaturados en comparación con el organismo inicial que no contiene los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Este es en particular el caso de plantas que no contienen de forma natural ácidos grasos C20 o C22 poliinsaturados de cadena larga tales como EPA o ARA. Debido a la expresión de los ácidos nucleicos se producen composiciones de lípidos novedosas por dichos medios siendo estos un aspecto adicional de la invención.
La invención se explica en más detalle por los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: procedimientos de clonación generales
Los procedimientos de clonación, tales como a modo de ejemplo escisiones de restricción, electroforesis en geles de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y de nailon, enlace de los fragmentos de ADN, transformación de células de Escherichia coli, cultivo de bacterias y análisis de secuencia de ADN recombinante, se llevaron a cabo como se describe en Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Ejemplo 2: análisis de secuencia de ADN recombinante
La secuenciación de las moléculas de ADN recombinantes se hizo usando un secuenciador de ADN de fluorescencia láser de la compañía ABI por el procedimiento de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Los fragmentos que resultan a partir de una reacción en cadena de la polimerasa se secuenciaron y comprobaron para evitar errores de la polimerasa en las construcciones a expresarse.
Ejemplo 3: clonación de la Δ-8-desaturasa de Euglena gracilis (= SEC ID N.º: 1)
Como una plantilla para amplificación de PCR, se usó ADNc de la Cepa Z de Euglena gracilis . El ADNc se sintetizó a partir de ARN total extraído a partir de cultivos de la cepa Z de E. gracilis. Los pigmentos únicos para la metionina de iniciación y el codón de parada de la Δ-8-desaturasa de Euglena se sintetizaron como se muestra, incluyendo sitios de restricción como se detallan.
Cebador 1: EDELTA8BamF
ATGGATCCACCATGAAGTCAAAGCGCCAA
Cebador 2: EDELTA8XhoR
ATCTCGAGTTATAGAGCCTTCCCCGC
Protocolo de PCR
Temperatura de adición: 1 minuto a 45 ºC.
Temperatura de desnaturalización: 1 minuto a 94 ºC.
Temperatura de elongación: 2 minutos a 72 ºC.
Número de ciclos: 30.
Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa y se aisló un fragmento de 1270 pb. El fragmento de PCR se clonó en el vector pGEM-T easy (Promega) y el inserto se secuenció después. Esto reveló la presencia de una fase de lectura abierta de 1266 pares de bases, que codifica una proteína de 421 residuos de aminoácidos y un codón de parada. El extremo C-terminal de la Δ-8-desaturasa clonada tiene homologías altas con la Δ-8-desaturasa publicada por Wallis y Browse (Archives of Biochem. and Biophysics, Vol. 365, N.º: 2, 1999) que se comunica que es una enzima de 422 residuos; véase también secuencia relacionada por estos autores [GenBank AF139720/AAD45877] que pretende relacionarse con la misma Δ-8-desaturasa pero describe una fase de lectura abierta de 419 residuos. La secuencia de aminoácidos deducida de la Euglena Δ-8-desaturasa descrita en la presente invención difiere de la que se describe previamente por heterogeneidad en el extremo N-terminal. En particular, los primeros 25 residuos aminoacídicos de LARS Δ-8-desaturasa son:
MKSKRQALP LTIDGTTYDVS AWVNF
Mientras que la secuencia descrita por Wallis y Browse es:
MKSKRQALS PLQLMEQTYDV SAWVN (como se da en ABB 1999)
O, alternativamente
MKSKRQALSPLQLMEQTYDVVNFH (como se da en GenBank AAD45877)
Dicha heterogeneidad presente en el extremo N-terminal de la secuencia de desaturasa no es resultante de la amplificación de PCR o cebadores. Las distinciones son diferencias verdaderas entre las proteínas.
Ejemplo 4: construcción de plantas transgénicas que expresan el componente de elongasa IsASE1 de
Isochrysis galbana
La clonación del ADNc de IgASE1 se describe por: Qi, B., Beaudoin, F., Fraser, T., Stobart, A. K., Napier, J.A. y Lazarus, C.M. Identification of a cDNA encoding a novel C18-Δ-9-polyunsaturated fatty acid-specific elongating activity from the docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis galbana. FEBS Letters 510, 159-165 (2002). El ADNc se liberó del vector plasmídico pCR2.1-TOPO por digestión con KpnI y se ligó dentro del sitio KpnI del vector intermedio pBlueBac 4.5 (Invitrogen). Los plásmidos recombinantes se rastrearon para orientación de inserto con EcoRI. El inserto se liberó de un plásmido seleccionado con PstI más EcoRI y se ligó en plásmido de vector binario pCB302-1 (Xiang et al, 1999) que se ha cortado con las mismas enzimas. Esto situó la región codificante IgASE1 sometida al control del promotor CaMV 35S como una fusión traduccional con el péptido de tránsito de la subunidad pequeña de Rubisco (Xiang et al., 1999), con la intención de dirigir el componente de elongasa a cloroplastos cuando se expresa en plantas transgénicas. Este vector binario recombinante se designó pCB302-1ASE. Para construir un vector similar con expresión del componente de elongasa dirigido a la membrana microsomal, la región codificante IgASE1 se retiró del vector intermedio por digestión con BamHI más Spel y se ligó en los sitios correspondientes de pCB302-3 (Xiang et al., 1999, en los que el mapa de pCB302-3 es incorrecto: el promotor CaMV 35S (secuencia plus omega) y las regiones de los terminadores de nos están invertidas con respecto a MCS2). Este vector binario recombinante se designó pCB302-3ASE.
Ejemplo 5: expresión de plantas de la elongasa
Los vectores binarios se transfirieron a la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación; se
seleccionaron colonias transformadas en medio que contiene 50 mg ml-1 de kanamicina. Se cultivaron colonias seleccionadas hasta la fase estacionaria a 28 ºC, después las células se concentraron por centrifugación y se suspendieron en una solución de inmersión que contiene sacarosa al 5 %, Silwet-177 al 0,03 % y MgCl2 10 mM.
Semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia 4 se hicieron germinar en medio de Murashige y Skoog a la mitad de su concentración y las plántulas se transfirieron a compost en macetas de flores de 15 cm. Las plantas se cultivaron hasta la fase de floración en una cabina de cultivo a 21 ºC, con un ciclo de 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad. La transformación de plantas se llevó a cabo por el procedimiento de inmersión floral de Clough y Bent (1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal 16, 735-743 (1998), esencialmente como sigue:
Para cada construcción se invirtieron dos macetas conteniendo 16 plantas en las soluciones de inmersión conteniendo
A. tumefaciens transformada (descrita anteriormente). Las plantas se revistieron después con una bolsa de plástico y se dejaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante toda una noche. La bolsa se retiró después y las plantas se transfirieron a la cámara de cultivo. Se repitió la inmersión (con soluciones de A. tumefaciens recién preparadas) después de 5 días y las plantas se dejaron granar. Se recogieron semillas agrupadas de plantas sumergidas (= semilla T1) y aproximadamente 10000 semillas se esparcieron sobre el compost en una cubeta de semillas y después de estratificación a 4 ºC for 2 días, se cultivaron en la cabina de cultivo. Cuando las plántulas hubieron alcanzado la fase de 2 a 4 hojas verdaderas se pulverizaron con herbicida Liberty (Aventis, 0,5 g de glufosinato de amonio I-1) y la pulverización se repitió una semana más tarde. Se selecionaron y se plantaron 12 plantas resistentes a herbicida para cada línea (componente de elongasa dirigido al cloroplasto o al citoplasma) y se dejaron autofertilizar. Muestras de semillas T2 recogidas a partir de estas plantas se hicieron germinar en un medio de Murashige y Skoog a la mitad de su concentración conteniendo Liberty (5 mg de glufosinato de amonio I-1). Semilla T3 recogida de plantas supervivientes individuales se hizo germinar de nuevo en placas de Liberty para rastrear en busca de líneas que hayan terminado segregación por resistencia a herbicida. Los ácidos grasos totales extraídos de hojas de tales líneas se analizaron y aquellos con el contenido en C20 más grande (CB12-4 con el componente de elongasa dirigido a cloroplastos y CA1-9 con el componente de elongasa dirigido a citoplasma) se seleccionaron.
Ejemplo 6: producción de plantas transgénicas que expresan el componente de elongasa de Isochrysisgalbana IgASE1 y la desaturasa Δ-8 EUGD8 deEuglena gracilis
La región codificante de la Δ-8-desaturasa se retiró del vector de expresión de levaduras pESC-Trp con BamHI más XhoI, se ligó en los sitios de BamHI y de XhoI de pBlueBac 4.5 (Invitrogen) y se transformó en cepa de E. coli Tam1. El inserto se retiró a partir de un plásmido recombinante con Bg/II y BamHI, se ligó en el sitio BamHI de pBECKS19.6 y se transformó en cepa Tam1 de E. coli. Se hicieron minipreparaciones de ADN de los plásmidos recombinantes de 6 colonias de transformantes; estas se digirieron con XhoI para determinar la orientación de inserción de la región codificante de la desaturasa en el vector binario. Un plásmido recombinante con el inserto en la orientación correcta para expresión a partir del promotor 35S de CaMV se transfirió a la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación y una solución de inmersión preparada a partir de una colonia transformada como se describe anteriormente.
Las líneas CB12-4 y CA1-9 de Arabidopsis thaliana (véase anteriormente) se sometieron a inmersión floral como se describe anteriormente. Aproximadamente 2000 semillas T1 de cada línea se dispersan en placas de petri de 15 cm que contienen un medio de Murashige y Skoog a la mitad de su concentración (sólido) suplementado con 50 mg ml-1 de kanamicina y germinado en la cabina de crecimiento. Se transfirieron 12 plantas resistentes a kanamicina de la línea parental CA1-9 y 3 plantas de la línea parental CB12-4 a tierra para macetas y se cultivaron adicionalmente en la cámara de cultivo. Se llevó a cabo análisis de ácidos grasos en una hoja tomada de cada una de las plantas de T2, que se dejaron madurar y granar.
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Ejemplo 7: producción de plantas transgénicas que expresan el componente de elongasa de Isochrysisgalbana IgASE1 y la desaturasa Δ-8 EUGD8 deEuglena gracilis y una desaturasa Δ-5
La Δ5 desaturasa de Phaeodactylum tricornutum se clonó en el plásmido pGPTV (Becker, D. et al.; Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1195-1197) que alberga un gen marcador seleccionable de resistencia a higromicina. Para expresión específica de semillas el promotor USP de Vicia faba se clonó 5' con respecto a la ATG de la desaturasa Δ5.
El vector binario se transfirió a cepa GV 3101 de Agrobacterium tumefaciens y las colonias transformadas se seleccionaron en medio conteniendo 30 mg ml-1 de higromicina. Las agrobacterias seleccionadas se usaron para la transformación (transformación floral) de plantas de Arabidopsis llevando las inserciones de ADN-T con la elongasa Δ9 y la desaturasa Δ5.
Las plántulas de Arabidopsis thaliana se hicieron germinar en medio Murashige y Skoog conteniendo higromicina y las plantas resistentes se transfirieron al invernadero.
Las semillas recogidas de plantas individuales se cosecharon y el perfil de ácidos grasos totales se analizó usando procedimientos de CG.
Ejemplo 8: clonación de plásmidos de expresión para expresión en plantas específica de semillas
pBin-USP es un derivado del plásmido pBin19. pBin-USP se produjo a partir de pBin19 insertando un promotor USP como un fragmento EcoRI-BaMHI dentro de pBin19 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711). La señal de poliadenilación es aquella del gen 3 del ADN-T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3, 835), por la que los nucleótidos 11749-11939 se aislaron como un fragmento de PvuII-HindIII y después de la adición de enlazadores de Sphl a la interfase Pvull entre la interfase SpHI-HindIII del vector se clonaron. El promotor USP corresponde a nucleótidos 1-684 (número de acceso del banco de genes X56240), en los que una parte de la región no codificante del gen USP está contenida en el promotor. El fragmento del promotor que se extiende hasta los 684 pares de bases se amplificó por procedimientos estándar por medio de cebador estándar T7 comercial (Stratagene) y usando un cebador sintetizado por una reacción de PCR.
Secuencia del cebador:
El fragmento de PCR se cortó de nuevo usando EcoRI/SalI y se insertó en el vector pBin 19 con terminador de OCS. Se obtuvo el plásmido que tiene la designación pBinUSP. Las construcciones se usaron para transformar Arabidopsis thaliana, colza oleaginosa, tabaco y linaza.
Ejemplo 9: producción de cultivos oleaginosos transgénicos
Producción de plantas transgénicas (modificada de acuerdo con Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242).
Para producir plantas de colza oleaginosa transgénicas se usaron vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 o en Escherichia coli (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para transformar plantas de colza oleaginosa (var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania) se usó una dilución
1:50 de un cultivo durante toda una noche de una colonia de agrobacterias transformadas positivamente en medio Murashige-Skoog (Murashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) conteniendo 3 % de sacarosa (medio 3MS). Los peciolos o hipocotiledones de plantas de colza estériles recién germinadas (aproximadamente 1 cm2 cada uno) se incubaron en una placa de Petri con una dilución de agrobacterias 1:50 durante 5-10 minutos. Esto se siguió por incubación de 3 días en la oscuridad a 25 ºC en medio 3MS que contiene 0,8 % de Bacto-Agar. Después de tres días, se continuó el cultivo con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y en un ciclo semanal de medio MS que contiene 500 mg/l of Claforán (cefotaxima de sodio), 50 mg/l de kanamicina, 20 microM de bencilaminopurina (BAP) y 1,6 g/l de glucosa. Se transfirieron brotes de crecimiento en medio MS que contiene 2 % de sacarosa, 250 mg/l de Claforán y 0,8 % de Bacto-Agar. Si después de tres semanas no se han formado raíces se añadió ácido 2-indolilbutírico al medio como una hormona del crecimiento para fines de enraizado.
Los brotes regenerados se obtuvieron en medio 2MS usando kanamicina y Claforán, se transfirieron en suelo después de enraizar y después de crecimiento en cultivo durante dos semanas en una cámara de clima controlado, se llevaron a floración y después de cosecha de semilla madura se investigaron en la expresión de la Δ-8-desaturasa por medio de análisis lipídicos. Se identificaron líneas que tienen contenidos incrementados de dobles enlaces en la posición Δ-8. En las líneas transgénicas transformadas establemente que expresan funcionalmente el transgén se encontró que hay un contenido incrementado de dobles enlaces en la posición Δ-8 por comparación con plantas control no transformadas.
El mismo procedimiento se hizo para crear plantas con actividad Δ-9-elongasa y/o Δ-5-desaturasa.
a) Plantas de lino transgénicas
Las plantas de lino transgénicas se pueden producir por ejemplo por el procedimiento Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6): 456-465, por medio de bombardeo de partículas. Las transformaciones mediadas por agrobacterias también pueden producirse, por ejemplo, como se describe por Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.
Ejemplo 10: extracción de lípidos a partir de material de semillas y hojas
El material de plantas (aproximadamente 200 mg) primero de todo se homogeneizó mecánicamente por medio de trituradores con el fin de volverlo más susceptible para extracción.
El sedimento celular desbaratado se hidrolizó con ácido clorhídrico metanólico 1 M y dimetoxipropano al 5 % durante 1
hora a 85 ºC y los lípidos se transmetilaron. Los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes (FAME) se extrajeron en hexano. Los FAME extraídos se analizaron por cromatografía de gases-líquida usando una columna capilar (Chrompack, sílice fusionada WCOT, cera CP 52 CB, 25 m, 0,32 mm) y un gradiente de temperatura desde 170 ºC hasta 240 ºC en 20 minutos y 5 minutos a 240 ºC. La identidad de los ésteres metílicos de ácidos grasos se confirmó
5 por comparación con los estándares de FAME correspondientes (Sigma). La identidad y la posición del doble enlace se analizaron adicionalmente por medio de CG-EM por ionización química adecuada de las mezclas de FAME, por ejemplo para formar derivados de 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998).
Figura 1 muestra el perfil de ácidos grasos (FAME) del tejido foliar de Arabidopsis thaliana de tipo silvestre como un control. Figura 2 muestra el perfil de ácidos grasos (FAME) de tejido foliar de Arabidopsis transgénica que expresa la
10 Δ-9-elongasa de Isochrysis (véase el ejemplo 4). Esta línea de Arabidopsis se retransformó subsiguientemente con la Δ-8-desaturasa de Euglena.
El perfil de ácidos grasos (FAME) de dicha línea de Arabidopsis doblemente transformada (Línea IsoElo X Eu D8 des) se da en la Figura 3.
Además dicha línea de Arabidopsis doblemente transformada (Línea IsoElo X Eu D8 des) se re-transformó
15 subsiguientemente con el gen de la Δ5 desaturasa de Mortierella (Mort Δ5). El perfil de ácidos grasos (FAME) de dicha línea de Arabidopsis triplemente transformada (Línea IsoElo X EU D8 des x Mort Δ5) se da en la Figura 4.
Ejemplo 11: perfiles de CG de ésteres metílicos de ácidos grasos en hojas de Arabidopsis a partir de diferentes transgénicos
Figura 5 muestra perfiles de CG de ésteres metílicos de ácidos grasos en hojas de Arabidopsis extraídos de plantas de
20 tipo silvestre (WT 5a), de plantas transgénicas de forma única que expresan el gen Ig ASE1 (5b) de elongasa Δ9 de Isochrysis galbana, de planta doblemente transgénica que expresa los genes Ig ASE1 y de desaturasa Δ8 de Euglena (EU Δ8) (5c) y de la planta triplemente transgénica que expresa los genes Ig ASE1, Eu Δ8 y de Δ5 desaturasa de Mortierella (Mort Δ5) (5d).
Tabla 1 muestra la composición de ácidos grasos de plantas de Arabidopsis preparadas a partir del tipo silvestre (Wt),
25 de la planta transgénica de forma única que expresa el gen de elongasa IgASE1 de Isochrysis galbana, de plantas doblemente transgénicas que expresan el gen de elongasa IgASE1 y el gen de Euglena Δ8 desaturasa y de plantas triplemente transgénicas que expresan el IgASE1, el Δ8 de Euglena y el gen de Δ5 desaturasa de Mortierella. El análisis es de tejido foliar a partir de plantas de Arabidopsis en fase de roseta. Cada valor representa el promedio de 2 medidas.
Ácido graso (% molar del total)
Fuente vegetal
Tipo silvestre
Transgénica en IgASE1 Transgénica en IgASE1 + EuΔ8 Transgénica en IgASE1 + EuΔ8 + MortΔ5
16:0
19,9 19,2 14,7 14,2
16:1
2,8 3,3 1,8 2,3
16:3
13,1 12,2 19,9 15,4
18:0
1,7 2,4 0,8 1,5
18:1n-9
1,7 5,1 1,6 3,4
18:2n-6
11,2 9,0 4,2 6,6
18:3n-3
50,1 31,1 36,0 31,2
20:2n-6
- 7,9 0,9 3,2
20:3, Δ5, 11, 14
- 1,5
20:3n-6
- - 9,1 1,5
20:4n-6 (ARA)
- - 6,6
20:3n-3
- 9,9 4,0 4,8
20, 4Δ5, 11, 14, 17
- - - 1,6
(continuación)
Ácido graso (% molar del total)
Fuente vegetal
Tipo silvestre
Transgénica en IgASE1 Transgénica en IgASE1 + EuΔ8 Transgénica en IgASE1 + EuΔ8 + MortΔ5
20:4n-3
- - 7,2 2,9
20:5n-3 (EPA)
- - - 3,3
PUFA C20 totales
- 17,8 21,2 22,2
Todos los transgenes están sometidos al control del promotor vírico 35S-CaMV. La Δ9 elongasa (IgASEI) de Isochrysis con secuencia de tránsito de Rubisco SSU [ADN-T de Basta-r] se retransformaron con Δ8-desaturasamut175+313 de
5 Euglena [ADN-T de Kanamicina-r]. La línea doblemente transformada, que es homocigótica tanto para Basta-r como para Kanamicina-r, se transformó de nuevo con desaturasa Δ5 de Mortierella (ADN-T de Higromicina-r). La línea triplemente transformada resultante es homocigota tanto para Basta-r como para Kanamicina-r, pero heterocigota para Higromicina-r.
Listado de secuencias
10 <110> Universidad de Bristol
<120> Procedimiento novedoso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados
<130> Documento 2002_791
<140> Documento 2002_271
<141> 18/12/2202 15 <160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 1266
<212> ADN 20 <213> Euglena gracilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1266)
<223> delta-8-desaturasa 25 <400> 1
<210> 2
<211> 421
<212> PRT
<213> Euglena gracilis
<400> 2
<210> 3
<211> 777
<212> ADN 5 <213> Isochrysis galbana
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(777)
<223> delta-9-elongasa 10 <400> 3
<210> 4
<211> 258
<212> PRT
<213> Isochrysis galbana
<400> 4
<210> 5
<211> 1410
<212> ADN 5 <213> Phaeodactylum tricornutum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1410)
<223> delta-5-desaturasa 10 <400> 5
<210> 6
<211> 469
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 6
<210> 7
<211> 1344
<212> ADN 5 <213> Ceratodon purpureus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1344)
<223> delta-5-desaturasa 10 <400> 7
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> Ceratodon purpureus
<400> 8
<210> 9
<211> 1443
<212> ADN
<213> Physcomitrella patens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1443)
<223> delta-5-desaturasa
<400> 9
<210> 10
<211> 480
<212> PRT
<213> Physcomitrella patens
<400> 10

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la producción de compuestos de la siguiente fórmula general I
    en planta que produce aceite transgénica con un contenido de al menos el 1 % en peso de dichos compuestos referido
    5 al contenido en lípidos total de dicha planta que produce aceite que comprende las siguientes etapas: a) introducción de al menos un ácido nucleico en una planta que produce aceite transgénica, que codifica una Δ-9-elongasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 3, e
    b) introducción de al menos un segundo ácido nucleico que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.º: 1 y 10 c) si es necesario introducción de al menos un tercer ácido nucleico, que codifica una Δ-5-desaturasa que tiene la secuencia SEC ID N.ºs: 5, 7 o 9, y d) cultivo y cosecha de dicha planta que produce aceite; y donde las variables y sustituyentes en fórmula I tienen los siguientes significados: R1 = hidroxil-, Coenzima A-(Tioéster), fosfatidilcolina-, fosfatidil-etanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, 15 fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-o un residuo de fórmula general II:
    R2 = hidrógeno-, fosfatidilcolina-, fosfatidiletanolamina-, fosfatidilglicerol-, difosfatidilglicerol-, fosfatidilserina-, fosfatidilinositol-, esfingolípido-, glucoesfingolípido-, glucoesfingolípido-o -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado,
    R3 = hidrógeno-, -alquilcarbonil C2-C24 saturado o insaturado, o R2 y R3 independientes el uno del otro son un residuo 20 de la fórmula Ia:
    n = 3, 4 o 6, m = 3, 4 o 5 y p = 0 o 3.
  2. 2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquilcarbonil C10-C22 saturado o insaturado.
    25 3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en las que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquil-carbonil C16-, C18-, C20-o C22 saturado o insaturado.
  3. 4.
    El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los sustituyentes R2 y R3 son independientemente el uno del otro -alquilcarbonil C16-, C18-, C20-o C22 con al menos tres dobles enlaces.
  4. 5.
    El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la planta transgénica se selecciona del
    30 grupo que consiste en colza oleaginosa, amapola, mostaza, cáñamo, semilla de ricino, sésamo, aceituna, caléndula, granado, avellana, almendra, macadamia, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, onagra, canola, cacahuete,
    linaza, soja, cártamo, girasol y borraja.
  5. 6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los compuestos de la fórmula general I están aislados en forma de sus aceites, lípidos o ácidos grasos libres.
  6. 7.
    El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los compuestos de la fórmula general I 5 están aislados en una concentración de al menos el 5 % en peso referido al contenido en lípidos total.
  7. 8.
    Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Δ-8-desaturasa que tiene una secuencia de ácidos nucleicos representada en SEC ID N.º: 1.
  8. 9.
    Polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.
  9. 10.
    Una construcción génica que comprende un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia SEC ID N.º: 1, en la que 10 el ácido nucleico está unido funcionalmente a una o más señales reguladoras.
  10. 11. Una planta productora de aceite que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 8 o una construcción génica según en la reivindicación 10.
    FIG. 1
    Tiempo de retención (min)
    FIG. 2
    Tiempo de retención (min)
    FIG. 3
    Tiempo de retención (min)
    FIG. 4D
    (min)
    FIG. 5A
    (min)
    FIG. 5B
    (min)
    FIG. 5C
    (min)
    FIG. 5D
    (min)
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