JP2002510205A

JP2002510205A - ポリケチド様合成遺伝子を植物内で発現させることによる多不飽和脂肪酸の製造

Info

Publication number: JP2002510205A
Application number: JP50292699A
Authority: JP
Inventors: ファッチオッティ，ダニエル; メッツ，ジェームズ，ジョージ; ラスナー，マイケル
Original assignee: カルジーンエルエルシー
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2002-04-02
Also published as: EP1003869A1; US6140486A; IN1998CH01219A; WO1998055625A1; CA2283422A1; BR9809946A; IL133272A0; MX9911200A

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物、植物部分および植物細胞、例えば葉、根、果実および種子内で多不飽和長鎖脂肪酸を製造するための組成物および方法に関する。シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）のエイコサペンタエン酸の産生を引き起こす遺伝子、およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）におけるドコサヘキサエン酸の産生に関連する新規遺伝子などの多不飽和長鎖脂肪酸の産生に必要なPKS様遺伝子をコードする核酸配列および構築物を使用して、そのような長鎖多不飽和脂肪酸の産生に関連するPKS様遺伝子の１以上をコードする１以上のトランスジーンを含有し発現するトランスジェニック植物、植物部分および細胞を作製する。該植物系内でのPKS様遺伝子の発現は、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの多不飽和長鎖脂肪酸の大規模製造を可能にし、植物、植物部分および組織の脂肪酸プロフィールを変更しうる。該脂肪酸プロフィールの操作は、商業的量の新規植物油および産物の製造を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】ポリケチド様合成遺伝子を植物内で発現させることによる多不飽和脂肪酸の製造序論発明の分野本発明は、宿主細胞内で長鎖多不飽和脂肪酸（PUFA）を修飾しうる酵素および／または酵素成分のレベルのモジュレーション、ならびに宿主細胞内でPUFAを製造するための構築物および方法に関する。本発明は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio mari nus）に由来する遺伝子を使用するエイコサペンタエン酸（eicosapentenoic aci d(EPA)）の製造により例示される。背景多不飽和脂肪酸（PUFA）の２つの主要ファミリーは、エイコサペンタエン酸などのω3脂肪酸およびアラキドン酸などのω6脂肪酸である。PUFAは細胞の形質膜の重要な成分であり、該形質膜においては、それはリン脂質のような形態で見出され、また、トリグリセリドのような形態でも見出されうる。また、PUFAは、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、プロスタグランジンなどのヒトおよび動物において重要な他の分子の前駆体として機能する。重要な長鎖PUFAには、種々のタイプの魚油中に主として見出されるドコサヘキサエン酸（docosahexenoic aci d(DHA)）およびエイコサペンタエン酸(EPA)、メマツヨイグサ(Oenothera bienni s)、ルリチシャ（Borago officinalis）およびクロフサスグリ（Ribes nigrum）などの多数の植物の種子中に見出されるγ-リノレン酸(GLA)、海洋油および植物種子中に見出されるステアリドン酸(SDA)、ならびにGLAと共に糸状菌中で見出されるアラキドン酸（ARA）が含まれる。ARAは、肝臓、副腎などの動物組織から精製することができる。EPAまたはDHAのいずれかを合成する海洋細菌のいくつかの属が公知である。DHAは、ARAと共にヒト乳中に存在する。 PUFAは、適切な発達、特に乳児の脳の発達、および組織の形成および修復に必要である。例えば、DHAは、多数のヒト細胞膜、特に神経細胞(灰白質)、筋細胞および精子の重要な構成成分であり、脳機能全般の発達に影響を及ぼし視覚の発達に必須であると考えられている。EPAおよびDHAは、多数の栄養的および薬理学的用途を有する。例えば、糖尿病（特に、インスリン非依存性糖尿病）に罹患した成人は、後の冠状状態の一因になると考えられているDHAレベルの欠乏および不均衡を示す。したがって、調和のとれたDHAを含む食物は、糖尿病に対して有益かもしれない。 DHAに関しては、種々の海洋生物、冷水海洋魚類から得た油および卵黄画分などの多数の商業的製造起源が存在する。魚類起源からのDHAの精製は、技術的な困難性のため比較的高い費用を要し、DHAを高価かつ供給不十分なものにする。アンフィディニウム（Amphidinium）、スキゾチトリウム（Schyzochytrium）などの藻類およびトラウストキトリウム(Thraustochytrium)などの海洋菌類では、 DHAが該細胞の脂肪酸含量の48％までに相当する。また、少数の細菌がDHAを産生すると報告されている。これらは、一般に、ビブリオ・マリヌス（VIbrio marin us）などの深海細菌である。ARAに関しては、モルティエレラ（Mortierella）属、エントモフトラ（Entomophthora）属、フィチウム（Phytium）属およびチノリモ（Porphyridium）属を含む微生物を、商業的製造に使用することができる。SD Aの商業的起源には、トリコデスマ（Trichodesma）属およびエチウム（Echium）属が含まれる。GLAの商業的起源には、メマツヨイグサ、クロフサスグリおよびルリチシャが含まれる。しかしながら、天然起源からPUFAを商業的に製造することに関連したいくつかの欠点がある。動物、植物などのPUFAの天然起源は、非常に不均一な油組成を有する傾向にある。これらの起源から得た油は、１以上の所望のPUFAを分離したり又は１以上の所望のPUFAに富む油を製造するためには、徹底的な精製を要する可能性がある。また、天然起源は、入手可能性における制御できない変動にさらされる。魚類資源は、自然変異を受けたり、あるいは乱獲により枯渇する可能性がある。動物油、および特に魚油は、環境汚染物質を蓄積している可能性がある。天候および病気が、魚および植物の両方の起源からの収量の変動を引き起こす可能性がある。代替油産生作物の生産に利用可能な農耕地は、一定の人口増加と、それに伴う、残りの耕地上の食物生産に対する需要の増加とからの競合にさらされる。PUFAを産生する作物（例えば、ルリチシャ）は、商業的栽培に順応化されておらず、単一栽培においては十分に得られない可能性がある。したがって、そのような作物の栽培は、より有益かつ定評ある作物の栽培が可能な場合には、経済的な競争力を有さない。また、シュウワネラ（Shewanella）などの生物の大規模発酵は高い費用を要する。天然動物組織は、少量のARAしか含有せず、加工が困難である。チノリモ(Porphyridium)、シュウワネラ（Shewanella）などの微生物は、商業的規模で培養することが困難である。 PUFAを含有する食物補充剤および医薬製剤は、PUFA起源の欠点を保有している可能性がある。魚油カプセルなどの補充剤は、特定の所望の成分を低レベルでしか含有していないことがあり、したがって大用量を要する。高用量は、汚染物を含む望ましくない成分の高レベルの摂取につながる。過剰添加は、内因性生合成経路の抑制を引き起こし、in vivoにおける種々の脂質画分中の他の必要な脂肪酸との競合を引き起こし、望ましくない結果を招く可能性があるため、脂肪酸補充剤を与える際には注意が必要である。例えば、ω3脂肪酸に富む食物を摂取するエスキモー人は、高い出血傾向を有する(米国特許第4,874,603号)。魚油は不快な風味および香りを有し、それを食物補充剤などの所望の製品から経済的に分離することが不可能な場合がある。該補充剤の不快な風味および香りは、該補充剤が係わるそのような投与計画を望ましくないものにすることがあり、患者による応諾を妨げる可能性がある。多数の酵素がPUFAの生合成に関与していることが確認されている。リノール酸（LA，18:2 Δ9，12）は、Δ12-デサチュラーゼによりオレイン酸（18:1 Δ9）から産生される。GLA（18:3 Δ6，9，12）は、Δ6-デサチュラーゼによりリノール酸（LA,18:2 Δ9，12）から産生される。ARA（20:4 Δ5,8,11,14）は、Δ5-デサチュラーゼにより触媒されてDGLA（20:3 Δ8，11，14）から産生される。エイコサペンタエン酸（EPA）は、すべてシス配置の５個の二重結合（Δ5,8,11,14,1 7）を含有する炭素数20のω3脂肪酸である。EPAおよび関連するDHA（Δ4,7,10,1 3,16,19,C22:6）は、一連の伸長および不飽和化反応によりオレイン酸から産生される。また、炭素数18のPUFAを炭素鎖長20および22にまで伸長させるためには、エロンガーゼ（elongase）が必要である。しかしながら、動物はオレイン酸（18:1 Δ9）をリノール酸（18:2 Δ9，12）に変換することができない。同様に、哺乳類は、μ-リノレン酸（ALA，18:3 Δ9，12，15）を合成することができない。菌類および植物を含む他の真核生物は、Δ12位およびΔ15位で不飽和化する酵素を有する。したがって、動物の主要な多不飽和脂肪酸は、食物に由来するか、および／または、リノール酸（18:2 Δ9，12）もしくはμ-リノレン酸（18:3 Δ9,12,15）の不飽和化および伸長に由来する。多不飽和脂肪酸は、栄養的、医薬的、産業的および他の目的に有用と考えられる。天然起源および化学合成からの多不飽和脂肪酸の広範な供給は、市場の需要を満たしていない。ほとんどの植物種に共通するリノール酸（LA,18:2 Δ9,12）から、より飽和した、より長い鎖のPUFAへと脂肪酸が合成されるためには、多数の分離したデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素が必要であるため、少なくともEPAおよびDHAに関しては、発現を達成するためには、EPAおよびDHAの発現のための植物宿主細胞の操作は、５個または６個の分離した酵素活性の発現を要する可能性があり、そのようなPUFAの大量生産のためには、追加的な操作労力（例えば、基質に関して競合する酵素のダウンレギュレーション、突然変異誘発または色素体オルガネラへの酵素のターゲッティングなどによる、より高い酵素活性の操作）を要するかもしれない。したがって、これらの脂肪酸を天然で産生する種から、PUFAの生合成に関与する遺伝物質を得ること、およびそのような単離された物質を、単独で又は組合せて、商業的量のPUFAの産生を可能にするように操作されうる異種系内で発現させることに関心が持たれている。関連文献 EPAまたはDHAのいずれかを合成する海洋細菌のいくつかの属が同定されている (DeLongおよびYayanos，Applied and Environmental Microbiology(1986)51:730 -737)。Sagami Chemical Research Instituteの研究者は、海洋細菌シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）由来の遺伝子クラスターで形質転換された大腸菌（E．coli）内でのEPA産生を報告している。大腸菌（E.coli）内でのEPAの脂肪酸合成には、少なくとも５個のオープンリーディングフレーム（ORF）が必要である。現在までに、これらの遺伝子にコードされるタンパク質の機能の広範な特徴づけは報告されていない(Yazawa(1996 )Lipids 31,S-297;WO 93/23545;WO 96/21735)。 Yazawa，米国特許第5,683,898号に公開されているオープンリーディングフレーム（ORF）３のタンパク質配列は、機能的なタンパク質ではない。Yazawaは、該タンパク質を、シュウワネラ（Shewanella）PKS様クラスター(Genbank受託第U 73935号）のヌクレオチド9016〜9014のメチオニンコドンから開始しシュウワネラ（Shewanella）PKS様クラスターのヌクレオチド8185〜8183の終結コドンで終結するものと定義している。しかしながら、このORFが、ORF３を除く全PKS様クラスターを含有する大腸菌（E．coli）株において異種プロモーターの制御下で発現される場合には、該組換え細胞はEPAを産生しない。ポリケチドは、脂肪酸合成の酵素反応に類似した一組の酵素反応を含む合成により生じる二次代謝産物である(以下の概説を参照されたい：HopwoodおよびSher man,Annu.Rev.Genet.(1990)24:37-66、ならびにKatzおよびDonadio,Annual Revi ew of Microbiology(1993)47:875-912)。新規抗生物質を産生させるためにポリケチドシンターゼを使用することが提案されている(HutchinsonおよびFujii,Ann ual Review of Microbiology(1995)49:201-238)。発明の概要植物および植物細胞内でポリケチド様合成（PKS様）遺伝子を使用して長鎖多不飽和脂肪酸（PUFA）を製造するための新規組成物および方法を提供する。脂肪酸合成遺伝子を使用してPUFAを製造するための公知の及び提案されている方法とは異なり、本発明は、PKS様系の遺伝子を使用することによりPUFAを製造するための構築物および方法を提供する。該方法は、発現カセットで形質転換された目的の宿主細胞を成長（増殖）させることを含み、該発現カセットは該宿主細胞内で機能的であり、該発現カセットは、PUFAの産生をモジュレーションしうるPKS 様系の遺伝子（PKS様遺伝子）または成分に対してDNA配列の5'側にリーディングフレームを合わせて連結された転写および翻訳開始調節領域を含む。宿主細胞のPUFAプロフィールの改変は、PUFAの生合成を引き起こす完全なPKS様系を宿主細胞内に導入した後の発現により達成される。本発明は、例えば、DHAおよびEPAの大規模製造、ならびに宿主細胞および食用植物組織および／または植物部分の脂肪酸プロフィールの修飾に有用である。図面の簡単な説明図１は、シュウワネラ（Shewanella）のEPA遺伝子クラスターのORFの名称を示す。図1Aは、該遺伝子の構成を示し、大腸菌（E．coli）内でのEPA産生に必須の ORFに番号が付されている。図1Bは、サブクローンに与えられた名称を示す。図２は、ORF６(図2A)、ORF７(図2B)、ORF８(図2C)、ORF９（図2D）およびORF ３（図2E）のシュウワネラ（Shewanella）PKS様ドメイン構造、モチーフおよび「ブラスト(Blast)」のマッチを示す。図2Fは、シュウワネラ（Shewanella）EPA ORF中に存在するドメインに関連したアナベナ（Anabeana）染色体の領域の構造を示す。図３は、大腸菌（E．coli）株SJ16におけるORF３のパンテテニル化（pantethe nylation）の結果を示す。図４は、ORF３、４、５、７、８および９を含有する、シュウワネラ（Shewane lla）において見出されるPKS様クラスターの配列である。各ORFの開始コドンおよび最終コドンは以下のとおりである：ORF３(公開されているもの一不活性)：9 016、8186；ORF３(EPA合成において活性)：9157、8186；ORF６：13906、22173； ORF７:22203、24515；ORF８:24518、30529；ORF９:30730、32358。図５は、ORF６、７、８および９を含有するビブリオ・マリヌス(Vibrio marinu s)の約40kbのDNA断片内のPKS様クラスターの配列を示す。各ORFの開始コドンおよび最終コドンは以下のとおりである：ORF６:17394、25352；ORF７:25509、281 60；ORF８:28209、34265；ORF９:34454、36118。図６は、ORF６、７、８および９を含有する図５のPKS様クラスターの約19kbの部分の配列を示す。各ORFの開始コドンおよび最終コドンは以下のとおりである：ORF６:411、8369；ORF７:8526、11177；ORF８:11226、17282；ORF ９：17471、19135。図７は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のPKS様遺伝子クラスターの比較を示す。図7Bは、ビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のオペロン配列である。図８は、ORF６、７および８がリーディングフレーム２中に存在しORF９がリーディングフレーム３中に存在することを示す、図7Bに示すビブリオ・マリヌス（ Vibrio marinus）のPKS様遺伝子クラスター部分の拡大図である。図９は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のORF６の配列相同性を示す。シュウワネラ(Shewanella)ORF６が縦軸に示されており、ビブリオ(Vibrio)ORF６が横軸に示されている。線は、60％の同一性を有するタンパク質領域を示す。中央部の反復線は、ORF６中に見出される複数のACPドメインに相当する。図10は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のORF７の配列相同性を示す。シュウワネラ（Shewanella）ORF７が縦軸に示されており、ビブリオ（Vibrio）ORF７が横軸に示されている。線は、60％の同一性を有するタンパク質領域を示す。図11は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のORF８の配列相同性を示す。シュウワネラ(Shewanella)ORF８が縦軸に示されており、ビブリオ(Vibrio)ORF８が横軸に示されている。線は、60％の同一性を有するタンパク質領域を示す。図12は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）およびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のORF９の配列相同性を示す。シュウワネラ（Shewanella）ORF９が縦軸に示されており、ビブリオ（Vibrio）ORF９が横軸に示されている。線は、60％の同一性を有するタンパク質領域を示す。図13は、種々の相補性実験および得られたPUFA産生の図である。左側に示すビブリオ（Vibrio）およびシュウワネラ（Shewanella）遺伝子を含有する大腸菌（E．coli）株中で生成した最長のPUFAを、右側に示す。中空の枠は、シュウワネラ(Shewanella)由来のORFを示す。黒塗りの枠は、ビブリオ(Vibrio)由来のORFを示す。図14は、大腸菌（E．coli）FadE-における、シュウワネラ（Shewanella）由来のpEPAD8（欠失ORF８）をシュウワネラ（Shewanella）由来のORF８で相補することによる脂肪酸の産生を示すクロマトグラムである。該クロマトグラムは、EPA （20:5）のピークを示す。図15は、大腸菌（E．coli）FadE-における、シュウワネラ（Shewanella）由来のpEPAD8（欠失ORF８）をビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）由来のORF８で相補することによる脂肪酸の産生を示すクロマトグラムである。該クロマトグラムは、EPA（20:5）およびDHA（22:6）のピークを示す。図16は、図15に示すクロマトグラムを与えたORF８相補性実験からのPUFA値の表である。図17は、pCGN7770の要素を示すプラスミド地図である。図18は、pCGN8535の要素を示すプラスミド地図である。図19は、pCGN8537の要素を示すプラスミド地図である。図20は、pCGN8525の要素を示すプラスミド地図である。図21は、Yazawaにより定義されているシュウワネラ（Shewanella）ORFと図４に開示のものとの比較である。ヌクレオチド9157〜9155のロイシン（TTG）コドンから開始しヌクレオチド8185〜8183の終結コドンで終結するタンパク質が、OR F３以外の全PKS様クラスターを含有する大腸菌（E．coli）株において異種プロモーターの制御下で発現される場合には、該組換え細胞はEPAを産生する。したがって、その公開されているタンパク質配列は誤っている可能性があり、該タンパク質のコード配列は、ヌクレオチド9157〜9155のTTGコドンまたはヌクレオチド9172〜9170のTTGコドンから開始する可能性がある。この情報は、機能的PKS様クラスター異種系の発現に決定的に重要である。図22は、pCGN8560の要素を示すプラスミド地図である。図23は、pCGN8556の要素を示すプラスミド地図である。図24は、公開されているORF３の上流の翻訳されるDNA配列を示す。9016 位のATG開始コドンは、Yazawaら（1996）(前掲)に記載されているタンパク質の開始コドンである。その他の矢印は、同様に細菌内で開始コドンとして機能しうるTTGまたはATTコドンを示す。ORF３が、公開されている9016位のATGコドンから開始する場合には、該タンパク質は、EPAの生成において機能的ではない。ORF３が、9157位のTTGコドンから開始する場合には、該タンパク質は、EPA合成を促進しうる。好ましい実施形態の説明本発明では、宿主細胞（特に宿主植物細胞）の多不飽和長鎖脂肪酸含量を改変するための、シュウワネラ(Shewanella)、ビブリオ（Vibrio）または他の微生物に由来するポリケチド様合成（PKS様）経路遺伝子の一部または全部を含む新規D NA配列、DNA構築物および方法を提供する。本発明は、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）中のEPA合成遺伝子がポリケチド様合成経路を構成することを示す。機能は、シュウワネラ（Shewanella）およびビブリオ（Vibrio）遺伝子によるものであり、宿主細胞内でのEPAおよびDHAの製造方法を提供する。該方法は、宿主細胞内の１以上のPUFAの量を増加させうるポリペプチドをコードするDNAを含む発現カセットで該細胞を形質転換する工程を含む。望ましくは、宿主細胞のゲノム内への該発現カセットの組込みを引き起こす組込み構築物を調製する。PKS様遺伝子活性を有するポリペプチドをコードするセンスまたはアンチセンスDNAを発現させるために、宿主細胞を操作する。「PKS様遺伝子」は、目的のPKS様活性の機能の任意の１以上をもたらすポリペプチドを意味する。「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）には無関係に、アミノ酸の任意の鎖を意味する。宿主細胞の性質に応じて、発現される酵素の基質は、宿主細胞により産生させるか、あるいは外因的に供給することが可能である。特に関心が持たれるのは、植物組織および／または植物部分（例えば、葉、根、果実および種子）におけるPUFA産生の選択的制御である。本発明は、宿主細胞内でEPA、DHAおよび他の関連PUFAを合成するために使用することができる。 PUFAのトランスジェニック産生には、多数の利点がある。例えば、シュウワネラ（Shewanella）の場合と同様にトランスジェニック大腸菌（E．coli）では、EPAはリン脂質画分中、特にsn-2位に蓄積する。シュウワネラ(Shewanella) または大腸菌（E.coli）内で産生されるものとは実質的に異なる構造化脂質を所望の宿主細胞内で産生させることが可能かもしれない。また、特定の宿主細胞内でのPUFAのトランスジェニック産生は、魚類、植物などの天然起源からの精製に優るいくつかの利点を与える。トランスジェニック植物においては、PKS様系を用いることにより、マロニルCo-AおよびアセチルCo-Aを基質として使用する脂肪酸のde novo産生を介してPUFAを産生する系により細胞質内でPUFAの脂肪酸合成が達成される。このようにして、基質の競合に関連した問題、宿主内での脂肪酸合成の正常な産物がPUFA産生へ迂回されることに関連した問題などの潜在的な問題が回避される。組換え植物からの脂肪酸の産生は、宿主内に新たな合成経路を付与することにより、あるいは望ましくない経路を抑制し、それにより望ましいPUFAまたはそのコンジュゲート化形態のレベルを増加させ、望ましくないPUFAのレベルを減少させることにより、天然に生じる植物脂肪酸プロフィールを改変しうる。また、特定の組織および／または植物部分におけるPKS様遺伝子の発現は、それらの組織および／または部分における所望のPUFAの著しく増加したレベルの達成が可能であること意味し、それらの組織からの回収を、より経済的なものにしうることを意味するという利点も、トランスジェニック植物内での脂肪酸の産生は与える。植物組織および／または植物部分における発現は、該組織または部分が容易に収穫されるもの（例えば、種子、葉、果実、花、根など）である場合には特に、確かな効率を与える。例えば、所望のPUFAを種子中で発現させることができ、種子油を単離する方法は十分に確立されている。所望のPUFAの精製用起源（source f or purification）が得られることに加えて、PKS様遺伝子を単独で又は他の遺伝子（例えば、エロンガーゼ）と組合せて発現させることにより種子油成分を操作して、ある特定のPUFAプロフィールを有する種子油を濃縮形態で得ることができる。ついで、ヒトの母乳を与えることが不可能または望ましくない場合あるいは成人および乳児の両方における栄養失調または病気の場合には、該濃縮種子油を動物の乳および／または合成もしくは半合成乳に加えて、乳児用製剤として使用することができる。トランスジェニック微生物による脂肪酸の産生には、高等生物のものと比べて著しく単純な油組成を有する多数の微生物が公知であり所望の成分の精製を容易にするという利点がある。微生物による産生は、天候および食物供給などの外的変数により生じる変動にさらされない。微生物が産生した油は、環境汚染物による汚染を実質的に伴わない。また、微生物は、特定の用途を有しうる個々の形態のPUFAを与えることが可能である。例えば、スピルリナ（Spirulina）は、トリグリセリドの１位および３位に優勢に位置するPUFAを与えることが可能であり、膵リパーゼによる消化は、これらの位置から優先的に脂肪酸を遊離する。スピルリナ（Spirulina）由来のトリグリセリドをヒトまたは動物が摂取した後、これらのPUFAは、膵リパーゼにより遊離脂肪酸として遊離され、したがって、例えば乳児の脳の発達に直接利用されうる。また、培養条件を制御することにより、あるいは、注目すべきは、微生物により発現される酵素の個々の基質を付与することにより、あるいは、望ましくない生化学的経路を抑制する化合物を加えることにより、微生物による油の産生を操作することができる。これらの利点に加えて、組換え微生物からの脂肪酸の産生は、宿主内に新たな合成経路を付与することにより、あるいは望ましくない経路を抑制し、それにより望ましいPUFAまたはそのコンジュゲート化形態のレベルを増加させ、望ましくないPUFAのレベルを減少させることにより、天然に生じる微生物脂肪酸プロフィールを改変しうる。動物における脂肪酸の産生もまた、いくつかの利点を与える。動物におけるデサチュラーゼ遺伝子の発現は、著しく増加したレベルの所望のPUFAを動物組織内で産生し、それらの組織からの回収を、より経済的なものにしうる。例えば、所望のPUFAが動物の母乳中で発現される場合、動物の乳からPUFAを単離する方法は十分に確立されている。所望のPUFAの精製用起源が得られることに加えて、デサチュラーゼ遺伝子を単独で又は他のヒト遺伝子と組合せて発現させることにより動物の母乳を操作して、乳児の発達の種々の段階においてヒトの母乳と実質的に同様のPUFA組成を有する動物の乳を得ることが可能である。ヒトの母乳を与えることが不可能または望ましくない場合あるいは栄養失調または病気の場合には、ヒトの母乳に近づくように処理（humanized）された動物の乳を、乳児用製剤として使用することができるであろう。所望のPKS様遺伝子をコードするDNAは、種々の方法で同定することができる。１つの方法では、所望のPKS様遺伝子の起源、例えば、シュウワネラ（Shewanell a）またはビブリオ・スピーシーズ（Vibrio spp）由来のゲノムライブラリーを、酵素的または化学的に合成された検出可能なプローブでスクリーニングする。 PKS様遺伝子を有するORFの起源は、所望のPUFAを産生する生物（例えば、高圧下または比較的低温で優先的に増殖しDHAまたはEPAを産生する深海細菌）である。また、EPAまたはDHAを産生するシュウワネラ（Shewanella）などの微生物を、PK S様遺伝子の起源として使用することができる。該プローブは、DNA、RNAもしくは天然に存在しないヌクレオチドまたはそれらの混合物から作製することができる。正常の又は減少したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション方法のためのプローブは、公知のPKS様遺伝子のDNAから酵素的に合成することができる。核酸プローブの設計およびアニーリング条件の検討には、例えば、Sambrookら,M olecular Cloning:A Laboratory Manual(第２版),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel ら編,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York（1987）(それらの各々を、参照により本明細書に組み入れるものとする)を参照されたい。PUFA酵素をコードする核酸の操作のための技術（例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列の、発現ベクター内へのサブクローニング、プローブの標識、DNAのハイブリダイゼーションなど）は、Sambrook（前掲）に一般的に記載されている。また、オリゴヌクレオチドプローブは、起源をスクリーニングするために使用することが可能であり、公知のPKS様遺伝子間で保存された配列を含む公知のPKS 様遺伝子の配列、または所望の精製タンパク質から得たペプチド配列に基づくことが可能である。アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝暗号の縮重を含むように縮重していることが可能であり、あるいは起源生物の好ましいコドンを優先するよう偏っていることが可能である。別法として、所望のタンパク質を、完全に配列決定し、そのポリペプチドをコードするDNAの全合成を行なうことができる。所望のDNAを単離したら、それを公知方法により配列決定することができる。当技術分野においては、そのような方法は過誤を受けやすいと認識されており、そのため、同一領域の多重配列決定が常套手段となっていろが、それでもなお、反復ドメイン、広範な二次構造または異常な塩基組成を有する領域（例えば、高いGC塩基含量を有する領域）においては特に、得られる推定配列内の無視できない過誤率を招くと予想される。相違が生じる場合には、再び配列決定を行なうことができ、特別な方法を用いることができる。特別な方法には、異なる温度；異なる酵素；より高次の構造を形成するオリゴヌクレオチドの能力を改変するタンパク質；改変されたヌクレオチド、例えばITPまたはメチル化dGTP；異なるゲル組成、例えば、ホルムアルデヒドの添加；異なるプライマーまたは問題の領域から異なる距離に位置するプライマー；または異なる鋳型、例えば一本鎖DNAを用いることによる配列決定条件の改変を含めることができる。また、mRNAの配列決定を用いることができる。通例、PKS様遺伝子活性を有するポリペプチドのコード配列の一部または全部は、天然由来である。しかしながら、場合によっては、例えば、宿主に好ましいコドンを用いることにより発現を増強するために、コドンの全部または一部を修飾することが望ましい。宿主に好ましいコドンは、目的の特定の宿主種において最大量で発現されるタンパク質における最高頻度のコドンから決定することができる。したがって、PKS様遺伝子活性を有するポリペプチドのコード配列の全部または一部を合成することができる。また、転写されたmRNA中に存在する任意の不安定化配列または二次構造の領域を除去するよう、該DNAの全部または一部を合成することができる。また、塩基組成を、所望の宿主細胞にとって更に好ましいものに改変するために、該DNAの全部または一部を合成することができる。配列を合成し配列を合体させるための方法は、文献において十分に実証されている。in vitro突然変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発または他の手段を用いて、天然に存在するPKS様遺伝子の突然変異を得、それにより、所望の多不飽和脂肪酸のより長い半減期またはより高い産生速度などの宿主細胞内での機能に関するより望ましい物理的および速度論的パラメーターを有するPKS様遺伝子活性を有するポリペプチドをin vivoで産生させることができる。特に関心が持たれるのは、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella p utrefaciens）のORFおよびビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）の対応ORFである。EPAの生合成を達成させるために、シュウワネラ・プトレファシエンス（S hewanella putrefaciens）PKS様遺伝子をトランスジェニック植物内で発現させることができる。また、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putre faciens）PKS様遺伝子と配列が実質的に同一であるか、またはシュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）のPKS様遺伝子と実質的に同様のポリペプチドをコードする他のDNA（例えば、ビブリオ・マリヌス（Vibrio mari nus）から同定したもの）を使用することもできる。配列において実質的に同一は、シュウワネラ・プトレファシエンス(Shewanella putrefaciens)のPKS様遺伝子のDNA配列またはそのような遺伝子に関するアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも60％、80％、90％または95％（この順序で好ましさが増加する）の相同性を示すアミノ酸配列または核酸配列を意味する。ポリペプチドの場合には、比較配列の長さは、一般には少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸の場合には、比較配列の長さは、一般には少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドである。相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェア、例えばGenetics Computer Gr oup,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue, Madison,Wisconsin 53705のSequence Analysisソフトウェアパッケージ、MEGAli gn（DNAStar,Inc.,1228 S.Park St.,Madison,Wisconsin 53715）およびMacVecto r(Oxford Molecular Group,2105 S.Bascom Avenue,Suite200,Campbell,Californ ia 95008)、BLAST(National Center for Biotechnology Information（WCBI）ww w.ncbi.nlm.gov)、FASTA(PearsonおよびLipman,Science(1985)227:1435-1446）を使用して測定する。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に対して相同性の度合を当てはめることにより、同様の配列に適合する。同類置換には、典型的には、以下の基の範囲内の置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。また、置換は、保存された疎水性または親水性に基づいて（Kyteおよび Doolittle,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132）あるいは同様のポリペプチド二次構造をとる能力に基づいて（ChouおよびFasman,Adv.Enzymol.(1978)47:45-148,197 8）行なうことが可能である。プローブしている配列に対する関連タンパク質は、p≧0.01、好ましくは、p≧10^-7または10^-8の場合に同定される。本発明には、同じまたは他の生物に由来する関連PKS様遺伝子が含まれる。そのような関連PKS様遺伝子には、シュウワネラ（Shewanella）の同じまたは異なる種内に天然に存在する開示されているPKS様ORFの変異体、および他の種に由来する開示されているPKS様遺伝子のホモログ、および同様の機能および活性を有する進化的に関連したタンパク質が含まれる。また、シュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaclens）PKS様遺伝子と実質的に同一ではないが、 PKS様系の一部としてPUFAを産生するように同様に機能するPKS様遺伝子も含まれる。関連PKS様遺伝子は、開示されているPKS様遺伝子と実質的に同じように機能するそれらの能力［すなわち、それらが、シュウワネラ（Shewanella）またはビブリオ（Vibrio）の対応ORFの代わりに使用され、それでもなお、EPAまたはDHA を有効に産生しうること］により同定することができる。また、開示されている PKS様遺伝子に相同な配列に関して配列データベースをスクリーニングすることにより、あるいは開示されているPKS様遺伝子に基づくプローブを、起源生物から構築されたライブラリーにハイブリダイズさせることにより、あるいは起源生物に由来するmRNAと開示されているPKS様遺伝子に基づくプライマーとを使用するRT-PCRにより、関連PKS様遺伝子を同定することができる。したがって、「PKS 様遺伝子」なる語は、本明細書に開示のヌクレオチド配列だけでなく、これらのヌクレオチド配列の対立遺伝子または種変異体である他の核酸をも意味する。また、これらの語は、単一部位突然変異などの組換え技術を用いる意図的な突然変異により、あるいはPUFA酵素をコードするDNAオープンリーディングフレームの短い断片を切り出すことにより、あるいは新たなコドンで置換したり又は新たなコドンを付加することにより導入される非天然突然変異を含むと理解される。そのような軽微な改変は、本来の発現産物の免疫同一性および／またはその生物活性を実質的に維持する。改変されたPUFA酵素の生物学的特性は、適当な細胞系内で該酵素を発現させることにより、また、該酵素がPUFAを合成する能力を測定することにより確認することができる。軽微とみなされる個々の酵素修飾には、同様の化学特性のアミノ酸の置換（例えば、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸、アスパラギンの代わりにグルタミン）が含まれるであろう。別の生物に由来するPUFA PKS様系を用いる場合には、PKS様遺伝子活性に重要なPKS様遺伝子ポリペプチドの領域を、通常の突然変異誘発、生じる突然変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の測定により決定することができる。該突然変異体のコード領域には、欠失、挿入および点突然変異またはそれらの組合せを含めることができる。典型的な機能分析は、欠失突然変異誘発から開始して、機能に必要なタンパク質のNおよびC末端境界を決定し、ついで該オープンリーディングフレームにおいて内部欠失、挿入または点突然変異体を作製して、機能に必要な領域を更に決定する。また、カセット突然変異誘発または全合成などの他の技術を用いることもできる。欠失突然変異誘発は、例えば、5'または3'コード領域を順次除去するためにエキソヌクレアーゼを使用することにより行なう。そのような技術のためのキットが入手可能である。欠失後、開始コドンまたは終結コドンを含有するオリゴヌクレオチドを、それぞれ5'側または3'側の欠失の後に該欠失コード領域に連結することにより、該コード領域を完成させる。別法として、開始コドンまたは終結コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発、突然変異PCRなどの種々の方法により、あるいは既存の制限部位で消化されたDNAに対する連結により、該コード領域内に挿入する。内部欠失は、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発PCRを介した突然変異誘発プライマーの使用による、該DNA内の既存の制限部位の使用などの種々の方法により、同様に作製することができる。挿入は、リンカースキャニング突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発PCRなどの方法により行なう。点突然変異は、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発 PCRなどの技術により作製する。また、活性に重要なPKS様遺伝子ポリペプチドの領域を同定するために、化学突然変異誘発を用いることができる。突然変異構築物を発現させ、得られた改変タンパク質がPKS様遺伝子として機能する能力をアッセイする。そのような構造 −機能分析により、どの領域を欠失させることが可能か、どの領域が挿入を許容するか、およびどのような点突然変異が、該突然変異タンパク質が天然PKS様遺伝子と実質的に同じように機能するのを可能にするのかを判定することができる。そのようなすべての突然変異タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。EPAは、PKS様系の産物としてシュウワネラ（ Shewanella）内で産生され、そのため、該EPA遺伝子はこの系の成分をコードしている。ビブリオ（Vibrio）では、DHAが同様の系により産生される。これらの脂肪酸を合成する酵素は、典型的には細菌内および植物内で見出されるC16およびC18脂肪酸の合成に関与する酵素をコードする脂肪酸合成遺伝子とは異なる遺伝子のクラスターによりコードされる。シュウワネラ（Shewanella）EPA遺伝子は、PKS様遺伝子クラスターを代表するため、EPAの産生は、少なくとも或る程度は、典型的な細菌II型FAS系から独立している。したがって、植物細胞の細胞質内でのEPAの産生は、適当な植物調節シグナルの制御下での植物細胞内のPKS様経路遺伝子の発現により達成させることができる。シュウワネラ（Shewanella）EPA遺伝子で形質転換した大腸菌（E．coli）内でのEPAの産生は、嫌気性増殖中に進行し、このことは、O₂依存性デサチュラーゼ反応が関与していないことを示している。EPA産生に必須のORFにコードされるタンパク質の分析は、PKS様系に特徴的なドメイン構造の存在を示している。図2A は、「BLAST」データバンク検索により検出されたドメイン、モチーフおよび主要な相同性の概要を示す。EPAは、PKS様経路により産生される他の基質の多くとは異なる（すなわち、それは、該分子に沿って３炭素ごとに位置する５個のシス二重結合を含有する）ため、EPAの合成のためのPKS様系は予測されない。さらに、シュウワネラ（Shewanella）EPA ORF内に存在するドメインを使用したBLAST検索は、いくつかが、アナベナ（Anabeana）において見出されるPKS様遺伝子クラスターにコードされるタンパク質に関連していることを示している。アナベナ（Anabeana）染色体のその領域の構造を図2Fに示す。アナベナ（Anabeana ）のPKS様遺伝子は、異質細胞の糖脂質層内に見出される長鎖（C26）ヒドロキシ脂肪酸の合成に連関している。アナベナ（Anabeana）タンパク質に対する相同性を有するEPAタンパク質ドメインを、図2Fに示す。シュウワネラ（Shewanella）のORF６は、活性部位モチーフ（DXAC^*）と多数の II型KASタンパク質の末端に存在する「GFGG」モチーフとを含むKASドメインを含有する(図2Aを参照されたい)。拡張された（extended）モチーフが存在するが、ここには示されていない。つぎに、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインが存在する。活性部位モチーフ付近の配列（GHS^*XG）は、それが、メチルマロン酸ではなくマロン酸を転移する（すなわち、それは、アセテート様ATに類似している）ことを示唆している。リンカー領域の後には、PKS様ACP配列に相同である各々約100アミノ酸長の６個の反復ドメインのクラスターが存在する。それぞれは、パンテテイン結合部位モチーフ（LGXDS^*(L/I)）を含有する。６個のそのようなACPドメインの存在は、これまでのところ、脂肪酸シンターゼ（FAS）またはPKS様系においては認められていない。該タンパク質の末端付近には、β-ケト-ACPレダクターゼ（KR）に対する相同性を示す領域が存在する。それは、ピリジンヌクレオチド結合部位モチーフ「GXGXX(G/A/P)」を含有する。シュウワネラ（Shewanella）ORF８は、活性部位と終結モチーフとを含むKASドメインから開始する(図2C)。該データバンクにおける最良のマッチは、アナベナ（Anabeana)HglDに対するものである。また、アナベナ（Anabeana）HglCのN末端半分に対する配列相同性を有するドメインが存在する。また、この領域は、活性部位および終結モチーフを欠くが、KASタンパク質に対して弱い相同性を示す。それは、II型PKS様系のいわゆる鎖長因子（chain length factors:CLF）の特徴を有する。ORF８は、PKS様系によるEPA対DHAの産生を指令するらしい。また、ORF８は、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ（ DH）に対する相同性を有する２個のドメインを有する。両ドメインに対する最良のマッチは、デヒドラーゼ反応と生成した二重結合の異性化（トランスからシス）との両方を行なう二官能性酵素である大腸菌（E．coli）FabAに対するものである。第１DHドメインは、FabAの触媒に関与する活性部位ヒスチジン（H）および隣接システイン（C）の両方を含有する。第２DHドメインは、活性部位Hを有するが、隣接Cを欠く(図2C)。また、第２DHドメインでのBlast検索は、もう１つの大腸菌（E.coli）DHであるFabZ（これは、イソメラーゼ活性を有さない）に対するマッチを示す。 ORF７（図2B）のN末端半分は、該データバンクにおいては有意なマッチを有さない。該C末端半分の最良のマッチは、アナベナ（Anabeana）HglCのC末端部分に対するものである。このドメインは、アシルトランスフェラーゼ(AT)モチーフ（ GXSXG）を含有する。大腸菌（E．coli）マロニル-CoA:ACP ATの結晶構造に基づく拡張された活性部位配列の比較は、ORF７が、該活性部位からの水の排除に必須の２個の残基を欠くことを示している(大腸菌（E.coli）名；Q11およびR117) 。これらのデータは、ORF７がチオエステラーゼとして機能しうることを示唆している。 ORF９（図2D）は、アナベナ（Anabeana）Hglクラスター内の未知機能のORFと相同である。また、それは、窒素固定細菌における調節タンパク質であるNIFAに対して非常に弱い相同性を示す。ORF９タンパク質に関する調節的役割は除外されていない。ORF３（図2E）は、アナベナ（Anabeana）HetIならびに大腸菌（E． coli）由来のEntDおよびバシラス（Bacillus）のSfpと相同である。最近、HetI 、EntDおよびSfpを含むホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの新規酵素ファミリーが同定された[Lamblot RHら(1996)，新規酵素スーパーファミリー−ホホパンテテイニルトランスフェラーゼ(A new enzyme superfamily-the phophopa ntetheinyl transferases)．Chemistry & Biology,Vol 3,#11,923-936]。図３のデータは、該ORF６タンパク質へのβ-アラニン（すなわち、パンテテイン）の付加にはORF３の存在が要求されることを示している。したがって、ORF３は、該OR F６ACPドメインに特異的なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードしている[Haydock SFら（1995 ）モジュラーポリケチドシンターゼ中の(メチル)マロニル-CoA:アシル担体タンパク質トランスアシラーゼドメインの基質特異性と相関した分岐配列モチーフ(D ivergent sequence motifs correlated with the substrate specificity of (m ethyl)malonyl-CoA:acyl carrier protein transacylase domains in modular p olyketide synthases)，FEBS Lett.,374,246-248を参照されたい]。マロン酸は、EPA合成の伸長反応に利用される炭素源である。また、マロニル-ACPではなくマロニル-CoAがAT基質である。すなわち、ORF６のAT領域は、マロニルCo-Aを使用する。 PUFA産生を引き起こす生物のPKS様遺伝子をコードするDNA配列が得られたら、それらを、宿主細胞内で複製可能なベクター内に配置するか、あるいはPCRまたはロング（long）PCRなどの技術によりin vitroで増殖させる。複製ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミドなどを含めることができる。望ましいベクターには、目的の遺伝子の突然変異誘発に又は宿主細胞内での目的の遺伝子の発現に有用なものが含まれる。PUFA合成酵素または相同タンパク質を、組換え的に操作された種々の細胞内で発現させることができる。PUFA酵素をコードするDNAの発現には、多数の発現系が利用可能である。PUFA酵素をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、発現ベクター内のプロモーター(構成的プロモーターまたは誘導プロモーター)に該DNAを機能しうる形で連結することにより達成される。発現ベクターは、PUFA酵素をコードするセグメント（これは、その転写をもたらす追加的セグメントに、機能しうる形で連結されている）を含む線状または環状のDNA分子を意味する。そのような追加的セグメントには、プロモーターおよびターミネーター配列が含まれる。また、発現ベクターには、１以上の複製起点、１以上の選択マ一カー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含めることが可能である。発現ベクターは、一般には、プラスミドまたはウイルスDNAに由来し、両方の要素を含有することが可能である。「機能しうる形で連結(された)」なる語は、それらのセグメントが、それらの意図される目的のために協奏的に機能するように配置していることを意味し、例えば、転写はプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを経由してターミネーターへと進行する(Sambrookら，前掲を参照されたい)。ロングPCRの技術は、大きな構築物のin vitro増殖を可能にし、その結果、目的の遺伝子に対する修飾、例えば、突然変異誘発または発現シグナルの付加、および得られた構築物の増殖を、複製ベクターまたは宿主細胞を使用することなく、完全にin vitroで行なうことができる。in vitroでの発現は、例えば、in vit ro用に設計された発現ベクター内にデサチュラーゼポリペプチドのコード領域を配置し、ウサギ網状赤血球ライゼートおよび補因子を加えることにより行なうことができ、所望により、標識されたアミノ酸を取込ませることができる。そのようなin vitro発現ベクターは、使用する系に必要な発現シグナルの一部または全部を付与することが可能である。これらの方法は当技術分野で良く知られており、該系の成分は商業的に入手可能である。ついで該反応混合物を、PKS様酵素に関して、例えばその活性を測定することにより直接アッセイすることができ、あるいは合成された酵素を精製し、ついでアッセイすることができる。宿主細胞内での発現は、一過性または安定に達成させることができる。一過性発現は、宿主細胞内で機能的である発現シグナルを含有する導入された構築物から生じうる(ただし、この構築物は複製されず、めったに宿主細胞内に組込まれないか、またはこの場合、該宿主細胞は増殖性でない)。また、目的の遺伝子に機能しうる形で連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することにより、一過性発現を達成させることができる(ただし、そのような誘導可能な系は、低い基底レベルの発現を示すことが多い)。安定発現は、宿主ゲノム内に組込まれうる又は宿主細胞内で自律複製する核酸構築物の導入により達成させることができる。発現構築物上に位置するか又は発現構築物と共にトランスフェクトされた選択マーカーを使用し、ついで該マーカーを発現する細胞に関して選択することにより、目的の遺伝子の安定発現を選択することができる。安定発現が組込みから生じる場合には、構築物の組込みは、宿主ゲノム内でランダムに生じることが可能であり、あるいは宿主遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な程度に宿主ゲノムに相同な領域を含有する構築物の使用により標的化されることが可能である。構築物を内因性遺伝子座に標的化する場合には、転写および翻訳の調節領域の全部または一部は、該内因性遺伝子座により付与されることが可能である。宿主細胞内で発現を行なうためには、該宿主細胞内で機能的である、転写および翻訳の開始および終結調節領域に、形質転換DNAを機能しうる形で連結させる。転写および翻訳の開始および終結領域は、発現させるDNA、所望の系内での発現が可能であることが公知の又は疑われる遺伝子、発現ベクター、化学合成などの種々の非排他的（nonexclusive）起源に由来する。該終結領域は、該開始領域を入手した遺伝子の3'領域または異なる遺伝子に由来することが可能である。多数の終結領域が、同一または異なる属および種からの種々の宿主において満足しうるものであることが、公知かつ判明している。該終結領域は、通常、特定の任意の特性よりも、むしろ簡便性の点から選ばれる。２以上のPKS様ORFを同一細胞内で発現させる場合には、適当な調節領域および発現方法を使用すべきである。導入された遺伝子は、複製ベクターの使用により又は宿主ゲノム内への組込みにより、宿主細胞内で増殖させることができる。別々の複製ベクターから２以上の遺伝子を発現させる場合には、各ベクターが、異なる複製手段を有することが望ましい。導入された各構築物は、組込まれているか否かにかかわらず、異なる選択手段を有すべきであり、その他の構築物に対する相同性を欠くべきであり、それにより、安定発現が維持され構築物間の要素の再構築が妨げられるようにする。調節領域、選択手段および導入構築物の増殖方法の適切な選択は、すべての導入遺伝子が必要レベルで発現されて所望の産物の合成をもたらすように、実験的に決定することができる。 PUFA酵素を発現させるためには、種々の原核生物の発現系を用いることができる。転写を指令するプロモーター、リボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する発現ベクターを構築することができる。大腸菌（E.coli）におけるこの目的に適した調節領域としては、例えば、Yanofsky(1984)J.Bacteriol.,158 :1018-1024に記載の大腸菌（E．coli）トリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域、ならびにHerskowitzおよびHagen,(1980)Ann.Rev.Ge net.,14:399-445に記載のファージラムダ（Pλ）の左側プロモーターが挙げられる。大腸菌（E．coli）において形質転換するDNAベクター内に選択マーカーを含有させることも有用である。そのようなマーカーには、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を特徴づける遺伝子が含まれる。細菌宿主内で外来遺伝子を発現させるために使用するベクターは、一般には、抗生物質耐性に関する遺伝子などの選択マーカー、および該宿主細胞内で機能するプロモーターを含有する。細菌を形質転換するのに有用なプラスミドには、pBR322(Bolivarら,(1977)Gene 2:95-113)、pUCプラスミド(M essing,(1983)Meth.Enzymol.101:20-77,VieiraおよびMessing,(1982)Gene 19:25 9-268)、pCQV2(Queen,同誌)、およびそれらの誘導体が含まれる。プラスミドは、ウイルス性および細菌性要素を含有することが可能である。該タンパク質を生物学的に活性な形態で回収するための方法は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,966,963号および第4,999,422号において検討されている。他の原核生物の発現系の説明は、Sambrookらを参照されたい。真核生物内での発現の場合、本発明の実施で使用するための宿主細胞には、哺乳類、鳥類、植物、昆虫および菌類細胞が含まれる。例えば、植物の場合には、プロモーターの選択は、１つには、構成的発現または誘導的発現のいずれが望ましいのか、および植物の発達の特定の段階および／または特定の組織においてPU FAを産生させることが望ましいか否かに左右されるであろう。該ORFの発現のための特定の組織および／または発達段階の選択に関する考慮事項は、競合基質、または特定のPUFAの発現を許容する該宿主細胞の能力に左右される可能性がある。特異的調節配列（例えば、米国特許第5,463,174号、米国特許第4,943,674号、米国特許第5,106,739号、米国特許第5,175,095号、米国特許第5,420,034号、米国特許第5,188,958号および米国特許第5,589,379号に記載のもの）を使用することにより、種子、葉、果実、花、根などの宿主植物内の特定の位置に発現を標的化することができる。宿主細胞が酵母の場合には、酵母細胞内で機能的である転写および翻訳領域は、特に該宿主種から付与される。該転写開始調節領域は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなどの解糖系内の遺伝子、または酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼなどの調節可能な遺伝子がら得ることができる。構成的転写または誘導的転写のいずれが望ましいのか、目的のオープンリーディングフレームと組合されるプロモーターの個々の効率、強力なプロモーターと誘導的転写を可能にする異なるプロモーターに由来する制御領域とを一緒にしうる可能性、構築の容易さなどに応じて、多数の調節配列の任意の１つを、個々の状況で使用することができる。特に関心が持たれるのは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトースにより誘導されうるプロモーター（GAL1、GAL7およびGAL10）は、酵母内での高レベルかつ調節されたタンパク質発現に広く利用されている(Lueら，(1987)Mol.Cell.Biol.7:3446;Johns ton,(1987)Microbiol.Rev.51:458)。GALプロモーターからの転写は、ガラクトースの存在下で該プロモーター領域に結合し転写を活性化するGAL4タンパク質により活性化される。ガラクトースの不在下では、アンタゴニストであるGAL80がGAL 4に結合し、GAL4による転写活性化を妨げる。ガラクトースの添加は、GAL80がGA L4による活性化を抑制するのを妨げる。好ましくは、該終結領域は、酵母遺伝子、特に、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharo myces)、カンジダ（Candida）またはクライベロマイセス（Kluyveromyces）に由来する。また、２つの哺乳類遺伝子（γインターフェロンおよびα2インターフェロン）の3'領域が酵母内で機能することが公知である。翻訳開始コドンATGの周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞内での発現に影響を及ぼすことが判明している。所望のポリペプチドが酵母内で十分に発現されない場合には、最適な遺伝子発現を得るために、効率的な酵母翻訳開始配列を含むように外因性遺伝子のヌクレオチド配列を修飾することができる。サッカロミセス（Saccharomyces）内での発現のためには、これを、非効率的に発現される遺伝子の部位特異的突然変異誘発［それを内因性サッカロミセス（Saccharomyces ）遺伝子、好ましくは、高度に発現される遺伝子（例えば、ラクターゼ遺伝子）にインフレームで融合することによるもの］により行なうことができる。植物細胞細胞質内でPKS様遺伝子を発現させることに代わる方法として、該酵素を葉緑体に標的化することが挙げられる。タンパク質を葉緑体に標的化するための１つの方法は、該タンパク質のN末端に結合したリーダーペプチドの使用を伴う。一般に使用されるリーダーペプチドは、植物リブロース-ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットに由来する。また、他の葉緑体タンパク質に由来するリーダー配列を使用することも可能である。タンパク質を葉緑体に標的化するためのもう１つの方法は、葉緑体ゲノムを形質転換させることである[外来DNAで被覆された高速タングステン微粒子を受容細胞に射撃することによるクラミドモナス・レインハルドティ（Chlamydomonas reinhardtii）(１緑藻類)の葉緑体の安定な形質転換が記載されている。例えば、BlowersらPlant Cell（198 9）1:123-132およびDebuchyらEMBO J（1989）8:2803-2809を参照されたい。タングステン微粒子を使用する形質転換技術は、Klineら,Nature(London)(1987)327: 70-73に記載されている]。葉緑体を形質転換させる最も一般的な方法は、バイオリスチック（biolistic）技術の使用を含むが、この目的のために開発された他の技術を使用することも可能である。外来遺伝子産物を葉緑体内（ShrierらEMBO J.(1985)4:25-32）またはミトコンドリア内（Boutryら前掲）に標的化するための方法が記載されている。また、核遺伝子産物を葉緑体内に輸送するための輸送ペプチドの使用に関しては、TomaiらGen．Biol．Chem．（1988）263:15104-1510 9および米国特許第4,940,835号を参照されたい。タンパク質の輸送を葉緑体へ方向づけるための方法は、Kenauf TIBTECH（1987）5:40-47に概説されている。鳥類の種および細胞においてPUFAを産生させるためには、当技術分野で公知の方法に従い、PUFA酵素をコードする核酸配列を該細胞内に導入することにより、遺伝子導入を行なうことができる。トランスジェニック動物が望ましい場合には、胚の多能性幹細胞に、PUFA酵素をコードするトランスジーンを保持するベクターを付与し、該細胞を成体動物にまで発育させることができる(米国特許第5,162 ,215号;Onoら(1996)Comparative Biochemisty and Physiology A 113(3):287-29 2;WO 9612793;WO 9606160)。ほとんどの場合、PUFAの産生を増加させるために、高レベルのPKS様酵素を発現するように該トランスジーンを修飾する。該トランスジーンは、例えば、特定の組織および卵部分（例えば、卵黄）内での発現を指令するプロモーターなどの鳥類細胞内で機能する転写および／または翻訳調節領域を付与することにより修飾することができる。該遺伝子調節領域は、ニワトリ貧血または鳥類白血病ウイルスまたは鳥類遺伝子、例えばニワトリオボアルブミン遺伝子を含む種々の起源から得ることができる。昆虫細胞内でのPUFAの産生は、PKS様トランスジーンを保持するバキュロウイルス発現ベクターを使用して行なうことができる。バキュロウイルス発現ベクターは、Clontechなどのいくつかの商業的供給元から入手可能である。また、デサチュラーゼトランスジーンを含有し発現する藻類（例えば、海洋藻類）のハイブリッドおよびトランスジェニック株の生産方法を提供する。例えば、トランスジェニック海洋藻類は、米国特許第5,426,040号に記載のとおりに作製することができる。前記のその他の発現系の場合と同様に、デサチュラーゼトランスジーンの発現の時期、程度および活性は、個々の用途のために選ばれる適当な転写および翻訳調節領域を該ポリペプチドコード配列に設けることにより調節することができる。特に関心が持たれるのは、予め選択した増殖条件下で誘導されうるプロモーター領域である。例えば、デサチュラーゼトランスジーンをコードする配列、その調節領域および／または該トランスジーンを導入する細胞のゲノム内への温度感受性および／または代謝産物応答性突然変異の導入を、この目的のために用いることができる。形質転換された宿主細胞を、所望の最終結果に適合させた適当な条件下で増殖させる。宿主細胞を培養内で増殖させるためには、典型的には、選択したデサチュラーゼ活性に関連したPUFAの最大の又は最も経済的な収量が得られるように該条件を最適化する。最適化されうる培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加する基質の最終濃度、添加する基質の形態、好気性または嫌気性増殖、増殖温度、誘導剤、誘導温度、誘導時の増殖期、収穫時の増殖期、pH、密度および選択の維持が含まれる。例えば酵母などの微生物は、好ましくは、酵母ペプトンブロス（YPD）および最少培地（アミノ酸、酵母窒素塩基および硫酸アンモニウムを含有し、選択のための成分、例えばウラシルを欠く）を含む選ばれた目的の培地を使用して増殖させる。望ましくは、添加する基質をまずエタノールに溶解する。必要に応じて、例えば、GALプロモーターから発現を誘導するためにガラクトースを含有させるかまたは加えることにより、目的のポリペプチドの発現を誘導することができる。 PKS様系からPUFAを発現する宿主細胞内でのPKS様遺伝子ポリペプチドの発現を増加させたい場合には、いくつかの方法を用いることができる。PKS様遺伝子ポリペプチドをコードする追加的な遺伝子を、宿主生物内に導入することができる。また、例えば、より強力なプロモーターを宿主ゲノム内に挿入して発現の増強を引き起こすことにより、あるいは該mRNAまたは該コード化タンパク質から不安定化配列を、その情報を該宿主ゲノムから欠失させて除去することにより、あるいは該mRNAに安定化配列を付加することにより、相同組換えを介して、天然PKS 様遺伝子座からの発現を増加させることができる(米国特許第4,910,141号および米国特許第5,500,365号を参照されたい)。したがって、該対象宿主は、該発現構築物の少なくとも１つのコピーを有し、また、該遺伝子がゲノム内に組込まれるか又は増幅されるか又は多コピー数を有する染色体外要素上に存在するかに応じて、２以上のコピーを有することが可能である。該対象宿主が酵母である場合には、主要な４つの型の酵母プラスミドベクター、すなわち酵母組込み型プラスミド(YIp)、酵母自己複製型プラスミド(YRp)、酵母セントロメアプラスミド（YCp ）および酵母エピソーム様プラスミド（YEp）を使用することができる。YIpは、酵母複製起点を欠き、酵母ゲノム内の組込み要素として増殖させなければならない。YRpは、染色体由来の自律複製配列を有し、中等度のコピー数（20〜40）の自律複製する不安定に分離（segregating）するプラスミドとして増殖する。YCp は、複製起点およびセントロメア配列の両方を有し、低コピー数（10〜20）の自律複製する安定に分離するプラスミドとして増殖する。YEpは、酵母２μmプラスミド由来の複製起点を有し、高コピー数の自律複製する不規則に分離するプラスミドとして増殖する。酵母内の該プラスミドの存在は、該プラスミド上のマーカーに関する選択を維持することにより確保することができる。特に関心が持たれるのは、酵母ベクターpYES2(Invitrogenから入手可能なYEpプラスミドは、ウラシル原栄養性および発現のためのGAL1ガラクトース誘導可能プロモーターを付与する)、およびpYX424（構成的TP1プロモーターを有しロイシン原栄養性を付与するYEpプラスミド）(AlberおよびKawasaki(1982).J.Mol.& Appl.Genetics 1:419) である。宿主細胞の選択は、１つには、トランスジェニック細胞の所望のPUFAプロフィールおよび宿主細胞の天然プロフィールに影響される。宿主細胞が１つのPU FAのPKS様遺伝子活性を発現する場合であっても、もう１つのPKS様系のPKS様遺伝子の発現が、該宿主細胞により産生されない新規PUFAの産生をもたらすことがある。PKS様遺伝子活性の発現を、異なるPUFAを産生する生物のORF８PKS様遺伝子の発現と共役させる特定の場合には、宿主細胞が、ORF８に関する低いPKS様遺伝子活性を本来有すること、またはそのような活性を有するように該宿主細胞を突然変異させることが望ましい場合がある。例えば、EPAの産生には、使用するD NA配列は、EPAを産生する生物のPKS様遺伝子活性を有するポリペプチドをコードし、一方、DHAの産生には、使用するDNA配列は、DHAを産生する生物からのDNA配列である。PKS様遺伝子活性を既に発現している宿主細胞内での使用には、所望のPKS様遺伝子の過剰発現をもたらす発現カセットを、単独で又は既存のPKS様系の既存のORFの活性をダウンレギュレーション（例えば、アンチヤンスまたは共抑制により）する構築物と共に、使用することが必要な場合がある。同様に、PK S様系を用いて同じ又は異なるPUFAを産生する別々の生物に由来するORFの組合せを用いることができる。例えば、ビブリオ（Vibrio）のORF８は、ORF３、６、７および９がシュウワネラ（Shewanella）に由来する場合であっても[それらは、シュウワネラ（Shewanella）のORF８と共役させた場合にはEPAを産生する]、宿主細胞内でDHAの発現を指令する。したがって、エイコサペンタエン酸（EPA）の産生のためには、使用する発現カセットは、一般には、海洋細菌であるシュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）(EPA産生のため)またはビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）(DHA産生のため)などのPUFA産生生物に由来するORF３、６、７、８および９を含む１以上のカセットを含む。DHA産生を誘導するためには、ORF８を使用することができ、DHAを産生させるためには、ビブリオ（Vibrio）のORF８を、シュウワネラ（Shewanella）のORF３、６、７および９と共に使用することができる。シュウワネラ（Shewanella）遺伝子クラスター内で同定されたORFの体制および番号づけの体系を図1Aに示す。この研究で言及されるいくつかのサブクローンの地図を、図1Bに示す。PKS様遺伝子ポリペプチドの発現には、宿主細胞内で機能的である転写および翻訳の開始および終結領域を、PKS様遺伝子ポリペプチドをコードするDNAに機能しうる形で連結させる。目的のPKS様ORFを含む構築物は、１つには宿主細胞の型に応じて種々の標準的な技術のいずれかにより、宿主細胞内に導入することができる。これらの技術には、トランスフェクション、感染、ボリスチック（bolistic）衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、擦り取り、または目的の遺伝子を宿主細胞内に導入する他の任意の方法が含まれる(米国特許第4,743,548号、米国特許第4,795,855号、米国特許第5,068,193号、米国特許第5,188,958号、米国特許第5,463,174号、米国特許第5,565,346号および米国特許第5,565,347号を参照されたい)。用いる形質転換の方法には、酢酸リチウム形質転換(Methods in Enzym ology,(1991)194:186-187)が含まれる。便宜上、DNA配列または構築物を取込ませる任意の方法により操作された宿主細胞を、本発明では、「形質転換(された) 」または「組換え(体)」と称することにする。該対象宿主は、該発現構築物の少なくとも１つのコピーを有することになり、また、該遺伝子がゲノム内に組込まれるか又は増幅されるか又は多コピー数を有する染色体外要素上に存在するかに応じて、２以上のコピーを有することが可能である。 PUFAの産生のためには、宿主細胞に応じて、pEPAにより産生されるいくつかのポリペプチド(ORF３、６、７、８および９)を、別個の発現構築物として導入するか、あるいは宿主細胞内に個別的に導入される又は共形質転換される２以上のカセット内に合体させることができる。標準的な形質転換プロトコールを用いる。PUFAの合成に要求されるPKS様遺伝子の一部が単一の植物内に挿入されている植物の場合には、相補遺伝子を含有する植物と交雑させて、所望のPUFAを合成するPKS様遺伝子の完全相補体を含有する植物を得ることができる。 PUFAのPKS様媒介産生は、原核または真核宿主細胞内で行なうことができる。該細胞は、培養したり、あるいは動物を含む宿主生物の一部または全部として形成させることができる。また、PUFAの産生においては、特に遺伝子導入、細胞ターゲッティングおよび選択のために、ウイルスおよびバクテリオファージを適当な細胞と共に使用することができる。宿主細胞としては、双子葉植物、単子葉植物、穀類などの任意の種類の植物細胞を使用することができる。特に関心が持たれるのは、アブラナ(Brassica)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、ダイズ、トウモロコシなどの栽培植物である。目的の原核細胞には、エシェリキア(Esc hericia)、バシラス(Baccillus)、ラクトバシラス(Lactobaccillus)、藍細菌(cy anobacteria)などが含まれる。真核細胞には、植物細胞、乳を分泌する動物の細胞などの哺乳類細胞、ニワトリ細胞などの鳥類細胞、および昆虫、菌類および藻類細胞を含む遺伝子操作に適した他の細胞が含まれる。宿主動物には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなど、トランスジーンを発現する集団の迅速な増殖のための遺伝子操作およびクローニングに適した動物が含まれる。動物の場合には、遺伝子調節領域の修飾により、PKS様トランスジーンを、標的細胞小器官、組織および体液内での発現に適合させることができる。特に関心が持たれるのは、宿主動物の母乳中でのPUFAの産生である。宿主微生物には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev isiae)、サツカロミセス・カールスバージェンシス（Saccharomyces carlsberge nsis）または他の酵母、例えばカンジダ(Candida)、クライベロマイセス（Kluyv eromyces）または他の菌類、例えば糸状菌、例えばアスペルギルス(Aspergillus )、ニユ一ロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)などが含まれる。宿主微生物の望ましい特性としては、例えば、それが遺伝的に十分に特徴づけられていること、超高密度発酵を用いる該産物の高レベルの発現に使用可能であること、提案されている最終産物はヒトによる摂取が意図されるためGRAS（genera lly recognized as safe；安全であると一般に認められている）リストに掲載されていることである。特に関心が持たれるのは、本発明における細胞宿主として酵母、特にパン酵母（S.cerevisiae）を使用することである。特に関心が持たれる株としては、SC334(Mat a pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3,112regl-501 ga l1;(Hovland P.ら(1989)Gene 83:57-64)、BJ1995(Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory,Berkely,CA94720)、INVSC1(Matα hiw3Δ1 leu2 trp1- 289 ura3-52（Invitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad，CA 92008）およびIN VSC2（Matα his3Δ200 ura3-167;(Invitrogen)）が挙げられる。細菌細胞を宿主として使用することも可能である。これには、発酵法に有用でありうる大腸菌（E.coli）が含まれる。あるいは、PK S様経路の産物をヨーグルトなどの産物中に導入するための宿主として、ラクトバシラス（Lactobaccillus）種などの宿主を使用することができる。形質転換された宿主細胞は、導入した構築物上に含まれるマーカーに関する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換技術は宿主細胞内に多数のDNA分子を導入するため、分離したマーカー構築物を所望の構築物と共に導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、それが選択培地上で増殖する能力に関して選択される。選択培地は、抗生物質を含んでいたり、あるいは未形質転換宿主の増殖に必要な因子（例えば、栄養因子または増殖因子）を欠いていてもよい。そのための導入マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を付与し、あるいは必須の増殖因子または酵素をコードし、形質転換宿主内で発現された場合に選択培地上での増殖を可能にしうる。望ましくは、カナマイシンおよびアミノグリコシドG418に対する耐性に特に関心が持たれる(米国特許第5,034,322号を参照されたい)。酵母形質転換体の場合には、酵母内で機能する任意のマーカー（例えば、ウラシル、ロイシン、リシンまたはトリプトファンを欠く培地上で増殖しうるもの）を使用することができる。また、発現されたマーカータンパク質が直接的または間接的に検出可能な場合に、形質転換宿主の選択を行なうことができる。該マーカータンパク質は、単独で又は別のタンパク質との融合体として発現させることができる。該マーカータンパク質は、その酵素活性により検出されるものであってもよく、例えば、βガラクトシダーゼは基質X-galを着色産物に変換することが可能であり、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することが可能である。該マーカータンパク質は、その光生成または修飾特性により検出されるものであってもよく、例えば、発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）のグリーン蛍光タンパク質は、青色光が照射されると蛍光を発する。該マーカータンパク質または分子タグ（例えば、目的のタンパク質上のもの）を検出するために、抗体を使用することができる。該マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば、視覚的に、またはFACSまたは抗体を使用するパンニングなどの技術により選択することができる。本発明の方法および組成物を用いて製造されたPUFAは、遊離脂肪酸として及び／又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などのコンジュゲート化形態で、宿主植物組織および／または植物部分において見出され、当技術分野で良く知られている種々の手段により宿主細胞から抽出することができる。そのような手段には、有機溶媒での抽出、音波処理、例えば二酸化炭素を使用する超臨界流体抽出、および圧搾（プレス）などの物理的手段、またはそれらの組合せを含めることができる。特に関心が持たれるのは、メタノールおよびクロロホルムでの抽出である。適宜、水層を酸性化して、負に荷電した部分をプロトン化し、それにより有機層中への所望の産物の分配を増加させることができる。抽出後、窒素気流下での蒸発により有機溶媒を除去することができる。該産物がコンジュゲート化形態で単離される場合には、該産物を酵素的または化学的に切断して、該遊離脂肪酸、または目的の、より単純なコンジュゲートを遊離させ、ついで更なる操作に付して所望の最終産物を得る。望ましくは、コンジュゲート化形態の脂肪酸を水酸化カリウムで切断する。更なる精製が必要な場合には、標準的な方法を用いることができる。そのような方法には、抽出、尿素での処理、分別晶出、HPLC、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離もしくは蒸留、またはこれらの技術の組合せを含めることができる。アルキル化またはヨウ素化などの公知技術により、酸またはアルケニル基などの反応性基の保護を任意の工程で行なうことができる。用いる方法には、メチルエステルを得るための脂肪酸のメチル化が含まれる。同様に、任意の工程で保護基を除去することができる。望ましくは、DHAおよびEPAを含有する画分の精製を、尿素での処理および／または分別蒸留により行なうことができる。本発明は、いくつかの用途を有する。本発明のDNAに基づくプローブは、関連分子の単離方法またはPKS様遺伝子を発現する生物の検出方法において有用である。該DNAまたはオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用される場合には、検出可能でなければならない。これは、通常、例えば修飾された残基の取込みにより内部部位に又は5'もしくは3'末端に標識を付けることにより達成される。そのような標識は、直接検出されうるものであってもよく、あるいは検出されうるように標識された二次分子に結合させることが可能であり、あるいは未標識二次分子および検出されうるように標識された三次分子に結合させることが可能である。この方法は、非許容レベルのバックグラウンドシグナルを伴わずに満足に検出されうるシグナルを得るために実施可能である限り、拡張適用することができる。二次、三次または架橋系は、他の任意の分子（標識または他の抗体を含む）に対する抗体の使用を含むことが可能であり、あるいは互いに結合する任意の分子、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン/アビジン系を関与させることが可能である。典型的には、検出可能な標識には、放射性同位体、化学的または酵素的に光を生成または改変する分子、検出可能な反応産物を与える酵素、磁性分子、蛍光分子または結合に際して変化する蛍光または光放出特性を有する分子が含まれる。標識方法の具体例は、米国特許第5,011,770号に記載されている。あるいは、標的分子の結合は、標的に対するプローブの結合の際の溶解熱の変化を等温滴定熱量測定により測定することにより、あるいは該プローブまたは標的を表面上にコートし、それぞれ標的またはプローブの結合により生じる表面からの光の散乱の変化を検出することにより(例えば、BIAcore系で行なうことができる)、直接検出することができる。組換え手段により産生されるPUFAは、多種多様な領域において有用である。ヒトまたは動物を種々の形態のPUFAで補うと、添加したPUFAのレベルだけでなく、それらの下流代謝産物のレベルも増加しうる。複雑な調節メカニズムは、種々の PUFAを組合せること又はPUFAの種々のコンジュゲートを加えることが、そのようなメカニズムを阻害、制御または抑制して個体において所望のレベルの特異的PU FAを得るために望ましいものとしうる。この場合、PKS様遺伝子またはアンチセンスPKS様遺伝子転写産物の発現は、植物部分および／または植物組織中に見出される特定のPUFAまたはその誘導体のレベルを改変しうる。PKS様遺伝子ポリペプチドをコードする領域は、単独で、または他の遺伝子と共に発現されて、未修飾の組織および／または植物部分よりも高い割合の所望のPUFAを含有する又はヒトの母乳のPUFA組成に一層よく似たPUFA組成を含有する組織および／または植物部分を与える(Prietoら，PCT公開WO 95/24494)。開示している方法により製造したPUFAまたはその誘導体は、静脈内栄養補給を受けている患者のための食物補充剤として、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用することができる。食物補充のためには、精製されたPUFAまたはその誘導体を、通常用途において摂取者が所望の量のPUFAを摂取するように製剤化された調理用油、脂肪またはマーガリン中に加えることができる。また、該PU FAは、乳児用製剤、栄養補充剤または他の食品中に加えることが可能であり、また、抗炎症剤およびコレステロール低下剤として有用である。 EPAなどの特定の脂肪酸は、ヒトの母乳のPUFA組成をより良く模倣するよう乳児用製剤の組成を改変するために使用することができる。ヒトの母乳中に優勢なトリグリセリドは、1,3-ジ-オレオイル-2-パルミトイルであると報告されており、2-パルミトイルグリセリドは2-オレオイルまたは2-リネオイルグリセリドより良く吸収されると報告されている(米国特許第4,876,107号)。典型的には、ヒトの母乳は、DHAを約0.15％〜約0.36％、EPAを約0.03％〜約0.13％、ARAを約0.30 ％〜約0.88％、DGLAを約0.22％〜約0.67％、およびGLAを約0.27％〜約1.04％含む脂肪酸プロフィールを有する。乳児用製剤におけるGLA：DGLA：ARAの好ましい比は、それぞれ約1：1：4〜約1：1：1である。当業者であれば、これらのPUFAの比を与える油の量を、過度な実験を行なうことなく決定することができる。また、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物の消費にとって一層好ましいものに改変するために、PUFAまたはそれを含有する宿主細胞を動物用食物補充剤として使用することができる。医薬用途（ヒト用または獣医学用）には、該組成物を一般には経口的に投与するが、それらがうまく吸収されうる任意の経路により、例えば、非経口的(すなわち、皮下、筋肉内または静脈内)、直腸内または膣内、または局所的（例えば、皮膚軟膏またはローションとして）に投与することが可能である。利用可能な場合には、ゼラチンカプセル剤が経口投与の好ましい形態である。また、前記の食物補充剤は、経口投与経路を意図したものであってもよい。本発明の不飽和酸は、コンジュゲート化形態で又は該脂肪酸の塩、エステル、アミドまたはプロドラッグとして投与することができる。製薬上許容される塩が本発明に含まれ、特に好ましいのは、ナトリウム、カリウムまたはリチウム塩である。また、PCT公開 WO 96/33155に記載のN-アルキルポリヒドロキシアミン塩、例えばN-メチルグルカミンが含まれる。好ましいエステルはエチルエステルである。本発明のPUFAは、単独で又は製薬上許容される担体もしくは賦形剤と共に投与することができる。また、固体塩としては、PUFAを錠剤形態で投与することができる。静脈内投与には、PUFAまたはその誘導体を、Intralipidsなどの市販の製剤中に封入することができる。所望により、製剤の個々の成分は、単一または複数の使用のためのキットの形態で、別々に提供されることが可能である。個々の脂肪酸の典型的な投与量は、１日約0.1mg〜20gまたは更には100g、好ましくは、１日10mg〜１、２、５または10g(必要に応じて)、あるいはその誘導体形態のモル等価量である。トリグリセリドとして計算した場合に約2〜約30重量％の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が、本発明に含まれる。所望により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン、例えばビタミンA、D、EおよびL-カルニチンを含むことができる。所望により、トコフェロールなどの保存剤を、典型的には約0.1重量％で加えることができる。以下の実施例は、例示にすぎず、本発明を限定するものではない。実施例実施例１ビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）に由来するORFの実体シュウワネラ（Shewanella）のORF６（Sp ORF6）配列に基づくプライマー［FW 5'プライマー：ビブリオ（Vibrio）およびSS9に関してそれぞれCUACUACUACUACC AAGCTAAAGCACTTAACCGTGおよびCUACUACUACUAACAGCGAAATGCTTATCAAG、ならびに3'B Wプライマー：ビブリオ（Vibrio）およびSS9の両方に関してCAUCAUCAUCAUGCGACC AAAACCAAATGAGCTAATAC］と、ビブリオ（Vibrio）およびEPAを産生するボロフィリック・フォトバクター(borophyllic photobacter)（UC San DiegoのBartlett 博士から提供された）に由来するゲノムDNA鋳型を使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）に関しては約400塩基の、SS9に関しては約900塩基のPCR産物を得、これらは、相同アミノ酸の直接計数による測定でSp ORF６の対応断片に対して75％を上回る相同性を示した(図25を参照されたい)。ついでビブリオ（Vibrio）コスミドライブラリーを調製し、ビブリオ（Vibrio ）ORF６PCR産物をプローブとして使用して(図26を参照されたい)、少なくともOR F６を含有するクローンをコロニーハイブリダイゼーションにより選択した。選択したコスミド（例えば、コスミド#9およびコスミド#21）の追加的配列を介して、シュウワネラ（Shewanella）のORF6〜9と相同で該ORF6〜9と同じ連続した順序（ORF6〜9）で構成されたORFを有するビブリオ（Vibrio）クラスター（図 5）を得た(図7)。この配列からのビブリオ（Vibrio）ORFは、17394〜36115位に見出され、ORF6〜9を含む。表ビブリオ（Vibrio）オペロンの図 17394〜25349 長さ=7956nt 25509〜28157 長さ=2649nt 28209〜34262 長さ=6054nt 34454〜36115 長さ=1662nt シュウワネラ（Shewanella）遺伝子のORFの名称は、図４に開示のものに基づいており、シュウワネラ（Shewanella）クラスターに関して公開されているもの（ Yazawaら，米国特許第5,683,898号）とは異なる。例えば、図４のORF３は、その他のORFとは逆方向に読取られ、Yazawaら，米国特許第5,683,898号との比較では、Yazawaら，米国特許第5,683,898号には開示されていない(図24を参照されたい )。 ORF３に相同な配列は、ORF６付近（ORF６の17000塩基上流）にもORF９付近（O RF９の約4000塩基下流）にも見出されなかった。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼに特徴的なモチーフ（Lambalotら（1996）Current Biology 3:923-93 6）は、これらのモチーフに関してスクリーニングされたビブリオ（Vibrio）配列には存在しなかった。また、ビブリオ（Vibrio）およびSC2Aシュウワネラ(She wanella)（同様にEPAを産生しうるUniversity of San Diegoにより提供されたもう１つの細菌）のゲノム消化物中には、Sp ORF３に由来するプローブに対するマッチが存在しなかった。ORF３はビブリオ（Vibrio）中に存在しうるが、そのDNAは、Sp ORF３のDNAとは相同でない可能性があり、および／または、配列決定しなかったゲノム部分に位置している可能性がある。図６には、ORF6〜9を含む約19kbのビブリオ（Vibrio）クローンの配列を記載する。図７および８では、ビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）およびシュウワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）のPKS様系の遺伝子クラスター体制を比較する。図9〜12は、それぞれ、対応するORF６、７、８および９の間の配列相同性のレベルを示す。実施例２ ORF ８はDHA産生を指令する実施例１に記載のとおり、Sp ORF６に相同的なDNAが、同様にEPAを産生しうる無関係な種であるSS9フォトバクター（Photobacter）において見出された。また、Sp ORF6〜9と相同なORFが、DHAを産生するビブリオ・マリヌス(Vibrio marinu s)において見出された。これらのORFから、大腸菌(E.coli)においてEPA合成を抑制するSp ORF6〜9（Yazawa(1996)前掲）のそれぞれにおける欠失をビブリオ（Vi brio）由来の対応相同遺伝子で相補する一連の実験を設計した。該Sp EPAクラスターを使用して、該ビブリオ（Vibrio）ORF6〜9のいずれかがD HAの産生を引き起こすか否かを確認した。該SP ORFのそれぞれに関して得られた欠失突然変異体は、EPAおよびDHAヌルである。ついで各欠失を、lacプロモーターの後方で発現される対応ビブリオ（Vibrio）ORFで相補した(図13)。ビブリオ（Vibrio）ORF６によるSp ORF６欠失の相補は、EPAの産生を回復させた。Sp ORF７およびORF９の欠失を相補することにより、同様の結果が得られた。これに対して、Sp ORF８欠失の相補は、C22:6の産生を引き起こした。したがって、ビブリオ（Vibrio）ORF８は、DHAの合成における鍵要素であるらしい。図 14および15は、ビブリオ(Vibrio)ORF６によるSp del ORF６の相補(EPA(DHAは無し))およびビブリオ(Vibrio)ORF８によるSp del ORF ８の相補（DHA）からの脂肪酸プロフィールのクロマトグラムを示す。図16は、O RF８の相補に関する脂肪酸の割合（％）を示し、ここでもまた、ORF８がDHAの産生を引き起こすことが示されている。これらのデータは、関連した又は類似したORFを有するポリケチド様合成遺伝子を合体させ異種系において発現させ、該宿主系における異なるPUFA種の産生のために使用することができること、およびORF８が、最終的な鎖長の決定において何らかの役割を有することを示している。ビブリオ（Vibrio）ORF６、７、８および９は、EPA合成を回復させる。また、ビブリオ（Vibrio）ORF８の場合には、DHA（約0.7％）がEPA（約0.6％）と共に存在し、このことは、この遺伝子が、これらの系に関するDHA対EPAの合成の指令において重要な役割を果たすことを示している。実施例３ DHA の産生のための要件クラスターORF6〜9のビブリオ（Vibrio）ORFをビブリオ（Vibrio）ORF８と組合せてどのように使用するかを決定し、DHAの合成を明らかにするために、ビブリオ（Vibrio）ORF８とその他のビブリオ（Vibrio）ORF6〜9クラスターの一部または全部とのいくつかの組合せを作製した。ビブリオ（Vibrio）ORF6〜9を、Sp ORF３で相補した。この相補の結果を、図1 6bおよび16cに示す。測定されたDHAの有意な量（約９％を上回る）およびEPAの不存在は、Sp ORF３との組合せの場合にはビブリオ（Vibrio）ORF6〜9以外のORF がDHA合成に要求されないことを示唆している。これは、Sp ORF３が、細菌PUFA の合成において普遍的な役割を果たすことを示唆している。 DHA対EPAの産生に関しては、DHAを特異的に産生させるためには、ビブリオ（V ibrio）ORF８と該6〜9クラスターの他のビブリオ（Vibrio）ORFとを組合せることが必要かもしれない。DHAの合成におけるビブリオ（Vibrio）ORF９の役割およびビブリオ（Vibrio）ORF(6,8)、(7,8)、（8,9）などの各組合せの役割については、現在研究中である。実施例４植物発現構築物大きな断片のクローニングおよびそれに続くそれらの操作を容易にするために、非常に少数の制限部位を有するクローニングベクターを設計した。配列AAGCCC GGGCTTおよびGTACAAGCCCGGGCTTAGCTを有するオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングさせることにより、アダプターを組立てた。ベクターpBluescript II SK+ （Stratagene）を制限エンドヌクレアーゼAsp718およびSstIで消化した後、このアダプターを該ベクターに連結した。得られたベクターpCGN7769は、平滑末端化 DNA断片のクローニングのための単一のSrfI（および埋め込まれたSmaI）クローニング部位を有していた。 pCGN3223（米国特許第5,639,790号）由来のナピン（napin）カセットを含有するプラスミドを修飾して、それを、複数の制限部位を含有する大きなDNA断片のクローニングに、より有用なものにし、植物バイナリー形質転換ベクター内への複数のナピン融合遺伝子のクローニングを可能にした。ベクターpBCSK+（Strata gene）を制限エンドヌクレアーゼBssHIIで消化した後、配列CGCGATTTAAATGGCGCG CCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAATの自己アニール化オリゴヌクレオチドを含むアダプターを該ベクターに連結して、ベクターpCGN7765を構築した。プラスミドpCGN3223およびpCGN7765をNotIで消化して、共に連結した。得られたベクターpCGN7770（図17）は、pCGN7765バックボーンと、pCGN3223由来のナピン種子特異的発現カセットとを含有する。シュウワネラ（Shewanella）構築物 PCRを用いて適当なクローニング部位をORFの5'および3'に導入するために、シュウワネラ（Shewanella）タンパク質をコードする遺伝子を突然変異誘発した。該PCR反応の鋳型は、コスミドpEPA（Yazawaら，前掲）のDNAであった。Pfu DNA ポリメラーゼを製造業者のプロトコールに従い使用して、PCR反応を行なった。S rfIで消化されたpCGN7769中に、該PCR産物をクローニングした。プライマーCTGC AGCTCGAGACAATGTTGATTTCCTTATACTTCTGTCCおよびGGATCCAGATCTCTAGCTAGTCTTAGCTG AAGCTCGAを使用してORF３を増幅し、プラスミドpCGN8520を生成した。プライマーTCTAGACTCGAGACAATGAGCCAGACCTCTAAACCTACAおよびCCCGGGCTCGAGCTAAT TCGCCTCACTGTCGTTTGCTを使用してORF６を増幅し、プラスミドpCGN7776を生成した。プライマーGAATTCCTCGAGACAATGCCGCTGCGCATCGCACTTATCおよびGGTACCAGATCTT TAGACTTCCCCTTGAAGTAAATGGを使用してORF７を増幅し、プラスミドpCGN7771を生成した。プライマーGAATTCGTCGACACAATGTCATTACCAGACAATGCTTCTおよびTCTAGAGTC GACTTATACAGATTCTTCGATGCTGATAGを使用してORF８を増幅し、プラスミドpGCN7775 を生成した。プライマーGAATTCGTCGACACAATGAATCCTACAGCAACTAACGAAおよびTCTAG AGGATCCTTAGGCCATTCTTTGGTTTGGCTTCを使用してORF９を増幅し、プラスミドpCGN7 773を生成した。 pCGN7771、pCGN8520およびpCGN7773のインサートのDNA配列決定により、該PCR 産物の完全性を確認した。ORF６およびORF８は非常に大きなサイズを有していた。全クローンの配列決定を避けるために、該ORFの中央部分をpEPAの制限断片で置換した。ORF６の中央部分を含有するpEPAの6.6キロベースのPacI/BamHI断片を、PacI/BamHIで消化されたpCGN7776に連結して、pCGN7776B4を得た。ORF８の中央部分を含有するpEPAの4.4キロベースのBamHI/BglII断片を、BamHI/BglIIで消化されたpCGN7775に連結して、pCGN7775Aを得た。該pEPA断片に隣接した領域および該クローニング結合部を、DNA配列決定により確認した。プラスミドpCGN7771をXhoIIおよびBglIIで切断し、SalIおよびBglIIで消化後のpCGN7770に連結した。得られたナピン/ORF７遺伝子融合プラスミドをpCGN7783 と称することにした。プラスミドpCGN8520をXhoIおよびBglIIで切断し、SalIおよびBglIIで消化後のpCGN7770に連結した。得られたナピン/ORF３遺伝子融合プラスミドをpCGN8528と称することにした。プラスミドpCGN7773をSalIおよびBamH Iで切断し、SalIおよびBglIIで消化後のpCGN7770に連結した。得られたナピン/O RF９遺伝子融合プラスミドをpCGN7785と称することにした。プラスミドpCGN7775 AをSalIで切断し、SalI で切断後のpCGN7770に連結した。得られたナピン/ORF８遺伝子融合プラスミドを pCGN7782と称することにした。プラスミドpCGN7776B4をXhoIで切断し、SalIで消化後のpCGN7770に連結した。得られたナピン/ORF６遺伝子融合プラスミドをpCGN 7786B4と称することにした。植物形質転換用のバイナリーベクターpCGN5139を、pCGN1558（McBrideおよびS ummerfelt(1990)Plant Molecular Biology,14:269-276)から構築した。pCGN1558 のポリリンカーを、HindIII/Asp718断片として、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位AscI、PacI、XbaI、SwaI、BamHIおよびNotIを含有するポリリンカーで置換した。該Asp718およびHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位は、pCGN5139内に保有されている。pCGN5139をNotIで消化し、NotIで消化されたpCGN7786B4に連結した。ナピン/ORF６遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、 pCGN8533と称することにした。プラスミドpCGN8533をSse8387Iで消化し、Sse838 7Iで消化されたpCGN7782に連結した。ナピン/ORF６遺伝子融合体およびナピン/O RF８遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、pCGN8535（図18）と称することにした。植物バイナリー形質転換ベクターpCGN5139をAsp718で消化し、Asp718で消化されたpCGN8528に連結した。ナピン/ORF３遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、pCGN8532と称することにした。プラスミドpCGN8532をNotIで消化し、NotIで消化されたpCGN7783に連結した。ナピン/ORF３遺伝子融合体およびナピン/ORF７遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、pCGN8534 と称することにした。プラスミドpCGN8534をSse8387Iで消化し、Sse8387Iで消化されたpCGN7785に連結した。ナピン/ORF３遺伝子融合体、ナピン/ORF７遺伝子融合体およびナピン/ORF９遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、pCGN8537（図19）と称することにした。ビブリオ（Vibrio）構築物植物発現用のビブリオ（Vibrio）ORFはすべて、出発分子としてビブリオ（Vib rio）コスミド#9を使用して得た。ビブリオ（Vibrio）コスミド#9は、実施例１に記載のビブリオ(Vibrio)ORF６PCR産物を使用したビブリオ(Vibrio) コスミドライブラリーから単離したコスミドの１つであった。 PCRプライマーTCTAGAGTCGACACAATGGCGGAATTAGCTGTTATTGGTおよびGTCGACGGATCC CTATTTGTTCGTGTTTGCTATATGを使用し、ビブリオ（Vibrio）ORF７をコードする遺伝子（図6）を突然変異誘発して、該オープンリーディングフレームの上流にSal I部位を、該オープンリーディングフレームの下流にBamHI部位を導入した。PCR プライマーGTCGACGGATCCACAATGAATATAGTAAGTAATCATTCGGCAおよびGTCGACCTCGAGTT AATCACTCGTACGATAACTTGCCを使用し、ビブリオ（Vibrio）ORF９をコードする遺伝子（図6）を突然変異誘発して、該オープンリーディングフレームの上流にBamHI 部位を、該オープンリーディングフレームの下流にXhoHI部位を導入した。該制限部位は、PCRを用いて導入し、突然変異誘発したプラスミドの完全性はDNA配列により確認した。ビブリオ（Vibrio）ORF７遺伝子をSalI-BamHI断片として、Sal -BglIで消化されたpCGN7770（図17）のナピンカセット中にクローニングして、p CGN8539を得た。ビブリオ（Vibrio）ORF９遺伝子をSalI-BamHI断片として、Sal- BglIで消化されたpCGN7770（図17）のナピンカセット中にクローニングして、pC GN8543を得た。ビブリオ（Vibrio）ORF６およびORF８をコードする遺伝子を突然変異誘発して、該オープンリーディングフレームに隣接するSalI部位を導入した。ORF６に隣接するSalI部位を、PCRを用いて導入した。使用したプライマーは、CCCGGGTCGAC ACAATGGCTAAAAAGAACACCACATCGAおよびCCCGGGTCGACTCATGACATATCGTTCAAAATGTCACT GAであった。該PCR産物の中央の7.3kbのBamHI-XhoI断片を、ビブリオ（Vibrio）コスミド#9由来の対応断片で置換した。突然変異誘発したORF６をpCGN7770のナピンカセットのSalI部位中にクローニングして、プラスミドpCGN8554を得た。 ORF８の突然変異誘発では、異なる方法を用いた。ORF８を含有するBamHI断片をプラスミドpHC79中にサブクローニングして、コスミド#9"を得た。該コード領域の上流のSalI部位を、オリゴヌクレオチドTCGACATGGAAAATATTGCAGTAGTAGGTATT GCTAATTTGTTCおよび CCGGGAACAAATTAGCAATACCTACTACTGCAATATTTTCCATGを含むアダプター上に導入した。該アダプターを、SalIおよびXmaIでの消化後にコスミド#9"に連結した。突然変異誘発のためにPCRを用いて、SalI部位を終結コドンの下流に導入した。該終結コドンを含有するDNA断片は、プライマーTCAGATGAACTTTATCGATACおよびTCATGA GACGTCGTCGACTTACGCTTCAACAATACTと共にコスミド#9"を鋳型として使用して作製した。該PCR産物を制限エンドヌクレアーゼClaIおよびAatIIで消化し、同じ酵素で消化されたコスミド#9"誘導体中にクローニングして、プラスミド8P3を得た。 8P3からのSalI断片を、SalIで消化されたpCGN7770中にクローニングして、pCGN8 515を得た。ナピンプロモーターの制御下にシュウワネラ（Shewannella）ORF３を含有するバイナリー植物形質転換ベクターであるpCGN8532をNotIで消化し、ナピンビブリオ（Vibrio）ORF７遺伝子融合体を含有するpCGN8539のNotI断片を挿入して、pCG N8552を得た。ナピンプロモーターの制御下にシュウワネラ（Shewannella）ORF ３ならびにビブリオ（Vibrio）ORF７および９を含有するプラスミドpCGN8556（図23）を、Sse8387で消化されたpCGN8552中にpCGN8543からのSse8357断片をクローニングすることにより構築した。 NotIで消化された、プラスミドpCGN8515からのナピン/ORF８遺伝子を、NotIで消化された植物バイナリー形質転換ベクターpCGN5139中にクローニングして、pC GN8548を得た。Sse8387で消化された、pCGN8554からのナピン/ORF６遺伝子をついで、pCGN8566のSse8387部位中にクローニングした。ナピン/ORF６遺伝子融合体およびナピン/ORF８遺伝子融合体を含有する得られたバイナリーベクターを、 pCGN8560（図22）と称することにした。実施例５植物の形質転換およびPUFAの産生 EPA の産生シュウワネラ（Shewanella）構築物pCGN8535およびpCGN8537は、同一または別々の植物中に形質転換することができる。別々の植物を使用する場合には、該トランスジェニック植物を交雑させて、両方の構築物を含有するヘテロ接合種子を得ることができる。 pCGN8535およびpCGN8537を、西洋アブラナ（Brassica napus）中に別々に形質転換する。カナマイシンを含有する培地上で植物を選択し、該構築物の完全長インサートによる形質転換を、サザン分析により確認する。また、ORF３、６、７、８または９にコードされる酵素のタンパク質発現について、ウエスタン分析を用いて未熟種子を試験することができ、この場合には、最も良く発現しているpC GNE8535およびpCGN8537T₁で形質転換された植物を、更なる実験および交雑のために選択し成長させる。あるいは、サザン法で挿入が示された、T₁で形質転換された植物を、互いに交雑させて、両方の挿入を有するT₂種子を得る。この種子のうちの半分の種子を、脂肪画分中のEPAの発現から直接分析することができる。最良のEPA産生の事象を有する残りの半分の種子を成長させ、従来の育種技術により発育させて、EPAの産生のためのアブラナ（Brassica）系統を得る。また、プラスミドpCGN7792およびpCGN7795を、西洋アブラナ（Brassica napus ）宿主細胞内に同時に導入する。標準的な形質転換プロトコール（例えば、米国特許第5,463,174号および米国特許第5,750,871号を参照されたい）を用いるが、両プラスミドを含有するアグロバクテリア（Agrobacteria）を共に混合し、共培養工程中にアブラナ（Brassica）子葉と共にインキュベートする。得られた植物の多数は、両プラスミドで形質転換されている。DHA の産生 EPAの産生に関して記載したとおりに、DHAの産生のために、pCGN8556およびpC GN8560を別々の植物内に又は同時に同一植物内に導入することにより、植物を形質転換する。別法として、シュウワネラ（Shewanella）ORFをビブリオ（Vibrio）のORF６および８と共に協同的に、例えば、構築物pCGN8560およびpCGN7795で植物を形質転換することにより使用し、植物細胞内での該対応ORFの発現を可能にすることができる。この組合せは、シュウワネラ（Shewanella）のORF３、７および９をビブリオ（Vibrio）由来のORF６およびビブリオ（Vibrio）由来のORF８と共に含む PKS様遺伝子配置を与える。前記のとおり、ORF８は、最終的なPUFA産物の種類を制御するPKS様遺伝子である。したがって、得られた形質転換植物は、植物油中にDHAを産生する。実施例６シュウワネラ（Shewanella）PUFA遺伝子を含有するトランスジェニック植物アブラナ（Brassica）植物プラスミドpCGN8535およびpCGN8537で同時形質転換した52個の植物を、PCRにより分析して、該シュウワネラ（Shewanella）ORFが該トランスジェニック植物内に存在するか否かを確認した。41個の植物がプラスミドpCGN8537を含有し、35 個の植物がpCGN8535を含有していた。該植物のうちの11個は、EPAの合成に必要な５個のORFすべてを含有していた。いくつかの植物は、該バイナリープラスミドの両方からの遺伝子を含有していたが、該ORFの少なくとも１つを欠いているらしかった。さらに約20個の植物に関する分析を現在実施中である。 pCGN8535のみで形質転換した23個の植物をPCRにより分析して、該シュウワネラ（Shewanella）ORFが該トランスジェニック植物内に存在するか否かを確認した。これらの植物のうちの13個は、シュウワネラ（Shewanella）ORF６およびシュウワネラ（Shewanella）ORF８の両方を含有していた。該植物のうちの６個は、１個のORFのみを含有していた。 pCGN8537のみで形質転換した19個の植物をPCRにより分析して、該シュウワネラ（Shewanella）ORFが該トランスジェニック植物内に存在するか否かを確認した。該植物のうちの18個は、シュウワネラ（Shewanella）ORF３、シュウワネラ（Shewanella）ORF７およびシュウワネラ（Shewanella）ORF９を含有していた。１個の植物はシュウワネラ（Shewanella）ORF３および７を含有していた。シロイヌナズナ（Arabidopsis）プラスミドpCGN8535およびpCGN8537で同時形質転換した40個を超えるトランスジェニック・シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物が、本発明者らの生育箱内で成長中である。該ORFのいずれが該植物内に存在するのかを確認するためのPCR分析が、現在進行中である。種々の生物に由来するPKS様遺伝子を使用して、植物細胞を形質転換し、該形質転換植物細胞内でのPUFAの生合成を介して植物細胞膜または植物種子油の脂肪酸組成を修飾することが、本発明により可能となった。該PKS様系の性質のため、該植物細胞内で産生された脂肪酸最終産物は、多数の特異的化学構造を含有するように選択または設計することができる。例えば、該脂肪酸は、以下の変異体を含むことが可能である：該炭素鎖に沿った種々の位置のケトまたはヒドロキシル基の数における変異；二重結合の数および型（シスまたはトランス）における変異；該炭素直鎖からの分枝（メチル、エチルおよびより長い分枝部分）の数および型における変異；および飽和炭素における変異。また、最終産物脂肪酸の個々の長さは、使用する個々のPKS様遺伝子により制御することができる。本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明に関連する当業者の技術水準に相当する。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられると具体的かつ個別的に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れるものとする。以上で本発明は十分に記載されており、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明に多数の変更および改変を施すことが可能であることが、当業者に明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月３０日（１９９８．１２．３０）【補正内容】【図１】【図１】【図２】【図２】【図３】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図４】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図５】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図６】【図７】【図７】【図８】【図９】【図１０】【図１１】【図１２】【図１３】【図１４】【図１５】【図１６】【図１７】【図１８】【図１９】【図２０】【図２１】【図２２】【図２３】【図２４】【図２５】【図２６】【図２６】【図２６】【図２６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｐ 7/64 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ (72)発明者ラスナー，マイケルアメリカ合衆国 95616 カリフォルニア州，デイビス，ファルコンアベニュー 721

Claims

【特許請求の範囲】１．図６に示すORF６、ORF７、ORF８およびORF９よりなる群から選ばれるビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。２．ポリケチド様合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸であって、該系が、宿主細胞内で発現されるとドコサヘキサエン酸を産生することを特徴とする単離された核酸。３．該ヌクレオチド配列が海洋細菌に由来する、請求項２に記載の単離された核酸。４．該ヌクレオチド配列が、図６に示すビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus ）ORF８である、請求項２に記載の単離された核酸。５．図６に示すORF６、ORF７、ORF８およびORF９よりなる群から選ばれるビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）のヌクレオチド配列の少なくとも50ヌクレオチドの配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。６．請求項１または請求項２に記載の単離された核酸の少なくとも１つのコピーを含んでなる組換え微生物細胞。７．該細胞が、長鎖多不飽和脂肪酸を産生するのに必要なポリケチド様合成系の各要素を含む、請求項６に記載の組換え微生物細胞。８．該細胞が真核細胞である、請求項７に記載の組換え微生物細胞。９．該真核細胞が菌類細胞、藻類細胞または動物細胞である、請求項８に記載の組換え微生物細胞。 10．該菌類細胞が酵母細胞であり、該藻類細胞が海洋藻類細胞である、請求項９に記載の組換え微生物細胞。 11．該細胞が原核細胞である、請求項６に記載の組換え微生物細胞。 12．該細胞が細菌細胞または藍細菌細胞である、請求項11に記載の組換え微生物細胞。 13．該組換え微生物細胞が、前記の単離された核酸を欠く非組換え微生物細胞と比べて22:6脂肪酸に富む、請求項６に記載の微生物細胞。 14．複数の微生物細胞を有する微生物培養細胞を成長させることを含んでなる、微生物培養細胞内でのドコサヘキサエン酸の製造方法であって、該微生物細胞または該微生物細胞の祖先が、ポリケチド合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１以上の核酸を含むベクターで形質転換されており、前記の１以上の核酸が、機能しうる形でプロモーターに連結されており、該成長を、前記の１以上の核酸が発現されドコサヘキサエン酸が該微生物培養細胞内で産生される条件下で行なうことを特徴とする製造方法。 15．複数の植物細胞を有する植物を成長させることを含んでなる、植物細胞内での長鎖多不飽和脂肪酸の製造方法であって、該植物細胞または該植物細胞の祖先が、長鎖多不飽和脂肪酸を産生するポリケチド合成系の１以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１以上の核酸を含むベクターで形質転換されており、該核酸のそれぞれが、植物細胞内で機能的であるプロモーターに、機能しうる形で連結されており、該成長を、該ポリペプチドが発現され長鎖多不飽和脂肪酸が該植物細胞内で産生される条件下で行なうことを特徴とする製造方法。 16．該植物細胞内で産生される長鎖多不飽和脂肪酸が20:5および22:6脂肪酸である、請求項15に記載の製造方法。 17．該核酸が、図６に示すビブリオ・マリヌス（Vibrio marinus）ORF６、ORF ７、ORF８およびORF９ならびに図４に示すシュウワネラ・プトレファシエンス（ Shewanella putrefaciens）ORF３、ORF６、ORF７、ORF８およびORF９よりなる群から選ばれるポリペプチドのいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の製造方法。 18．該核酸構築物が２以上のポリケチド合成系に由来する、請求項15に記載の製造方法。 19．長鎖多不飽和脂肪酸を産生する組換え植物細胞であって、該長鎖多不飽和脂肪酸が該植物細胞にとって外因的であり、該組換え植物細胞が、長鎖多不飽和脂肪酸を産生するポリケチド合成系の１以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１以上の核酸であって、そのそれぞれは、該植物細胞内で機能的であるプロモーターに、機能しうる形で連結されている該核酸を含むベクターで植物細胞または該植物細胞の祖先を形質転換して、組換え植物細胞を得、該ポリペプチドが発現され長鎖多不飽和脂肪酸が該植物細胞内で産生される条件下、該組換え植物細胞を成長させることを含む方法に従い産生されることを特徴とする組換え植物細胞。 20．該組換え植物細胞が組換え種子細胞である、請求項19に記載の組換え植物細胞。 21．該組換え種子細胞が組換え胚細胞である、請求項20に記載の組換え植物細胞。 22．該植物細胞内で産生される長鎖多不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸である、請求項15に記載の製造方法。 23．該植物細胞内で産生される長鎖多不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である、請求項15に記載の製造方法。 24．該組換え植物細胞が、アブラナ(Brassica)、ダイズ、サフラワーおよびヒマワリよりなる群から選ばれる植物に由来する、請求項19に記載の組換え植物細胞。 25．請求項19に記載の組換え植物細胞により産生される植物油であって、エイコサペンタエン酸を含んでなる植物油。 26．請求項19に記載の組換え植物細胞により産生される植物油であって、ドコサヘキサエン酸を含んでなる植物油。 27．該植物油がカプセル化されている、請求項25または請求項26に記載の植物油。 28．請求項27に記載の植物油を含んでなる食物補充剤。 29．ドコサヘキサエン酸を産生する組換え大腸菌（E.coli）細胞。 30．エイコサペンタエン酸を含んでなる植物油。 31．ドコサヘキサエン酸を含んでなる植物油。 32．該細菌細胞が乳酸桿菌細胞である、請求項12に記載の組換え微生物細胞。