ES2909600T3 - Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes - Google Patents

Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes Download PDF

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Abstract

Una composición lipídica que comprende de 25% en peso a 40% en peso de DHA n-3, de 6% en peso a 10% en peso de DPA n-6 y de 0% en peso a 3% en peso de EPA n-3, que comprende, además: (i) de 11% en peso a 15% en peso de ácido mirístico; o (ii) de 3% en peso a 7% en peso de ácido palmitoleico; o (iii) al menos 1% en peso de material carotenoide.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes
1. Esta solicitud reivindica el beneficio de y la prioridad para la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 60/688.207, presentada el 7 de junio de 2005, y la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 60/751.401, presentada el 16 de diciembre de 2005.
1. ANTECEDENTES
2. Existe una abrumadora evidencia científica de que los ácidos grasos altamente insaturados (n-3) tales como el ácido docosahexaenoico (DHA) tienen un efecto positivo sobre enfermedades cardiocirculatorias, inflamaciones crónicas y trastornos cerebrales. Por otra parte, los ácidos grasos (n-6) se han observado como metabolitos intermedios dentro de los esteroides eicosanoides, tales como prostaglandina, leucotrienos o similares.
3. Actualmente, la principal fuente de estos ácidos grasos altamente insaturados es el pescado, con DHA y ácido eicosapentaenoico (EPA) observados dentro de diversos pescados azules (tales como sardinas y atún) en cantidades alrededor de 20% y 10%, respectivamente. Sin embargo, si se trata de usar aceite de pescado como la única fuente de estos lípidos, existen varias desventajas, tales como problemas con un aroma desagradable, fluctuaciones incontrolables en la disponibilidad, variabilidad en el contenido de aceite de pescado natural, así como el potencial de acumular contaminantes ambientales nocivos. Además, si se pretende obtener un aceite (n-3) o (n-6) altamente purificado a partir de estas fuentes, es muy difícil separar y purificar preferentemente. El documento EP0823475 divulga una composición que comprende DHA n-3, DPA n-6, obtenidos utilizando microorganismos SR21 del género Schizochytrium.
II. SUMARIO
La invención se dirige a una composición como la definida en la reivindicación 1, y a productos que comprenden estas composiciones.
III. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
5. Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones y junto con la descripción ilustran las composiciones y los métodos divulgados.
6. la Figura 1 muestra un diagrama que muestra los resultados obtenidos a partir de la metilación de ácidos grasos de los lípidos derivados de ONC-T18;
7. la Figura 2 representa gráficamente una comparación de éster metílico de ácido graso entre el aislado de ONC-T18 original recogido en Advocate Harbor y el de la ONC-T18 Thraustochytrium sp. depositada en ATCC como PTA-6245. Todos los picos se identificaron mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas;
8. la Figura 3 muestra un gráfico de un diagrama de dispersión de los resultados procedentes de experimentos de optimización de biomasa de ONC-T18 realizados. Estos experimentos usaban una técnica conocida como el método de Taguchi a fin de determinar las condiciones óptimas para el crecimiento de ONC-T18 bajo diversas condiciones de los medios;
9. la Figura 4 muestra un gráfico de barras del perfil de ácidos grasos de ONC-T18, desarrollado bajo condiciones óptimas (ejemplo 4) a lo largo de un período de nueve días;
10. la Figura 5 muestra un diagrama de organismos productores de aceite aislados según se describe en cualquier parte en la presente;
11. la Figura 6 muestra un árbol filogenético ramificado de la relación entre el gen de ARNr de 18S de ONC-T18 y otros Thraustochytriales;
12. la Figura 7 muestra la producción de lípidos y DHA de ONC-T18 bajo diferentes condiciones;
13. la Figura 8 muestra un gráfico modificado con información acerca de las condiciones de crecimiento sobre ellos para los eucariotas divulgados en la presente. (Modificado a partir de Ratledge, C. (2004), Lipid Technol. 16:3439).
14. la Figura 9 muestra una ruta metabólica propuesta para la producción de PUFAs para los eucariotas divulgados; 15. la Figura 10 muestra una comparación de máximos de producción de ácidos grasos y composiciones bajo diversas fuentes de carbono de bajo coste alternativas;
16. la Figura 11 muestra un agrupamiento de aislados recogidos basándose en sus perfiles de PUFA C20 y C22. Los resultados se compararon con dos cepas de referencia: ATCC 20891 y MYA-1381;
17. la Figura 12 muestra un árbol de unión de vecinos de ARNr de 18S de la cepa ONC-T18. La barra representa la distancia genética, mientras que los corchetes representan secuencias derivadas del GenBank usadas dentro de este árbol filogenético;
18. la Figura 13 muestra el perfil de ácidos grasos de ONC-T18 desarrollada en medio que contiene 2 g l-1 de extracto de levadura, 8 g l-1 de L-glutamato, 6 g l-1 de sal marina y 60 g l-1 de glucosa en 3 tipos diferentes de fermentación: placa de agar (agar al 1,5%, 25°C, 27 días), matraces (50 ml en matraz de 250 ml, 120 RPM, 25°C, 3 días) y un biorreactor de 5 l (4 lpm de aire, pO290%, 25°C, 3 días);
19. la Figura 14 muestra el cromatograma de HPLC de compuestos carotenoides aislados de ONC-T18 de Thraustochytrium sp. Por ejemplo, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona y ^-caroteno se aislaron de ONC-T 18 de Thraustochytrium sp.;
20. la Figura 15 muestra la producción y la utilización de biomasa típica, ácido graso total (TFA), DHA de ONC-T18 de Thraustochytrium sp. mantenida en un biorreactor de 5 l durante 168 h con medio compuesto por 60 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de extracto de levadura, 8 g l-1 de ácido glutámico y 6 g l-1 de sal (4 lpm de aire, pO290%, 25°C, pH 7-9);
21. la Figura 16 muestra rutas postuladas implicadas en la formación de astaxantina en ONC-T 18 de Thraustochytrium sp.
IV. DESCRIPCIÓN DETALLADA
22. Antes de que se divulguen y describan los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, se ha de entender que no se limitan a métodos sintéticos específicos o métodos de biotecnología recombinante específicos a menos que se especifique otra cosa, o a reactivos particulares a menos que se especifique otra cosa, ya que, por supuesto, estos pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitativa.
23. Los expertos en la técnica identificarán, o serán capaces de averiguar usando nada más que experimentación habitual, muchos equivalentes para las realizaciones específicas del método y las composiciones descritos en la presente. Estos equivalentes están destinados a estar abarcados por las reivindicaciones posteriores.
A. Definiciones
24. Según se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "uno/una" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de estos portadores, y similares.
25. Los intervalos se pueden expresar en la presente como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa este intervalo, otra realización incluye del un valor particular y/o al otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente," se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación al otro punto final como independientemente del otro punto final. También se ha de entender que hay un número de valores divulgados en la presente, y que cada valor también se divulga en la presente como "aproximadamente" ese valor particular además del propio valor. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces también se divulga "aproximadamente 10". También se entiende que cuando se divulga un valor "menor que o igual al" valor, también se divulgan "mayor que o igual al valor" y posibles intervalos entre valores, como se entiende apropiadamente por el experto. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces también se divulga "menor que o Párrafos a insertar antes del párrafo [22] de la página 3 de la descripción. Según la invención, se proporciona una composición lipídica que comprende de 25% en peso a 40% en peso de DHA n-3, de 6% en peso a 10% en peso de DPA n-6, y de 0% en peso a 3% en peso de EPA n-3, que comprende además:
(i) de 11% en peso a 15% en peso de ácido mirístico; o
(ii) de 3% en peso a 7% en peso de ácido palmitoleico; o
(iii) al menos 1% en peso de material carotenoide.
Una realización según la invención es una composición lipídica que comprende de aproximadamente 25% en peso a aproximadamente 40% en peso de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso a aproximadamente 10% en peso de DPA n-6 y de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 3% en peso de EPA n-3, que comprende además de 11% en peso a 15% en peso de ácido mirístico.
Una realización adicional según la invención es una composición lipídica que comprende de aproximadamente 25% en peso a aproximadamente 40% en peso de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso a aproximadamente 10% en peso de DPA n-6 y de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 3% en peso de EPA n-3, que comprende además de 3% en peso a 7% en peso de ácido palmitoleico.
Una realización adicional más según la invención es una composición lipídica que comprende de aproximadamente 25% en peso a aproximadamente 40% en peso de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso a aproximadamente 10% en peso de DPA n-6 y de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 3% en peso de EPA n-3, que comprende además al menos 1% en peso de material carotenoide. Igual a 10" así como "mayor que o igual a 10". También se entiende que, a lo largo de la solicitud, se proporcionan datos en un número de formatos diferentes, y que estos datos representan puntos finales y puntos de partida, e intervalos para cualquier combinación de puntos de datos. Por ejemplo, si se divulgan un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular "15", se entiende que mayor que, mayor que o igual a, menor que, menor que o igual a; e igual a 10 y 15 se consideran divulgados asimismo como entre 10 y 15. También se entiende que se divulga cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se divulgan 10 y 15, entonces también se divulgan 11, 12, 13 y 14.
26. Por "reducir" u otras formas de reducir se entiende la disminución de un episodio o característica. Se entiende que esto es típicamente en relación con algún valor estándar o esperado, en otras palabras es relativo, pero que no siempre es necesario para el valor estándar o relativo al que se hace referencia. Por ejemplo, "reduce la fosforilación" significa la disminución de la cantidad de fosforilación que tiene lugar con relación a un estándar o un control. Se entiende que a menos que se indique específicamente otra cosa, un compuesto o una composición o una condición se puede reducir con relación a otro compuesto o composición o condición.
27. Por "inhibir" u otras formas de inhibir se entiende obstruir o restringir una característica particular. Se entiende que esto es típicamente en relación con algún valor estándar o esperado, en otras palabras es relativo, pero que no siempre es necesario para el valor estándar o relativo al que se hace referencia. Por ejemplo, "inhibe la fosforilación" significa la obstrucción o restricción de la cantidad de fosforilación que tiene lugar con relación a un estándar o un control. Se entiende que a menos que se indique específicamente otra cosa, un compuesto o una composición o una condición se puede inhibir con relación a otro compuesto o composición o condición.
28. Por "prevenir" u otras formas de prevenir se entiende detener una característica o condición particular. La prevención no requiere la comparación con un control ya que típicamente es más absoluta que, por ejemplo, la reducción o la inhibición. Según se usa en la presente, algo se podría reducir pero no inhibir o prevenir, pero algo que se reduce también se podría inhibir o prevenir. Se entiende que cuando se usan reducción, inhibición o prevención, a menos que se indique específicamente otra cosa, el uso de las otras dos palabras también se divulga expresamente. Así, si se divulga inhibe la fosforilación, entonces también se divulgan reduce y previene la fosforilación.
29. El término "terapéuticamente eficaz" significa que la cantidad de la composición usada es de suficiente cuantía para mejorar una o más causas o síntomas de una enfermedad o trastorno. Esta mejora solo requiere una reducción o alteración, no necesariamente una eliminación.
30. El término "portador" significa un compuesto, una composición, una sustancia o una estructura que, cuando está en combinación con un compuesto o una composición, ayuda o facilita la preparación, el almacenamiento, la administración, el aporte, la eficacia, la selectividad o cualquier otro rasgo del compuesto o la composición para su uso o propósito pretendido. Por ejemplo, un portador se puede seleccionar para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualesquiera efectos secundarios adversos en el sujeto.
31. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" y variaciones de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", significa "incluyendo pero no limitado a", y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.
32. El término "célula" según se usa en la presente también se refiere a células microbianas individuales, o cultivos derivados de estas células. Un "cultivo" se refiere a una composición que comprende células aisladas de un tipo igual o diferente.
33. El término "metabolito" se refiere a derivados activos producidos tras la introducción de un compuesto en un medio biológico, tal como un paciente.
34. Cuando se usa con respecto a composiciones farmacéuticas y nutracéuticas, se entiende generalmente en la técnica que el término "estable" significa menos de una cierta cantidad, habitualmente 10%, de pérdida del ingrediente activo bajo condiciones de almacenamiento especificadas durante un período indicado. El tiempo requerido para que una composición se considere estable es relativo al uso de cada producto y está dictado por los aspectos prácticos comerciales para producir el producto, mantenerlo para control de calidad e inspección, transportarlo hasta un mayorista o directamente a un cliente donde se mantiene de nuevo almacenado antes de su uso final. Incluyendo un factor de seguridad de un tiempo de pocos meses, la vida útil mínima para los productos farmacéuticos es habitualmente un año, y preferiblemente más de 18 meses. Según se usa en la presente, el término "estable" hace referencia a estas realidades del mercado y la capacidad para almacenar y transportar el producto en condiciones ambientales fácilmente obtenibles tales como condiciones refrigeradas, de 2°C a 8°C.
35. Las referencias en la memoria descriptiva y las reivindicaciones finales a partes en peso de un elemento o componente particular en una composición o un artículo indican la relación en peso entre el elemento o componente y cualesquiera otros elementos o componentes en la composición o el artículo para el que se expresa una parte en peso. Así, en un compuesto que contiene 2 partes en peso de componente X y 5 partes en peso de componente Y, X e Y están presentes en una relación en peso de 2:5, y están presentes en esta relación independientemente de si están contenidos en el compuesto componentes adicionales.
36. Un porcentaje en peso de un componente, a menos que se indique específicamente lo contrario, se basa en el peso total de la formulación o composición en la que está incluido el componente.
37. "Aislar" y cualquier forma tal como "aislado" se refieren a una situación en la que algo está en una forma en la que se pueda manipular o purificar adicionalmente. Aislado y sus formas indica que algo está en un estado actual que es diferente de un estado previo. Por ejemplo, una molécula de ARN ribosómico se puede "aislar" si, por ejemplo, se retira de un organismo, se sintetiza o se produce recombinantemente. A menudo, el "aislamiento" de una cosa es con relación a otra. Por ejemplo, un eucariota según se analiza en la presente se puede aislar, según se analiza en la presente, por ejemplo, al cultivar el eucariota, de modo que el eucariota sobreviva en ausencia de cantidades apreciables (detectables) de otros organismos. Se entiende que a menos que se indique específicamente otra cosa, cualquiera de las composiciones divulgadas se puede aislar según se divulga en la presente.
38. "Purificar" y cualquier forma tal como "purificación" se refiere al estado en el que una sustancia o un compuesto o una composición está en un estado de más homogeneidad de lo que estaba anteriormente. Se entiende que, según se divulga en la presente, algo puede ser, a menos que se indique otra cosa, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% puro. Por ejemplo, si una composición A dada era 90% pura, esto significaría que 90% de composición era A y que 10% de la composición era una o más cosas, tales como moléculas, compuestos u otras sustancias. Por ejemplo, si un microorganismo eucariótico divulgado, por ejemplo, produce 35% de DHA, este se podría "purificar" adicionalmente de modo que la composición lipídica final fuera más de 90% DHA. A menos que se indique otra cosa, la pureza estará determinada por los "pesos" relativos de los componentes dentro de la composición. Se entiende que a menos que se indique específicamente otra cosa, cualquiera de las composiciones divulgadas se puede purificar según se divulga en la presente.
39. "Opcional" u "opcionalmente" significa que el episodio o la circunstancia descritos a continuación se puede producir o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho episodio o circunstancia se produce y casos en los que no.
40. Los "cebadores" son un subconjunto de sondas que son capaces de soportar algún tipo de manipulación enzimática y que se pueden hibridar con un ácido nucleico diana de modo que no se produzca la manipulación enzimática. Un cebador puede estar formado por cualquier combinación de nucleótidos o derivados o análogos de nucleótidos disponibles en la técnica que no interfieran con la manipulación enzimática.
42. Se divulgan los componentes que se van a usar para preparar las composiciones divulgadas así como las propias composiciones que se van a usar dentro de los métodos divulgados en la presente. Estos y otros materiales se divulgan en la presente, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque pueda no divulgarse explícitamente la referencia específica de cada una de diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos, cada uno se contempla y describe específicamente en la presente. Por ejemplo, si se divulga y se analiza una especie particular de la familia Thraustochytriaceae y se analiza un número de modificaciones que se pueden realizar en un número de organismos incluyendo especies de la familia Thraustochytriaceae, se contemplan específicamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de estas especies de la familia Thraustochytriaceae y las modificaciones que son posibles a menos que se indique específicamente lo contrario. Así, si se divulga una clase de moléculas A, B y C así como una clase de moléculas D, E y F y se divulga un ejemplo de una molécula combinada, A-D, entonces, incluso si cada una no se cita individualmente, cada una se contempla individualmente y colectivamente significando que se consideran divulgadas las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F. Asimismo, también se divulga cualquier subconjunto o combinación de estos. Así, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se consideraría divulgado. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta solicitud incluyendo, pero no limitado a, etapas en los métodos para elaborar y usar las composiciones divulgadas. Así, si existe una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier realización o combinación de realizaciones específica de los métodos divulgados.
B. Composiciones
43. Se divulgan microorganismos eucarióticos del orden Thraustochytriales, preferiblemente especies de Thraustochytrium o Schizochytrium, que tienen la capacidad de producir lípidos, tales como ácidos grasos, tales como ácidos grasos insaturados, tales como ácidos grasos omega-3, tales como ácidos grasos omega-6 y ácidos grasos omega-9, tales como la serie (n-3) de ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA), la serie (n-6) de ácido docosapentaenoico (DPA) y la serie (n-9) de ácidos palmítico y esteárico. Los microorganismos eucarióticos divulgados también pueden producir antioxidantes, tales como pero no limitados al compuesto carotenoide caroteno (por ejemplo - caroteno) y los compuestos xantofílicos astaxantina, zeaxantina, cantaxantina y equinenona.
44. También se divulgan condiciones para el aislamiento y el crecimiento de los microorganismos eucarióticos. Por ejemplo, con la presente se dan condiciones de crecimiento heterótrofas para la producción de los lípidos y antioxidantes divulgados, por ejemplo, tanto individualmente como acumulativamente. Según esto, es posible a través del uso de este eucariota único producir eficazmente la serie (n-3) de DHA y/o la serie (n-6) de DPA y/o la serie carotenoide de compuestos antioxidantes y/o la serie xantofílica de compuestos antioxidantes, que son útiles como o dentro de productos nutracéuticos, aditivos alimentarios, productos farmacéuticos o la industria.
45. Se divulgan composiciones que comprenden un microorganismo eucariótico que comprende o que consiste en una especie de Thraustochytrium, siendo un ejemplo como el divulgado en la presente la cepa ONC-T18 que tiene un número de depósito del registro de la ATCC número PTA-6245.
46. Se entiende que también se divulgan el microorganismo eucariótico y cualesquiera clones, organismos modificados o genes aislados de dicho organismo que se indica en ONC-T18. Los organismos divulgados tienen la capacidad de producir ácidos grasos insaturados, tales como lípidos que contienen la serie omega-3 de DHA y EPA, y la serie omega-6 de DPA y diversos antioxidantes tales como carotenoides, xantófilas y compuestos fenólicos.
47. También se divulgan procedimientos para la producción de biomasa que contiene dichos compuestos. Se divulgan además procedimientos para preparar compuestos omega-3, omega-6 y carotenoides utilizando el microorganismo eucariótico. También se divulgan procedimientos para la producción de aceites derivados de microbios (o unicelulares).
48. Además, se divulgan los ácidos grasos y los carotenoides producidos por el microorganismo eucariótico divulgado y cualquier descendencia (modificada genéticamente o de otro modo), diversos piensos, productos nutracéuticos, un producto farmacéutico y un alimento complementados con los lípidos y antioxidantes, así como un procedimiento para utilizar estos compuestos como un aditivo para diversos piensos y alimentos.
49. La Patente de EE. UU. N° 5.130.242 de Barclay divulgaba un procedimiento de recogida y cribado para aislar cepas de microorganismos con las siguientes características para la producción de ácidos grasos omega-3: 1) capaces de crecimiento heterótrofo; 2) produceir un alto contenido de ácidos grasos omega-3; 3) unicelulares; 4) producir un bajo contenido de ácidos grasos estándar y omega-6; 5) células no pigmentadas, blancas o incoloras; 6) termotolerantes (p. ej., capacidad para crecer por encima de 30°C); y 7) eurhalinos (p. ej., capacidad para crecer en un amplio intervalo de salinidades, pero preferiblemente a baja salinidad).
50. La divulgación '242 también describe un procedimiento para la producción heterótrofa de productos microbianos de células enteras o extraídos con una alta concentración de ácidos grasos omega-3, que se pueden usar posteriormente en productos alimenticios para animales o seres humanos. Este procedimiento usa microorganismos identificados por el procedimiento de recogida y cribado divulgado de los mismos. Estos microorganismos, que son del orden Thaustochytriales, se cultivan en grano triturado. Para potenciar la producción de ácidos grasos omega-3, se usan estrés a baja temperatura y gran cantidad de oxígeno disuelto, así como la adición de antioxidantes, factores de crecimiento, vitaminas y fósforo. Los productos extraídos contienen altas concentraciones de ácidos grasos omega-3 (p. ej., C20:5w3, C22:5w3 y C22:6w3) y bajas concentraciones de ácidos grasos omega-6 (p. ej., C20:4w6 y C22:5w6). Específicamente, las relaciones de los ácidos grasos C20:5w3 a C22:6w3 van de 1:1 a 1:30. Las relaciones de ácidos grasos C22:5w3 a C22:6w3 van de 1:12 con cantidades solo vestigiales de C22:5w3. Además, los microorganismos producen de 0,6 a 0,72% de DHA, de 0 a 5% de DPA y de 0 a 18,9% de EPA, en peso de ácido graso total.
51. La Patente de EE. UU. N° 6.451.567 de Barclay divulgaba un procedimiento para hacer crecer Thraustochytrium y Schizochytrium en un medio libre de cloruro (<3 g/l) que contiene sales sódicas (p. ej., sulfato sódico). El medio libre de cloruro da como resultado tamaño de agregados celulares de menos de 150 gm. El procedimiento divulgado produce microorganismos y extractos que son útiles en productos alimenticios para acuicultura. Componentes adicionales de los productos alimenticios incluyen semillas de lino, semillas de colza, soja y harina de aguacate. Los microorganismos pueden producir 1,08 g/l de medio al día de ácidos grasos omega-3. La divulgación '567 describe además diversos medios de cultivo, que incluyen agua marina, glucosa (1, 3, 5 o 10 g/l), extracto de levadura (0,01, 0. 2, 0,4 y 5 g/l), fuentes de nitrógeno adicionales tales como hidroxilado de proteína (1 g/l), extracto de hígado (1 g/l), glutamato (5 g/l), MSG (3 g/l) y sales adicionales, vitaminas y minerales vestigiales (p. ej., KH2PO4, MgSO4, y extracto de gelatina).
52. La Patente de EE. UU. N° 6.582.941 de Yokochi y cols. divulga especies de Schizochytrium, cepa SR21 y otra cepa de Schizochytrium perteneciente a la misma especie que tienen la capacidad de producir fracciones de ácido graso que tienen una concentración de DHA omega-3 y/o DpA omega-6 y una baja concentración de EPA. Además, se divulgan métodos para cultivar estos microorganismos y aislar estos ácidos grasos. El medio usado contiene sal marina, extracto de levadura (0,2, 1,0 o 10 g/l), licor de maíz fermentado (0,5, 1,0 o 10 g/l), glucosa (10-120 g/l), más sales adicionales (p. ej., NH4OAc, fosfatos). Las composiciones de ácidos grasos contienen aproximadamente de 15 a 20% de DHA en peso de biomasa (aproximadamente 28% en peso de ácido graso total). Las composiciones se pueden usar en productos alimenticios (p. ej., leche para recién nacidos).
53. La Patente de EE. UU. N° 6.607.900 de Bailey y cols. divulgaba un procedimiento para hacer crecer microorganismos eucarióticos (p. ej., Schizochytrium sp. N° ATCC 20888) que son capaces de producir al menos 20% de su biomasa como lípidos poliinsaturados (particularmente ácidos grasos omega-3 y -6). El procedimiento implica cultivar los microorganismos en un medio que contiene una fuente de carbono y nitrógeno. También se divulga el uso de bajos niveles de oxígeno disuelto (menos de 3%) y bajos niveles de ion cloruro (menos de 3 g/l) para potenciar la producción. Los microorganismos tienen una velocidad de producción de lípidos de al menos 0,5 g/l/h. La fracción lipídica es de 15 a 20% de DHA en peso de biomasa (aproximadamente 35% en peso de éster metílico de ácido graso total).
54. La Publicación de EE. UU. N° 2004/0161831 de Komazawa y cols. divulga una cepa de Thraustochytrium (LEF1; N° ATCC FERM BP-08568) que tiene la capacidad de producir DHA. Al cultivar en medios convencionales, el microorganismo puede producir aceite con al menos 50% en peso de DHA. El aceite se puede tratar con una lipasa antes del aislamiento de DHA. El aceite se puede usar en alimentos o bebidas o el DHA se puede hidrolizar para producir ácido behénico.
1. Ácidos grasos
55. Los ácidos grasos son cadenas hidrocarbonadas que terminan en un grupo carboxilo, denominándose insaturados si contienen al menos un doble enlace carbono-carbono y poliinsaturados cuando contienen varios de estos enlaces. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) o ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) de cadena larga se pueden dividir en las series (n-3) y (n-6) como resultado de la localización de estos dobles enlaces. Existe una evidencia científica abrumadora de que los ácidos grasos altamente insaturados (n-3) tales como DHA tienen un efecto positivo sobre enfermedades cardiocirculatorias, inflamación crónica y trastornos cerebrales. Por otra parte, los ácidos grasos (n-6) se han señalado como metabolitos intermedios dentro de los esteroides eicosanoides, tales como prostaglandinas, leucotrienos o similares.
56. Los ácidos grasos poliinsaturados pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dobles y/o triples enlaces carbono-carbono. Por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados pueden comprender 3-8, 4-7 o 5-6 dobles y/o triples enlaces carbono-carbono.
57. Actualmente, la principal fuente de estos ácidos grasos altamente insaturados es el pescado, con DHA y EPA apreciados dentro de diversos pescados azules (tales como sardinas y atún) en cantidades alrededor de 20% y 10%, respectivamente. Sin embargo, si se trata de usar aceite de pescado como la única fuente de estos lípidos, existen varias desventajas, tales como problemas con un aroma desagradable, fluctuaciones incontrolables en la disponibilidad, variabilidad en el contenido de aceite de pescado natural, así como el potencial de acumular contaminantes ambientales nocivos. Además, si se pretende obtener un aceite (n-3) o (n-6) altamente purificado a partir de estas fuentes, es muy difícil separar y purificar preferentemente. Específicamente, está disponible un gran mercado dentro del mercado de los complementos neonatales para una forma muy concentrada de DHA. Si el aceite de pescado fuera la fuente de dichos productos, entonces el DHA se tendría que aislar preferentemente en grandes cantidades a partir de EPA. Claramente, se necesita una fuente alternativa de una fuente altamente purificada y adaptada para la producción de estos ácidos grasos muy insaturados.
58. Además de los aceites de pescado, diversos microorganismos (principalmente marinos) son capaces de producir y/o acumular la serie (n-3) de ácido docosahexaenoico. De particular interés es el hecho de que la producción microbiana no está sometida a fluctuaciones provocadas por variables externas tales como la estacionalidad, el clima y el suministro de alimento. Por ejemplo, se sabe que los siguientes microorganismos tiene la capacidad de producir DHA: la bacteria derivada de aguas profundas Vibrio marinus (ATCC 15381), Vibrio sp. T3615, Photobacterium profundum SS9, Mortierella marina MP-1 y Psychromonas kaikoae (ATCC BAA-363T); especies de microalgas tales como Crypthecodinium cohmi, Cyclotella cryptica y Mortieralla alpina (IS-4); y los protistas Thraustochytrium sp. (ATCC 20892), Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) y Thraustochytrium roseum. Sin embargo, según un procedimiento que utiliza estos organismos purificados, la cantidad de ácido docosahexaenoico producida por gramo de biomasa por litro es baja, estando dentro del intervalo de 10 a 500 mg. Algunos ejemplos y organismos microbianos productores de aceite representativos se muestran en la Figura 5.
59. Se ha mostrado que los omega 3 tienen efectos beneficiosos y los aceites y las composiciones divulgados en la presente se pueden usar por el efecto antiinflamatorio sobre la fibrosis quística (Cochrane Database Syst Rev. 3), la artritis reumatoide (Drugs 63: 845-53), el asma (Ann Allergy Asthma Immunol 90: 371-7) y la apoplejía trombótica (Prev Cardiol 6: 38-1), cardioprotector, así como un efecto directo sobre la arteriosclerosis y la arritmia (Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 63:351-62), la inhibición de la proliferación del cáncer en líneas celulares de cáncer de mama y próstata y la reducción en experimentos en animales (Am J Clin Nutr 77: 532-43), el efecto antipsicótico sobre la esquizofrenia (J Neural Transm Suppl 64:105-17) y otras enfermedades psiquiátricas (Can J Psychiatry 48: 195-203), complemento inmunonutriente usado para el desarrollo neonatal normal y en el tratamiento de infecciones neonatales (Eur J Pediatr 162: 122-8) y el tratamiento del dolor patológico al atenuar directamente los procesos neuronales y ganglionares que subyacen al dolor neuropático e inflamatorio (Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68: 219-24).
2. Thraustochytriaceae
a) ONC-T18
60. El organismo marino ONC-T18, según se divulga en la presente, se recogió como parte de un viaje de aislamiento microbiano para producir PUFA, con más de 60 cultivos puros aislados (véase la tabla 7 para los detalles). Además, ONC-T18 se aisló de las hojas de pastos de marismas en the Advocate Harbor, Bahía de Fundy, Nueva Escocia, Canadá. A través de exámenes microscópicos y técnicas de purificación por cultivo en serie, se creía que la cepa era un solo microorganismo perteneciente al género Thraustochytrium. Todas las cepas y dos cultivos de comparación de ATCC (ATCC 20891 & MYA-1381) se hicieron crecer sobre 0,5% de glucosa, 0,2% de peptona, 0,2% de extracto de levadura en agua marina (SW) y se sometieron a análisis por GC (éster metílico de ácido graso, FAME).
61. La Figura 6 muestra un árbol filogenético propuesto de la relación entre ONC-T18 y otros organismos estrechamente relacionados.
62. ONC-T18 se aisló originalmente como un solo microbio usando técnicas clásicas de cebado con polen de pino, seguido por cultivo sobre medio selectivo. Específicamente, se preparó un medio nutriente que contenía 5 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de peptona, 2 g l-1 de extracto de levadura para 1 l de agua marina filtrada a través de 0,2 pm. A continuación, se determinó el perfil de ácidos grasos de ONC-T18 usando el método de extracción de Bligh y Dyer y técnicas cromatográficas de gases de PUFA. Los resultados cromatográficos demostraban la capacidad de esta cepa para producir un incremento en las cantidades de TFA, DHA, así como cantidades notables de EPA y DPA. 63. El microorganismo eucariótico divulgado se puede usar en un procedimiento para preparar un lípido o una grasa que contiene DHA, EPA y DPA, pero no se limita a la susodicha cepa ONC-T18 o PTA-6245, sino cualquier derivación de dicha cepa ya sea a través de modificación genética, mutagénesis química, adaptación fermentativa y cualesquiera otros medios para producir mutantes de la cepa, con lo que el producto de estas modificaciones tiene rasgos genéticos o morfológicos y funcionales tales como el microorganismo eucariótico, según se divulga en la presente.
64. Se divulgan microorganismos eucarióticos capaces de producir una composición lipídica que tiene propiedades de una clase lipídica distintivas, y la solución al problema de mantener una fuente estable, fiable y económica para este lípido que tenga alta funcionalidad y un valor adicional según la misma. Por lo tanto, se divulgan en la presente cepas silvestres que producen la serie (n-3) de DHA y la serie (n-6) de DPA hasta un grado mayor así como cepas variantes y recombinantes diseñadas para producir estos ácidos grasos poliinsaturados hasta un grado mayor. Estos microorganismos variantes o recombinantes incluyen los diseñados para tener un contenido superior de dichos lípidos que los producidos por la cepa silvestre original, cuando se cultivan usando las mismas condiciones y medio. Además, se pueden seleccionar microorganismos diseñados para producir un lípido que contenga cantidades similares de la serie (n-3) de DHA, EPA y la serie (n-6) de DPA, en comparación con las correspondientes cepas silvestres, usando eficazmente sustratos que tienen un comportamiento de coste superior, también se incluyen. 65. Se divulgan composiciones que comprenden un microorganismo eucariótico del orden Thraustochytriales en donde el microorganismo eucariótico produce ácidos grasos insaturados. Los ácidos grasos poliinsaturados pueden ser, por ejemplo, ácidos grasos omega 3 u omega 6, tales como DHA y DPA.
66. Se divulgan composiciones que comprenden un eucariota, en donde la composición produce un lípido.
67. También se divulgan composiciones en las que el lípido comprende un lípido según se divulga en la presente.
68. También se divulgan composiciones en las que el eucariota comprende un miembro del orden Thraustochytriales.
69. También se divulgan composiciones en las que el eucariota tiene una secuencia del gen de ARN del ribosoma 18S que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NO:1.
70. Se entiende que se puede usar cualquier forma de caracterización descrita en la presente, tal como mediante genética o mediante las firmas lipídica o mediante las clasificaciones, para los microorganismos eucarióticos para caracterizar los microorganismos que se divulgan en la presente. El microorganismo eucariótico puede comprender uno o más microorganismos de la familia Thraustochytriaceae, y ejemplos son el número de registro de la ATCC 20888, 20889, 20890, 20891 y 20892. Existe una variedad de características que se pueden usar relacionadas con los organismos y los ácidos grasos insaturados que producen. Se entiende que estos se pueden usar en cualquier combinación o permutación para definir un conjunto o conjuntos de organismos o aceites o antioxidantes, por ejemplo. Una característica es la clasificación de los propios organismos, la identificación genética de los organismos, los perfiles de lípidos y antioxidantes de los organismos y las condiciones de crecimiento de los organismos, por ejemplo.
b) Clasificación
71. El microorganismo eucariótico puede ser del filo Labyrinthulomycota. El microorganismo eucariótico puede ser de la clase Labyrinthulomycetes. El microorganismo eucariótico puede ser de la subclase Thraustochytriade. El microorganismo eucariótico puede ser del orden Thraustochytriales. El microorganismo eucariótico puede ser de la familia Thraustochytriaceae. El microorganismo eucariótico puede ser del género Thraustochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser una Thraustochytrium sp. El microorganismo eucariótico puede ser Thraustochytrium aureum. El microorganismo eucariótico puede ser Thraustochytrium roseurn. El microorganismo eucariótico puede ser Thraustochytrium striatum. El microorganismo eucariótico puede ser del género Schizochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser Schizochytrium sp. El microorganismo eucariótico puede ser una versión modificada de cualquiera de los microorganismos eucarióticos listados. El microorganismo eucariótico también puede comprender cualesquiera miembros actualmente desconocidos o aislados de dicha clase, subclase, orden, familia o género de procariotas. Una combinación de microorganismos eucarióticos puede ser cualquier combinación de cualesquiera organismos divulgados en la presente, incluyendo una o más de las Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium striatum y Thraustochytrium roseum.
72. Los microorganismos eucarióticos de la familia Thraustochytriaceae pueden ser cualquiera de los divulgados anteriormente. El microorganismo eucariótico puede comprender el organismo que tiene el número de registro de ATCC PTA-6245.
c) Genética
73. El microorganismo eucariótico puede tener una secuencia de ARNr de 18S SEQ ID NO:1. El microorganismo eucariótico puede tener una secuencia de ARNr de 18S que, por ejemplo, tiene aproximadamente 90% de homología, o cualquier otra identidad divulgada en la presente, con SEQ ID NO:1. El microorganismo eucariótico puede tener una secuencia de ARNr de 18S que se hibrida bajo condiciones restrictivas, o cualesquiera otras condiciones como las divulgadas en la presente, a SEQ ID NO:1 o una porción de SEQ ID NO:1.
74. La similitud/identidad de secuencia y la hibridación de ácidos nucleicos de los ácidos nucleicos de los organismos pueden ser según se describe en la presente. Específicamente, la comparación de SEQ ID NO:1 con secuencias de ácido nucleico encontradas en la base de datos genómica, GenBank (National Centre for Biotechnology Information, National Institute of Health, Bethesda, MD, EE. UU. de A.) usando el algoritmo BLAST (Basic local alignment search tool) identificaba que SEQ ID NO:1 está relacionada (91% de similitud) con varias especies de traustocítrido eucarióticas, estrechamente relacionada con Thraustochytrium sp. CHN-1 [AB126669] (94,5% de similitud) y Thraustochytriidae sp. N1-27 [AB073308] (95,5% de similitud) y lo más estrechamente relacionada con Thraustochytrium striatum [AF265338] (97,5% de similitud).
3. (1) Similitudes de secuencia
75. Se entiende que, según se analiza en la presente, el uso de los términos homología e identidad significa lo mismo que similitud. Así, por ejemplo, si el uso de la palabra homología se usa entre dos secuencias no naturales, se entiende que esto no está indicando necesariamente una relación evolutiva entre estas dos secuencias, sino que más bien en cambio está considerando la similitud o relación entre sus secuencias de ácido nucleico. Muchos de los métodos para determinar la homología entre dos moléculas evolutivamente relacionadas se aplican habitualmente a cualesquiera dos o más ácidos nucleicos o proteínas con el propósito de medir la similitud de secuencia independientemente de si están o no relacionadas evolutivamente.
76. En general, se entiende que un modo de definir cualesquiera variantes o derivados conocidos, o los que pudieran surgir, de los genes y las proteínas divulgados en la presente, es a través de definir las variantes y los derivados en cuanto a homología con secuencias conocidas específicas. Esta identidad de las secuencias particulares divulgadas en la presente también se analiza en cualquier parte en la presente. En general, las variantes de ácidos nucleicos y proteínas divulgadas en la presente tienen típicamente al menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de homología con la secuencia indicada o la secuencia natural. Los expertos en la técnica entienden fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas o ácidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homología se puede calcular después de alinear las dos secuencias de modo que la homología esté en su nivel más alto.
77. Otro modo de calcular la homología se puede realizar mediante algoritmos publicados. Un alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede efectuar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante ejecuciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, b EsTFIT, PASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección.
78. Los mismos tipos de homología se pueden obtener para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, M Science 244:48-52, 1989, Jaeger y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger y cols. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989. Se entiende que típicamente se puede usar cualquiera de los métodos y que en ciertos casos los resultados de estos diversos métodos pueden diferir, pero el experto entiende que, si se encuentra identidad con al menos uno de estos métodos, se debe decir que las secuencias tienen la identidad indicada, y se deben divulgar en la presente.
79. Por ejemplo, según se usa en la presente, una secuencia citada por tener un porcentaje de homología particular con otra secuencia se refiere a secuencias que tienen la homología citada según se calcula mediante uno cualquiera o más de los métodos de cálculo descritos anteriormente. Por ejemplo, una primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento, según se define en la presente, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento con la segunda secuencia usando el método de cálculo de Zuker aunque la primera secuencia no tenga una homología de 80 por ciento con la segunda secuencia según se calcula mediante cualquiera de los otros métodos de cálculo. Como otro ejemplo, una primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento, según se define en la presente, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento con la segunda secuencia usando tanto el método de cálculo de Zuker como el método de cálculo de Pearson y Lipman aunque la primera secuencia no tenga una homología de 80 por ciento con la segunda secuencia según se calcula mediante el método de cálculo de Smith y Waterman, el método de cálculo de Needleman y Wunsch, los métodos de cálculo de Jaeger o cualquiera de los otros métodos de cálculo. Como otro ejemplo más, una primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento, según se define en la presente, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene una homología de 80 por ciento con la segunda secuencia usando cada uno de los métodos de cálculo (aunque, en la práctica, los diferentes métodos de cálculo a menudo darán como resultado diferentes porcentajes de homología calculados).
(2) Hibridación/hibridación selectiva
80. El término hibridación significa típicamente una interacción conducida por secuencias entre al menos dos moléculas de ácido nucleico, tales como un cebador o una sonda y un gen. Interacción conducida por secuencias significa una interacción que se produce entre dos nucleótidos o análogos nucleotídicos o derivados nucleotídicos de un modo específico nucleotídicamente. Por ejemplo, G que interactúa con C o A que interactúa con T son interacciones conducidas por secuencias. Típicamente, las interacciones conducidas por secuencias se producen sobre la cara de Watson-Crick o la cara de Hoogsteen del nucleótido. La hibridación de dos ácidos nucleicos está afectada por un número de condiciones y parámetros conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las concentraciones de sales, el pH y la temperatura de la reacción afectarán todos a si se hibridarían dos moléculas de ácido nucleico.
81. Parámetros para la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las condiciones de hibridación selectiva se pueden definir como condiciones de hibridación restrictivas. Por ejemplo, la restricción de la hibridación está controlado tanto por la temperatura como por la concentración de sales de cualquiera o ambas de las etapas de hibridación y lavado. Por ejemplo, las condiciones de hibridación para conseguir una hibridación selectiva pueden implicar la hibridación en solución de alta intensidad iónica (6x SSC o 6x SSPE) a una temperatura que está aproximadamente 12-25°C por debajo de la Tm (la temperatura de fusión a la que la mitad de las moléculas se disocian de sus parejas de hibridación) seguido por lavado a una combinación de temperatura y concentración de sales elegidas de modo que la temperatura de lavado esté aproximadamente 5-20°C por debajo de la Tm. Las condiciones de temperatura y sal se determinan fácilmente empíricamente en experimentos preliminares en los que muestras de ADN de referencia inmovilizadas sobre filtros se hibridan a un ácido nucleico marcado de interés y a continuación se lavan bajo condiciones de restricciones diferentes. Típicamente, las temperaturas de hibridación son superiores para hibridaciones de ADN-ARN y ARN-ARN. Las condiciones se pueden usar según se describe anteriormente para alcanzar restricción o según se conoce en la técnica. (Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; Kunkel y cols. Methods Enzymol.
154:367, 1987). Una condición de hibridación restrictiva preferible para una hibridación de ADN:ADN puede ser a aproximadamente 68°C (en solución acuosa) en 6x SSC o 6x SSPE seguido por lavado a 68°C. La restricción de la hibridación y el lavado, si se desea, se pueden reducir según esto a medida que se disminuye el grado de complementariedad deseado y, además, dependiendo de la riqueza de G-C o A-T de cualquier zona en la que se busque variabilidad. Asimismo, la restricción de la hibridación y el lavado, si se desea, se puede incrementar según esto a medida que se incrementa la homología deseada y, además, dependiendo de la riqueza de G-C o A-T de cualquier zona en la que se desee alta homología, todo según se sabe en la técnica.
82. Otro modo de definir la hibridación selectiva es al considerar la cantidad (porcentaje) de uno de los ácidos nucleicos unidos al otro ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las condiciones de hibridación selectivas serían cuando al menos aproximadamente 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del ácido nucleico limitativo esté unido al ácido nucleico no limitativo. Típicamente, el cebador no limitativo está, por ejemplo, en un exceso de 10 o 100 o 1000 veces. Este tipo de ensayo se puede realizar bajo condiciones en las que tanto el cebador limitativo como el no limitativo están, por ejemplo, 10, 100 o 1000 veces por debajo de su kd, o en las que solo una de las moléculas de ácido nucleico es 10, 100 o 1000 veces o en las que una o ambas moléculas de ácido nucleico están por encima de su kd.
83. Otro modo de definir la hibridación selectiva es al considerar el porcentaje de cebador que está manipulado enzimáticamente bajo condiciones en las que se requiere hibridación para promover la manipulación enzimática deseada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las condiciones de hibridación selectivas serían cuando al menos aproximadamente, 50, 55, 60, 65, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del cebador se manipula enzimáticamente bajo condiciones que promueven la manipulación enzimática, por ejemplo si la manipulación enzimática es extensión de ADN, entonces las condiciones de hibridación selectiva serían cuando se extiende al menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento de las moléculas de cebador. Condiciones preferidas también incluyen las sugeridas por el fabricante o indicadas en la técnica como apropiadas para realizar enzimáticamente la manipulación.
84. Al igual que con la homología, se entiende que existe una variedad de métodos divulgados en la presente para determinar el nivel de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico. Se entiende que estos métodos y condiciones pueden proporcionar diferentes porcentajes de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico, pero a menos que se indique otra cosa, sería suficiente cumplir los parámetros de cualquiera de los métodos. Por ejemplo, si se requería 80% de hibridación y con la condición de que la hibridación se produzca dentro de los parámetros requeridos en uno cualquiera de estos métodos, se considera divulgado en la presente.
85. Se entiende que los expertos en la técnica entienden que si una composición o un método cumple uno cualquiera de estos criterios para determinar la hibridación bien colectivamente o bien individualmente, es una composición o un método que se divulga en la presente.
d) Composición de las moléculas producidas
86. Se entiende que los eucariotas divulgados en la presente son capaces de producir un número de compuestos y composiciones. Los compuestos y las composiciones se pueden usar como una firma, un modo de identificación del organismo. Por ejemplo, un modo de caracterización de un organismo es mediante el perfil lipídico que produce el organismo. Según se divulga en la presente, estos diversos perfiles lipídicos se pueden usar para caracterizar el organismo, así como para ser purificado, manipulado y recogido por una variedad de razones.
(1) Lípidos
87. Se entiende que cada organismo puede producir algún perfil de ácidos grasos insaturados, según se divulga en la presente. Estos perfiles son característicos de los organismos. Posteriormente hay algunos ejemplos de perfiles de lípidos insaturados y otros para los organismos.
88. El microorganismo eucariótico puede producir, por ejemplo, una fracción de lípidos o ácidos grasos de al menos aproximadamente 4% en peso a 6% en peso (p. ej., aproximadamente 5% en peso), que comprende de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 2% en peso de ácido mirístico (p. ej., aproximadamente 1% en peso), de aproximadamente 16% en peso a aproximadamente 20% en peso (p. ej., aproximadamente 18% en peso) de ácido palmítico, de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 2% en peso (p. ej., aproximadamente 1% en peso) de ácido palmitoleico, de aproximadamente 4% en peso a aproximadamente 8% en peso (p. ej., aproximadamente 6% en peso) de ácido esteárico, de aproximadamente 30% en peso a aproximadamente 34% en peso (p. ej., aproximadamente 32% en peso) de ácido oleico, de aproximadamente 40% en peso a aproximadamente 44% en peso (p. ej., aproximadamente 42% en peso) de ácido linoleico y de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 3% en peso (p. ej., aproximadamente 2% en peso) de EPA n-3 por biomasa celular deshidratada.
89. El microorganismo eucariótico también puede producir, por ejemplo, una fracción de lípidos o ácidos grasos de al menos aproximadamente 1% en peso a 3% en peso (p. ej., aproximadamente 1,25% en peso), que comprende de aproximadamente 2% en peso a aproximadamente 4% en peso (p. ej., aproximadamente 3% en peso) de ácido mirístico, de aproximadamente 50% en peso a aproximadamente 60% en peso (p. ej., aproximadamente 55% en peso) de ácido palmítico, de aproximadamente 2% en peso a aproximadamente 4% en peso (p. ej., aproximadamente 3% en peso) de ácido palmitoleico, de aproximadamente 16% en peso a aproximadamente 20% en peso (p. ej., aproximadamente 18% en peso) de ácido esteárico, de aproximadamente 9% en peso a aproximadamente 13% en peso (p. ej., aproximadamente 11% en peso) de ácido oleico, de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 3% en peso (p. ej., aproximadamente 2% en peso) de ácido eicosadienoico y de aproximadamente 6% en peso a aproximadamente 10% en peso (p. ej., aproximadamente 8% en peso) de EPA n-3 por biomasa celular deshidratada.
90. El microorganismo eucariótico, por ejemplo, tal como ONC-T18, puede producir al menos aproximadamente 30% en peso, 40% en peso, 50% en peso, 60% en peso, 70%% en peso u 80% en peso (p. ej., aproximadamente 80% en peso) de una composición lipídica por biomasa celular deshidratada. Por ejemplo, el microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende de aproximadamente 25% a aproximadamente 40% de un ácido graso omega-3, tal como DHA n-3, (por ejemplo, al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% en peso) y de aproximadamente 0% a aproximadamente 3% del ácido graso omega-3, EPA, (por ejemplo, al menos 1% o 2% en peso) y de aproximadamente 4% a aproximadamente 12% de un ácido graso omega-6, tal como el DPA n-6 (por ejemplo, al menos 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10% en peso).
91. Se entiende que la composición del lípido producido por el microorganismo eucariótico se puede manipular basándose en las condiciones de crecimiento en las que existe el microorganismo eucariótico. Al cambiar diversos parámetros, según se divulga en la presente, las composiciones se pueden manipular para producir, por ejemplo, un mejor rendimiento de DHA o DPA. Por ejemplo, la manipulación puede no producir más gramos reales, pero la manipulación puede producir una mejor relación de DHA o DPA a EPA y otros PUFAs deseados, lo que puede ser deseable desde un punto de vista de la purificación. Se analizan en la presente condiciones variables.
92. La Figura 10 muestra una posible ruta metabólica para los diversos PUFAs producidos por el microorganismo eucariótico divulgado, de acuerdo con el seguimiento de metabolitos de ésteres metílicos de ácidos grasos. Proteínas que se pueden identificar dentro de las rutas que se analizan en la presente son policétido sintasa, usando, por ejemplo, un cebador degenerativo, (Metz y cols. (2001) Science 293:290-3 y Kaulmann & Hertweck (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:1866-9). También se pueden identificar elongasas y desaturasas, usando, por ejemplo, un estudio de sondas de hibridación. También se pueden identificar ácido graso sintasas usando, por ejemplo, un estudio de sondas de hibridación y/o cebadores degenerativos.
4. Crecimiento y cultivo
93. Se realizó un estudio fenotípico en microplacas que incluye carbono; nitrógeno (nitrógeno peptídico); fósforo y azufre; osmolitos y pH.
94. Se usó un método de disposición ortogonal (Taguchi) para determinar las configuraciones y las variaciones en nitrógeno, carbono y sal de los medios (Joseph J & Piganatiells JR (1998) IIE Trans, 20:247-254).
95. Si se incrementa la agitación o dO2, se incrementa la producción de biomasa y el TFA pero se disminuye el DHA. Si se disminuye la agitación o dO2, se disminuye la biomasa celular (g) y se disminuye el TFA pero se incrementa el DHA pero también se reducen C16:0, C16:1 y C18:1.
96. Si se incrementa la temperatura, se incrementa la producción de biomasa y el TFA pero se disminuye el DHA. Si se disminuye la temperatura, se disminuye la biomasa celular (g) y se disminuye el TFA pero se incrementa el DHA, pero se reducen C16:0, C16:1 y C18:1.
97. Se puede obtener biomasa celular derivada del microorganismo eucariótico divulgado al inocular un medio de agua marina natural o artificial adecuado, que contiene de aproximadamente 2% a aproximadamente 100% de agua marina. Este microorganismo eucariótico es capaz de utilizar diversos componentes nutricionales dentro de este medio. Ejemplos de una fuente de carbono usada dentro del medio son carbohidratos tales como glucosa, fructosa, dextrosa, lactulosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, lactosa, glucógeno, gelatina, almidón (maíz o trigo) así como derivados de azúcar tales como acetato, m-inositol (derivado de licor de maíz fermentado), ácido galacturónico (derivado de pectina), L-fucosa (derivada de galactosa), gentiobiosa, glucosamina, 1-fosfato de a-D-glucosa (derivado de glucosa), celobiosa (derivada de celulosa), dextrina (derivada de maíz) y a-ciclodextrina (derivada de almidón), y polioles tales como maltitol, eritritol, adonitol y ácidos oleicos tales como glicerol y Tween 80, y aminoazúcares tales como N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina y N-acetil-p-D-manosamina. Mientras, ejemplos de una fuente de nitrógeno son fuentes de nitrógeno naturales tales como peptona, extracto de levadura, extracto de malta y harina de pescado, o fuentes de nitrógeno orgánicas tales como glutamato sódico, pero no se limitan a estas. Por otra parte, si es necesario, se pueden usar fosfatos, tales como fosfato potásico y fosfato sódico, sales inorgánicas tales como sulfato amónico, bicarbonato sódico, ortovanadato sódico, cromato potásico, molibdato sódico, ácido selenioso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso y cloruro cálcico como nutrientes vestigiales, junto con el compuesto quelante, ácido etilendiaminotetraacético, solos o junto con vitaminas tales como hidrocloruro de piridoxina, hidrocloruro de tiamina, pantotenato cálcico, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12. Después de preparar el medio, el pH se ajusta hasta entre 3,0 y 10,0 usando ácido o base para el ajuste cuando sea apropiado, por ejemplo, entre pH 4,0 y 6,5, y el medio se esteriliza mediante tratamiento en autoclave, por ejemplo. El cultivo se puede llevar a cabo durante de 1 a 30 días, de 1 a 21 días, de 1 a 15 días, de 1 a 12 días, de 1 a 9 días, o preferiblemente de 3 a 5 días a temperaturas entre 4 y 30°C, preferiblemente 18 y 28°C, mediante cultivo con remoción por aireación, cultivo con remoción, cultivo estacionario, cultivo discontinuo, cultivo continuo, cultivo discontinuo giratorio o cultivo por ondas, o similares.
98. Las siguientes condiciones son un ejemplo de condiciones que pueden permitir la producción de un conjunto de lípidos con rendimientos que permitan su uso como una materia prima. La investigación de las condiciones de cultivo para ONC-T18 revelaba que el microorganismo eucariótico divulgado en la presente crece bien en agua marina natural o artificial o en un medio que contiene una concentración de hasta 5% de agua marina natural o artificial. Las fuentes de carbono y nitrógeno añadidas al medio pueden ser las usadas convencionalmente según se describe anteriormente. La fuente de nitrógeno que es de naturaleza bien natural o bien orgánica es relativamente igual y la concentración de nitrógeno total dentro del medio se mantiene constante. Estas fuentes se añaden al medio en condiciones estándar. Si se cumplen estas condiciones, se produce poca influencia sobre el contenido de lípido, las proporciones o la cantidad de DHA, DPA y EPA acumulados, según se divulga en la presente.
99. Para la fermentación de ONC-T18 a alta concentración, es posible usar varios métodos para incrementar las velocidades de producción tanto de biomasa celular como de lípido. Estos incluyen incrementar la concentración tanto de carbono como de nitrógeno en el medio (a una relación de entre 6:1 y 15:1, preferiblemente entre 6:1 y 13:1 y a temperaturas entre 4 y 30°C, preferiblemente 18 y 28°C) desde el intervalo de 5 g l-1 a 60 g l-1 hasta el intervalo 100 g l-1 y 160 g l-1 y desde el intervalo de 4 g l-1 a 10 g l-1 hasta el intervalo de 40 g l-1 a 60 g l-1, respectivamente. Usando este método, también se incrementa la proporción de biomasa y lípido producidos a velocidades comparables. Por otra parte, es posible incrementar la producción de lípido a través del uso de fuentes de carbono incrementadas desde el intervalo de 5 g l-1 a 60 g l-1 hasta el intervalo 100 g l-1 y 160 g l-1, mientras la fuente de nitrógeno permanece constante. Adicionalmente, es posible incrementar la producción de biomasa mientras se mantiene el contenido de lípido, a través del uso de cantidades incrementadas de fuentes de nitrógeno desde el intervalo de 10 g l-1 a 60 g l-1 mientras la fuente de carbón permanece constante. Por otra parte, la experimentación ha determinado que la producción de biomasa y lípido se incrementa mucho con el incremento de la agitación desde el intervalo 100 y 1000 rpm, mejor que a entre 350 y 600 rpm y óptimamente a entre 350 y 450 rpm, con solo una disminución marginal en el contenido de lípido y sin disminución en los perfiles de ácidos grasos, con agitación particularmente pertinente en las fases iniciales de la fermentación heterótrofa. La experimentación también ha determinado que se alcanzan óptimos de producción de lípido cuando el contenido de oxígeno disuelto del medio de cultivo esté entre 1 y 10%, óptimamente al 5%. Finalmente, la adición de acetato, elementos vestigiales, metales y vitaminas al medio de producción (según se menciona anteriormente) incrementa la producción of DHA, EPA y DPA con respecto a otros ácidos grasos sin disminuir los valores de lípidos totales.
100. Al realizar fermentación heterótrofa según se describe anteriormente. es posible producir sistemáticamente biomasa celular que produce un lípido que contiene la serie (n-3) de DHA en un cultivo de alta concentración de no menos de 5 g y más preferiblemente no menos de 20 g/l de medio. Por otra parte, la experimentación ha mostrado que la mayoría de estos lípidos se acumulan durante la fase de cultivo exponencial final/de transición, después de que se alcancen niveles de biomasa máximos. No obstante, durante el procedimiento de fermentación, el contenido de lípido típicamente no cae por debajo de 25% de la biomasa total, maximizándose típicamente a alrededor de 80%. El cultivo bajo las condiciones anteriores se puede llevar a cabo usando un fermentador de agitación convencional. También es posible usar un fermentador de columna de burbujeo (cultivos discontinuos o continuos), o un fermentador de ondas.
101. La recogida de biomasa celular antes del procesamiento para la separación de lípidos se puede realizar usando diversos métodos convencionales tales como centrifugación (tales como centrífugas de expulsión de sólidos) o filtración (tal como filtración de flujo cruzado) y también puede incluir el uso de un agente de precipitación para la recogida acelerada de biomasa celular (tal como fosfato sódico, cloruro cálcico o poliacrilamida).
5. Aislamiento del Lípido
102. La Figura 7 muestra perfiles de lípidos y DHA como funciones de una variedad de parámetros. Todos estos datos se pueden usar para extraer características específicas acerca del microorganismo eucariótico ONC-T18. La Figura 13 muestra un perfil de ácidos grasos general para el eucariota divulgado.
103. La grasa que contiene la serie (n-3) de DHA y la serie (n-6) de DPA se puede obtener al romper o disgregar la biomasa celular recogida, por ejemplo, a través de molienda, baño ultrasónico y a continuación llevando a cabo una extracción con un disolvente tal como cloroformo, hexano, metanol, etanol o a través de medios de extracción con fluidos supercríticos. El contenido de la grasa resultante que contiene la serie (n-3) de DHA y la serie (n-6) de DPA por 0,65 g (“grain”) de biomasa celular deshidratada es preferiblemente mayor de 0,25 g y más preferiblemente mayor que 0,6 g.
104. Los microorganismos eucarióticos divulgados tales como ONC-T18 son capaces de producir el lípido así obtenido, cualquiera de sus variantes y cualesquiera asociaciones entre miembros de la misma especie de microorganismos eucarióticos con lo que el perfil lipídico es como sigue. El porcentaje de lípidos neutros puede ser al menos 95% en peso de los lípidos totales. Una composición típica de ácidos grasos para el microorganismo eucariótico, tal como ONC-T18, en los lípidos neutros es como sigue: 15% de ácido mirístico, 8% de ácido pentadecanoico, 35% de ácido palmítico, 7% de ácido palmitoleico, 1% de ácido esteárico, 2% de ácido oleico, 1% de ácido eicosapentaenoico, 6% de ácido decosapentaenoico y 25% de ácido docosahexaenoico (espectros de GC mostrados en la Figura 1).
105. Los microorganismos eucarióticos divulgados, tales como ONC-T18, son capaces de producir el lípido así obtenido, cualquiera de sus variantes y cualesquiera asociaciones entre miembros de la misma especie de microorganismos eucarióticos con lo que el perfil lipídico es como sigue. El porcentaje de mono-, di- y tri-glicéridos en la fracción de lípidos neutros de ONC-T18 es de 0% a aproximadamente 2%, de 0 a aproximadamente 2% y de 96 a aproximadamente 100%, respectivamente. Mientras, la fracción de lípidos polares que comprende entre 5% y aproximadamente 10% de la fracción lipídica comprende fosfatidilcolina, fosfatidilserina y ácido fosfatídico tanto unidos como no unidos a lípidos neutros.
106. Se entiende que estos lípidos se pueden encontrar en cualquier combinación o permutación dentro del organismo. También se entiende que las concentraciones de estos lípidos se pueden manipular al cambiar las condiciones de crecimiento y las condiciones del medio según se analiza en la presente.
(1) Lípido según la concentración
107. El microorganismo eucariótico puede producir una fracción lipídica que comprende DHA n-3, EPA y DPA n-6 en más de o igual a aproximadamente 4,0 g l-1 de medio. El microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende DHA n-3, EPA y DPA n-6 en más de o igual a aproximadamente 20,0 g l-1 de medio. El microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende DHA n-3, EPA y DPA n-6 en más de o igual a aproximadamente 14,0 g l-1 de medio. El microorganismo eucariótico puede producir de aproximadamente 1,5 g l-1 a aproximadamente 5,0 g l-1 (p. ej., aproximadamente 4,6 g l-1) del DHA n-3, de aproximadamente 0,5 g l-1 a aproximadamente 1,5 g l-1 (p. ej., aproximadamente 0,22 g l-1) del n-3 EPA y de aproximadamente 0,5 g l-1 a aproximadamente 1,5 g l-1 del DPA n-6. Por otra parte, el microorganismo eucariótico puede producir una fracción lipídica que comprende ácidos mirístico, miristoleico, pentadecanoico, palmítico, palmitoleico, esteárico, oleico, linoleico, eicosadienoico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexanoico y docosapentaenoico entre 301,2 y 360,3 mg g-1 o incluso hasta 790 mg g-1 de biomasa celular. El microorganismo eucariótico también puede producir una fracción que comprende entre 44,3 y 57 mg g-1 de ácido mirístico (igual a de 1134,5 a 1458,1 mg l-1), de 0,5 a 0,65 de ácido miristoleico (igual a de 13,3 a 16,63 mg l-1), de 33,5 a 34,6 mg g-1 de ácido pentadecanoico (igual a de 856,9 a 885,1 mg l-1), 121,9 y 165,1 mg g-1 de ácido palmítico (igual a de 3118,2 a 4223,3 mg l-1), de 7,9 a 28,5-mg g-1 de ácido palmitoleico (igual a de 202,1 a 729 mg l-1), de 4,38 a 5,9 mg g-1 de ácido esteárico (igual a de 112 a 151 mg l-1), de 6,94 a 9,9 mg g-1 de ácido oleico (igual a de 177,5 a 253,2 mg l-1), de 0,4 a 1,3 mg g-1 de ácido linoleico (igual a de 11,26 a 33,3 mg l-1), de 0,5 a 1,0 mg g-1 de ácido eicosadienoico (igual a de 12,8 a 25,6 mg l-1), de 0,4 a 0,5 mg g-1 de ácido araquidónico (igual a de 10,2 a 13 mg l-1), de 75 a 100 mg g-1 de ácido docosahexanoico (igual a de 1918 a 2560 mg l-1), de 1,9 a 6 mg g-1 de ácido eicosapentaenoico (igual a de 48,6 a 153,5 mg l-1) y de 17,1 a 33,7 mg g-1 de ácido docosapentaenoico (igual a de 437,4 a 862,1 mg l-1), teniendo un contenido de ácidos grasos total dentro de la biomasa celular de entre 301 y 790 mg g (igual a de 7700 a 20,209 mg l-1).
(2) Otras moléculas
108. El microorganismo eucariótico puede producir además carotenoides y xantófilas. Ejemplos de estos carotenoides y xantófilas incluyen beta-caroteno, licopeno, astaxantina, cantaxantina, foenicoxantina, zeaxantina, equinenona, beta-criptoxantina, capsantina, luteína, achiote, beta-apo-8-carotenal y éster de beta-apo-8-carotenal.
109. Las xantófilas producidas por los microorganismos eucarióticos divulgados pueden estar conjugadas con los diversos PUFAs también producidos por los microorganismos eucarióticos divulgados.
{a} Antioxidantes
110. Generalmente, los antioxidantes son compuestos que reaccionan con, y típicamente son consumidos por, oxígeno. Puesto que los antioxidantes típicamente reaccionan con oxígeno, los antioxidantes también reaccionan típicamente con los generadores de radicales libres y los radicales libres. ("The Antioxidants - The Nutrients that Guard Your Body" de Richard A Passwater, Ph.D., 1985, Keats Publishing Inc.,). Las composiciones pueden contener cualesquiera antioxidantes, y una lista no limitativa incluiría pero no se limitaría a antioxidantes y nutrientes no flavonoides que pueden eliminar directamente radicales libres incluyendo multicarotenos, beta-carotenos, alfacarotenos, gamma-carotenos, licopeno, luteína y zeaxantinas, selenio, vitamina E, incluyendo alfa-, beta- y gamma-(tocoferol, particularmente alfa-tocoferol, etc., succinato de vitamina E y Trolox (un análogo soluble de vitamina E), vitamina C (ácido ascórbico) y niacina (vitamina B3, ácido nicotínico y nicotinamida), vitamina A, ácido retinoico 13-cis, N-acetil-L-cisteína (NAC), ascorbato sódico, ditiocarbamato de pirrolidina y coenzima Q10; enzimas que catalizan la destrucción de radicales libres incluyendo peroxidasas tales como glutationa peroxidasa (GSHPX) que actúa sobre H2O2 y tales como peróxidos orgánicos, incluyendo catalasa (CAT) que actúa sobre H2O2, superóxido dismutasa (SOD) que desproporciona O2H2O2, glutationa transferasa (GSHTx), glutationa reductasa (GR), 6-fosfato de glucosa deshidrogenasa (G6PD), y sus miméticos, análogos y polímeros (análogos y polímeros de enzimas antioxidantes, tales como SOD, se describen, por ejemplo, en la Patente EE. UU. N° Ser. 5.171.680); glutationa; ceruloplasmina; cisteína y cisteamina (beta-mercaptoetilamina) y flavonoides y moléculas flavonoideas como ácido fólico y folato. Una revisión de enzimas antioxidantes y sus miméticos y nutrientes antioxidantes se puede encontrar en Kumar y cols., Pharmac. Ther. 39: 301, 1988 y Machlin L. J. y Bendich, FASEB Journal 1 :441 -445, 1987.
111. Los flavonoides, también conocidos como "fenilcromonas", son compuestos hidrosolubles presentes en la naturaleza que tienen características antioxidantes. Los flavonoides están ampliamente distribuidos en plantas vasculares y se encuentran en numerosas hortalizas, frutas y bebidas tales como el té y en vino (particularmente el vino tinto). Los flavonoides son compuestos aromáticos conjugados. Los flavonoides más ampliamente presentes son flavonas y flavonoles (por ejemplo, miricetina, (3,5,7,3',4',5',-hexahidroxiflavona), quercetina (3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavona), kaempferol (3,5,7,4'-tetrahidroxiflavona), y las flavonas apigenina (5,7,4'-trihidroxiflavona) y luteolina (5,7,3',4'- tetrahidroxiflavona) y sus glucósidos y quercetina).
112. Los carotenoides son importantes pigmentos naturales producidos por muchos microorganismos y plantas, habitualmente de color rojo, naranja o amarillo. Tradicionalmente, los carotenoides se han usado en las industrias de los piensos, los alimentos y los productos nutracéuticos. Se sabe que son esenciales para el crecimiento de las plantas y la fotosíntesis, y son una fuente alimentaria principal de vitamina A en seres humanos. Los antioxidantes alimentarios, tales como carotenoides (beta-caroteno, licopeno, astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, capsantina, luteína, achiote, betaapo-8-carotenal y éster de beta-apo-8-carotenal) exhiben actividades anticancerosas significativas y representan un papel importante en la prevención de enfermedades crónicas. Los carotenoides son potentes antioxidantes biológicos que pueden absorber la energía excitada de oxígeno singlete sobre la cadena de carotenoide, conduciendo a la degradación de la molécula de carotenoide, pero evitando que se dañen otras moléculas o tejidos.
113. El oxígeno se requiere para funciones metabólicas, pero también presenta retos para las células. El organismo humano tiene una amplia gama de enzimas metabólicas y antioxidantes para librar a sus células de moléculas derivadas de oxígeno. Se supone que este estrés oxidativo es un factor contribuyente en afecciones tales como artritis reumatoide, cardiopatía isquémica y apoplejía, demencia de Alzheimer, cáncer y envejecimiento. Por lo tanto, los antioxidantes tienen el potencial de proteger contra un amplio espectro de enfermedades. Varios compuestos antioxidantes se han aislado de fuentes microbianas marinas; estos incluyen astaxantina, beta-caroteno y otros carotenoides.
114. Los carotenoides son un grupo ampliamente distribuido de pigmentos presentes en la naturaleza, con más de 700 pigmentos liposolubles naturales producidos principalmente por especies microalgáceas, macroalgáceas, bacterianas y fúngicas, siendo de particular interés comercialmente la astaxantina y sus derivados. La astaxantina es un protector antioxidante extremadamente eficaz. No obstante, a diferencia del beta-caroteno, la astaxantina cruza fácilmente la barrera hematoencefálica/retiniana, y por lo tanto tiene potencial para proteger de enfermedades del cerebro y los ojos. Estudios preclínicos sugieren diversos efectos beneficiosos del consumo de astaxantina tales como: (i) inhibir la formación y el crecimiento del cáncer en la vejiga urinaria, el colon, el hígado, la mama y la cavidad oral; (ii) proteger la retina del daño oxidativo y así tiene un efecto contra la enfermedad macular asociada a la edad; (iii) promover el incremento de la actividad inmunitaria, (iv) proporcionar protección del daño por luz ultravioleta, así como (v) proporcionar un incremento de la resistencia muscular.
b) Aislamiento de microorganismos
115. Se divulgan microorganismos de la familia Thraustochytriaceae obtenidos mediante un método que comprende cebar una muestra vegetativa en agua salada (marina natural o artificial) con granos de polen e incubar; separar y transferir los granos a un medio heterótrofo e incubar; identificar un aislado que produce ácidos grasos, aislando del aislado identificado el microorganismo de la familia Thraustochytriaceae. Formas adicionales de aislamiento incluyen medios complementados con antibióticos apropiados e identificación bien a través de medios microscópicos según se menciona anteriormente o bien a través del uso de cebadores o sondas del gen de ARNr de 18S. El medio heterótrofo puede ser según se describe posteriormente.
6. Lípidos y otras moléculas producidas por el microorganismo eucariótico
116. La invención se dirige a composiciones lipídicas que comprenden de aproximadamente 25% en peso a aproximadamente 40% en peso de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso a aproximadamente 10% en peso de DPA n-6 y de aproximadamente 0% en peso a aproximadamente 3% en peso de n-3 EPA.
117. La composición lipídica comprende además (i) de 11% en peso a 15% en peso (p. ej., aproximadamente 13% en peso) de ácido mirístico, (ii) de 3% en peso a 7% en peso (p. ej., aproximadamente 5% en peso) de ácido palmitoleico o (iii) al menos aproximadamente 1% en peso de material carotenoide.
118. La composición lipídica puede comprender DHA n-3 en concentraciones por encima de aproximadamente 400 mg de biomasa, DPA n-6 en concentraciones por encima de 100 mg de biomasa.
119. La composición lipídica puede comprender además carotenoides. Ejemplos de estos carotenoides incluyen beta-caroteno, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona, foenicoxantina, capsantina, luteína, achiote, beta-apo-8-carotenal y éster de beta-apo-8-carotenal.
120. En un aspecto, la composición puede comprender al menos aproximadamente 24% en peso de DHA n-3, aproximadamente 1% en peso de DPA, aproximadamente 6% en peso de DPA n-6 y aproximadamente 1% en peso de EPA n-3.
7. Composiciones que contienen las moléculas producidas por el microorganismo eucariótico
121. Un producto alimenticio, complemento, composición farmacéutica tanto para ser humano como para animal (incluyendo marino) puede comprender la composición (lípido, lípido con antioxidante y antioxidante solo).
122. También se divulga una leche maternizada que comprende la composición (lípido, lípido con antioxidante y antioxidante solo).
C. Métodos
1. Métodos para elaborar lípidos
123. Se divulgan métodos para preparar una composición lipídica, comprendiendo el método: cultivar un microorganismo eucariótico que comprende uno o más microorganismos de la familia Thraustochytriaceae, y aislar la composición lipídica.
124. Se puede emplear una variedad de procedimientos en la recuperación de la biomasa celular resultante a partir de fermentación en diversos medios de cultivo, tal como mediante filtración o centrifugación. A continuación, las células se pueden lavar, congelar, liofilizar o secar por pulverización, y almacenar bajo atmósfera no oxidante para eliminar la presencia de oxígeno, antes de la incorporación en un producto alimenticio o de pienso procesado.
125. Lípidos celulares que contienen los PUFAs DHA (n-3), EPA y DPA (n-6) también se pueden extraer de la biomasa celular por métodos tales como extracción con fluidos supercríticos o mediante extracción con disolventes tales como cloroformo, hexano, cloruro de metileno o metanol, y el extracto resultante se puede evaporar bajo presión negativa para producir una muestra de material lipídico concentrado. Los PUFAs omega-3 y omega-6 se pueden concentrar adicionalmente al hidrolizar los lípidos y concentrar la fracción altamente insaturada al emplear métodos tradicionales tales como aducción de urea o destilación fraccionada, cromatografía en columna o mediante fraccionación con fluidos supercríticos. Las células también se pueden romper o someter a lisis y los lípidos se pueden extraer en aceites vegetales o animales (p. ej. aceites de pescado). Los aceites extraídos se pueden refinar mediante procedimientos muy conocidos empleados habitualmente para refinar aceites vegetales (p. ej. mediante refinado químico o físico). Estos procedimientos de refinado retiran impurezas de aceites extraídos antes de que se usen o se vendan como aceites comestibles. Después del refinado, los aceites se pueden usar directamente como un aditivo para piensos o alimentos para producir productos enriquecidos en omega-3 y/u omega-6. Alternativamente, adicionalmente, el aceite se puede procesar y purificar según se esboza posteriormente y a continuación se puede usar en las aplicaciones anteriores y también en aplicaciones farmacéuticas.
126. En otro procedimiento para la producción de aceites omega-3 u omega-6 enriquecidos (concentrados), la biomasa celular recogida (fresca o deshidratada) se puede romper o permeabilizar mediante técnicas bien conocidas tales como ultrasonidos, métodos de ruptura por cizalladura de líquidos, molienda con microesferas, prensado bajo alta presión, congelación-descongelación o digestión enzimática de la pared celular. Los lípidos procedentes de las células rotas se extraen mediante el uso de un disolvente o una mezcla de disolventes tales como hexano, cloroformo, éter o metanol. El disolvente se retira y los lípidos se hidrolizan al usar cualquiera de los métodos bien conocidos para convertir triglicéridos en ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos incluyendo hidrólisis básica, ácida o enzimática. Después de que se complete la hidrólisis, los compuestos no saponificables se extraen en un disolvente tal como éter, hexano o cloroformo y se retiran. A continuación, la solución restante se acidifica mediante la adición de un ácido, y el ácido graso libre se extrae en un disolvente tal como hexano, éter o cloroformo. A continuación, la solución en disolvente que contiene los ácidos grasos libres se puede enfriar hasta una temperatura suficientemente baja para la cristalización de los compuestos diferentes a PUFAs, que a continuación se pueden retirar a través de filtración, centrifugación o sedimentación. Dando como resultado la concentración de los compuestos de PUFA restantes y se usan como complementos nutricionales para seres humanos, como un aditivo alimentario o como aplicaciones farmacéuticas.
127. También se divulga una composición lipídica preparada mediante el método divulgado anteriormente.
128. Los microorganismos de la familia Thraustochytriaceae pueden ser cualquiera de los microorganismos divulgados anteriormente.
a) Medio
129. El medio heterótrofo puede comprender sal marina (artificial o natural), una o más fuentes de carbono y una o más fuentes de nitrógeno. La sal marina puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 40,0 g l-1. La concentración de la fuente de carbono y nitrógeno usada bajo condiciones de cultivo estándar (no para fermentación a alta concentración, sino en cambio fermentación rentable) se encuentra dentro del intervalo de 5 g l-1 a 0 g l-1 y de 4 g l-1 a 10 g l1, respectivamente. Para la fermentación a alta concentración, la concentración de la fuente de carbono y nitrógeno usada bajo condiciones de cultivo estándar se encuentra dentro del intervalo de 100 g l-1 y 160 g l-1 y de 40 g l-1 a 60 g l-1, respectivamente. La tendencia es que para la acumulación de aceite, el microorganismo eucariótico se hace crecer en un medio de cultivo (como los descritos anteriormente) en el que el suministro de nitrógeno se limita después de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas, mientras el suministro de carbono permanece en abundancia. Este microorganismo eucariótico continúa asimilando el carbono (en la forma de azúcares simples) pero ya no puede sufrir división celular debido a una falta de nitrógeno para la generación de proteínas y ácidos nucleicos pertinentes. El resultado es que estos azúcares se convierten en aceites de almacenamiento, en gran parte del mismo modo que describe Ratledge C. (Lipid Tech. 16:34-39, 2004) y la figura 9 representa este fenómeno específico para este organismo.
130. La fuente de nitrógeno puede ser uno o más de peptona, extracto de levadura, extracto de malta y glutamato sódico. La fuente de nitrógeno también puede ser licor de maíz fermentado o extracto de semillas de algodón. La fuente de nitrógeno puede comprender extracto de levadura y/o peptona o glutamato monosódico. Por ejemplo, la fuente de nitrógeno puede incluir, pero no se limita a, YE-MSG EmD™, YE EMD™, peptona-MSG EMD™, YE-MSG Sigma™, YE Sigma™, YE-MSG Fermtech™, YE Fermtech™ o harina de pescado (62% de proteína). El extracto de levadura puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2 g l-1. El glutamato monosódico puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 8 g l-1.
131. La fuente de carbono puede ser uno o más de D-trehalosa, glicerol, ácido D-glucónico, ácido L-láctico, ácido D,L-málico, D-ribosa, Tween 20, D-fructosa, acetato, ácido acético, alfa-D-glucosa, maltosa, timidina, L-asparagina, D-xilosa, Tween 40, ácido a-cetoglutárico, sacarosa, L-glutamina, Tween 80, beta-metil-D-glucósido, maltotriosa, adenosinina, ácido fumárico, ácido bromosuccínico, L-serina, D-celobiosa, L-alanilglicina, piruvato de metilo, ácido L-málico, glicil-L-prolina, D-palcosa, L-lixosa, ácido pirúvico, alfa-D-lactosa, dextrina, D-arabinosa, 2-desoxi-D-ribosa, gelatina, dextrosa, almidón, 3-0-beta-D-galactopiranosil-D-arabinosa, D-tagatosa, ácido 5-ceto-D-glucónico, ácido oxalomálico, ácido sórbico, L-ornitina y dihidroxiacetato. En un aspecto, la fuente de carbono puede ser ácido D,L-málico, D-fructosa, D-xilosa, ácido fumárico, D-celobiosa, ácido 5-ceto-D-glucónico, ácido pirúvico, alfa-D-lactosa, dextrina de maíz, gelatina, almidón de maíz o almidón de trigo. La fuente de carbono puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 g l-1 a aproximadamente 60 g l-1 y hasta aproximadamente 200 g l-1.
132. En un ejemplo, el medio puede comprender aproximadamente 5 g de D-glucosa, aproximadamente 2 g de peptona y aproximadamente 2 g de extracto de levadura por litro de agua salada (natural o artificial). En otro, el medio puede comprender aproximadamente 60 g de D-glucosa, aproximadamente 10 g de extracto de levadura por litro de agua salada (natural o artificial). En otro, el medio puede comprender aproximadamente 8 g de extracto de levadura, 32 g de MSG, 24 g de agua marina (natural y artificial) y 300 g de D-glucosa por litro.
133. El medio puede comprender además fosfatos (p. ej., fosfato potásico y fosfatos sódicos). El medio puede comprender además sales inorgánicas (p. ej., sulfato amónico, bicarbonato sódico, ortovanadato sódico, cromato potásico, molibdato sódico, ácido selenioso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso). El medio puede comprender además un compuesto quelante (p. ej., EDTA). El medio puede comprender además vitaminas (p. ej., hidrocloruro de piridoxina, hidrocloruro de tiamina, pantotenato cálcico, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12). El medio puede estar a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,5.
134. La incubación puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 9 días (p. ej., de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 días). La incubación puede ser a de aproximadamente 18 a aproximadamente 30°C (p. ej., de aproximadamente 18-25°C). La incubación puede comprender además remoción o aireación.
135. El aislamiento del lípido puede comprender poner en contacto los microorganismos con un disolvente de extracción. El disolvente puede comprender uno o más disolventes elegidos de cloroformo, hexano, metanol o etanol, o CO2 supercrítico.
136. El método puede producir cualquiera de las composiciones que se divulgan anteriormente.
137. El microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende DHA n-3 en más de o igual a aproximadamente 20 g l-1 de medio. El microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende DHA n-3 en más de o igual a aproximadamente 40 g l-1 de medio. El microorganismo eucariótico puede producir una composición lipídica que comprende DHA n-3 en más de o igual a aproximadamente 80 g l-1 de medio.
2. Métodos de cribado e identificación
138. El microorganismo eucariótico que se divulga en la presente puede producir un lípido que contiene la serie (n-3) de ácido docosahexaenoico y ácido eicosapentaenoico y la serie (n-6) de DPA. Este microorganismo eucariótico se puede seleccionar, por ejemplo, con el siguiente método de cribado. Las muestras vegetativas se pueden introducir (y se introdujeron) en viales de 20 ml que contienen 10 ml de agua marina natural estéril filtrada a través de 0,2 pm que contiene penicilina y estreptomicina a 300 y 500 mg l-1, respectivamente. A continuación, los viales se cebaron con granos de polen estériles y se incubaron durante 48 horas a de 18 a 25°C. A continuación, los granos de polen se transfirieron sobre placas de agar que contenían antibióticos (como anteriormente) y se incubaron bajo las mismas condiciones. Se recogieron colonias hialinas irregulares individuales constituidas por células esféricas o limaciformes y atípicas de colonias de levadura o bacterianas y se subcultivaron sobre el mismo medio y bajo las mismas condiciones que anteriormente. A continuación, estos aislados se cribaron con respecto al crecimiento y los ácidos grasos usando un medio líquido nutritivo, preparado con agua marina natural filtrada a través de 0,2 pm que contenía 5 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de peptona y 2 g l-1 de extracto de levadura, con la biomasa celular resultante recogida mediante centrifugación o sedimentación dentro de un medio líquido. Los ácidos grasos se transesterificaron directamente usando métodos convencionales, con la composición de ésteres metílicos de ácidos grasos analizada a través de cromatografía de gases, con las cepas produciendo cantidades apropiadas de la serie n-3 de DHA y la serie n-6 de DPA seleccionadas para el trabajo adicional.
139. Se divulgan métodos para identificar un microorganismo eucariótico, comprendiendo el método: cebar una muestra vegetativa en agua salada (marina natural o artificial) con granos de polen e incubar; transferir los granos a un medio heterótrofo e incubar; e identificar aislados que producen ácidos grasos.
140. También se divulgan composiciones lipídicas producidas por los microorganismos eucarióticos identificados anteriormente.
141. También se divulgan composiciones lipídicas producidas por métodos que usan los microorganismos eucarióticos divulgados y los métodos divulgados en la presente.
142. También se divulgan microorganismos eucarióticos (ONC-T18) que tienen un número de registro de la American Type Culture Collection PTA-6245.
143. También se divulgan microorganismos eucarióticos pertenecientes al orden Thraustochytriales (ONC-T18) que tienen ARNr de 18S, tal como SEQ ID 1, e identificados como una Thraustochytrium sp.
144. También se divulga un microorganismo eucariótico, Thraustochytrium sp., capaz de producir DHA y DPA en concentraciones por encima de 400 mg l-1 y 100 mg l-1, respectivamente.
145. También se divulga un microorganismo eucariótico, Thraustochytrium sp., capaz de producir carotenoides a través de fermentación heterótrofa según se menciona anteriormente en el intervalo de 50 a 1250 mg kg-1 y astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona y beta-caroteno en el intervalo de 1 a 20 mg kg-1, de 0,25 a 10 mg kg-1, de 1 a 20 mg kg-1, de 1 a 20 mg kg-1 y de 1 a 200 mg kg-1, respectivamente.
146. También se divulgan procedimientos para hacer crecer un microorganismo eucariótico que comprenden cultivar el microorganismo eucariótico bajo unas condiciones, en donde las condiciones comprenden un medio que comprende cloruro sódico en la forma de sal marina artificial (marina trófica) entre 2,0 y 15,0 g l-1; una fuente de nitrógeno en la forma de extracto de levadura y glutamato monosódico en 2,0 y 8,0 g l-1 respectivamente; y carbono en la forma de glucosa hasta 130 g l-1.
147. Los procedimientos divulgados, por ejemplo, pueden hacer crecer ONC-T18, con lo que al menos 24% en peso es DHA, al menos 6% en peso es DPA y al menos 1% es EPA del ácido graso total.
148. Los procedimientos divulgados para el crecimiento, por ejemplo, también pueden hacer crecer ONC-T18 de modo que al menos 1% en peso sea material carotenoide, siendo de 1 a 2% y al menos 1,2% astaxantina, siendo de 0,25 y 1% y al menos 0,45% zeaxantina, siendo de 5 a 16% y al menos 9% cantaxantina, siendo de 1 a 2% y al menos 1,2% de eso equinenona y siendo de 12 a 16% y al menos 14% en peso beta-caroteno.
3. Ácidos nucleicos
149. Existe una variedad de moléculas divulgadas en la presente que se basan en ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, ARNr, así como cualesquiera otras proteínas divulgadas en la presente, así como diversos ácidos nucleicos funcionales. Los ácidos nucleicos divulgados están constituidos, por ejemplo, por nucleótidos, análogos de nucleótidos o derivados de nucleótidos. Ejemplos no limitativos de estas y otras moléculas se analizan en la presente. Se entiende que, por ejemplo, cuando un vector se expresa en una célula, el ARNm expresado estará constituido típicamente por A, C, G y U/T. Asimismo, se entiende que si, por ejemplo, se introduce una molécula antisentido en una célula o un ambiente celular a través de, por ejemplo, aporte exógeno, es ventajoso que la molécula antisentido esté constituida por análogos de nucleótidos que reduzcan la degradación de la molécula antisentido en el ambiente celular.
a) Nucleótidos y moléculas relacionadas
150. Un nucleótido es una molécula que contiene un resto de base, un resto de azúcar y un resto de fosfato. Los nucleótidos pueden estar enlazados entre sí a través de sus restos de fosfato y restos de azúcar creando un enlace internucleosídico. El resto de base de un nucleótido puede ser adenin-9-ilo (A), citosin-1-ilo (C), guanin-9-ilo (G), uracil-1-ilo (U) y timin-1-ilo (T). El resto de azúcar de un nucleótido es una ribosa o una desoxirribosa. El resto de fosfato de un nucleótido es fosfato pentavalente. Un ejemplo no limitativo de un nucleótido sería 3'-AMP (3'-monofosfato de adenosina) o 5'-GMP (5'-monofosfato de guanosina).
151. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación en los restos bien de base, bien de azúcar o bien de fosfato. Las modificaciones en los nucleótidos son muy conocidas en la técnica e incluirían, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina y 2-aminoadenina, así como modificaciones en los restos de azúcar o fosfato.
152. Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que tienen propiedades funcionales similares a los nucleótidos, pero no contienen un resto de fosfato, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán ácidos nucleicos en un modo de Watson-Crick o Hoogsteen, pero que están enlazadas entre sí a través de un resto distinto de un resto de fosfato. Los sustitutos de nucleótidos son capaces de ajustarse a una estructura de tipo doble hélice cuando interactúan con el ácido nucleico diana apropiado.
153. También es posible conectar otros tipos de moléculas (conjugados) a nucleótidos o análogos de nucleótidos para potenciar, por ejemplo, la captación celular. Los conjugados pueden estar químicamente conectados al nucleótido o los análogos de nucleótido. Estos conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol. (Letsinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989).
154. Una interacción de Watson-Crick es al menos una interacción con la cara de Watson-Crick de un nucleótido, un análogo de nucleótido o un sustituto de nucleótido. La cara de Watson-Crick de un nucleótido, un análogo de nucleótido o un sustituto de nucleótido incluye las posiciones C2, N1 y C6 de un nucleótido, un análogo de nucleótido o un sustituto de nucleótido basado en purina y las posiciones C2, N3, C4 de un nucleótido, un análogo de nucleótido o un sustituto de nucleótido basado en pirimidina.
155. Una interacción de Hoogsteen es una interacción que tiene lugar sobre la cara de Hoogsteen de un nucleótido o análogo de nucleótido, que está expuesta en la hendidura principal de ADN bicatenario. La cara de Hoogsteen incluye la posición N7 y los grupos reactivos (NH2 u O) en la posición C6 de nucleótidos de purina.
b) Secuencias
156. Existe una variedad de secuencias relacionadas con, por ejemplo, SEQ ID NO:1, así como cualesquiera otros ácidos nucleicos y proteínas divulgados en la presente que se puedan divulgar en Genbank, y estas secuencias y otras se incorporan en la presente mediante referencia en sus totalidades, así como para subsecuencias individuales contenidas en las mismas.
157. Se proporciona en la presente una variedad de secuencias y estas y otras se pueden encontrar en Genbank, en www.pubmed.gov. Los expertos en la técnica entenderán cómo resolver discrepancias y diferencias de secuencia y ajustar las composiciones y los métodos con relación a una secuencia particular con otras secuencias relacionadas.
Se pueden diseñar cebadores y sondas para cualquier secuencia, dada la información divulgada en la presente y conocida en la técnica.
c) Cebadores y sondas
158. Se divulgan composiciones que incluyen cebadores y sondas, que son capaces de interactuar con los genes divulgados en la presente. En ciertas realizaciones, los cebadores se usan para soportar reacciones de amplificación de ADN. Típicamente, los cebadores serán capaces de extenderse de un modo específico para la secuencia. La extensión de un cebador de un modo específico para la secuencia incluye cualesquiera métodos en los que la secuencia y/o la composición de la molécula de ácido nucleico a la que se hibrida o se asocia de otro modo el cebador dirija o influya en la composición o la secuencia del producto producido por la extensión del cebador. Por lo tanto, la extensión del cebador de un modo específico para la secuencia incluye, pero no se limita a, PCR, secuenciación de ADN, extensión de ADN, polimerización de ADN, transcripción de ARN o transcripción inversa. Se prefieren técnicas y condiciones que amplifiquen el cebador de un modo específico para la secuencia. En ciertos aspectos, los cebadores se pueden usar como sondas específicas de la especie o el género para el Thraustochytrium o Bacillus mencionados en la presente. En este caso, los cebadores se diseñarían para ser específicos para el microorganismo eucariótico, con reacciones PCR llevadas a cabo posteriormente. La presencia de especies diana se determinaría a continuación mediante la formación satisfactoria de productos de PCR. En ciertos aspectos, los cebadores también se pueden usar para reacciones de amplificación de ADN, tales como PCR o secuenciación directa. Se entiende que en ciertos aspectos los cebadores también se pueden extender usando técnicas no enzimáticas, donde, por ejemplo, los nucleótidos u oligonucleótidos usados para extender el cebador se modifican de modo que reaccionen químicamente con el cebador de un modo específico para la secuencia. Típicamente, los cebadores divulgados se hibridan con el ácido nucleico o la región del ácido nucleico o se hibridan con el complemento del ácido nucleico o el complemento de una región del ácido nucleico.
d) Aporte de Ácidos Nucleicos
159. En los métodos descritos anteriormente que incluyen la administración y la captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos divulgados pueden estar en la forma de ADN o ARN desnudo, o los ácidos nucleicos pueden estar en un vector para aportar los ácidos nucleicos a las células, con lo que el fragmento de ADN codificante de anticuerpo está bajo la regulación transcripcional de un promotor, como será entendido por un experto normal en la técnica. El vector puede ser una preparación disponible comercialmente, tal como un vector adenoviral (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canadá). El aporte del ácido nucleico o el vector a las células puede ser a través de una variedad de mecanismos. Como un ejemplo, el aporte puede ser a través de un liposoma, usando preparaciones liposómicas disponibles comercialmente tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como otros liposomas desarrollados según procedimientos estándar en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector divulgado se puede aportar in vivo mediante electroporación, la tecnología para la cual está disponible de Genetronics, Inc. (San Diego, CA) así como por medio de una máquina SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).
160. Como un ejemplo, el aporte del vector puede ser a través de un sistema viral, tal como un sistema de vector retroviral que puede empaquetar un genoma viral recombinante (véase, p. ej., Pastan y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4486, 1988; Miller y cols., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986). El retrovirus recombinante se puede usar a continuación para infectar y de ese modo aportar a las células infectadas ácido nucleico que codifica un anticuerpo ampliamente neutralizador (o uno de sus fragmentos activos). El método exacto para introducir el ácido nucleico alterado en células de mamífero, por supuesto, no se limita al uso de vectores retrovirales. Otras técnicas están ampliamente disponibles para este procedimiento incluyendo el uso de vectores adenovirales (Mitani y cols., Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994), vectores virales adenoasociados (AAV) (Goodman y cols., Blood 84:1492-1500, 1994), vectores lentivirales (Naidini y cols., Science 272:263-267, 1996), vectores retrovirales pseudotipados (Agrawal y cols., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996). También se pueden usar técnicas de transducción física, tales como aporte de liposomas y mecanismos mediados por receptores y otros mecanismos de endocitosis (véase, por ejemplo, Schwartzenberger y cols., Blood 87:472-478, 1996). Estas composiciones y métodos divulgados se pueden usar junto con cualquiera de estos y otros métodos de transferencia génica usados comúnmente.
4. Sistemas de expresión
161. Los ácidos nucleicos que se aportan a células contienen típicamente sistemas de control de la expresión. Por ejemplo, los genes insertados en sistemas virales y retrovirales contienen habitualmente promotores y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando están en una localización relativamente fija con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Un promotor contiene elementos centrales requeridos para la interacción básica de ARN polimerasa y factores de transcripción, y puede contener elementos aguas arriba y elementos de respuesta.
162. Se entiende que existe una variedad de sistemas de control de la transcripción que se pueden usar en los organismos divulgados en la presente, además de los sistemas generales analizados posteriormente. Se entiende que los organismos divulgados en la presente se pueden transfectar y transformar con una variedad de genes, tales como genes marcadores, según se analiza en la presente, o genes que tienen otros atributos deseables, tales como características de crecimiento potenciadas o únicas.
a) Promotores y Potenciadores Virales
163. Promotores preferidos que controlan la transcripción a partir de vectores en células anfitrionas de mamífero se pueden obtener a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus símico 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-B y lo más preferiblemente citomegalovirus, o a partir de promotores de mamífero heterólogos, p. ej. promotor de actina beta. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Tiers y cols., Nature, 273:113, 1978). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E (Greenway, P.J. y cols., Gene 18:355-360, 1982). Por supuesto, también son útiles en la presente promotores procedentes de la célula anfitriona o especies relacionadas.
164. Potenciador se refiere generalmente a una secuencia de ADN que funciona a una distancia no fijada del sitio de inicio de la transcripción y puede estar bien 5' (Laimins, L. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993, 1981) o bien 3' (Lusky, M.L., y cols., Mol. Cell Bio. 3:1108, 1983) con respecto a la unidad de transcripción. Por otra parte, los potenciadores también pueden estar dentro de un intrón (Banerji, J.L. y cols., Cell 33:729, 1983) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., y cols., Mol. Cell Bio. 4:1293, 1984). Habitualmente, tienen una longitud entre 10 y 300 bp y funcionan en cis. Los potenciadores funcionan para incrementar la transcripción a partir de promotores próximos. Los potenciadores también contienen a menudo elementos de respuesta que median en la regulación de la transcripción. Los promotores también pueden contener elementos de respuesta que median en la regulación de la transcripción. Los potenciadores a menudo determinan la regulación de la expresión de un gen. Aunque se conocen ahora muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina), típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de células eucariotas para la expresión general. Ejemplos preferidos son el potenciador de SV40 en la cara final del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma o la cara final del origen de replicación, y potenciadores adenovirales.
165. El promotor y/o el potenciador se pueden activar específicamente bien mediante luz o bien mediante episodios químicos específicos que activan su función. Los sistemas pueden ser regulados por reactivos tales como tetraciclina y dexametasona. También existen modos de potenciar la expresión de genes de vectores virales mediante la exposición a irradiación, tal como irradiación gamma, o fármacos quimioterapéuticos alquilantes.
166. En ciertas realizaciones, la región promotora y/o potenciadora puede actuar como un promotor y/o potenciador constitutivo para maximizar la expresión de la región de la unidad de transcripción que se va a transcribir. En ciertas construcciones, la región promotora y/o potenciadora será activa en todos los tipos de células eucarióticas, aunque solo se exprese en un tipo de célula particular en un momento particular. Un promotor preferido de este tipo es el promotor de CMV (650 pb). Otros promotores preferidos son promotores de SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa) y vector retroviral LTF.
167. Se ha mostrado que todos los elementos reguladores específicos se pueden clonar y usar para construir vectores de expresión que se expresan selectivamente en tipos de células específicos tales como células de melanoma. El promotor de la proteína acética fibrilar glial (GFAP) se ha usado para expresar selectivamente genes en células de origen glial.
168. Los vectores de expresión usados en células anfitrionas eucarióticas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, ser humano o nucleadas) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar a la expresión de ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica proteína de factor tisular. Las regiones no traducidas 3' también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Se prefiere que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que incrementa la probabilidad de que la unidad transcrita se procese y se transporte como ARNm. La identificación y el uso de señales de poliadenilación en construcciones de expresión está bien establecida. Se prefiere que se usen señales de poliadenilación homólogas en las construcciones transgénicas. En ciertas unidades de transcripción, la región de poliadenilación se deriva de la señal de poliadenilación temprana de SV40 y consiste en aproximadamente 400 bases. También se prefiere que las unidades transcritas contengan otras secuencias estándar solas o en combinación con las secuencias anteriores mejoran la expresión a partir de, o la estabilidad de, la construcción.
b) Marcadores
169. Los vectores virales pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto marcador. Este producto marcador se usa para determinar si el gen se ha aportado a la célula y, una vez que se aporta, se expresa. Genes marcadores preferidos son el gen lacZde E. coli, que codifica p-galactosidasa, y proteína fluorescente verde.
170. En algunas realizaciones, el marcador puede ser un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina cinasa, neomicina, análogo de neomicina G418, hidromicina y puromicina. Cuando estos marcadores seleccionables se transfieren satisfactoriamente a una célula anfitriona de mamífero, la célula anfitriona de mamífero transformada puede sobrevivir si se pone bajo presión selectiva. Existen dos categorías distintas de regímenes selectivos usadas ampliamente. La primera categoría se basa en un metabolismo de la célula y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad para crecer independientemente de un medio complementado. Dos ejemplos son: células CHO DHFR- y células LTK. Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta de síntesis de nucleótidos completa, no pueden sobrevivir a menos que los nucleótidos faltantes se proporcionen en un medio complementado. Una alternativa a complementar el medio es introducir un gen DHFR o TK intacto en células que carecen de los genes respectivos, alterando así sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaran con el gen DHFR o TK no serían capaces de sobrevivir en medios no complementados.
171. La segunda categoría es la selección dominante que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo de célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos esquemas usan típicamente un fármaco para detener el crecimiento de una célula anfitriona. Las células que tienen un nuevo gen expresarían una proteína que transmita resistencia al fármaco y sobreviva a la selección. Ejemplos de esta selección dominante usan los fármacos neomicina, (Southern P. y Berg, P., J Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982), ácido micofenólico, (Mulligan, R.C. y Berg, P. Science 209:1422, 1980) o higromicina, (Sugden, B. y cols., Mol. Cell. Biol. 5:410-413, 1985). Los tres ejemplos emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para transmitir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente. Otros incluyen el análogo de neomicina G418 y puramicina.
5. Péptidos
a) Variantes de proteínas
172. Según se analiza en la presente, existen numerosas variantes de las proteínas del organismo divulgado que son conocidas y se contemplan en la presente. Además, de la cepa Thraustochytriales funcional conocida, existen derivados de las proteínas de Thraustochytriales que también funcionan en los métodos y las composiciones divulgados. Variantes y derivados de proteínas son muy conocidos por los expertos en la técnica y pueden implicar modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos se encuentran dentro de una o más de tres clases: variantes de sustitución, inserción o eliminación. Las inserciones incluyen fusiones amino- y/o carboxiloterminales así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido individuales o múltiples. Normalmente, las inserciones serán menores que las de las fusiones amino- o carboxiloterminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Derivados de proteínas de fusión inmunogénicas, tales como los descritos en los ejemplos, se elaboran al fusionar un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana al reticular in vitro o mediante cultivo celular recombinante transformado con ADN que codifica la fusión. Las eliminaciones se caracterizan por la retirada de uno o más residuos de aminoácido de la secuencia proteínica. Típicamente, no se eliminan más de aproximadamente 2 a 6 residuos en un sitio cualquiera dentro de la molécula proteínica. Estas variantes se preparan habitualmente mediante mutagénesis de nucleótidos específica del sitio en el ADN que codifica la proteína, produciendo de ese modo ADN que codifica la variante, y posteriormente expresando el ADN en cultivo celular recombinante. Son bien conocidas las técnicas para formar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero se pueden producir en un número de localizaciones diferentes a la vez; habitualmente las inserciones serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácido; y las eliminaciones variarán aproximadamente de 1 a 30 residuos. Preferiblemente, las eliminaciones o las inserciones se realizan en pares adyacentes, es decir una eliminación de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquiera de sus combinaciones se pueden combinar para llegar a una construcción final. Las mutaciones no deben sacar a la secuencia del marco de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura secundaria de ARNm. Las variantes de sustitución son aquellas en las que se ha retirado al menos un residuo y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Estas sustituciones se realizan generalmente según las Tablas 1 y 2 siguientes y se denominan sustituciones conservativas.
173. Se realizan cambios sustanciales en la función o la identidad inmunológica al seleccionar sustituciones que sean menos conservativas que las de la Tabla 2, es decir, seleccionar residuos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o la hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Se espera en general que las sustituciones que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la proteína sean aquellas en las que (a) un residuo hidrófilo, p. ej. serilo o treonilo, sustituya a (o sea sustituido por) un residuo hidrófobo, p. ej. leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina sustituya a (o sea sustituida por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histidilo, sustituya a (o sea sustituido por) un residuo electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, sustituya a (o sea sustituido por) uno que tiene una cadena lateral, p. ej., glicina, en este caso, (e) al incrementar el número de sitios para sulfatación y/o glicosilación.
TABLA 1: Abreviaturas de Aminoácidos
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TABLA 2: Sustituciones de Aminoácidos
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174. Por ejemplo, la sustitución de un residuo de aminoácido por otro que sea biológicamente y/o químicamente similar es conocida por los expertos en la técnica como una sustitución conservativa. Por ejemplo, una sustitución conservativa sería reemplazar un residuo hidrófobo por otro o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Estas variaciones sustituidas conservativamente de cada secuencia divulgada explícitamente se incluyen dentro de los polipéptidos de mosaico proporcionados en la presente.
175. Se puede emplear mutagénesis de sustitución o eliminación para insertar sitios para N-glicosilación (Asn-X-Thr/Ser) u O-glicosilación (Ser o Thr). Las eliminaciones de cisteína u otros residuos lábiles también pueden ser deseables. Las eliminaciones o sustituciones de sitios de proteólisis potencial, p. ej. Arg, se efectúan, por ejemplo, al eliminar uno de los residuos básicos o sustituir uno por residuos de glutaminilo o histidilo.
176. Ciertas derivaciones postraduccionales son el resultado de la acción de células anfitrionas recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan postraduccionalmente hasta los correspondientes residuos de glutamilo y asparilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones suavemente ácidas. Otras modificaciones postraduccionales incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos oamino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86, 1983), la acetilación de la amina N-terminal y, en algunos casos, la amidación del carboxilo C-terminal.
177. Se entiende que un modo de definir las variantes y los derivados de las proteínas divulgadas en la presente es a través de la definición de las variantes y los derivados en cuanto a homología/identidad con secuencias conocidas específicas. Se divulgan específicamente variantes de proteínas divulgadas en la presente que tienen al menos 60%, 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% de homología con la secuencia indicada. Los expertos en la técnica entienden fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología se puede calcular después de alinear las dos secuencias de modo que la homología está a su nivel más alto.
178. Otro modo de calcular la homología se puede realizar mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede efectuar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J Mal. Biol. 48: 443, 1970, mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, mediante ejecuciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BeSt FiT, PASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
179. Los mismos tipos de homología se pueden obtener para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, M Science 244:48-52, 1989, Jaeger y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger y cols. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989.
180. Se entiende que la descripción de mutaciones conservativas y la homología se puede combinar conjuntamente en cualquier combinación, tal como realizaciones que tienen al menos 70% de homología con una secuencia particular en las que las variantes son mutaciones conservativas.
181. Como esta memoria descriptiva analiza diversas proteínas y secuencias proteínicas, se entiende que también se divulgan los ácidos nucleicos que pueden codificar esas secuencias proteínicas. Esto incluiría todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia proteínica específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia proteínica particular así como todos los ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y los derivados divulgados de las secuencias proteínicas. Así, aunque cada secuencia de ácido nucleico particular pueda no estar escrita en la presente, se entiende que todas y cada una de las secuencias se divulgan y describen de hecho en la presente a través de la secuencia proteínica divulgada. También se entiende que aunque ninguna secuencia de aminoácidos indique qué secuencia de ADN particular codifica esa proteína dentro de un organismo, cuando se divulgan en la presente variantes particulares de una proteína divulgada, la secuencia de ácido nucleico conocida que codifica esta proteína en la cepa particular a partir de la cual surge esa proteína también se conoce y se divulga y describe en la presente.
182. Se entiende que existen numerosos análogos de aminoácidos y péptidos que se pueden incorporar en las composiciones divulgadas. Por ejemplo, existen numerosos D-aminoácidos o aminoácidos que tienen un sustituyente funcional diferente que los aminoácidos mostrados en la Tabla 1 y la Tabla 2. Se divulgan los estereoisómeros opuestos de péptidos presentes en la naturaleza, así como los estereoisómeros de análogos peptídicos. Estos aminoácidos se pueden incorporar fácilmente en cadenas polipeptídicas al cargar moléculas de ARNt con el aminoácido de elección y manipular construcciones genéticas que utilizan, por ejemplo, codones ámbar, para insertar el aminoácido análogo en una cadena peptídica de un modo específico del sitio (Thorson y cols., Methods in Mal. Biol. 77:43-73, 1991, Zoller, Curr. Opin. Biotech., 3:348-354, 1992; Ibba, Biotechnol. Genet. Eng. 13:197-216, 1995, Cahill y cols., Trends Biochem. Sci., 14:400-403, 1989; Benner, Trends. Biotechnol, 12: 158-163, 1994).
183. Se pueden producir moléculas que se asemejan a péptidos, pero que no están conectados a través de un enlace peptídico natural. Por ejemplo, enlaces para aminoácidos o análogos de aminoácidos pueden incluir CH2NH-, -CH2S-, -CHrCH2 -CH= CH-(cis y trans), -COCH2 - CH(OH)CHr y -CHH2SO- .(Estos y otros se pueden encontrar en Spatola, A F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York p. 267, 1983; Spatola, A.F., Vega Data (Marzo 1983), Vol. 1, Edición 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm. Sci. 463-468, 1980; Hudson, D. y cols., Int. J Pept. Prat. Res.
14:177-185, 1979 (-CH2NH-, CH2CH2 -); Spatola y cols. Life Sci. 38:1243-1249, 1986 (-CH H2-S); HannJ Chem. Soc. Perkin Trans. 1307-314, 1982 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist y cols. J Med. Chem. 23:1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White y cols. Tetrahedron Lett., 23:2533, 1982 (-COCHr); Szelke y cols. European Appln., EP 45665 CA: 97:39405, 1982 (-CH(OH)CHr); Holladía y cols. Tetrahedron Lett. 24:4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2-); y Hruby Life Sci. 31:189-199, 1982 (-CH2-S-).
Un enlace no peptídico particularmente preferido es -CH2NH-. Se entiende que los análogos peptídicos pueden tener más de un átomo entre los átomos de la unión, tales como beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico y similares.
184. Los análogos de aminoácidos y los análogos y análogos peptídicos tienen a menudo propiedades potenciadas o deseables, tales como una producción más económica, una mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.) intensificadas, especificidad alterada (p. ej., un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida, y otras.
185. Se pueden usar D-aminoácidos para generar péptidos más estables, debido a que los D-aminoácidos no son reconocidos por peptidasas y similares. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar péptidos más estables. Se pueden usar residuos de cisteína para ciclar o ligar dos o más péptidos entre sí. Esto puede ser beneficioso para restringir péptidos en conformaciones particulares. (Rizo y GieraschAnn. Rev. Biochem.
61:387, 1992).
6. Complementos
186. También se divulgan en la presente complementos nutricionales. Un complemento nutricional es cualquier compuesto o composición que se pueda administrar a o ser tomado por un sujeto para proporcionar, suministrar o incrementar un nutriente o nutrientes (p. ej., vitamina, mineral, elemento vestigial esencial, aminoácido, péptido, ácido nucleico, oligonucleótido, lípido, colesterol, esteroide, carbohidrato y similares). En un aspecto, se divulgan en la presente complementos nutricionales que comprenden cualquiera de los compuestos divulgados en la presente. Por ejemplo, un complemento nutricional puede comprender cualquiera de los lípidos divulgados en la presente. Los residuos de ácido graso de estos lípidos pueden ser cualquier ácido graso que se divulgue en la presente (p. ej., residuos de ácidos grasos insaturados o saturados).
187. El complemento nutricional puede comprender cualquier cantidad de los compuestos divulgados en la presente, pero típicamente contendrá una cantidad determinada para suministrar a un sujeto una dosis deseada de derivado de a-bencenodiol (p. ej., CoQ10)) y/o ácidos grasos. La cantidad exacta de compuesto requerida en el complemento nutricional variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad, el peso y la condición general del sujeto, la gravedad de la deficiencia alimentaria que se trate, el modo particular de administración, y similares. Así, no es posible especificar una cantidad exacta para cada complemento nutricional. Sin embargo, una cantidad apropiada puede ser determinada por un experto normal en la técnica usando solo una experimentación habitual dadas las enseñanzas de la presente. En un ejemplo específico, un complemento nutricional puede comprender de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 20%, de aproximadamente 1 a aproximadamente 7,5% o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5% en peso del compuesto. En otro ejemplo, el complemento nutricional puede comprender de aproximadamente 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, o 20,0% en peso del compuesto, donde cualquiera de los valores indicados puede formar un punto final superior o inferior cuando sea apropiado. En otro aspecto, cuando el complemento nutricional, el complemento puede estar compuesto por hasta 100% del complemento.
188. El complemento nutricional también puede comprender otros nutrientes tales como vitaminas, elementos vestigiales, minerales y similares. Además, el complemento nutricional puede comprender otros componentes tales como conservantes, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión y/o aglutinantes.
189. Generalmente, los complementos nutricionales se toman oralmente y pueden estar en cualquier forma adecuada para la administración oral. Por ejemplo, un complemento nutricional puede ser típicamente un comprimido, una cápsula de gelatina, una cápsula, un líquido, saquitos o en forma de jarabe.
7. Dispositivos de Aporte
190. Cualquiera de los compuestos descritos en la presente se puede incorporar en un dispositivo de aporte. Ejemplos de dispositivos de aporte incluyen, pero no se limitan a, microcápsulas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas, liposomas, un noisoma, un nanoeritrosoma, nanopartículas sólidas-líquidas, geles, cápsulas de gelatina, comprimidos, lociones, cremas, aerosoles o emulsiones. Otros ejemplos de dispositivos de aporte que son adecuados para administración no oral incluyen pulmoesferas. Ejemplos de dispositivos de aporte particulares útiles en la presente se describen posteriormente.
191. Los compuestos divulgados se pueden incorporar en liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Los liposomas se forman mediante cristales líquidos hidratados mono- o multilaminares que están dispersados en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lípido atóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las composiciones divulgadas en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto divulgado en la presente, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Ejemplos de lípidos adecuados son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Se conocen en la técnica métodos para formar liposomas. Véase, p. ej., Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volumen XIV, Academic Press, Nueva York, p. 33 y siguientes; 1976.
192. En otros ejemplos, los liposomas pueden ser liposomas catiónicos (p. ej., DOTMA, DOPE, DC colesterol) o liposomas aniónicos. Los liposomas pueden comprender además proteínas para facilitar la elección de una célula particular, si se desea. La administración de una composición que comprende un compuesto y un liposoma catiónico se puede administrar a la sangre aferente a un órgano diana o inhalarse en el tracto respiratorio hasta células diana del tracto respiratorio. En cuanto a los liposomas, véanse, p. ej., Brigham, y cols, Am J Resp Cell Mal Biol 1:95-100, 1989; Feigner y cols., Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7, 1987; y la Pat. EE. UU. N° 4.897.355. Como un ejemplo, el aporte puede ser a través de un liposoma usando preparaciones liposómicas disponibles comercialmente tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como otros liposomas desarrollados según procedimientos estándar en la técnica. También se pueden usar liposomas en los que la difusión del compuesto o el aporte del compuesto desde el liposoma está diseñada para una velocidad o dosificación específica.
193. Según se describen en la presente, los noisomas son dispositivos de aporte que se pueden usar para aportar las composiciones divulgadas en la presente. Los noisomas son vesículas multilaminares o unilaminares que implican tensioactivos iniónicos. Una solución acuosa de soluto está encerrada por una bicapa resultante de la organización de macromoléculas de tensioactivo. Similares a los liposomas, los noisomas se usan en el aporte dirigido de, por ejemplo, fármacos anticancerosos, incluyendo metotrexato, doxorrubicina e inmunoadyuvantes. Se entiende generalmente que son diferentes de los transferosomas, vesículas preparadas a partir de polímeros anfifílicos que contienen grupos carbohidrato y amino, p. ej., quitosano.
194. Según se describe en la presente, los nanoeritrosomas son dispositivos de aporte que se pueden usar para aportar las composiciones divulgadas en la presente. Los nanoeritrosomas son nanovesículas formadas por glóbulos rojos mediante diálisis a través de filtros de tamaño de poro definido. Estas vesículas se pueden cargar con una serie diversa de moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas y las composiciones divulgadas en la presente. Generalmente, sirven como portadores ideales para agentes antineoplásticos como bleomicina, actinomicina D, pero se pueden usar para esteroides, otros lípidos, etc.
195. Los glóbulos rojos artificiales, según se describen en la presente, son dispositivos de aporte adicionales que se pueden usar para aportar las composiciones divulgadas en la presente. Los glóbulos rojos artificiales se pueden generar mediante métodos en emulsión con polimerización interfacial. Generalmente, la pared "celular" está formada por polímero de poliftaloil-L-lisina/poliestireno y el núcleo está formado por una solución de hemoglobina procedente de hemolisado de oveja. Las microesferas cargadas con hemoglobina tienen típicamente tamaños de partícula de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm. Su tamaño, flexibilidad y capacidad de transporte de oxígeno son similares a los glóbulos rojos.
196. Las nanopartículas lipídicas sólidas, según se describen en la presente, son otros dispositivos de aporte que se pueden usar para aportar las composiciones divulgadas en la presente. Las nanopartículas lipídicas sólidas son nanopartículas, que están dispersadas en una solución acuosa de tensioactivo. Están comprendidas por un núcleo hidrófobo que tiene una monocapa de un revestimiento fosfolipídico y se preparan habitualmente mediante técnicas de homogenización a alta presión. Los complejos inmunomoduladores (ISCOMS) son ejemplos de nanopartículas lipídicas sólidas. Son montajes supramoleculares de 40 nm en forma de jaula que comprenden fosfolípido, colesterol y antígenos hidrófobos y se usan principalmente como inmunoadyuvantes. A modo de ejemplo, los ISCOMs se usan para prolongar los niveles en plasma sanguíneo de ciclosporina inyectada subcutáneamente.
197. Las microesferas y las microcápsulas, según se describen en la presente, son otros dispositivos de aporte más que se pueden usar para aportar las composiciones divulgadas en la presente. En contraste con los sistemas de aporte liposómicos, las microesferas y las microcápsulas típicamente no tienen un núcleo acuoso sino una matriz o membrana de polímero sólido. Estos dispositivos de aporte se obtienen mediante precipitación controlada de polímeros, reticulación química de polímeros solubles y polimerización interfacial de dos monómeros o técnicas de homogeneización a alta presión. El compuesto encapsulado se libera gradualmente del depósito mediante erosión o difusión desde las partículas. Se han desarrollado formulaciones satisfactorias de péptidos de acción corta, tales como agonistas de LHRH como leuprorelina y triptorelina. Las microesferas de poli(láctido-co-glicólido (PLGA) se usan actualmente como formas de dosificación mensuales y trimensuales en el tratamiento del cáncer de próstata avanzado, la endometriosis y otras afecciones sensibles a hormonas. La leuprolida, un superagonista de LHRH, se incorporaba en una variedad de matrices de PLGA usando un método de extracción/evaporación de disolvente. Según se apunta, todos estos dispositivos de aporte se pueden usar en los métodos divulgados en la presente.
198. Las pulmoesferas son otros ejemplos adicionales de dispositivos de aporte que se pueden usar en la presente. Las pulmoesferas son partículas porosas huecas con una baja densidad (menos de aproximadamente 0,1 m ml-1). Típicamente, las pulmoesferas tienen una excelente redispersabilidad y se preparan habitualmente mediante tecnología de condensación de fluidos supercríticos. El secado por copulverización con ciertas matrices, tales como carbohidratos, albúmina sérica humana, etc., puede mejorar la estabilidad de proteínas y péptidos (p. ej., insulina) y otras biomoléculas para aporte pulmonar. Este tipo de aporte también se podría efectuar con microemulsiones, que son emulsiones de aceite en agua (o/w) transparentes, diluidas, ultrafinas formadas espontáneamente sin entrada significativa de energía mecánica. En esta técnica, una emulsión se puede preparar a una temperatura que debe ser superior que la temperatura de inversión de fase del sistema. A temperatura elevada, la emulsión es de tipo agua en aceite (w/o) y a medida que se enfría a la temperatura de inversión de fase, esta emulsión se invierte para volverse o/w. Debido a su fase interna muy pequeña, son extremadamente estables y se usan para la liberación sostenida de esteroides y vacunas. Las emulsiones lipídicas comprenden un núcleo lipídico neutro (es decir, triglicéridos) estabilizado mediante una monocapa de lípido anfifílico (es decir, fosfolípido) usando tensioactivos como triglicéridos de lecitina de huevo y migliol. Son adecuadas para la orientación pasiva y activa.
199. Existen otros sistemas de aporte oral bajo investigación que se basan en la modulación de la presión osmótica, la modulación del pH, la modulación del hinchamiento, sistemas de densidad y flotación alteradas, mucoadhesividad etc. Estas formulaciones y formulaciones retardadas para aportar f divulgadosla presente, los en aplicar para el aporte de las sidas, plo, los r o inferior cuando sea apropiado. En otro les se pármacos según el ritmo circadiano de la enfermedad que actualmente se usan o investigan se pueden aplicar para el aporte de las composiciones divulgadas en la presente.
200. En un aspecto particular divulgado en la presente, los compuestos divulgados, incluyendo el complemento nutricional y sus formulaciones farmacéuticas, se pueden incorporar en microcápsulas como las descritas en la presente.
201. En un aspecto divulgado en la presente, los compuestos divulgados se pueden incorporar en microcápsulas. En un aspecto, la microcápsula comprende una aglomeración de microcápsulas primarias y los compuestos de cromo descritos en la presente, teniendo cada microcápsula primaria individual una envuelta primaria, en donde el compuesto de cromo está encapsulado por la envuelta primaria, en donde la aglomeración está encapsulada por una envuelta externa. Estas microcápsulas se denominan en la presente "microcápsulas multinucleares".
202. En otro aspecto, se describen en la presente microcápsulas que comprenden un compuesto de cromo, una envuelta primaria y una envuelta secundaria, en donde la envuelta primaria encapsula el compuesto de cromo y la envuelta secundaria encapsula la sustancia de carga y la envuelta primaria. Estas microcápsulas se denominan en la presente "microcápsulas mononucleares”.
203. Opcionalmente, otras sustancias de carga se pueden encapsular con el compuesto de cromo. La sustancia de carga puede ser cualquier sustancia que no sea totalmente soluble en la mezcla acuosa. En un aspecto, la sustancia de carga es un sólido, un líquido hidrófobo o una mezcla de un sólido y un líquido hidrófobo. En otro aspecto, la sustancia de carga comprende una grasa, un aceite, un lípido, un fármaco (p. ej., una molécula pequeña), una sustancia biológicamente activa, un complemento nutricional (p. ej., vitaminas), un compuesto aromatizante, o una de sus mezclas. Ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, aceites animales (p. ej., aceite de pescado, aceite de mamíferos marinos, etc.), aceites vegetales (p. ej., Canola o colza), aceites minerales, sus derivados o sus mezclas. La sustancia de carga puede ser una sustancia oleosa purificada o parcialmente purificada tal como un aceite graso, un triglicérido o uno de sus ésteres, o una de sus mezclas. En otro aspecto, la sustancia de carga puede ser un carotenoide (p. ej., licopeno), un agente saciante, un compuesto aromatizante, un fármaco (p. ej., un fármaco insoluble en agua), un material en partículas, un producto químico agrícola (p. ej., herbicidas, insecticidas, fertilizantes) o un ingrediente de acuicultura (p. ej., pienso, pigmento).
204. En un aspecto, la sustancia de carga puede ser un ácido graso omega-3. Ejemplos de ácidos grasos omega-3 incluyen, pero no se limitan a, ácido a-linolénico (18:3n3), ácido octadecatetraenoico (18:4n3), ácido eicosapentaenoico (20:5n3) (EPA), ácido docosahexaenoico (22:6n3) (DHA), ácido docosapentaenoico (22:5n3) (DPA), ácido eicosatetraenoico (20:4n3), ácido uncosapentaenoico (21:5n3), ácido docosapentaenoico (22:5n3) y sus derivados y sus mezclas. Muchos tipos de derivados de ácidos grasos omega-3 son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de derivados adecuados incluyen, pero no se limitan a, ésteres, tales como ésteres de fitosterol, ésteres alquílicos C1-C30 ramificados o no ramificados, ésteres alquenílicos C2-C30 ramificados o no ramificados o ésteres cicloalquílicos C3-C30 ramificados o no ramificados tales como ésteres de fitosterol y ésteres alquílicos C1-C6. Las fuentes de aceites se pueden derivar de organismos acuáticos (p. ej., anchoas, capelán, bacalao del Atlántico, arenque del Atlántico, caballa del Atlántico, sábalo del Atlántico, salmónidos, sardinas, tiburón, atún, etc.) y plantas (p. ej., lino, hortalizas, etc.) y microorganismos (p. ej., hongos y algas).
205. En un aspecto, la sustancia de carga puede contener un antioxidante. Ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, vitamina E, CoQ10, tocoferoles, derivados liposolubles de antioxidantes más polares tales como esteres ascorbílicos de ácidos grasos (p. ej., palmitato de ascorbilo), extractos vegetales (p. ej., aceites de romero, salvia y orégano), extractos algáceos y antioxidantes sintéticos (p. ej., BHT, TBHQ, etoxiquina, galatos de alquilo, hidroquinonas, tocotrienoles).
206. Un número de diferentes polímeros se puede usar para producir las capas de envuelta de las microcápsulas mono- y multinucleares. Ejemplos de estos polímeros incluyen, pero no se limitan a, una proteína, un polifosfato, un polisacárido, o una de sus mezclas. En otro aspecto, el material de envuelta usado para preparar las microcápsulas mono- y multinucleares comprende, además. En otro aspecto, el material de envuelta usado para preparar las microcápsulas mono- y multinucleares comprende además gelatina tipo A, gelatina tipo B, polifosfato, goma arábiga, alginato, quitosano, carragenina, pectina, almidón, almidón modificado, alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobulina, ovoalbúmina, polisorbitano, maltodextrinas, ciclodextrinas, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, proteína de la leche, proteína de suero, proteína de soja, proteína de colza, albúmina, quitina, poliláctidos, poli-láctido-co-glicólidos, quitina derivada, quitosano, polilisina, diversos materiales compuestos inorgánicos-orgánicos, o cualquiera de sus mezclas. También se contempla que se puedan usar asimismo derivados de estos polímeros. En otro aspecto, el polímero puede ser gelatina kosher, gelatina no kosher, gelatina halalo gelatina no halal.
207. En un aspecto, una o más de las capas de envuelta en las microcápsulas mono- y multinucleares comprende gelatina que tiene un número de Bloom menor de 50. Esta gelatina se denomina en la presente "gelatina de bajo Bloom". El número de Bloom describe la resistencia del gel formado a 10°C con una solución al 6,67% gelificada durante 18 horas. En un aspecto, la gelatina de bajo Bloom tiene un número de Bloom menor de 40, menor de 30, menor de 20 o menor de 10. En otro aspecto, la gelatina tiene un número de Bloom de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0, donde dos valores cualesquiera se pueden usar para producir un intervalo. En otro aspecto, la gelatina de bajo Bloom está tanto en la envuelta primaria como en la envuelta externa de la microcápsula multinuclear. En un aspecto, la gelatina de bajo Bloom es gelatina tipo A. En otro aspecto, la gelatina de bajo Bloom es gelatina tipo A producida por Kenney & Ross Ltd., R.R. #3 Shelburne, NS Canadá. En otro aspecto, la gelatina que tiene un número de Bloom de cero está tanto en la envuelta primaria como en la envuelta externa de la microcápsula multinuclear.
208. En un aspecto, el material usado para formar las envueltas de las microcápsulas mono- o multinucleares es un sistema de dos componentes formado por una mezcla de dos tipos diferentes de polímeros. En un aspecto, el material es un coacervado complejo entre los componentes poliméricos. La coacervación compleja está provocada por la interacción entre dos polímeros opuestamente cargados. En un aspecto, el material de envuelta usado para producir las microcápsulas mono- y multinucleares está compuesto por (1) gelatina de bajo Bloom y (2) gelatina tipo B, polifosfato, goma arábiga, alginato, quitosano, carragenina, pectina, carboximetilcelulosa, proteína de suero, proteína de soja, proteína de colza, albúmina, o una de sus mezclas. La relación molar de los diferentes polímeros puede variar. Por ejemplo, la relación molar de gelatina de bajo Bloom al otro componente polimérico es de 1:5 a 15:1. Por ejemplo, cuando se usan gelatina de bajo Bloom y polifosfato, la relación molar de gelatina de bajo Bloom a polifosfato es de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 12:1; cuando se usan gelatina de bajo Bloom y gelatina de tipo B, la relación molar es de 2:1 a 1:2; y cuando se usan gelatina de bajo Bloom y alginato, la relación molar es de 3:1 a 8:1.
209. Se pueden incluir adyuvantes de procesamiento en el material de envuelta (p. ej., envueltas primaria o externa). Los adyuvantes de procesamiento se pueden usar por una variedad de razones. Por ejemplo, se pueden usar para promover la aglomeración de las microcápsulas primarias, estabilizar el sistema de emulsión, mejorar las propiedades de las envueltas externas, controlar el tamaño de las microcápsulas y/o actuar como un antioxidante. En un aspecto, el adyuvante de procesamiento puede ser un emulsionante, un ácido graso, un lípido, una cera, una célula microbiana (p. ej., líneas celulares de levadura), una arcilla o un compuesto inorgánico (p. ej., carbonato cálcico). Sin querer limitarse por una teoría, estos adyuvantes de procesamiento pueden mejorar las propiedades de barrera de las microcápsulas. En un aspecto, uno o más antioxidantes se pueden añadir al material de envuelta. Las propiedades antioxidantes son útiles tanto durante el procedimiento (p. ej. durante la coacervación y/o el secado por pulverización) como en las microcápsulas después de que se formen (es decir, para prolongar la vida útil, etc.). Preferiblemente, se puede usar un pequeño número de adyuvantes de procesamiento que realizan un gran número de funciones. En un aspecto, el antioxidante puede ser un compuesto fenólico, un extracto vegetal o un aminoácido que contiene azufre. En un aspecto, se puede usar ácido ascórbico (o una de sus sales tales como ascorbato sódico o potásico) para promover la aglomeración de las microcápsulas primarias, para controlar el tamaño de las microcápsulas y para actuar como un antioxidante. El antioxidante se puede usar en una cantidad de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 12.000 ppm, o de aproximadamente 1.000 ppm a aproximadamente 5.000 ppm. Asimismo, se pueden usar otros adyuvantes de procesamiento tales como, por ejemplo, queladores de metales. Por ejemplo, se puede usar ácido etilendiaminotetraacético para unir iones metálicos, lo que puede reducir la oxidación catalítica de la sustancia de carga.
210. En un aspecto, las microcápsulas primarias (envueltas primarias) tienen un diámetro medio de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 10 gm, de 0,1 gm a aproximadamente 10 gm, de 1 gm a aproximadamente 10 gm, de 1 gm a aproximadamente 8 gm, de 1 gm a aproximadamente 6 gm, de 1 gm a aproximadamente 4 gm o de 1 gm a aproximadamente 2 gm, o 1 gm. En otro aspecto, las microcápsulas multinucleares pueden tener un diámetro medio de aproximadamente 1 gm a aproximadamente 2000 gm, de 20 gm a aproximadamente 1000 gm, de aproximadamente 20 gm a aproximadamente 100 gm o de aproximadamente 30 gm a aproximadamente 80 gm En otro aspecto, las microcápsulas uninucleares tienen un diámetro externo de 1 gm a 2.000 gm.
211. Las microcápsulas descritas en la presente tienen generalmente una combinación de carga útil y resistencia estructural altas. Por ejemplo, las cargas útiles de la sustancia de carga pueden ser de 20% a 90%, de 50% a 70% en peso, o 60% en peso de las microcápsulas mono- o multinucleares.
212. En un aspecto, los métodos divulgados en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2003/0193102. También se contempla que una o más capas de envuelta adicionales se puedan situar sobre la envuelta externa de las microcápsulas mono- o multinucleares. En un aspecto, las técnicas descritas en la Publicación Internacional N° WO 2004/041251 A1 se pueden usar para añadir capas de envuelta adicionales a las microcápsulas mono- y multinucleares.
a) Composiciones farmacéuticas y nutracéuticas
213. Estos lípidos y antioxidantes se eligen para el uso en piensos, productos farmacéuticos, productos nutracéuticos (especialmente leche maternizada) así como en la industria. Estos también deben incluir formas nutracéuticas de aporte tales como cápsulas de gelatina y similares, microencapsulaciones comunes, etc.
214. Según se describe anteriormente, las composiciones también se pueden administrar in vivo en un portador farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de un modo perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que esté contenido. El portador se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualesquiera efectos adversos en el sujeto, como será bien conocido por un experto en la técnica.
215. Las composiciones se pueden administrar oralmente, parenteralmente (p. ej., intravenosamente), mediante inyección intramuscular, mediante inyección intraperitoneal, transdérmicamente, extracorpóreamente, tópicamente o similares, incluyendo la administración intranasal tópica o la administración mediante inhalador. Según se usa en la presente, "administración intranasal tópica" significa el aporte de las composiciones a la nariz y las fosas nasales a través de una o ambas de las narinas y puede comprender el aporte mediante un mecanismo de pulverización o un mecanismo de gotículas, o a través de la aerosolización del ácido nucleico o el vector. La administración de las composiciones mediante inhalador puede ser a través de la nariz o la boca mediante el aporte por un mecanismo de pulverización o gotículas. El aporte también puede ser directamente a cualquier zona del sistema respiratorio (p. ej., los pulmones) a través de intubación. La cantidad exacta de las composiciones requeridas variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad, el peso y el estado general del sujeto, la gravedad del trastorno alérgico que se trate, el ácido nucleico o vector particular usado, su modo de administración y similares. Así, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, una cantidad apropiada puede ser determinada por un experto normal en la técnica usando solo una experimentación habitual dadas las enseñanzas de la presente.
216. La administración parenteral de la composición, si se usa, se caracteriza generalmente por inyección. Las preparaciones inyectables se pueden preparar en formas convencionales, bien como soluciones o bien como suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución de suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un enfoque más recientemente revisado para la administración parenteral implica el uso de un sistema de liberación lenta o liberación sostenida de modo que se mantenga una dosificación constante. Véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 3.610.795.
217. Los materiales pueden estar en solución, suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas o células). Estos se pueden dirigir a un tipo de célula particular a través de anticuerpos, receptores o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas a tejido tumoral (Senter, y cols., Bioconjugate Chem., 2:447-451,1991; Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281,1989; Bagshawe, y cols., Br. J. Cancer, 58:700-703,1988; Senter, y cols., Bioconjugate Chem., 4:3-9,1993; Battelli, y cols., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, 1992; Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80,1992; y Roffler, y cols., Biochem. Pharmacol., 42:2062-2065,1991). Vehículos tales como liposomas conjugados a anticuerpos "sigilosos" y otros (incluyendo la orientación mediada por lípidos de fármaco a carcinoma colónico), la orientación mediada por receptor de ADN a través de ligandos específicos de la célula, la orientación a tumores dirigida por linfocitos y la orientación retroviral terapéutica altamente específica de células de glioma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para orientar proteínas específicas a tejido tumoral (Hughes y cols., Cancer Research, 49:6214-6220,1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187,1992). En general, los receptores están implicados en rutas de endocitosis, bien constitutiva o bien inducida por ligandos. Estos receptores se agrupan en pozas revestidas con clatrina, entran en las células a través de vesículas revestidas con clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se ordenan los receptores y a continuación bien se reciclan a la superficie celular, bien se almacenan intracelularmente o bien se degradan en lisosomas. Las rutas de internalización realizan una variedad de funciones, tales como captación de nutrientes, retirada de proteínas activadas, depuración de macromoléculas, entrada oportunista de virus y toxinas, disociación y degradación del ligando y regulación del nivel de receptor. Muchos receptores siguen más de una ruta intracelular, dependiendo del tipo de célula, la concentración de receptor, el tipo de ligando, la valencia del ligando y la concentración de ligando. Se han revisado mecanismos moleculares y celulares de endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:399-409,1991).
(1) Portadores Farmacéuticamente Aceptables
218. Las composiciones, incluyendo anticuerpos, se pueden usar terapéuticamente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
219. Portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer la formulación isotónica. Ejemplos del portador farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Portadores adicionales incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en la forma de artículos conformados, p. ej., películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos portadores pueden ser más preferibles dependiendo de, a modo de ejemplo, la vía de administración y la concentración de la composición que se administra.
220. Los portadores farmacéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Estos serían lo más típicamente portadores estándar para la administración de fármacos a seres humanos, incluyendo soluciones tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones se pueden administrar intramuscularmente o subcutáneamente. Otros compuestos se administrarán según procedimientos estándar usados por los expertos en la técnica.
221. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, tensioactivos y similares, además de la molécula de elección. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y similares.
222. La composición farmacéutica se puede administrar de un número de modos dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico, y de la zona a tratar. La administración puede ser tópicamente (incluyendo oftálmicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente), oralmente, mediante inhalación, o parenteralmente, por ejemplo, mediante goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos divulgados se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavitariamente o transdérmicamente.
223. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer con lactato, o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.
224. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares convencionales.
225. Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, saquitos o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes.
226. Algunas de las composiciones se pueden administrar potencialmente como una sal por adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable, formada por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o mediante reacción con una base inorgánica tal como hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico, y bases orgánicas tales como mono-, di-, trialquil- y arilaminas y etanolaminas sustituidas.
(2) Usos Terapéuticos
227. Las dosificaciones eficaces y los esquemas para administrar las composiciones se pueden determinar empíricamente, y realizar estas determinaciones está dentro de la experiencia de la técnica. Los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que se ven afectados los síntomas del trastorno. La dosificación no debe ser tan grande que provoque efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, el estado, el sexo y el grado de la enfermedad en el paciente, la vía de administración o si se incluyen otros fármacos en el régimen, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en caso de contraindicaciones. La dosificación puede variar y se puede administrar en una o más administraciones de dosis diaria, durante uno o varios días. Pueden encontrarse en la bibliografía directrices adecuadas para dosificaciones apropiadas para clases dadas de productos farmacéuticos. Por ejemplo, directrices para seleccionar dosis apropiadas para anticuerpos se pueden encontrar en la bibliografía sobre usos terapéuticos de anticuerpos, p. ej., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone y cols., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 y pp. 303-357; Smith y cols., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber y cols., eds., Raven Press, Nueva York (1977) pp. 365-389. Una dosificación diaria típica del anticuerpo usado solo podría variar de aproximadamente 1 pg/kg hasta 100 mg/kg del peso corporal o más al día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.
b) Aporte dirigido
228. Los liposomas y las microcápsulas divulgados se pueden dirigir a un tipo de célula particular, tal como células de los islotes, a través de anticuerpos, receptores o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigirse a un tejido específico (Senter, y cols., Bioconjugate Chem 2:447-51, 1991; Bagshawe, Br J Cancer 60:275-81, 1989; Bagshawe, y cols., Br J Cancer 58:700-3, 1988; Senter, y cols., Bioconjugate Chem 4:3-9, 1993; Battelli, y cols., Cancer Immunol Immunother 35:421-5, 1992; Pietersz y McKenzie, Immunolog Reviews 129:57-80, 1992; y Roffler, y cols., Biochem Pharmacol 42:2062-5, 1991). Estas técnicas se pueden usar para una variedad de otros tipos de células específicos.
8. Productos alimenticios
229. También se divulgan en la presente productos alimenticios que comprenden cualquiera de las microcápsulas y emulsiones divulgadas en la presente. Por "producto alimenticio” se entiende cualquier artículo que pueda ser consumido (p. ej., comido, bebido o ingerido) por un sujeto. En un aspecto, las microcápsulas se pueden usar como complementos nutricionales para un producto alimenticio. Por ejemplo, las microcápsulas y las emulsiones se pueden cargar con vitaminas, ácidos grasos omega-3 y otros compuestos que proporcionen beneficios para la salud. En un aspecto, el producto alimenticio es un producto horneado, una pasta, un producto cárnico, un producto lácteo congelado, un producto lácteo, un producto de queso, un producto de huevo, un condimento, una mezcla para sopa, un aperitivo, un producto de nuez, un producto de proteína vegetal, un caramelo duro, un caramelo blando, un producto avícola, un zumo de fruta procesado, un azúcar granulado (p. ej., blanco o moreno), una salsa, un condimento, un jarabe, una barra nutritiva, una bebida, un polvo seco para bebida, una mermelada o jalea, un producto de pescado o un alimento para animales de compañía. En otro aspecto, el producto alimenticio es pan, tortillas, cereal, salchicha, pollo, helado, yogur, leche, aderezo para ensaladas, salvado de arroz, zumo de frutas, un polvo seco para bebida, rollos, pasteles, galletas, un aperitivo, tartas de frutas o tortas.
9. Chips y micromatrices
230. Se divulgan chips en los que al menos una coordenada es las secuencias o parte de las secuencias indicadas en cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en la presente. También se divulgan chips en los que al menos una coordenada es las secuencias o la porción de secuencias indicadas en cualquiera de las secuencias peptídicas divulgadas en la presente.
[0220] 231. También se divulgan chips en los que al menos una coordenada es una variante de las secuencias o parte de las secuencias indicadas en cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en la presente. También se divulgan chips en los que al menos una coordenada es una variante de las secuencias o una porción de las secuencias indicadas en cualquiera de las secuencias de polipéptido divulgadas en la presente.
10. Medios legibles informáticamente
232. Se entiende que los ácidos nucleicos y las proteínas divulgados se pueden representar como una secuencia que consiste en los nucleótidos de aminoácidos. Existe una variedad de modos de presentar estas secuencias, por ejemplos el nucleótido guanosina se puede representar por G o g. Asimismo, el aminoácido valina se puede representar por Val o V. Los expertos en la técnica saben cómo representar y expresar cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína en cualquiera de una variedad de modos que existen, cada uno de los cuales se considera divulgado en la presente. Se contempla específicamente en la presente la representación de estas secuencias en medios legibles informáticamente, tales como discos flexibles, cintas, chips, discos duros, discos compactos y videodiscos disponibles comercialmente, u otros medios legibles informáticamente. También se divulgan las representaciones en código binario de las secuencias divulgadas. Los expertos en la técnica conocen los medios legibles informáticamente. Así, los medios legibles informáticamente sobre los que los ácidos nucleicos o las secuencias proteínica se registran, almacenan o guardan.
233. Se divulgan medios legibles informáticamente que comprenden las secuencias y la información referente a las secuencias indicadas en la presente.
11. Estuches
234. Se divulgan en la presente estuches que están diseñados para reactivos que se pueden usar para poner en práctica los métodos divulgados en la presente o para usar o mantener las composiciones divulgadas en la presente. Los estuches pueden incluir cualquier reactivo o combinación de reactivo analizados en la presente o que se entendiera que se requerían o serían beneficiosos en la práctica de los métodos divulgados. Por ejemplo, los estuches podrían incluir uno o más de los microorganismos eucarióticos divulgados en la presente junto con, por ejemplo, medios para su mantenimiento. Los estuches también pueden incluir, por ejemplo, los lípidos o antioxidantes, junto con medios para usarlos o administrarlos.
12. Composiciones con funciones similares
235. Se entiende que las composiciones divulgadas en la presente tienen ciertas funciones, tales como producir ciertas relaciones de lípidos. Se divulgan en la presente ciertos requisitos estructurales, genéticos y funcionales para realizar las funciones divulgadas, y se entiende que existe una variedad de estructuras, fundamentos genéticos y fundamentos funcionales que pueden realizar la misma función que están relacionados con las estructuras divulgadas, y que estas estructuras alcanzarán finalmente el mismo resultado, por ejemplo, la producción de una cierta relación de lípidos.
D. Métodos para elaborar las composiciones
236. Las composiciones divulgadas en la presente y las composiciones necesarias para realizar los métodos divulgados se pueden elaborar usando cualquier método conocido en la técnica para ese reactivo o compuesto particular a menos que se apunte específicamente otra cosa.
1. Síntesis de ácidos nucleicos
237. Por ejemplo, los ácidos nucleicos, tales como los oligonucleótidos que se van a usar como cebadores se pueden elaborar usando métodos de síntesis química estándar o se pueden producir usando métodos enzimáticos o cualquier otro método conocido. Estos métodos pueden variar de digestión enzimática estándar seguida por aislamiento de fragmentos nucleotídicos (véase, por ejemplo, Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5, 6) a métodos puramente sintéticos, por ejemplo, mediante el método de la cianoetilfosforamidita usando un sintetizador de ADN Milligen o Beckman System 1 Plus (por ejemplo, el sintetizador automático Modelo 8700 de Milligen-Biosearch, Burlington, MA o ABI Modelo 380B). Métodos sintéticos útiles para elaborar oligonucleótidos también son descritos por Ikuta y cols., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356, 1984, (métodos del fosfotriéster y fosfitotriéster) y Narang y cols., Methods Enzymol., 65:610-620, 1980, (método del fosfotriéster). Moléculas proteínicas de ácido nucleico se pueden elaborar usando métodos conocidos tales como los descritos por Nielsen y cols., Bioconjug. Chem. 5:3-7, 1994.
2. Síntesis de péptidos
238. Un método para producir las proteínas divulgadas es conectar entre sí dos o más péptidos o polipéptidos mediante técnicas de química proteínica. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos se pueden sintetizar químicamente usando un equipo de laboratorio disponible actualmente usando química bien de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o bien de Boc (ferc-butiloxicarbonilo). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido correspondiente a las proteínas divulgadas, por ejemplo, se puede sintetizar mediante reacciones químicas estándar. Por ejemplo, un péptido o polipéptido se puede sintetizar y no escindir de su resina de síntesis mientras el otro fragmento de un péptido o una proteína se puede sintetizar y posteriormente escindir de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que está funcionalmente bloqueado sobre el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos se pueden enlazar covalentemente a través de un enlace peptídico en sus extremos carboxilo y amino, respectivamente, para formar un anticuerpo, o un fragmento del mismo. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (que se incorpora en la presente mediante referencia al menos para el material relacionado con la síntesis de péptidos). Alternativamente, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo según se describe en la presente. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes se pueden conectar para formar un péptido o fragmento del mismo a través de reacciones de condensación de péptidos similares.
239. Por ejemplo, la ligación enzimática de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permite que fragmentos peptídicos relativamente cortos se enlacen para producir fragmentos peptídicos, polipéptidos o dominios proteínicos enteros mayores (Abrahmsen L y cols., Biochemistry, 30:4151, 1991). Alternativamente, la ligación química natural de péptidos sintéticos se puede utilizar para construir sintéticamente péptidos o polipéptidos grandes a partir de fragmentos peptídicos más cortos. Este método consiste en una reacción química en dos etapas (Dawson y cols. Science, 266:776-779, 1994). La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un tioéster de péptido sintético desprotegido con otro segmento peptídico desprotegido que contienen un residuo de Cys aminoterminal para dar un producto intermedio conectado a tioéster como el producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este producto intermedio sufre una reacción intramolecular rápida espontánea para formar un enlace peptídico natural en el sitio de ligación (Baggiolini M y cols. FEBS Lett. 307:97-101, 1992; Clark-Lewis I y cols., J. Biol. Chem., 269:16075, 1994; Clark-Lewis I y cols., Biochemistry, 30:3128, 1991; Rajarathnam K y cols., Biochemistry 33:6623-30, 1994).
240. Alternativamente, los segmentos peptídicos desprotegidos están conectados químicamente cuando el enlace formado entre los segmentos peptídicos como resultado de la ligación química es un enlace no natural (no peptídico) (Schnolzer, M. y cols. Science, 256:221, 1992). Esta técnica se ha usado para sintetizar análogos de dominios proteínicos, así como grandes cantidades de proteínas relativamente puras con actividad biológica completa (de Lisle Milton RC y cols., Techniques in Protein Chemistry IV Academic Press, Nueva York, pp. 257-267, 1992).
3. Procedimientos para elaborar las composiciones
241. Se divulgan procedimientos para elaborar las composiciones, así como elaborar los productos intermedios que conducen a las composiciones. Por ejemplo, se divulgan microorganismos eucarióticos que pueden producir lípidos y antioxidantes deseados, así como métodos para aislar y purificar los lípidos y antioxidantes deseados. Existe una variedad de métodos que se pueden usar para elaborar estas composiciones, tales como métodos químicos sintéticos y métodos de biología molecular estándar. Se entiende que los métodos para elaborar estas y las otras composiciones divulgadas se divulgan específicamente.
242. Se divulgan células producidas mediante el procedimiento de transformación de la célula con cualquier ácido nucleico. Se divulgan células producidas mediante el procedimiento de transformación de la célula con cualquiera de los ácidos nucleicos divulgados no presentes en la naturaleza.
243. Se divulgan cualesquiera de los lípidos producidos por los microorganismos eucarióticos divulgados. Se divulgan cualesquiera péptidos producidos mediante el procedimiento de expresar el péptido en los organismos divulgados. Métodos para usar las composiciones.
4. Métodos para usar las composiciones como herramientas de investigación
244. Las composiciones divulgadas se pueden usar de una variedad de modos como herramientas de investigación y de la producción de, por ejemplo, lípidos y antioxidantes.
245. Las composiciones divulgadas se pueden usar según se analiza en la presente bien como reactivos en micromatrices o bien como reactivos para sondar o analizar micromatrices existentes. Las composiciones divulgadas se pueden usar en cualquier método conocido para aislar o identificar polimorfismos de un solo nucleótido. Las composiciones también se pueden usar en cualquier método para determinar un análisis alélico de, por ejemplo, las cepas de los organismos divulgados en la presente, particularmente un análisis alélico en lo relativo a la producción de lípidos y antioxidantes. Las composiciones también se pueden usar en cualquier método conocido para ensayos de rastreo, relacionados con chip/micromatrices. Las composiciones también se pueden usar en cualquier modo conocido para usar las realizaciones legibles informáticamente de las composiciones divulgadas, por ejemplo, para estudiar una relación o para realizar análisis de modelado molecular relacionado con las composiciones divulgadas.
5. Métodos de modificación génica y perturbación génica
246. Las composiciones y los métodos divulgados se pueden usar para la perturbación y la modificación génica dirigidas en cualquier animal que pueda sufrir estos episodios. Modificación génica y perturbación génica se refieren a los métodos, las técnicas y las composiciones que rodean a la retirada o la alteración selectivas de un gen o un tramo de un cromosoma en un organismo, tal como los eucariotas divulgados en la presente, de un modo que propague la modificación a través de la replicación del organismo. En general, por ejemplo, una célula se transforma con un vector que está diseñado para recombinarse homólogamente con una región de un cromosoma o ácido nucleico particular contenido dentro de la célula dentro de la célula, por ejemplo, según se describe en la presente. Este episodio de recombinación homóloga puede producir un cromosoma que tiene ADN exógeno introducido, por ejemplo, en el marco, con el ADN circundante. Este tipo de protocolo permite que se introduzcan mutaciones muy específicas, tales como mutaciones puntuales, en el genoma contenido dentro de la célula. Se divulgan en la presente métodos para realizar este tipo de recombinación homóloga.
V. REALIZACIONES ESPECÍFICAS
247. Se divulga en la presente un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1. El microorganismo eucariótico puede producir ácidos grasos insaturados que tienen un perfil mostrado en la figura 2. El microorganismo eucariótico puede ser del filo Labyrinthulomycota, la clase Labyrinthulomycetes, la subclase Thraustochytridae, el orden Thraustochytriales, la familia Thraustochytriaceae, y/o el género Thraustochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser Thraustochytrium sp., Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum o Thraustochytrium striatum. El microorganismo eucariótico también puede ser de la familia Thraustochytriaceae y puede tener el número de registro de la ATCC 20888, 20889, 20890, 20891 o 20892.
248. También se divulga en la presente un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo es del género Schizochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser Schizochytrium sp.
249. También se divulga en la presente un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo eucariótico comprende un ácido graso omega 3 u omega 6. El microorganismo eucariótico también puede comprender DHA o DPA.
250. También se divulga en la presente un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo produce una fracción de lípidos o ácidos grasos de al menos aproximadamente 4% en peso a 6% en peso. El lípido puede comprender DHA. La composición lipídica también puede comprender de aproximadamente 25% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 40% en peso de fracción de ácidos grasos de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 10% en peso de fracción de ácidos grasos de DPA n-6 y de aproximadamente 0% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 3% en peso de fracción de ácidos grasos de EPA n-3.
251. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1. La composición puede comprender además un medio y/o nutrientes.
252. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde la composición es una biomasa. El microorganismo eucariótico de la composición puede ser del filo Labyrinthulomycota, la clase Labyrinthulomycetes, la subclase Thraustochytridae, el orden Thraustochytriales, la familia Thraustochytriaceae o el género Thraustochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser Thraustochytrium sp., Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum o Thraustochytrium striatum. El microorganismo eucariótico también puede ser de la familia Thraustochytriaceae y puede tener el número de registro de la ATCC 20888, 20889, 20890, 20891 o 20892.
253. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo es del género Schizochytrium. El microorganismo eucariótico puede ser Schizochytrium sp. 254. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo eucariótico produce ácidos grasos insaturados que tienen un perfil mostrado en la figura 2. El ácido graso insaturado puede comprender un ácido graso omega 3 u omega 6. El ácido graso insaturado también puede comprender DHA o DPA.
255. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, en donde el microorganismo eucariótico puede producir una fracción de lípidos o ácido grasos de al menos aproximadamente 4% en peso a 6% en peso. El lípido puede comprender DHA. El lípido también puede comprender de aproximadamente 25% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 40% en peso de fracción de ácidos grasos de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 10% en peso de fracción de ácidos grasos de DPA n-6, y de aproximadamente 0% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 3% en peso de fracción de ácidos grasos de n-3 EPA.
256. También se divulga una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 80% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1 257. También se divulga una composición que comprende de aproximadamente 25% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 40% en peso de fracción de ácidos grasos de DHA n-3, de aproximadamente 6% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 10% en peso de fracción de ácidos grasos de DPA n-6, y de aproximadamente 0% en peso de fracción de ácidos grasos a aproximadamente 3% en peso de fracción de ácidos grasos de n-3 EPA.
258. También se divulga un método para preparar una composición lipídica, comprendiendo el método: cultivar el microorganismo eucariótico descrito en la presente, en un medio heterótrofo, y aislar la composición lipídica. También se divulga una composición lipídica preparada según este método.
259. También se divulga un dispositivo de aporte que comprende cualquiera de las composiciones descritas anteriormente. Por ejemplo, se divulga un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1. El dispositivo de aporte puede comprender una microcápsula, una microesfera, una nanoesfera o nanopartícula, un liposoma, un noisoma, un nanoeritrosoma, una nanopartícula sólida-líquida, una leuprolida, un gel, una cápsula de gelatina, un comprimido, una loción, una crema, un aerosol, una emulsión o un polvo.
260. También se divulga una microcápsula, que comprende una aglomeración de microcápsulas primarias y una sustancia de carga, teniendo cada microcápsula primaria individual una envuelta primaria, en donde la sustancia de carga comprende cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, y está encapsulada por la envuelta primaria, y en donde la aglomeración está encapsulada por una envuelta externa. La envuelta primaria y/o la envuelta externa puede comprender un tensioactivo, gelatina, polifosfato, polisacárido o una de sus mezclas. La envuelta primaria y/o la envuelta externa también puede comprender gelatina tipo B, polifosfato, goma arábiga, alginato, quitosano, carragenina, pectina, almidón, almidón modificado, alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobumina, ovoalbúmina, polisorbitano, maltodextrina, ciclodextrina, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, proteína de la leche, proteína de suero, proteína de soja, proteína de colza, albúmina, gelatina kosher, gelatina no kosher, gelatina halal, gelatina no halal o una de sus mezclas. La envuelta primaria y/o la envuelta externa también puede comprender un coacervado complejo, gelatina tipo A, gelatina de pescado, una gelatina con un número de Bloom de aproximadamente 0 a aproximadamente 300, una gelatina con un número de Bloom de aproximadamente 0 a aproximadamente 50, una gelatina con un número de Bloom de aproximadamente 51 a aproximadamente 300, una gelatina con un número de Bloom de aproximadamente 0, aproximadamente 210, aproximadamente 220 o aproximadamente 240, un coacervado de gelatina y polifosfato.
261. La sustancia de carga de las microcápsulas divulgadas puede comprender aceite procedente de Thraustochytrium, Schizochytrium o una de sus mezclas. La sustancia de carga puede ser de aproximadamente 20% a aproximadamente 90% o 50% a aproximadamente 70% en peso de la microcápsula.
262. La envuelta externa de las microcápsulas divulgadas puede tener un diámetro promedio de aproximadamente 1 gm a aproximadamente 2.000 gm, de aproximadamente 20 gm a aproximadamente 1.000 gm, de aproximadamente 30 gm a aproximadamente 80 gm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 10 gm o de aproximadamente 0:1 gm a aproximadamente 5 gm.
263. También se divulga un complemento nutricional que comprende cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte o las microcápsulas descritos anteriormente. Los complementos nutricionales divulgados pueden estar en la forma de un comprimido, una cápsula de gelatina, una cápsula, un líquido o un jarabe.
264. También se divulga un producto alimenticio que comprende cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte o las microcápsulas descritos anteriormente. El producto alimenticio puede ser un producto horneado, una pasta, un producto cárnico, un producto lácteo congelado, un producto lácteo, un producto de queso, un producto de huevo, un condimento, una mezcla para sopa, un aperitivo, un producto de nuez, un producto de proteína vegetal, un caramelo duro, un caramelo blando, un producto avícola, un zumo de fruta procesado, un azúcar granulado, una salsa, un condimento, un jarabe, una barra nutritiva, una bebida, un polvo seco para bebida, una mermelada o jalea, una leche maternizada o un alimento para recién nacidos. El producto alimenticio también puede ser un producto de pescado, un alimento para animales de compañía, un pienso para ganado o de acuicultura. El producto alimenticio también puede ser pan, tortillas, cereal, salchicha, pollo, helado, yogur, leche, aderezo para ensaladas, salvado de arroz, zumo de frutas, un polvo seco para bebida, rollos, pasteles, galletas, tartas de frutas o tortas.
265. También se divulga un método para aportar una composición a un sujeto, que comprende administrar al sujeto cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas o los productos alimenticios descritos anteriormente. El sujeto puede ser un mamífero. El sujeto también puede ser un ser humano.
266. También se divulga un uso de cualquiera de las microcápsulas descritas anteriormente y para preparar un medicamento para aportar una sustancia de carga a un sujeto.
267. También se divulga un método para reducir los niveles de colesterol, los niveles de triglicéridos o una de sus combinaciones en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
268. También se divulga un método para complementar con elementos vestigiales esenciales en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente, en donde la composición, el dispositivo de aporte, la microcápsula, el complemento y el producto alimenticio comprende un elemento vestigial esencial.
269. También se divulga un método para mejorar la sensibilidad a insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
270. También se divulga un método para reducir la hiperglucemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
271. También se divulga un método para reducir la hipercolesterolemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
272. También se divulga un método para reducir la grasa corporal en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
273. También se divulga un método para promover la pérdida de peso en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
274. También se divulga un método para tratar o prevenir la diabetes en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte, las microcápsulas, los complementos nutricionales o los productos alimenticios descritos anteriormente.
275. También se divulga una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones, los dispositivos de aporte o las microcápsulas descritos anteriormente, y un portador farmacéutico.
276. También se divulga un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1. El producto alimenticio puede ser un producto horneado, una pasta, un producto cárnico, un producto lácteo congelado, un producto lácteo, un producto de queso, un producto de huevo, un condimento, una mezcla para sopa, un aperitivo, un producto de nuez, un producto de proteína vegetal, un caramelo duro, un caramelo blando, un producto avícola, un zumo de fruta procesado, un azúcar granulado, una salsa, un condimento, un jarabe, una barra nutritiva, una bebida, un polvo seco para bebida, una mermelada o jalea, una leche maternizada o un alimento para recién nacidos. El producto alimenticio también puede ser un producto de pescado o un alimento para animales de compañía, un pienso para ganado o de acuicultura. El producto alimenticio también puede ser pan, tortillas, cereal, salchicha, pollo, helado, yogur, leche, aderezo para ensaladas, salvado de arroz, zumo de frutas, un polvo seco para bebida, rollos, pasteles, galletas, tartas de frutas o tortas.
277. También se divulga un método para disminuir los niveles de colesterol, los niveles de triglicéridos o una de sus combinaciones en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
278. También se divulga un método para complementar con elementos vestigiales esenciales en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
279. También se divulga un método que mejora la sensibilidad a insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
280. También se divulga un método para reducir la hiperglucemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
281. También se divulga un método para reducir la hipercolesterolemia en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
282. También se divulga un método para reducir la grasa corporal en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
[0272] 283. También se divulga un método para promover la pérdida de peso en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
284. También se divulga un método para tratar o prevenir la diabetes en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un complemento nutricional que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, un dispositivo de aporte que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, o un producto alimenticio que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
285. También se divulga una formulación farmacéutica que comprende una composición que comprende un microorganismo eucariótico que tiene una secuencia de 18S, en donde la secuencia de 18S tiene al menos 94% de identidad con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1.
VI. EJEMPLOS
286. Los siguientes ejemplos se proponen a fin de proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo se elaboran y evalúan los compuestos, las composiciones, los artículos, los dispositivos y/o los métodos, y están destinados a ser puramente ejemplares y no están destinados a limitar la divulgación. Se han realizado esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a los números (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero se deben justificar algunos errores y desviaciones. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, la temperatura es en °C o es temperatura ambiente y la presión está en o cerca de la atmosférica.
1. Ejemplo 1 Aislamiento de la cepa de Thraustochytrium sp. ONC-T18
287. Se emplearon técnicas clásicas de purificación de cepas bacteriológicas a fin de aislar ONC-T18 de hojas de mangle recogidas en Advocate Harbor, Nueva Escocia DNC-T18 se cultivó en serie a 25°C sobre un agar de medio nutritivo que contenía 5 g l-1 de glucosa, 2 g l-1 de peptona, 2 g l-1 de extracto de levadura y 15,0 g l-1 de agar para 1 l de agua marina filtrada a través de 0,2 gm hasta que se aseguraba la pureza. Posteriormente, se preparó un medio líquido que contenía 15% de agua marina artificial (marina trófica), complementado con una fuente de nitrógeno y carbono, que eran 60 g l-1 de glucosa y 10 g l-1 de extracto de levadura, respectivamente. Este medio (50 ml de medio en matraces de 250 ml) se inoculó con ONC-T18, y a continuación se incubó a 25°C y se aireó a través de remoción a 120 rpm.
288. Se preparó ONC-T18 a partir del medio a través de centrifugación, con biomasa celular, a continuación se lavó, se recentrifugó y se liofilizó hasta la finalización. A continuación, la biomasa celular se peso a fin de determinar las eficacias de cultivo con los valores de biomasa por litro de medio registrados. La extracción de la fracción lipídica procedente de la biomasa y la separación posterior de ésteres metílicos de ácidos grasos se realizó usando el método de Bligh y Dyer. Se realizó transesterificación al transferir material celular liofilizado a un tubo de ensayo con tapón de rosca de 10 ml y añadiendo HCl metanólico al 10% y diclorometano al tubo, dejando reaccionar la mezcla durante 2 horas a 90°C. A continuación, los ésteres metílicos de ácidos grasos se extrajeron a través de la adición de hexano:cloroformo, y el componente de éster metílico se midió a través de cromatografía de gases (FID) a fin de determinar el perfil de ácidos grasos de cada microorganismo y la comunidad simbiótica (ONC-T18). Las concentraciones de cada éster metílico de ácido graso (de C14:0 a C22:6) se determinaron mediante la comparación de las superficies de los picos de GC de dos patrones internos (C19:0 y C23:0) añadidos en cantidades definidas tanto al principio (C23:0) como al final (C19:0) del procedimiento de transesterificación. La cantidad total de ácidos grasos por gramo de biomasa celular deshidratada y el contenido porcentual de cada ácido graso, calculado usando este método, se muestran en la figura 2.
289. A partir del análisis de estos resultados, junto con los mostrados en la Figura 1, se puede observar que ONC-T18 demostraba la capacidad para producir un incremento en las cantidades de DHA, así como cantidades marcadas de EPA y DpA. ONC-T18 produce aproximadamente 25% de DHA, 8,0% de DPA (n-6) y 1,0% de EPA dentro de este medio de fermentación no optimizado. Posteriormente, se eligió ONC-T18 basándose en una combinación de características económicamente deseables: (1) capaz de un crecimiento heterótrofo máximo (en comparación con cepas de control); (2) contiene un alto porcentaje de ácido grasos altamente insaturados omega-3; (3) capaz de crecimiento sobre nutrientes económicos; (4) termotolerancia y son (5) eurihalinos.
290. Además, múltiples cepas diferentes de microbios productores de aceite se compararon con ONC-T18. Se cree que cada uno de estos microbios comprende un traustocítrido, y produce aceite en las cantidades mostradas en la Tabla 3.
Tabla 3, []= mg/g
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Figure imgf000040_0001
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291. Se entiende que exactamente como para ONC-T18, según se describe en la presente, se divulga un conjunto de microbios productores de aceite según se representa por las capacidades productoras de aceite divulgadas en la presente, tal como por un porcentaje de DHA para la producción de aceite total o por la producción de DHA total, por ejemplo.
2. Ejemplo 2 Identificación de especies de Thraustochytrium eucarióticas de ONC-T18 usando técnicas genéticas
292. Usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores que se dirigen al gen de ARN ribosómico de 18S, que es universal para todas las especies eucarióticas, era posible generar productos de PCR de los genes estructurales del microorganismo eucariótico aislado de ONC-T18 (como para el ejemplo 1). A continuación, los productos de PCR se secuenciaron y se denominaron SEQ ID NO:1 para la especie eucariótica (véase la figura 2).
293. La comparación de SEQ ID NO:1 con secuencias de ácido nucleico encontradas en la base de datos genómica, GenBank (National Centre for Biotechnology Information, National Institute of Health, Bethesda, MD, EE. UU. de A.) usando el algoritmo BLAST (Basic local alignment search tool) identificaba SEQ ID NO:1 como la más relacionada con Thraustochytrium striatum, [AF265338] (97,5% de similitud).
294. Los resultados de BLAST para Thraustochytrium sp. ONC-T18 se muestran posteriormente
Secuencias que producen alineamientos significativos:
Puntuación Valor
(bits) E gi 114279326| gb |AF265338.1| ...subunidad pequeña de Thraustochytrium striatum 2126 0,0 gi |50508012| dbj |AB183657.11.g e n MBIC11072 de Thraustochytriidae sp. 2121 0,0 gi |54778780| gb |AY773276.11 ...rib. 18S de FJN-10 de Thraustochytriidae sp. 1857 0,0 gi |50508019| dbj |AB183664.11 gen MBIC11093 de Thraustochytriidae sp.... 1828 0,0 gi |38524571| dbj |AB126669.11 gen CHN-1 de Thraustochytrium sp. para... 1748 0,0 gi |24817740| dbj |AB073308.2| gen N1-27 de Thraustochytriidae sp. pa... 1628 0,0 gi |50508018| dbj |AB183663.11 gen MBIC11092 de Thraustochytriidae sp.... 1257 0,0 gi |50508017| dbj |AB183662.11 gen MBIC11091 de Thraustochytriidae sp.... 1257 0,0 gi |50508015| dbj |AB183660.11 gen MBIC11084 de Thraustochytriidae sp.... 1255 0,0 gi |505080111 dbj |AB183656.11 gen MBIC11070 de Thraustochytriidae sp.... 1255 0,0 gi |50508016| dbj |AB183661.11 gen MBIC11086 de Thraustochytriidae sp.... 1249 0,0 gi |15823623| dbj |AB052555.11 gen KH105 de Schizochytrium sp. para 18... 1245 0,0 gi |50508013| dbj |AB183658.11 gen MBIC11075 de Thraustochytriidae sp.... 1227 0,0 gi |50508010| dbj |AB183655.11 gen MBIC11067 de Thraustochytriidae sp.... 1213 0,0 gi |54303872| gb |AY758384.11 ribosoma 18S de FJU-512 de Schizochytrium sp. 1158 0,0 gi |14279326| gb |AF265338.1| ...peq. de AF265338 de Thraustochytrium striatum 1106 0,0 gi |6492308| gb |AF155209.11... parásito de almeja Labyrinthulid AF155209 765 0,0 gi |16209570| gb |AY052644.11 .peq . QPX de parásito de almeja Labyrinthulid... 757 0,0 gi |97550311 gb |AF261664.11.parásito de almeja Labyrinthulid AF261664 757 0,0 gi |58176547| gb |AY870336.11 ribos. 18S de Fngl de Thraustochytriidae sp.... 735 0,0 gi |67624914| dbj |AB191425.11 gen eucariótico no cultivado para.pequeña 724 0,0 gi |55098911 dbj |AB022112.11 gen de Thraustochytrium striatum para 18... 724 0,0 gi |561884| gb |L34054.11 ...ARN ribosómico de 18S de Ulkenia profunda. ULKRRE 702 0,0 gi |50508014| dbj |AB183659.11 .g e n MBIC11077 de Thraustochytriidae sp. 686 0,0 gi |50508008| dbj |AB183653.11 .g e n MBIC11060 de Thraustochytriidae sp. 686 0,0 gi |50508009| dbj |AB183654.11 .g e n MBIC11063 de Thraustochytriidae sp. 658 0,0 gi |41391986| emb |AJ535188.11.g e n de ARNr de 18S de Pleurosira cf. laevis 634 e-178 gi |28316562| gb |AF525670.11 ..ribos. subunidad pequeña de Pleurosira laevis 634 e-178 gi |5509889| dbj |AB022110.11 gen de Thraustochytrium aureum para .18 S ... 634 e-178 gi |561883| gb |L34668.11..ribosoma 18S de Thraustochytrium kinnei TUKRRE 628 e-176 gi |5509894| dbj |AB022115.1| gen de Ulkenia radiata para ARNr de 18S 624 e-175 gi |5509893| dbj |AB022114.11 gen de Ulkenia profunda para ARNr de 18S 624 e-175 gi |5509895| dbj |AB022116.11 gen de Ulkenia vizurgensis para ARNr de 18S 603 e-169 gi |9027563| gb |AF257315.2| .ribosom. 18S de BS2 de Thraustochytriidae sp. 589 e-164 gi |5509886| dbj |AB022107.11 gen de Schizochytrium limacinum para 18S... 581 e-162 gi |48727879| gb |AY620254.11 . s . pequeña del clon TC-S de Metromonas simplex 571 e-159 gi |33309650| gb |AF411282.11.ribosómica de 18S de crecozoo no identificado 569 e-158 gi |28076844| gb |AF530543.11 .18 S del clon AT4-68 de eucariota no cultivado 531 e-147 gi |30144485| gb |AY256273.11 .peq . aislado E170 de eucariota no cultivado 517 e-143 gi |30144529| gb |AY256317.11 .peq . de aislado D107 de eucariota no cultivado 507 e-140 gi |14579477| gb |AF363207.11 .r ib . 18S del clon ME1-24 marino 505 e-139 gi |39578677| gb |AY426906.11 clon BL0 de eucariota marino no cul 504 e-139 gi |39981869| gb |AY381216.11.c lo n BL010625.3 de eucariota no 504 e-139 gi |73533408| gb | DQ103811.1| clon M4_... de eucariota marino ado 504 e-139 gi |73533402| gb |DQ103805.11 clon M3_... de eucariota marino ado 504 e-139 gi |73533389| gb |DQ103792.11 clon M2_... de eucariota marino ado 504 e-139 gi |73533382| gb |DQ103785.11 clon M1_... de eucariota marino
Figure imgf000042_0001
ado 504 e-139 gi |30144534| gb |AY256322.11 peq. de aislado D179 de eucariota 504 e-139 gi |24817738| dbj |AB073305.2| gen H1-14 de Thraustochytriidae sp. para... 504 e-139 gi |30268157| emb |AJ519935.11 AST519935 Aplanochytrium stocchinoi p... 504 e-139 gi |585318811 gb |AY882527.1| clon T41 de eucariota marino no cultivado... 504 e-139 gi |463127| gb |L27634.11 LADDLRRNA .s im ilar a 16S de Labyrinthuloides minuta... 504 e-139 gi |39981839| gb |AY381186.11 clon de eucariota no cultivado OR000415.1... 502 e-138 gi |39981824| gb |AY381171.11 clon de eucariota no cultivado HE001005.1... 502 e-138 gi |18026024| gb |AY046848.11 aislado de eucariota no cultivado C3_E019... 502 e-138 gi |18026022| gb |AY046846.11 aislado de eucariota no cultivado C3_E017 ... 502 e-138 gi 118026014| gb |AY046838.11 aislado de eucariota no cultivado C3_E008 ... 502 e-138 gi |18026008| gb |AY046832.11 aislado de eucariota no cultivado C3_E002 ... 502 e-138 gi |18025980| gb |AY046804.11 aislado de eucariota no cultivado C2_E014 ... 502 e-138 gi |18025969| gb |AY046793.11 aislado de eucariota no cultivado C2_E002 ... 502 e-138 gi 1180258011 gb |AY046625.11 aislado de eucariota no cultivado C1_E024 ... 502 e-138 gi |67624915| dbj |AB191426.11 gen de eucariota no cultivado para.pequeña 502 e-138 gi |67624913| dbj |AB191424.11 gen de eucariota no cultivado para.pequeña 502 e-138 gi |67624912| dbj |AB191423.11 gen de eucariota no cultivado para.pequeña 502 e-138 gi |399818611 gb| AY381208.11 Clon de eucariota no cultivado BL010320.1... 500 e-138 gi |14349249| dbj |AB052556.1| gen KK17-3 de Thraustochytrium sp. para... 500 e-138 gi |20218962| dbj |AB073307.11 gen M4-103 de Thraustochytriidae sp. p... 498 e-137 gi |59709960| gb |AY916582.11 .18 S de clon de eucariota no cultivado Zeuk76... 496 e-136 gi |18025960| gb |AY046784.11 aislado de eucariota no cultivado A3_E043 ... 496 e-136 gi |18025789| gb |AY046613.11 aislado de eucariota no cultivado C1_E009 ... 496 e-136 gi |30144548| gb |AY256336.11 .p . de aislado de eucariota no cultivado D278... 496 e-136 gi |2138106| gb |U59933.1 U59933 ...ribosómica 18S de Scybalium jamaicense... 496 e-136 gi |53828186| gb |AY744948.11 aislado 88108 de Phytophthora palmivora... 494 e-136 gi |60687349| gb |AY821976.11..peq. de clon CV1_B2_5 de oomiceto no cultivado 494 e-136 gi |60687347| gb |AY821974.11.oomiceto similar a Phytophthora no cultivado 494 e-136 gi |60687342| gb |AY821969.11...p. clon CV1_B1_49 de oomiceto no cultivado 494 e-136 gi |39981870| gb |AY381217.1| Clon de eucariota no cultivado BL010625.3... 494 e-136 gi |39981864| gb |AY381211.1| Clon de eucariota no cultivado BL010320.2... 494 e-136 gi |39981860| gb |AY381207.11 Clon de eucariota no cultivado BL010320.6... 494 e-136 gi |39981844| gb |AY381191.11 Clon de eucariota no cultivado BL000921.1... 494 e-136 gi |18026046| gb |AY046870.1| aislado de eucariota no cultivado C3_E044 ... 494 e-136 gi |18026039| gb |AY046863.1| aislado de eucariota no cultivado C3_E035 ... 494 e-136 gi |180260311 gb |AY046855.11 aislado de eucariota no cultivado C3_E026 ... 494 e-136 gi |42412527| gb |AY486144.11 ARN ribosómico de 18S de Pythium insidiosum... 494 e-136 gi |73533425| gb |DQ103828.11 clon M2_... de eucariota marino no cultivado 494 e-136 gi |34576227| gb |AY129064.1| ...UEPAC45p4 de eucariota marino no cultivado 494 e-136 gi |30144522| gb |AY256310.11.peq . D85 de aislado de eucariota no cultivado 494 e-136 gi |301445211 gb |AY256309.1| .peq . D84 de aislado de eucariota no cultivado 494 e-136 gi |30144518| gb |AY256306.1| .peq . D79 de aislado de eucariota no cultivado 494 e-136 gi |30144475| gb |AY256263.1| .peq . E106 de aislado de eucariota no cultivado 494 e-136 gi |30144473| gb |AY256261.1| .peq . E94 de aislado de eucariota no cultivado 494 e-136 gi |21954246| gb |AY116220.11 Clon de eucariota no cultivado ANT12-261... 494 e-136 gi |41393027| emb |AJ535176.11.18 S de LMI535176 Leptocylindrus minimum 494 e-136 gi |536931111 gb |AY742743.11 aislado de Phytophthora tropicalis 129F-... 494 e-136 gi |53693108| gb |AY742759.1| .r ib . 18S de aislado de Pythium vexans Pyv6-2 494 e-136 gi |53693105| gb |AY742756.11 .r ib . 18S de aislado de Pythium splendens 117 494 e-136 gi |53693104| gb |AY742755.1| .ribosómica de 18S de Pythium aphanidermatum 494 e-136 gi |53693097| gb |AY742748.1| aislado de Phytophthora capsici 9811018... 494 e-136 gi |53693096| gb |AY742747.1| aislado de Phytophthora tropicalis 23047... 494 e-136 gi |53693094| gb |AY742745.11 aislado de Phytophthora palmivora 88291... 494 e-136 gi |58531862| gb |AY882508.11 clon de eucariota marino no cultivado T53... 494 e-136
3. Ejemplo 3: Producción optimizada de biomasa usando la cepa ONC-T18
295. La producción de aceites derivados de microbios (o unicelulares) depende de una variedad de variables del procedimiento, tales como el nivel de inóculo inicial, el tipo de sustrato, la composición del medio, la temperatura y el pH. Específicamente, la producción microbiana de ácidos grasos altamente insaturados usando cepas de traustocítrido muestra una correlación directa entre biomasa y producción de ácido grasos. Por consiguiente, una comprensión de las necesidades básicas o la optimización de parámetros es un factor importante para alcanzar un rendimiento máximo. Por lo tanto, a fin de determinar el mejor medio para la producción de cantidades incrementadas de ácidos grasos, se realizaron experimentos de optimización de la biomasa. Específicamente, se usó el método de Taguchi recientemente desarrollado (Joseph J y Piganatiells JR, IIE Trans 20:247-254, 1998), basado en series ortogonales, a fin de determinar la configuración óptima del medio para un incremento en la densidad óptica (directamente relacionada con la producción de biomasa). En este caso, el método de Taguchi se usó para conseguir comprender los efectos acumulativos de las variables que plantean un impacto sobre la producción de biomasa. Los efectos de las variaciones en la concentración de nitrógeno (extracto de levadura, peptona, L-glutamato), carbono (glucosa) y sal (sal marina artificial) tenían sobre la producción de biomasa. Por lo tanto, se preparó una variedad de medios líquidos con cantidades variables de extracto de levadura, peptona y L-glutamato (0, 4, 10, 20, 50 g l-1) que se relacionan con cantidades variables de glucosa y solución salina marina (5, 40, 100, 160, 200 g l-1 y 0, 6, 20, 30, 40 g l-1, respectivamente). Las concentraciones se calcularon según una serie ortogonal L25 de tal modo que el medio nitrogenado de elección se discerniera a través del uso de un análisis de la relación de señal a ruido (SNL) a las 48 y las 120 h, usando la siguiente fórmula:
Figure imgf000043_0001
donde n = número de niveles e y = rendimiento (ODD promedio procedente de experimentos por triplicado).
296. Los resultados procedentes de estos experimentos (que se dirigen específicamente a consideraciones de biomasa), según se muestra dentro de la figura 2 posterior, demuestran que el grado de utilización de nitrógeno por ONC-T18 según se refiere a la densidad óptica (OD600) era peptona, a continuación, extracto de levadura seguido por L-glutamato. Sin embargo, basándose en los máximos de crecimiento, las mejores fuentes de nitrógeno para incrementar la producción de biomasa eran extracto de levadura, a continuación, peptona, seguido por L-glutamato. Por otra parte, a través del uso de experimentos similares con variaciones en la glucosa y la salinidad (concentración de sal marina), la composición del medio óptima y más económica para la producción de biomasa de ONC-T18 estaba dentro de un medio que comprendía 2 g l-1 de extracto de levadura, 8 g l-1 de MSG, 60 g l-1 de glucosa y 6 g l-1 de sal marina.
4. Ejemplo 4: Producción optimizada de ácido docosahexaenoico (DHA) por la cepa ONC-T18
297. Se prepararon medios que consistían en una fuente de nitrógeno (bien peptona, bien extracto de levadura, bien L-glutamato (MSG) o bien combinaciones de estos) y una fuente de carbono (glucosa), en una solución salina (agua marina artificial) a fin de determinar la mejor composición del medio para la producción óptima de biomasa y DHA de un modo similar al descrito en el Ejemplo 3 (mostrado en la Tabla 4). Después del cultivo a 25°C y 130 rpm a lo largo de 3 días, se determinaron la biomasa, el ácido graso total por litro de medio, el porcentaje en peso de contenido de ácidos grasos, el contenido porcentual de DHA en ácidos grasos totales y la cantidad de DHA por litro de medio a través de cromatografía de gases como para el método descrito en el ejemplo 1, y en la presente, y se muestran en la Tabla 4 posteriormente.
298. En este caso el DHA se confirmó mediante la comparación con patrones conocidos de DHA usando cromatografía de gases-espectrometría de masas y métodos de bloqueo de picos. Los hallazgos procedentes del paquete experimental ® , donde se investigaban las variaciones en las formas tanto naturales como orgánicas de nitrógeno, mostraban que la composición óptima del medio debe contener entre 4,0 y 6,0 g I'1 tanto de extracto de levadura como de L-glutamato para la producción óptima de biomasa y DHA. Por otra parte, el paquete experimental © , que investigaba cambios en la composición de sodio añadida al medio, mostraba una producción de DHA y una producción de biomasa óptimas cuando se usa sal marina artificial. Por otra parte, el paquete experimental ® , en el que se variaba la concentración de sodio dentro del medio, representaba máximos para la producción de DHA y biomasa entre agua marina artificial al 5 y 15% í1 de dH2Ü. Los resultados procedentes del paquete experimental ® , donde se evaluaban variaciones en los niveles de glucosa, demostraban que el intervalo de 40 a menos de 160 g í1 de glucosa se traducía en una producción óptima de biomasa y DHA. Finalmente, los resultados del paquete experimental © indican que ONC-T18 producía valores equivalentes para la concentración tanto de biomasa celular como de DHA, cuando se usaban glucosa o glicerol como fuentes de carbono.
Figure imgf000045_0001
5. Ejemplo 5: Tiempo óptimo para la recogida de ONC-T18 para la producción máxima de DHA
299. Se cultivó ONC-T18 bajo la misma composición del medio y condiciones que las mostradas dentro del ejemplo 1. De interés en este caso particular es el tiempo en el que se debe recoger ONC-T18 a fin de obtener las cantidades máximas de DHA, DPA y EPA, así como tener en cuenta el tiempo necesario para obtener dichas cantidades (véase la figura 3).
300. Los resultados experimentales del transcurso del tiempo mostraban que el tiempo óptimo para recoger ONC-T18 para la producción óptima de DHA dentro del matraz y el biorreactor variaba entre 3 y 5 días, respectivamente.
6. Ejemplo 6: Análisis de Lípidos Derivados de ONC-T18
301. La fracción lipídica total de ONC-T18 se extrajo usando un método de Bligh y Dyer modificado. Específicamente, 2,0 g de biomasa celular deshidratada se rehidrataron durante la noche a 4°C en 8 ml de H2O destilada. Se añadieron a la mezcla 30 ml de metanol:cloroformo (2:1 vol/vol) y se removieron suavemente a 120 rpm durante 20 min, con el sobrenadante resultante decantado. A continuación, la pella se resuspendió en metanol:cloroformo:H2O (2:1:0.8 vol/vol/vol) y el procedimiento se repitió con los sobrenadantes reuniéndose y trasladándose a un embudo de separación. A continuación, se añadieron al embudo 5 ml de cloroformo y 5 ml de H2O dando como resultado la formación de un sistema líquido bifásico. Después de la mezcladura vigorosa dentro del embudo de separación, la capa de cloroformo se retiró, se concentró bajo N2 gaseoso, se resuspendió en cloroformo y se almacenó a -20°C bajo análisis. Aproximadamente 1 pl de la fracción lipídica total se añadió por gotas sobre múltiples Chromarods, se separó y se analizó usando un instrumento de TLC/FID latroscan MK6.
302. El análisis de los resultados muestra que el componente de ácido graso que ONC-T18 produce bajo fermentación heterótrofa es casi enteramente de naturaleza triglicérica (al menos 95%). Además de la fracción de ácidos grasos neutros mencionada anteriormente, ONC-T18 también produce una fracción discernible de carotenoides y fosfolípidos. Durante el aislamiento posterior de la fracción fosfolipídica, en primer lugar, a través de un 50% y a continuación un 75% de combustión seguida por separación basada en disolvente, se determinó que estaba presente una fracción fosfolipídica grande y compleja. Los resultados mostraban la presencia de componentes de fosfatidilcolina, fosfatidilserina y ácido fosfatídico dentro de la muestra.
7. Ejemplo 7: Producción de antioxidantes usando la cepa, ONC-T18
303. El eucariota, ONC-T18, se cultivó usando las condiciones y el medio que se mencionan previamente. La biomasa celular resultante después de la fermentación heterótrofa se recoge a través de centrifugación, filtración o sedimentación. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3800 x g y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. La biomasa celular (fresca o liofilizada) se suspendió en 10 x volumen de acetona, se agitó durante 5 minutos a 200 rpm, se centrifugó a 3800 x g durante 5 minutos y se concentró hasta sequedad mediante evaporación de N2. A continuación, los pigmentos se resuspendieron inmediatamente en una cantidad mínima de acetona al 10% en hexano y se almacenaron a -20°C hasta el análisis por HPLC. A continuación, se llevó a cabo la identificación de extractos de carotenoides en un HPLC Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU. de A.) equipado con un detector de longitud de onda variable graduado a 470 nm. Las muestras se inyectaron a través de una columna de seguridad Symmetry C18 (Waters, Milford, IA, EE. UU. de A.) hasta una columna en fase inversa Bondclone C18 (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU. de A.; partículas de 10 pm; 3,9 x 300 mm de diámetro interno). El volumen de inyección era 10 pl y se usó un flujo de 1,00 ml/min de acetona al 10% en hexano a lo largo de un período de 25 minutos. Los datos cuantitativos de los carotenoides se basaban en la comparación de la superficie de los picos con estándares conocidos (en este caso astaxantina, cantaxantina, p-criptoxantina, zeaxantina, equinenona y p-caroteno; ChromaDex, Santa Ana, CA, EE. UU. de A.). En ausencia de un estándar conocido tal como en el caso del carotenoide foenicoxantina, se usó la superficie del pico de astaxantina para calcular sus concentraciones. La identidad del carotenoide se confirmó adicionalmente a través de HPLC-MS usando un HPLC de Waters equipado con una serie de fotodiodos (Waters modelo 996) que conduce a un espectrómetro de masas Micromass ESI-Q-Tof (Waters, Milford, MA, EE. UU. de A.). El análisis por HPLC de ONC-T18 revelaba posteriormente la presencia de varios compuestos antioxidantes (entre 50 y 1250 mg kg-1) dentro de la biomasa celular. Estos compuestos incluían los carotenoides antioxidantes astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona y beta-caroteno en el intervalo de 1 a 20 mg kg-1, de 0,25 a 10 mg kg-1, de 1 a 20 mg kg-1, de 1 a 20 mg kg-1 y de 1 a 200 mg kg-1, respectivamente, así como varios compuestos polifenólicos flavonoides no identificados.
8. Ejemplo 8: Comparación con Microorganismos Conocidos
304. La capacidad de ONC-T18 para producir DHA, EPA y DPA se comparó con la de microorganismos conocidos. La cantidad de biomasa celular por litro de medio, el contenido porcentual de grasas o ácidos grasos por biomasa celular deshidratada, el contenido porcentual de DHA, EPA y DPA en ácidos grasos totales y la cantidad de DHA, EPA y DPA obtenida cuando el DHA, el EPA y el DPA se producen mediante cultivo de Thraustochytrium aureum ATCC 34304, Thraustochytrium sp. ATCC 20891, Thraustochytrium sp. ATCC 20892, Thraustochytrium roseum ATCC 28210, Thraustochytrium sp. ATCC 26185, Schizochytrium sp. ATCC 20888, Schizochytrium aggregatum ATCC 28209 y Schizochytríum limacinum MYA-1381, así como cuando el DHA, el EPA y el DPA se producen mediante cultivo de ONC-T18 según la presente invención.
Tabla 5. Comparación de la producción de lípidos y las características de la biomasa de varias cepas de traustocítrido representativas.
Figure imgf000047_0001
305. Según se muestra en la Tabla 5, es evidente que, cuando el cultivo se lleva a cabo usando ONC-T18 según la presente invención, los valores de biomasa celular por litro de medio eran extremadamente altos en comparación con las otras cepas probadas. Por otra parte, según la presente invención, ONC-T18 tiene un contenido porcentual de lípidos muy alto en comparación con las otras cepas mencionadas anteriormente. Por otra parte, según la presente invención, el contenido porcentual de DHA y DPA dentro de ONC-T18 es extremadamente alto, con niveles de EPA que se muestra que son comparables a todas las cepas cribadas. Así, parece que ONC-T18 tiene la capacidad de producir grandes cantidades de DHA, EPA y DPA bajo condiciones de fermentación como las mencionadas dentro del ejemplo 1.
9. Ejemplo 9: Información de Fuentes de Carbono Alternativas
306. Se ha observado que ONC-T18 crece preferentemente sobre medios en los que las principales fuentes de nitrógeno son extracto de levadura, glutamato sódico y/o peptona y la principal fuente de carbono es D-glucosa. Como resultado de un perfilado metabólico detallado de ONC-T18, se apreció que el glicerol (fuente de carbono) también era una alternativa viable. Por otra parte, también se probaron corrientes residuales de procesamiento de aceite de pescado que contenían glicerol con respecto a su aplicabilidad como alternativas nutritivas de bajo coste. Se realizaron experimentos que usaban 200 ml de medio en matraces de 500 ml, desarrollados a 25°C durante 3 días, 120 rpm en el caso del glicerol. El contenido de glicerol de dos productos residuales de procesamiento de aceite de pescado, GWW (lavado de agua con glicerol) y GAW (lavado ácido de glicerol) constituía 40% vol:vol de los 200 ml de medio (ajustado hasta pH 6,5), mientras que se añadía 6% de glicerol a los 200 ml de medio (p:vol) como control.
Tabla 6. Contenido de ácidos grasos, biomasa y glicerol para un estudio de fuentes de carbono alternativas.
Figure imgf000048_0001
307. El análisis de estos resultados ha determinado que el uso de componentes de corrientes residuales de aceite de pescado, tales como subproductos glicerólicos, como fuentes de carbono en la fermentación a gran escala de ONC-T18, aunque da como resultado una cantidad de ácidos grasos totales reducida, representa un contenido de DHA mantenido dentro de las células microbianas (figura 10).
10. Ejemplo 10: Multiplicador del peso celular seco
308. ONC-T18 de Thraustochytrium sp. se puede hacer crecer para la producción de aceites omega 3 en una variedad de configuraciones del reactor hasta 100.000 l. Todas las fermentaciones empiezan con la preparación de un inóculo con un volumen final de 10-20%, que se usa para establecer el cultivo de fermentación. Las configuraciones iniciales del medio comprenden hasta 6 g/l de sal marina, 10 g/l de fuente de nitrógeno y 60 g/l de fuente de carbono, con la adición discontinua de otros 75 g/l de fuente de carbono después de 24 a 36 horas de la fermentación inicial durante de 72 a 96 horas adicionales y se produce dentro del intervalo de temperatura 18-25°C. Por ejemplo, usando el medio 6 g/l de sal marina, 2 g/l de extracto de levadura, 8 g/l de L-glutamato y 60 g/l de D-glucosa (con una adición de 75 g/l añadida después de 36 horas), desarrollado a 25°C durante 96 horas, ONC-T18 era capaz de producir 40 g/l de peso celular seco (dcw), 80% (dcw) de fracción de ácidos grasos totales (TFA)/lípidos (entre C14:0 y C24:0) y 30% (TFA) de DHA. De forma similar, es posible incrementar el peso celular seco al multiplicar los componentes tanto de nitrógeno como de carbono del medio para exigir un efecto de multiplicación similar sobre la biomasa sin afectar a los contenidos de TFA o DHA. Por ejemplo, usando el medio 24 g/l de sal marina, 8 g/l de extracto de levadura, 32 g/l de L-glutamato y 300 g/l de D-glucosa, desarrollado a 25°C durante 312 horas, ONC-T18 era capaz de producir 80 g/l de peso celular seco (dcw), 60% (dew) de fracción de ácidos grasos totales (TFA)/lípidos (entre C14:0 y C24:0) 38% (TFA) de DHA.
11. Ejemplo 11: Crecimiento de ONC-T18 de Thraustochytrium sp. sobre diversas fuentes de carbono (C) y nitrógeno (N) alternativas y el efecto sobre el peso celular seco y los lípidos
309. Se investigó el crecimiento de ONC-T18 de Thraustochytrium sp. sobre una variedad de fuentes de nitrógeno y carbono de bajo coste. Específicamente, se cultivaron 50 ml de ONC-T18 en matraces de 250 ml que contenían 6 g/l de sales marinas artificiales, durante 72 horas a 25°C. Las concentraciones de las fuentes de carbono y nitrógeno se muestran posteriormente con 2 g/l de cada fuente de nitrógeno listada, usada junto con 8 g/l de L-glutamato (con la excepción de la harina de pescado en la que se usaban 4 g). Las fuentes de carbono se cambiaron según se indica. Todos los experimentos se realizaron por triplicado; todas las extracciones para el análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos se realizaron por triplicado junto con inyecciones de GC por triplicado.
310. Los resultados indican que ONC-T18 de Thraustochytrium sp. produce una biomasa celular seca óptima (es decir, mayor que los dos medios de control) cuando se hace crecer sobre las fuentes de nitrógeno extracto de levadura EMD y harina de pescado. A la inversa, se encontró que el lípido era menor que el control, mientras que el DHA era óptimo usando licor de fermentación de maíz y peptona EMD. Finalmente, se encontró que la fuente de carbono dextrosa incrementaba el contenido de lípidos, mientras que la fructosa y la dextrosa producen un contenido de DHA más alto que los controles.
Tabla 7: Crecimiento de ONC-T18 de Thraustochytrium sp..
Figure imgf000049_0001
Abreviaturas:
MSG = L-glutamato (sódico) YE = Extracto de levadura
12. Ejemplo 12: Técnicas de extracción para el aislamiento de lípidos totales y fracciones
311. Se probó una variedad de métodos para el aislamiento de aceites omega-3 seleccionados a fin de determinar la eficacia de aislamiento óptima. Estos métodos incluían: el método de Bligh y Dyer estándar (Bligh & Dyer, Can J. Biochem. Physiol., 37:912-917, 1959); el método de extracción y transesterificación combinadas usado específicamente con especies de traustocítridos que permite el procesamiento de muestra para el análisis rápido de FAME por GC (Lewis y cois., J Microbiol. Methods, 43:107-116, 2000); extracción mediante saponificación simultánea (Cartens y cois., J. Am. Oil Chem. Soc. 73:1025-1031, 1996); y extracción en fase sólida usando columnas de gel de sílice que pueden aislar selectivamente triglicéridos; diglicéridos y monoglicéridos (Pinkart y cols., J. Microbiol. Methods, 34:9-15, 1998; Bateman & Jenkins, J. Agric. Food Chem., 45:132-135, 1997).
312. Específicamente, 40 gramos de biomasa de ONC-T18 de Thraustochytrium sp. en peso celular seco producida en una sola ronda de fermentación (véase el ejemplo 1) se dividieron en lotes de 0,44 g y se usaron para cada técnica. Todas las técnicas se realizaron por triplicado con las eficacias analizadas usando determinación de ésteres metílicos de ácidos grasos a través de FID-GC, de nuevo por triplicado con rondas por triplicado por muestra. Los resultados demuestran que el contenido de ácido graso total podría variar entre métodos individuales con fluctuaciones debidas lo más probablemente al disolvente: saturación de compuestos, consideraciones de perturbación de la biomasa y otras consideraciones de la condición física (p. ej. temperatura y tiempo).
Tabla 8: Técnicas de extracción para el aislamiento de lípidos totales y fracciones.
Bligh y Dyer
DHA EPA C14:0 C14:1 C15:0 C16:0 C16:1 C18:1 C20:0 C20:4 C22:5 TFA mg de omega-3 por gramo de biomasa (mg/g)
1 104,39 4,25 36,28 5,82 113,94 77,27 4,92 44,01 1,13 1,67 28,86 430,99 2 136,75 5,45 46,51 7,40 142,96 98,38 6,07 56,49 1,40 2,19 37,92 552,98 3 134,59 4,78 42,51 6,91 128,54 87,01 5,20 51,10 1,30 2,10 35,98 532,91 Av. 125,24 4,83 41,77 6,71 128,48 87,55 5,40 50,53 1,28 1,99 34,25 505,63
Transesterificación Directa
DHA EPA C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C20:0 C20:4 C22:5 TFA mg de omega-3 por gramo de biomasa (mg/g)
1 104,39 4,24 36,39 5,42 112,94 75,27 5,42 44,01 1,13 1,67 28,86 420,99 2 89,83 4,54 34,81 5,60 103,04 73,43 5,56 42,85 0,98 1,87 25,35 392,88 3 101,64 4,25 37,16 5,98 106,94 75,98 5,35 43,95 1,11 1,78 26,46 410,65 Av. 98,65 4,34 36,12 5,67 107,64 74,89 5,44 43,60 1,07 1,77 26,89 408,17
Saponificación simultánea
DHA EPA C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C20:0 C20:4 C22:5 TFA mg de omega-3 por gramo de biomasa (mg/g)
1 204,85 6,75 46,55 8,56 182,26 134,81 8,73 105,04 2,16 3,20 66,68 785,25 2 188,51 6,17 47,64 9,32 208,29 121,25 10,35 95,80 2,53 2,89 61,41 770,14 3 198,25 6,12 47,21 9,65 207,71 136,51 9,58 98,50 2,41 3,10 63,58 782,54 Av. 197,20 6,35 47,13 9,18 199,42 130,86 9,55 99,78 2,37 3,06 63,89 779,31
Extracción en fase sólida
DHA EPA C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 < C20:0 C20:4 C22:5 TFA mg de omega-3 por gramo de biomasa (mg/g)
1 169,17 0,42 68,41 10,83 204,43 140,14 8,09 76,97 1,75 3,00 47,05 748,33 2 172,26 0,44 69,59 11,01 207,01 143,74 8,11 78,72 1,74 3,27 47,86 819,04 3 173,65 0,43 69,21 11,31 208,97 146,64 8,16 77,64 1,73 3,64 46,98 785,64 Av. 171,69 0,43 69,07 11,05 206,80 143,51 8,12 77,78 1,74 3,30 47,30 784,34 N.B: Cada valor listado anteriormente es el promedio de rondas por triplicado que usan FID-GC para el análisis de
FAME
13. Ejemplo 13:
a) Materiales y Métodos
(1) Aislamiento y Mantenimiento de traustocítridos
313. Setenta muestras marinas incluyendo: Spartina alterniflora, Zostera marina y sedimento se recogieron en zonas de la costa este canadiense de Nueva Escocia, Prince Edward Island, New Brunswick, Newfoundland y Labrador entre julio y agosto de 2002. Las muestras se pusieron en viales de 20 ml que contenían 10 ml de agua marina natural estéril filtrada a través de 0,2 gm y 300 mg l-1 de penicilina y 500 mg l-1 de estreptomicina. Las suspensiones se cebaron con polen estéril (Acer sp.) y se incubaron durante 48 horas a 18°C, según (Bremer, Marine Mycology - A Practical Approach, Fungal Diversity Press, Hong Kong, pp 49-61 (2000)). A continuación, los granos de polen se transfirieron mediante una presilla y se rayaron sobre placas de agar B1 (1 g l-1 de extracto de levadura, 1 g l-1 de peptona, 10 g l-1 de agar para 1 l de agua marina natural) que contenía antibióticos y se incubó. Colonias hialinas irregulares individuales constituidas por células esféricas o limaciformes y atípicas de colonias bien de levadura o bien bacterianas se recogieron y se subcultivaron al menos tres veces sobre placas de B1 para la pureza.
(2) Producción de biomas para el cribado de ácidos grasos
314. Para cribar aislados con respecto al crecimiento y la producción de ácidos grasos, se preparó un medio líquido usando agua marina natural filtrada a través de 0,2 gm que contenía 2 g l-1 de peptona (BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU. de A.) y 2 g l-1 de extracto de levadura (BD, Franklin Lanes, NJ, EE. UU. de A.), que se esterilizaba mediante tratamiento en autoclave, seguido por la adición de 5 g l-1 de glucosa esterilizada a través de un filtro de 0,2 gm (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. de A.) (Bowles y cols., J Biotechnol 70:193-202 (1999)). Un volumen de 30 ml de cultivo se inoculó mediante una presilla desde una placa de agar y se hizo crecer durante 4 días a 18°C sobre un agitador a 100 RPM. A continuación, se usaron 5 ml de este cultivo para inocular un cultivo de 95 ml incubado durante 4 días adicionales (fase estacionaria). Las células se recogieron mediante centrifugación a 4.500 RPM, se enjuagaron con 5 ml de agua destilada y se recentrifugaron. Las pellas celulares se liofilizaron, se pesaron y se almacenaron a -80°C antes de la derivación para el análisis de ácidos grasos.
(3) Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME)
315. La extracción de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) era a través del método de transesterificación directa, modificado a partir de Lewis y cols. (J Microbiol Meth. 43:107-116 (2000)). Específicamente, se añadieron 20 mg de material liofilizado y 3 ml de mezcla de reacción de transesterificación (metanol:ácido clorhídrico:cloroformo (10:1:1 vol/vol)). Las células se sometieron a turbulencia durante 10 segundos para asegurar incluso la dispersión de biomasa y se pusieron a 90°C durante 120 minutos. Una vez que finalizaba la transesterificación, las muestras se retiraron y se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente. A continuación, se añadió agua (1 ml) y se sometió a turbulencia durante 10 segundos. A continuación, los FAMEs se extrajeron con la adición de 3 x alícuotas de 2 ml de hexano:cloroformo (4:1), se sometieron a turbulencia durante 10 segundos y se dejaron sedimentar hasta que se conseguían separaciones de líquido transparente.
(4) Análisis cromatográfico de gases (GC) de FAMES
316. El análisis por GC de FAMES se llevó a cabo usando dos estándares internos (200 gl cada uno). Se añade un ácido hexacosaenoico (C23:0) antes de la transesterificación y el otro ácido nonadecaenoico (C19:0) se añade directamente antes del análisis. El análisis se realizó usando un GC Agilent 6890 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU. de A.) equipado con una columna capilar con sílice fundida OMEGAWAX 320 de 30 m x 0,32 m de diámetro interno (espesor de la película 0,25 gm) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. de A.) y un detector de ionización a la llama (volumen de inyección 1 gl, portador H2 gaseoso con un flujo constante de 5,0 ml min-1 y graduado a 250°C, relación de separación 50:1 al detector de FID a 275°C). La confirmación de la identidad del FAME se realizó usando un espectrómetro de masas Trace GC-DSQ (Thermo Electron, Boston, MA, EE. UU. de A.) y una comparación de los tiempos de retención para los estándares de laboratorio.
(5) Identificación genética
317. El ADN genómico se extrajo usando el MoBio UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU. de A.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores oligonucleotídicos usados al amplificar el gen de ARNr de 18S se modificaron a partir de Vinda y cols. (J Eukaryot Microbiol. 46:637-647 (1999)), a saber, T18S1 F 5'-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3' y T18S5R 5'-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3'. Una mezcla de reacción de PCR de 20 gl contenía 2 U de ADN polimerasa Biolase™ (Biolin, Boston, MA, EE. UU. de A.), 1 x tampón de reacción de NH4, 3 mM de MgCl2, 1 M de betaína (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU. de A.), 200 gM de nucleótidos de PCR mixtos (Promega, Madison, WI, EE. UU. de A.), 1 gM de cada cebador directo e inverso (MWG Biotech., High Point, NC, e E. UU. de A.) y 100 ng de plantilla de AdN genómico. Después de una etapa de desnaturalización inicial cuatro minutos a 94°C, se realizó amplificación por PCR usando un ciclador térmico Eppendorf Master Cycle Gradient (Eppendorf, Westbury, NY, EE. UU. de A.), usando un programa de 45 segundos a 94°C, 30 segundos a 64°C y 2 minutos a 72°C durante 30 ciclos, seguido por una extensión final de 10 minutos a 72°C. El producto de PCR se purificó usando MoBio UltraClean PCR Clean-up Kit (MoBio Laboratories Inc, Carlsbad, CA, EE. UU. de A.) para la secuenciación directa (MWG Biotech., High Point, nC, EE. UU. de A.) usando los cebadores FA2, FA3, rA1, R (Mo y cols., Mar Biol 140:883-889 2002), T18S1F y T18S5R. Las secuencias resultantes se alinearon y se compararon con secuencias nucleotídicas de microorganismos similares almacenados en GenBank (Benson y cols., Nucleic Acids Res 33:D34-38 (2005)) usando DS Gene (Accelrys, San Diego, CA, EE. UU. de A.). Posteriormente, se generó un árbol filogenético usando el método de unión de vecinos (Saito and Nei, Mol Biol Evol 4:406-425 (1987)), con la significación estadística determinada usando 1.000 remuestreos de arranque (“bootstrap”) (Felsenstein, Evolution 39:783-791 (1985)).
(6) Identificación de carotenoides
318. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3800 x g y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se resuspendieron en 10 x volumen de acetona (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU. de A.), se agitaron durante 5 minutos a 200 RPM, se centrifugaron a 3.800 x g durante 5 min y se concentraron hasta sequedad mediante evaporación de N2. Seguido por resuspensión en una cantidad mínima de acetona al 10% en hexano antes del análisis por HPLC. Las identificaciones se llevaron a cabo en un HPLC Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU. de A.) equipado con un detector de longitud de onda variable graduado a 470 nm. Las muestras se inyectaron a través de una columna de seguridad Symmetry C18 (Waters, Milford, MA, EE. UU. de A.) hasta una columna en fase inversa Bondclone C18 (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU. de A.; partículas de 10 gm; 3,9 x 300 mm de diámetro interno). El volumen de inyección era 10 gl y se usó un flujo de 1 ml min-1 de acetona al 10% en hexano a lo largo de un período de 25 minutos. La identidad del carotenoide se confirmó adicionalmente con análisis por espectrometría de masas (Micromass ESl-QTof MS, Waters, Milford, MA, EE. UU. de A.). Los datos cuantitativos para cada carotenoide se basaban en el desarrollo de una curva de calibración usando estándares (astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona y ^-caroteno) y comparando la superficie de los picos con concentraciones definidas.
(7) Optimización de la fermentación
319. El efecto del carbono, el nitrógeno y la sal marina sobre la producción de ácidos grasos y DHA se examinó usando cultivos discontinuos en matraces de Erlenmeyer de 250 ml removidos a 130 RPM durante 3 días a 25°C. Se llevaron a cabo estudios de cultivo adicionales usando un Biostat® Bplus Twin SL Bioreactor (Sartorius BBI Systems Inc., Betlehem, PA, EE. UU. de A.). Se usó un inóculo de 100 ml para inocular 4,9 l de medio al biorreactor. La concentración de glucosa se midió usando el Glucose (HK) Assay Kit (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU. de A.) según las instrucciones del fabricante. Los constituyentes del medio y las condiciones empleadas en el biorreactor se detallan con los resultados pertinentes.
b) Resultados
320. Se desarrolló un procedimiento de recolección y cribado por el que miembros de la familia de protistas Labyrinthulida, especialmente el género Schizochytrium y Thraustochytrium, se aislaban usando cebado con polen y medios bacteriológicos selectivos. Este estudio, que cubre 20 zonas de recogida únicas dispersadas a través de las provincias atlánticas de Canadá, producía 68 cepas puras, identificadas microscópicamente. La selección de cepas oleaginosas, que tienen más de 20% de su peso celular seco que son ácidos grasos, se basaba en los resultados del perfilado de PUFA por GC, la productividad de la biomasa, las concentraciones máximas de TFA, DHA y en menor extensión EPA (Fig. 11), según el método de (Lewis y cols., J Microbiol Meth 43.107-116 (2000)). Los valores para las productividades de biomasa, TFA y DHA y EPA posteriores variaban de 100 a 2300 mg l-1, de 27,1 a 321,14, de 5,18 a 83,63 y de 2,97 a 21,25 mg g-1, respectivamente (Fig. 11).
321. Todos los aislados que crecían en medio líquido (54 de 68) producían cantidades importantes de ácido graso poliinsaturado omega-3, particularmente DHA que comprendía entre 22 y 80% del contenido de C20 a C22 total de estas células (Fig. 11). Esto confirma hallazgos previos, por los que traustocítridos aislados de ambientes de temperatura fría tienen perfiles de ácidos grasos con DHA que son hasta 53% del ácido graso total presente (Bowles y cols., J Biotechnol 70:193-202 (1999) y Huang y cols., Mar Biotechnol 5450-457 (2003)). De particular interés es ONC-T18 que produce hasta 90% de su contenido de C20 a C22 como DHA que es aproximadamente 35% de los ácidos grasos intracelulares totales. Se observó que este contenido de DHA era equivalente a los de varias cepas de producción comercial, tales como Schizochytrium sp. ATCC 20888 (32%) y S. limacinum MYA- 1381/SR21 (34%) (Barclay y cols., J Appl Phycol 6:123-129 (1994) y Yokochi y cols., Appl Microbiol Biotechnol 49:72-76, (2003)). Por otra parte, todos los aislados sintetizaban ácido eicosapentaenoico (EPA), variando entre 2 y 20% p/p de PUFAs totales identificados (Fig. 11). Además de los aceites omega-3 producidos, aproximadamente 80% de todos los aislados sintetizaban los PUFAs omega-6 ácido araquidónico (AA) o ácido docosapentaenoico (DPA) en concentraciones que variaban entre 1 y 18% y 3 y 7% p/p, respectivamente (Fig. 11).
322. Huang y cols. (Mar Biotechnol 5:450-457 (2003)) sugirieron que para traustocítridos aislados de las aguas costeras tropicales de Japón y Fiji, se podían describir cinco perfiles de ácidos grasos poliinsaturados, a saber DHA/DPA (n-6), DHA/DPA/EPA, DHA/EPA, DHA/DPA/EPA/AA y DHA/DPA/EPA/AA/ácido docosatetraenoico (Huang y cois., Mar Biotechnol 5:450-457 (2003)). En el caso de esta colección de traustocítridos, aislados de las aguas templadas de las provincias atlánticas de Canadá, se podían determinar cuatro perfiles de PUPA, tres de los cuales son idénticos a los mencionados anteriormente, a saber, DHA/DPA/EPA en 7,4% de la colección, DHA/EPA en 13% de la colección y DHA/DPA/EPA/AA, 74%, con un cuarto que comprende una mezcla de DHA/EPA/AA en 5,6%.
323. A través de la secuenciación directa del gen de ADNr de 18S, ONC-T 18 se identificó positivamente como un miembro de la familia de traustocítridos (Número de Registro del GenHank: DQ374149). El análisis filogenético indicaba que ONC-T18 formaba un grupo único (97,5% de identidad) con Thraustochytrium striatum T91-6 (Fig. 12) (Leander y Porter, Mycologia 93:459-464 (2001)). Mientras, se obervaba que Thraustochytriidae sp. MBIC 11093, N1-27 y Thraustochytrium sp. CHN-1, recogidas de las aguas costeras tropicales de Japón, y encontradas como productores significativos de DHA (Carmona y cols., Biosci Biotechnol Biochem 67:884-888 (2003) y Huang y cols., Mar Biotechnol 5:450-457 (2003)), eran 96, 95,5 y 94,5% similares, respectivamente. La diversidad genética es bastante baja entre todos los miembros de los Thraustochytriidae mostrados en la figura 12, variando de 97,5-91,0% de similitud en todos ellos. Sin embargo, estas especies están distribuidas mundialmente, con dos tercios aislados de las aguas costeras tropicales de Japón, China e Israel y lo restante de las aguas templadas de América, Europa y Canadá.
324. El perfil de ácidos grasos de ONC-T18 incluía altos contenidos de PUFA C22, niveles muy bajos de FA C18 y C20 y la presencia de ácidos grasos saturados de cadena impar (15:0 y 17:0), similares a los de Schizochytrium sp. KH105 o S. limacinum SR21. Por otra parte, el análisis de los perfiles de utilización de carbono y nitrógeno para las cepas ONC-T18, SR21 y KH105 mostraba un patrón de asimilación similar. El contenido de DPA n-6 en la cepa ONC-T 18 variaba de 6-10%, que parece ser extremadamente alto cuando se considera la presencia limitada de DPA n-6 en la biosfera. Sin embargo, fueron presentados niveles de DPA distintos de 6 por Nakahara y cols. (J Am Oil Chem Soc 73:1421-1426 (1996)) en Schizochytrium sp. SR21 (6-10%) y Ellenbogen y cols. (Comp Biochem Physiol 29:805-81 (1969)) en T. aureum (9,5%) y T. roseum (6,6%).
325. El análisis del perfil de ácidos grasos de ONC-T 18 bajo tres condiciones de cultivo diferentes: (1) placa de agar; (2) matraz cónico y (3) biorreactor y desarrollado bajo el mismo medio (Fig. 13), muestra una disminución en la diversidad de PUFAs presentes y un incremento global en TFA desde la placa de agar al biorreactor. Específicamente, las placas de agar exhibían una serie de PUFAs, mientras que los cultivos desarrollados en matraz y biorreactor estaban dominados por uno o dos productos intermedios (Fig. 13). En comparación con Thraustochytrium aureum, que crecía mejor en cultivo en matraz que en un fermentador de depósito agitado (Ilda y cols., J Ferment Bioeng 81:76-78 (1996)), ONC-T18 crecía mejor en un biorreactor. Este resultado está de acuerdo con el de (Nakahara y cols., J Am Oil Chem Soc 73:1421-1426 (1996)), que encontraron que Schizochytrium sp. SR21 mostraba alta resistencia a la remoción mecánica, y por lo tanto prosperaba bajo condiciones de biorreactor.
326. Por otra parte, se encontró que se producían pigmentos carotenoides en fermentaciones en placa, matraz y biorreactor de ONC-T18 de Thraustochytrium sp., dando como resultado una decoloración naranja claro. La producción de estos antioxidantes es máxima dentro de fermentaciones en biorreactor simultáneamente con producción de ácidos grasos. Por otra parte, a través del uso de HPLC- espectrometría de masas, se determinó que estos compuestos antioxidantes se identificaban como astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona y pcaroteno (Fig. 14), que estaban conjugados a diversos PUFAs. Se presentaron resultados similares entre miembros del grupo traustocítrido de protistas. Específicamente, se mostró que Schizochytrium aggregatum producía equinenona y cantaxantina (Valadon, Trans Br Mycol Soc 67:1-15 (1976)), mientras que Carmona y cols. (Biosci Biotechnol Biochem 67:884888 (2003) y Huang y cols. (Mar Biotechnol 5:450457 (2003)) demostraron la producción de astaxantina, equinenona, cantaxantina, foenicoxantina (no zeaxantina como en ONC-T18) y p-caroteno por CHN-1 de Thraustochytrium sp., un pariente cercano de ONC-T18 (Fig. 12). En este estudio, se encontró que las concentraciones de estos carotenoides eran un orden de magnitud menores que las de CHN-1, siendo el compuesto principal p-caroteno, en lugar de astaxantina. Así, dentro de Thraustochytrium spp., la producción de PUFA y carotenoides puede estar conectada, de modo que las grasas de almacenamiento que se producen puedan estar protegidas de la oxidación.
327. Previamente, se ha determinado que las cantidades relativas de los componentes de ácido graso principales (ácidos mirístico, palmítico y oleico) se pueden alterar algo al cambiar las condiciones de crecimiento del cultivo (Ilda y cols., J Ferment Bioeng 81:76-78 (1996)). De este modo, se puede manipular la composición de ácidos grasos final y, de ahí, las propiedades físicas del PUFA deseado de un modo controlado durante la fermentación (Sijtsma y cols., Recent Res Devel Microbiol 2:219-232 (1998)). En un intento de limitar los factores que inhiben la producción tanto de biomasa como de PUFA omega-3 en ONC-T18, se manipularon los componentes de carbono, nitrógeno y sal marina en medios nutritivos (Tabla 9), junto con la duración del cultivo (Fig. 15).
Tabla 9: Producción media de biomasa (SD <15 %), contenido de ácido graso total (TEA)
y DHA de ONC-T18 de Thraustochytrium sp..
Glucosa (g l-1) Biomasa (g l-1) TFA. (% biomasa) DHA (% TFA) DHA (g l-1)
5 12,13 5,21 29,18 0,18
20 13,73 29,59 24,01 0,98
40 16,69 59,39 23,88 2,37
60 21,08 51,01 26,17 2,81
100 18,40 69,49 31,55 4,03
160 10,68 9,40 30,01 0,30
YE (g l-1) MSG (g l-1) Biomasa (g l-1) TFA (% biomasa) DHA (% TFA) DHA (g l-1)
10 0 22,33 34,53 20,20 1,56
8 2 22,81 44,00 17,52 1,72
6 4 22,64 50,69 16,23 1,86
4 6 24,46 69,07 24,19 4,09
2 8 26,09 81,73 20,99 4,47
0 10 7,50 1,97 28,81 0,04
Sal marina (g l-1) Biomasa (g l-1) TFA (% biomasa) DHA (% TFA) DHA (g l-1)
2 24,70 59,23 31,44 4,60 6 21,08 51,01 26,17 2,81 15 22,90 69,32 25,32 4,02 30 17,76 61,02 25,25 2,74 40 17,27 68,21 24,02 2,83 50 18,77 59,63 22,56 2,53
328. Dentro de este estudio, a medida que la concentración de nitrógeno disminuía, el contenido de ácido graso total se incrementaba, con el contenido de ácido graso total más alto (aproximadamente 80%) obtenido a una concentración de 1% de extracto de levadura y/o glutamato monosódico (p/v). Sin embargo, los cultivos con una concentración de nitrógeno baja también limitaban el crecimiento celular y de ahí la producción de ácido graso total. La producción óptima en este experimento se obtenía usando 8 g l-1 de glutamato monosódico y 2 g l-1 de extracto de levadura, produciendo 26,1 g l-1 de biomasa y 4,5 g l-1 de DHA (Tabla 9). Por otra parte, los incrementos en el carbono hasta 100 g l-1 incrementaban eficazmente el rendimiento de DHA, esto está de acuerdo con resultados obtenidos para Schizochytrium sp. SR21 (Yokochi y cols., Appl Microbiol Biotechnol 49:72-76, (2003)) y es contrario a los mostrados en T. aureum donde concentraciones de glucosa por encima de 10 g l-1 eran inhibidores (Ilda y cols., J Ferment Bioeng 81:76-78 (1996)). Se obtenían rendimientos de DHA máximos de más de 4,0 g l-1 en medio de glucosa, con rendimientos de más de 5 veces los de T. aureum (Bajpai y cols., J Am Oil Chem Sac 68:509-514 (1991)) y T. roseum (Li y Ward, Ind Microbiol 13:238-241 (1994)) y comparables con los de Schizochytrium sp. SR21 y KH105 (Aki y cols., J Am Oil Chem Soc 80:789-794 (2003)). Finalmente, ONC-T18 exhibía capacidades eurihalinas clásicas, siendo capaz de soportar salinidades que variaban de 2,0 a 50,0 g l-1, dando como resultado una productividad de biomasa de 25-30% de variabilidad (Tabla 9). En el mismo experimento, se encontró que los valores de DHA g l-1 variaban hasta 45% entre el óptimo a 4,6 g l-1 y el mínimo a 2,5 g l-1 (Tabla 9).
329. La biomasa, el TFA y el DHA producidos por ONC-T18 a lo largo de un período de 168 h en un biorreactor de 5 l se presentan en la Figura 15. La curva de crecimiento representada es típica de varias alcanzadas bajo condiciones idénticas. La producción máxima de biomasa se alcanzaba después de 120 h, cerca del punto de agotamiento de la fuente de carbono (es decir, glucosa). Este también era el punto en el que el contenido de ácido graso total de la biomasa alcanzaba un máximo a alrededor de 70% de biomasa. De forma interesante, después de solo 24 h de cultivo, el contenido de DHA se disparaba hasta 30% de ácido graso total, permaneciendo posteriormente constante a 20-25%. Estos resultados son coherentes con los de otras cepas de traustocítridos productoras de ácidos grasos, no obstante, existe una disparidad con respecto a la velocidad a la que se producen estas reacciones.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una composición lipídica que comprende de 25% en peso a 40% en peso de DHA n-3, de 6% en peso a 10% en peso de DPA n-6 y de 0% en peso a 3% en peso de EPA n-3, que comprende, además:
(i) de 11% en peso a 15% en peso de ácido mirístico; o
(ii) de 3% en peso a 7% en peso de ácido palmitoleico; o
(iii) al menos 1% en peso de material carotenoide.
2. La composición lipídica según la reivindicación 1, en donde dicha composición lipídica se deriva de un microorganismo eucariótico Thraustochytrium sp.
3. La composición lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha composición lipídica comprende además una cantidad eficaz de al menos un antioxidante añadido para proporcionar estabilidad oxidativa.
4. Un producto alimenticio, un cosmético o una composición farmacéutica para animales o seres humanos, que comprende la composición lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. El producto alimenticio según la reivindicación 4, en donde el producto alimenticio es una leche maternizada.
6. El producto alimenticio según la reivindicación 4, en donde el producto alimenticio es leche, una bebida, una bebida terapéutica, una bebida nutricional o una de sus combinaciones.
7. El producto alimenticio según la reivindicación 4, en donde el producto alimenticio es un aditivo para un alimento para animales o seres humanos.
8. El producto alimenticio según la reivindicación 4, en donde el producto alimenticio es un complemento nutricional.
9. El producto alimenticio según la reivindicación 4, en donde el producto alimenticio es un pienso.
10. El pienso según la reivindicación 9, en donde el pienso es un pienso de acuicultura.
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