JP2764572B2

JP2764572B2 - ドコサヘキサエン酸生産能を有する新規微生物及びそれを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法

Info

Publication number: JP2764572B2
Application number: JP8099317A
Authority: JP
Inventors: 俊弘横地; 東郎中原; 孝規東原
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1995-04-17
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1998-06-11
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: JPH09284A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ドコサヘキサエン
酸（ＤＨＡ）生産能を有する新規微生物、ならびにドコ
サヘキサエン酸含有油脂及びドコサヘキサエン酸の微生
物を用いた製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ドコサヘキサエン酸は、動物の脳や網膜
に特異的に存在する高度不飽和脂肪酸であり、それらの
器官における重要な生理的役割を果たすとともに、抗炎
症作用、血中コレステロール低下作用などの生理活性を
も有する。そのようなことから、ドコサヘキサエン酸
は、医薬、食品分野における利用が注目されている有用
物質であり、近年、健康食品や乳児用ミルクなど、機能
性食品分野においても利用が広がっている。

【０００３】ドコサヘキサエン酸は、青魚に属する魚油
中に含まれ、特にイワシやマグロ由来の油には20％前後
含まれている。魚由来のドコサヘキサエン酸含有油脂を
食品分野において利用する場合の大きな問題は、魚臭を
取り除くために多大な操作を必要とすることである。ま
た、魚由来のドコサヘキサエン酸含有油脂には、アラキ
ドン酸やイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）など各種の高度
不飽和脂肪酸が含まれるため、酸化され易く、安定した
品質の油脂を得ることが困難である。さらに、ドコサヘ
キサエン酸を医薬品等の分野で利用する場合には、ドコ
サヘキサエン酸含有油脂からドコサヘキサエン酸を分離
精製することが必要であるが、ドコサヘキサエン酸に構
造が類似した各種高度不飽和脂肪酸が含まれているた
め、分離精製は困難である。特に乳児用ミルクの調合に
おいては、イコサペンタエン酸含有割合の低いドコサヘ
キサエン酸含有油脂が望ましいが、供給源が魚油の場
合、イコサペンタエン酸のみを効率的に除くことはきわ
めて困難である。

【０００４】魚油以外のドコサヘキサエン酸の供給源と
して、微生物による生産方法が考えられている。ドコサ
ヘキサエン酸含有油脂を生産する微生物としては、深海
から分離された細菌ビブリオマリナス(Vibrio marinu
s)(ATCC 15381)や深海魚の腸内から分離されたビブリオ
属細菌、鞭毛菌類であるスラウストキトリウムアウレ
ウム(Thraustochytrium aureum)(ATCC 34304) 、ジャポ
ノキトリウム(Japonochytrium sp.)(ATCC 28207)、微細
藻類であるシクロテラクリプティカ(Cyclotella cryp
tica) などが知られており、これらの微生物を利用した
培養法によるドコサヘキサエン酸含有油脂の生産も検討
されてきた(P.K.Bajapai、 P.BajapaiとO.P.Ward, J. A
m. Oil Chem. Soc., 68:509 (1991)及び特開平1-199588
号公報参照) 。しかしながら、従来公知の微生物による
方法によれば、培地１リットル当たりのドコサヘキサエ
ン酸含有油脂の生産量が100〜700mg程度と少ない。従っ
て、ドコサヘキサエン酸の生産量としても培地１リット
ル当たり数十mgから500mg程度ときわめて低い水準に止
まっている。

【０００５】従来公知の微生物によるドコサヘキサエン
酸含有油脂の生産性がきわめて低い理由としては、これ
らの菌の増殖性がきわめて低いことが挙げられる。すな
わち、これらの菌は増殖速度が小さく、また到達する菌
体濃度が低い。菌の増殖性が低いことは、これらの微生
物が低栄養性であることに関係しており、すなわちこれ
らの微生物は基質による増殖阻害を受けやすいためにグ
ルコースなどの炭素源の濃度を培地１リットル当たり20
ｇ程度と低い値にすることしかできず、効率的に菌の増
殖を行わせることができない。このように菌の増殖性が
低い結果、ドコサヘキサエン酸含有油脂の生産も制限さ
れることになる。また、従来公知の微生物の菌体内のド
コサヘキサエン酸含有油脂の蓄積性が低い、すなわちド
コサヘキサエン酸含有油脂の含量が、乾燥菌体当たりせ
いぜい20重量％止まりであることもドコサヘキサエン酸
含有油脂の低生産性の要因の一つである。

【０００６】また、従来公知の微生物を使用して得られ
る油脂中のイコサペンタエン酸含有割合は、魚油と比べ
ると相対的に低いものの、いずれも数重量％以上と依然
として高いため、ドコサヘキサエン酸の分離・精製が困
難である。

【０００７】以上のように、ドコサヘキサエン酸生産能
を有する微生物を利用したドコサヘキサエン酸の工業的
生産法は未だ確立されていない。また、ドコサヘキサエ
ン酸の生産能が高い、工業的生産に利用可能な微生物も
未だ知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ドコ
サヘキサエン酸生産能の高い微生物を提供することにあ
る。また、本発明の課題は、ドコサヘキサエン酸生産能
を有する微生物を用いて従来よりもイコサペンタエン酸
含有割合が低いドコサヘキサエン酸含有油脂を高収率で
しかも複雑な工程を要せずきわめて効率よく製造する方
法を提供することにある。更に、本発明の課題は、ドコ
サヘキサエン酸を効率よく製造する方法を提供すること
にある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決すべく鋭意研究した結果、増殖性及び油脂蓄積
性に優れるとともに、イコサペンタエン酸含量が低く、
ドコサヘキサエン酸含量の高い油脂生産能を有する新規
な微生物を見い出し、また、そのような微生物を利用し
てドコサヘキサエン酸含有油脂及びドコサヘキサエン酸
を効率よく生成せしめることができることを見いだし、
本発明を完成するに至った。

【００１０】本発明は、ドコサヘキサエン酸生産能を有
するシゾキトリウム(Schizochytrium)属SR21株である。
また、本発明は、シゾキトリウム(Schizochytrium)属に
属し、ドコサヘキサエン酸含有油脂生産能を有する微生
物であって、前記油脂中のイコサペンタエン酸含有割合
が 1.0重量％以下である油脂生産能を有する微生物を培
地中で培養し、培養物から前記ドコサヘキサエン酸含有
油脂を採取することを特徴とする、前記ドコサヘキサエ
ン酸含有油脂の製造方法である。更に、本発明は、シゾ
キトリウム(Schizochytrium)属に属し、ドコサヘキサエ
ン酸含有油脂生産能を有する微生物であって、前記油脂
に含まれる全 n-3脂肪酸に対するドコサヘキサエン酸の
含有割合が98重量％以上である油脂生産能を有する微生
物を培地中で培養し、培養物から前記ドコサヘキサエン
酸含有油脂を採取することを特徴とする、前記ドコサヘ
キサエン酸含有油脂の製造方法である。更に、本発明
は、上記のいずれかのドコサヘキサエン酸含有油脂から
ドコサヘキサエン酸を分離することを特徴とする、ドコ
サヘキサエン酸の製造方法である。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のドコサヘキサエン酸含有
油脂の製造方法において使用する微生物は、シゾキトリ
ウム(Schizochytrium)属に属し、ドコサヘキサエン酸含
有油脂生産能を有する微生物であって、該油脂中のイコ
サペンタエン酸含有割合が 1.0重量％以下である油脂生
産能を有するか、及び／又は前記油脂に含まれる全 n-3
脂肪酸に対するドコサヘキサエン酸の含有割合が98重量
％以上である油脂生産能を有する菌株であればいずれの
ものでもよい。具体的には、例えば、本発明の新規微生
物である、シゾキトリウム属SR21株を用いることができ
る。

【００１２】シゾキトリウム属SR21株は、ミクロネシア
連邦のヤップ島沿岸の海水から分離したものである。こ
のシゾキトリウム属SR21株の菌学的性質は下記のとおり
である。

【００１３】SR21株の菌学的性質は次の２つの方法によ
り調べた。まず、人工海水（トロピックマリン）１リッ
トルに、グルコース２ｇ、酵母エキス 0.2ｇ及びグルタ
ミン酸ナトリウム 0.5ｇを加えた栄養培地を小シャーレ
に入れ、同じ培地によるSR21株のフラスコ前培養液を１
滴接種し、倒立顕微鏡により細胞形態を追跡した。この
場合、アメーバ状の不定形細胞の放出が見られた。次
に、同様の追跡をフィルター滅菌した天然海水中でも行
った。この場合はアメーバ状の不定形細胞の放出は見ら
れず、２分裂を繰り返した後の栄養細胞塊のいくつかの
細胞から、遊走子の放出が観察された。或いは、２分裂
をせずに１個の栄養細胞から直接遊走子へと分化したも
のも観察された。

【００１４】遊走子放出が多く認められたサンプルにグ
ルタルアルデヒドを10容量％加え、光学顕微鏡により遊
走子の観察を行った。図１は、シゾキトリウム属SR21株
の遊走子の形態を示す光学顕微鏡写真である。更に酢酸
ウランを用いたネガティブ染色法により、鞭毛の電子顕
微鏡観察を行った。図２は、シゾキトリウム属SR21株の
遊走子の鞭毛の構造を示す透過型電子顕微鏡写真であ
る。図１は２本の長さの異なる鞭毛を示しており、図２
は鞭毛のマスチゴネマの基部、軸、頂毛からなる三部構
造を示している。また、上記２通りの倒立顕微鏡による
細胞形態観察において栄養細胞が２分裂を繰り返し、細
胞塊及び原形質のネットワークを形成するのが見られ
た。図３は、シゾキトリウム属SR21株の栄養細胞塊と原
形質とのネットワークを示す光学顕微鏡写真である。

【００１５】SR21株が寒天平板培地上で形成するコロニ
ーは、酵母のコロニーと同様のなめらかな黄土色を呈す
る。また、このSR21株を液体培地で増殖させると、増殖
により培養液の濁度が増加するが、その初期に２本の長
さの異なる鞭毛を持つ遊走子が観察される（図１）。２
本の鞭毛のうち、長鞭毛にある毛状構造（マスチゴネ
マ）が基部、軸、頂毛の三部構造をとることから（図
２）、SR21株は、クロミスタ界(Kingdom Chromista) 、
不等毛門(Phylum Heterokonta)に属する。さらに原形質
のネットワーク形成性、ゴルジ体由来の鱗片からSR21株
は、ラビリンチュラ綱(Class Labyrinthulea) ラビリン
チュラ目(Order Labyrinthulida)に属する。そして栄養
細胞が球形又は楕円形であること、及び原形質のネット
ワーク中の滑走運動がないことからSR21株が、スラウス
トキトリウム科(Family Thraustochytriidae) に属する
ことは明らかである。さらにSR21株の栄養細胞は２分裂
を繰り返し、８〜32個の栄養細胞塊を形成する。その後
いくつかの細胞からアメーバ状の不定形細胞が放出さ
れ、細胞塊から徐々に離れ１〜２時間後球形細胞にな
る。この球形細胞はその後遊走子嚢として８ないし16個
の遊走子へ分化する。その際、遊走子嚢の膜は観察され
ない。さらに２分裂をせずに１個の栄養細胞から直接遊
走子嚢へ分化したり、２分裂をして栄養細胞塊となった
後に不定形細胞を経ないで遊走子へ分化する細胞もあ
り、複雑な生活環を有する。

【００１６】スラウストキトリウム科はポーター(D. Po
rter, “Handbook of Protoctista”, Jones and Bartl
ett Publishers (1990)) によれば７属30種よりなる。
その後、コラロキトリウム(Corallochytrium) 属(Raghu
kumar, S., Botanica Marina, 30: 83(1987)) が加えら
れ、モス(Moss, S. T., “The Biology of Free-living
Heterotrophic lagellates ”, Oxford University Pr
ess (1991)) によれば８属33種とされる。スラウストリ
ウム科８属の特徴は次のとおりである。ラビリンチュロ
イデス(Labyrinthuloides)属の栄養細胞は球状である
が、原形質ネットワーク上を不規則に滑走する。また、
アプラノキトリウム(Aplanochytrium)属は不動胞子、即
ち鞭毛を持たない胞子によって増殖する。アルソーニア
(Althornia) 属は原形質ネットワークを生じず、浮遊性
である。ジャポノキトリウム(Japonochytrium)属は細胞
外に胞嚢(apophysis) を生じる。またウルケニア(Ulken
ia)属は遊走子嚢からアメーバ状の不定形細胞が放出し
た後に遊走子へ分化する。また、スラウストキトリウム
(Thraustochytrium)属は１個の遊走子から１個の栄養細
胞となり、それが１個の遊走子嚢を形成する。また、シ
ゾキトリウム(Schizochytrium)属は１個の遊走子が着生
した後に２分裂を行い、複数個の栄養細胞塊を形成し、
それぞれが遊走子嚢となる。コラロキトリウム(Corallo
chytrium) 属はコウラナメクジ状の胞子を形成し、鞭毛
を持った遊走子は形成しない。

【００１７】なお上記８属のうち、ウルケニア属につい
ては1977年ゲルトナー (Gaertner,A., Veroff. Inst. M
eeresforsch. Bremerh., 16:139(1977)) により、遊走
子嚢から裸の原形質塊（アメーバ状の不定形細胞）が放
出された後、遊走子へ分化する形質を属の分類基準に用
い、それまでスラウストリウム属に分類された２属、ス
ラウストキトリウムヴィサージェンス(Thraustochytr
ium visurgense)(Ulken, A., Veroff. Inst. Meeresfor
sch. Bremerh., 9:289(1965)) 及びスラウストキトリウ
ムアモエボイダム(Thraustochytrium amoeboidum)(Ba
hnweg, O. とSparrow, F.K., Jr. Am. J. Bot., 61:754
(1974)) の２種をウルケニア属に移すとともに、それら
にラグクーマーによる新種ウルケニアミヌータ(Ulken
ia minuta) (Raghukumar, S., Veroff. Inst. Meeresfo
rsch. Bremer., 16:159(1977))とさらに３種の新種を併
せてウルケニア属６種として新属、ウルケニア属が提唱
された。

【００１８】しかしそれ以後、ウルケニア属の新しい種
について記載した論文はみられない。カーリング (Karr
ing, J. S., "Predominantly Holocarpic and Eucarpic
Simple Biflagellate Phycomycetes", J. Cramer(198
1))はウルケニア属が独立した属として成立するかどう
かについては疑問としており、暫定的なものとして掲げ
た。ただしポーター及びモスの文献には前述の記載がさ
れている。

【００１９】SR21株はアメーバ状の不定形細胞を形成す
るので、その形質を重視するとウルケニア属に属すると
も考えられる。しかしながら、ラグクーマーはスラウス
トキトリウム属のスラウストキトリウムストリアタム
(Thraustochytriumstriatum)が、栄養培地ではバクテリ
アを捕食するアメーバ状の不定形細胞を形成することを
報告している（Raghukumar, S., Marine Biology, 113:
165(1992))。さらにラグクーマーはシゾキトリウム属の
新種としたシゾキトリウムマングローヴァイ(Schizoc
hytrium mangrovei)が、栄養培地ではアメーバ状不定形
細胞を形成するが、海水に松花粉のみを添加した栄養の
希薄な培地で培養した場合はアメーバ状不定形細胞を形
成しないことを示した（Raghukumar, S., Trans. Br. M
ycol.Soc., 90:627(1988))。そこでラグクーマーはアメ
ーバ状の不定形細胞を形成するという形質が、培地組成
や培養条件によって影響を受けることから、基準となる
培地を使ってこの形質を調査する必要があるとした。そ
の基準培地としては、従来から伝統的によく用いられて
おり、またこれまでの属や種の原記載の中で形態形質を
観察する際に用いられることの多かった前述の海水／松
花粉培地を挙げている。ウルケニア属に分類されている
６種はすべて、この海水／松花粉培地中でアメーバ状不
定形細胞を形成することが知られている。一方、スラウ
ストキトリウムストリアタムとシゾキトリウムマン
グローヴァイは栄養培地では前述のようにアメーバ状不
定型細胞を形成するものの、海水／松花粉培地ではアメ
ーバ状不定形細胞を形成しないことから、ウルケニア属
に分類されていない。以上に基づくと、SR21株は栄養培
地ではアメーバ状不定形細胞を形成するが、海水のみの
培地ではこれが観察されなかったので、ウルケニア属に
分類することは適当ではないと思われる。

【００２０】一方、１個の遊走子が着生した後の栄養細
胞が２分裂を繰り返し、複数個の栄養細胞塊を形成し、
それぞれが遊走子嚢となる形質は培地組成によらず安定
であり、SR21株の生活環の中で常に観察される形質であ
る。この形質をはじめとしてSR21株で観察される性質
は、ゴールドシュタインら（Goldstein, S. とBelsky,
M., Am. J. Bot., 51:72(1964)) 、及びブーツら（Boot
h, T. と Miller, C.E.,Can. J. Bot., 47:2051(1969))
により報告されているシゾキトリウム属の記載に矛盾
することはない。よって、SR21株はシゾキトリウム属に
分類することが妥当であると判断される。

【００２１】現在、ジゾキトリウム属の中には、次のよ
うな４種が文献に記載されている (Goldstein, SとBels
ky, M., Am. J. Bot., 51:72(1964)、Booth, T. とMill
er,C.E.,Can. J.Bot.,47:2051(1969)、Raghukumar, S.,
Trans. Br. Mycol. Soc.,90:273(1988)、Raghukumar,
S., Trans. Br. Mycol. Soc., 90:627(1988)) 。

【００２２】シゾキトリウムアグレガタム(Schizochy
trium aggregatum) は、その栄養細胞は連続する分裂に
よって多数の細胞が互いに接着した塊を形成する。その
細胞塊のうち、３、４個或いはそれ以上の細胞が遊走子
嚢へ分化する。また、１個の遊走子嚢は16〜64個の遊走
子を形成する。更に、２個の細胞からは遊走子放出は見
られないとも記載されている（Goldstein, S. とBelsk
y, M., Am. J. Bot., 51:72(1964)、Booth, T. とMille
r, C.E., Can. J. Bot., 47:2051(1969))。

【００２３】シゾキトリウムミヌータム(Schizochytr
ium minutum)は、シゾキトリウムアグレガタムと同様に
栄養細胞の分裂の結果、４〜８個或いは数百の細胞塊を
形成し、各遊走子嚢から２個の遊走子を放出する。遊走
子は豆型で、２本の鞭毛の長さは 8.5μｍと 3.0μｍ程
度である（Gaertner,A., Veroff. Inst. Meerestorsch.
Bremer.,19:61(1981)) 。

【００２４】また、シゾキトリウムオクトスポラム(S
chizochytrium octosporum) は、シゾキトリウムミヌ
ータムと異なる点は、１個の遊走子嚢から８個の遊走子
が放出されることにある（Raghukumar, S.,Trans. Br.
Mycol. Soc., 90:273 (1988)) 。

【００２５】さらに1987年、ラグクーマーがゴア（イン
ド）のマングローブの腐朽葉より分離したスラウストキ
トリウム科の生物は、栄養細胞は連続する分裂によって
細胞塊を形成することからシゾキトリウム属に分類され
た。しかしそれまでに記載されていた上記３種の遊走子
はいずれも遊走子嚢という袋の中で形成されるのに対し
て、この生物では栄養細胞の連続的な２分裂により、
４、６、８又は12個の細胞となり、それぞれの細胞が直
接遊走子となる過程をとり、遊走子嚢の形態をとらなか
った。ラグクーマーはこの特徴に注目し、新種シゾキト
リウムマングローヴァイ(Schizochytrium mangrovei)
を設けた（Schizochytrium mangrovei、Raghukumar,S.,
Trans.Br. Mycol. Soc.,90:627(1988))。

【００２６】ラグクーマーは同じ文献においてこれまで
に知られたシゾキトリウム属の検索表を提案した（表
１) 。表１に示した検索表及び４種を記載した原報とSR
21株の菌学的性質を比較してみる。まずシゾキトリウム
属SR21株は、分裂した栄養細胞が遊走子嚢の形態をとら
ずに、ひとつひとつの遊走子になるシゾキトリウムマ
ングローヴァイとは異なる。また遊走子嚢の径が14μｍ
以下で、各遊走子嚢から２個の遊走子が形成される場合
は、シゾキトリウムミヌータムに、同じく８個の遊走
子が形成される場合は、シゾキトリウムオクトスポラ
ムにそれぞれ帰属されるが、SR21株は８ないし16個の遊
走子へ分化することからこれらのどちらとも異なる。さ
らに遊走子嚢の径が15ないし25μm で遊走子嚢から16な
いし64個の遊走子（ただし記載のある原報には多くのと
いう表現のみ）が形成される場合は、シゾキトリウム
アグレガタムとされるが、この種ではアメーバ状の不定
形細胞は観察されていないためSR21株はこれとも異な
る。さらにSR21株では２分裂をしない栄養細胞又は不定
形細胞を経ないで遊走子へ分化する細胞も見られる。以
上のことから、SR21株はシゾキトリウム属の既存の４種
には該当せず、シゾキトリウム属の新種であることが認
められた。

【００２７】

【表１】

【００２８】尚、このシゾキトリウム属SR21株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成７年３月６日付け
で寄託し、受託番号FERM BP-5034を得ており、また、財
団法人発酵研究所に平成７年３月17日付けで寄託し、受
入番号IFO 32693 を得ている。

【００２９】また、本発明のドコサヘキサエン酸含有油
脂等の製造方法に用いる微生物は、前記FERM BP-5034又
はIFO 32693 に限らず、上述したシゾキトリウム属SR21
株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株であればい
ずれの菌株も使用することができる。このような微生物
を培養し、その培養菌体中にドコサヘキサエン酸含有油
脂を高濃度に蓄積させた後、そのドコサヘキサエン酸含
有油脂等を採取することによりドコサヘキサエン酸含有
油脂等を製造することができる。

【００３０】シゾキトリウム属SR21株の増殖は、当該SR
21株を天然海水又は人工海水で調製した適当な培地に接
種して、常法にしたがって培養することにより行われ
る。培地としては、公知のものをいずれも使用できる。
例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、サ
ッカロース、デンプンなどの炭水化物の他、オレイン
酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリ
ウムなどが例示できる。これらの炭素源を、例えば、培
地１リットル当たり20〜120ｇの濃度で使用する。窒素
源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリ
ペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒
素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無
機窒素が例示できる。無機塩としては、リン酸カリウム
等を適宜組み合わせて使用できる。上記の培地は、調製
後、適当な酸又は塩基を加えることによりpHを4.0〜6.5
の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌され
る。菌の培養は、培養温度は10〜35℃、好ましくは17〜
30℃にて３〜７日間、通気攪拌培養、振とう培養又は静
置培養で行われる。

【００３１】このようにして、培養物中にドコサヘキサ
エン酸含有油脂を高濃度に蓄積した菌体が、培地１リッ
トル当たり乾燥菌体重量で15〜40ｇ程度と、高い濃度で
生産される。培養物から培養液と菌体とを分離する方法
としては、従来から行われている遠心分離法や濾過等の
方法が使用できるが、遠心分離法が好適である。

【００３２】また、上記の培養物から分離した菌体を、
例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、
例えば、クロロホルム、ヘキサン等による溶媒抽出を行
うことにより、ドコサヘキサエン酸含有油脂を得ること
ができる。乾燥菌体100ｇ当たりのドコサヘキサエン酸
含有油脂の含有量は、25〜60ｇ程度であり、培地１リッ
トル当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の生産量は、
８〜15ｇ程度に達する。また、油脂の脂肪酸組成におけ
るドコサヘキサエン酸含有割合は、25〜45重量％と高濃
度で含有される。したがって、培地１リットル当たりの
ドコサヘキサエン酸の生産量としては、2.2〜7.2ｇ程度
と極めて高い。

【００３３】ドコサヘキサエン酸含有油脂からドコサヘ
キサエン酸を分離するには、混合脂肪酸あるいは脂肪酸
エステルの状態で、常法により、例えば、尿素付加法、
冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超
臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取すること
により行う。

【００３４】微生物としてシゾキトリウム属SR21株を用
いた場合、得られるドコサヘキサエン酸含有油脂の脂肪
酸組成の特徴として、ドコサヘキサエン酸が25重量％以
上の高濃度で含まれ、油脂に含まれる全n-3 脂肪酸に対
するドコサヘキサエン酸の割合は、98重量％以上である
ことが挙げられる。更に、この油脂にはアラキドン酸及
びイコサペンタエン酸がほとんど含まれないことも特徴
である。具体的には、油脂中のイコサペンタエン酸の含
有割合は 1.0重量％以下である。従って、このような油
脂はドコサヘキサエン酸の濃縮分離の面での利点を持っ
ている。また、かかる油脂はドコサヘキサエン酸と生理
活性が類似あるいは拮抗したそれらの脂肪酸をほとんど
含まないことは機能性食品や医薬品面での利用を目指す
上でも好都合である。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により、本発明をより具体的に
説明する。〔実施例１〕実験No.101〜110 フラスコに、50％濃度の人工海水（トロピックマリン）
１リットルを入れ、次いで、表２に示した炭素源及び窒
素源としてコーンスチープリカー（ＣＳＬ）を、それぞ
れ表２に示した量添加して培地を調製した。これに、シ
ゾキトリウム属SR21株を接種して、26℃で５日間、振と
う培養を行った。得られた培養物２mlを採取して遠心分
離法で菌体を集めた後洗浄し、オーブン中で110℃で５
時間乾燥することにより乾燥菌体を得た。この乾燥菌体
の重量を測定して、培地１リットル当たりの菌体量を求
めた結果を表２に示す。次いで、乾燥菌体から、常法に
従って、直接油脂の抽出及び脂肪酸メチルエステルの調
製を行った。すなわち、乾燥菌体をねじ口試験管中で10
％塩酸メタノール及びジクロロメタンを加え、60℃の温
浴中で３時間加熱して反応させた後、ヘキサンにて脂肪
酸メチルエステル成分を抽出した。ガスクロマトグラフ
分析により脂肪酸メチルエステル成分の脂肪酸組成を求
めて、ドコサヘキサエン酸の含有割合を求めた。また、
前記の反応の際に既知量の内部標準物質を添加すること
による内部標準法にて、ガスクロマトグラフ分析により
検出された全脂肪酸メチルエステル量から菌体中に含ま
れていた全脂肪酸量を、ドコサヘキサエン酸メチルエス
テル検出量からドコサヘキサエン酸生成量を求めた。こ
のようにして、培地１リットル当たりの全脂肪酸量、乾
燥菌体当たりの脂肪酸含有割合、全脂肪酸中のドコサヘ
キサエン酸（ＤＨＡ）含有割合、及び培地１リットル当
たりのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）量を求めた結果を
表２に示す。なお、ドコサヘキサエン酸は、ガスクロマ
トグラフ−質量分析法により標準物質との比較を行い、
確認した。

【００３６】

【表２】

【００３７】培地１リットル当たりの炭素源量が60〜12
0ｇと高い培地でも良好な菌体増殖が行われ、21.9〜35.
9ｇの量の菌体が得られた。また、培地１リットル当た
りの脂肪酸量も8.2〜14.6ｇであり、乾燥菌体当たり30.
3〜58.0重量％の高い含量でドコサヘキサエン酸含有油
脂が蓄積されていることが示された。さらに、全脂肪酸
中のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の含量は、25.5〜2
9.7重量％と高く、培地１リットル当たりのドコサヘキ
サエン酸（ＤＨＡ）の生産量が2.43〜4.20ｇと高いこと
が示された。

【００３８】〔実施例２〕実験No.201〜204 フラスコに、50％濃度の人工海水１リットル、炭素源と
してグルコース60ｇ、リン酸一カリウム4.0ｇ、酵母エ
キス1.0ｇ、有機窒素源としてコーンスチープリカー
（ＣＳＬ）1.0ｇを入れ、さらに無機窒素源として表３
に示したものを表３に示した量添加することにより培地
を調製した。これに、シゾキトリウム属SR21株を接種し
て、25℃で４日間、振とう培養を行った。実施例１と同
様の方法で培養後の培地１リットル当たりの菌体量、培
地１リットル当たりの全脂肪酸量、乾燥菌体当たりの脂
肪酸含有割合、全脂肪酸中のドコサヘキサエン酸（ＤＨ
Ａ）含有割合、及び培地１リットル当たりのドコサヘキ
サエン酸（ＤＨＡ）量を求めた。その結果を表３に示
す。

【００３９】

【表３】

【００４０】これらの結果から、SR21株は窒素源として
無機窒素を使用しても良好に増殖できること、そしてSR
21株は高いドコサヘキサエン酸生産性を有することが示
された。

【００４１】〔実施例３〕実験No.301〜302 グルコース60ｇ、ポリペプトン20ｇ、酵母エキス10ｇ及
び50％濃度人工海水１リットルからなる培地(A) 、又は
グルコース90ｇ、ポリペプトン10ｇ、コーンスチープリ
カー10ｇ及び50％濃度人工海水１リットルからなる培地
(B) を用いて、ジャーファーメンター（培養槽容量５リ
ットル、培地量３リットル）での培養を行った。培養
は、培養温度25℃、通気量0.5vvm、攪拌速度200rpmとし
て行った。培養後、遠心分離法により菌体を集めて凍結
乾燥し、重量法により培地１リットル当たりの菌体量を
求めた。その結果を表４に示す。乾燥菌体に、クロロホ
ルム／メタノール（2:1 v/v)混合液を加え、ガラスビー
ズの存在下でホモジナイズすることにより、菌体の破砕
と油脂の抽出を行った。抽出液をFolch 法により洗浄し
た後、溶媒を留去して精製油脂を得て、重量法により生
成油脂量を求めた。得られた油脂の一部について常法に
より脂肪酸メチルエステルを調製して、ガスクロマトグ
ラフ法により脂肪酸組成及び全脂肪酸中のドコサヘキサ
エン酸（ＤＨＡ）含有割合を求めた。ドコサヘキサエン
酸（ＤＨＡ）生成量は、油脂生成量にドコサヘキサエン
酸（ＤＨＡ）含有割合を乗じた値として求めた。これら
の結果を表４に示す。

【００４２】

【表４】

【００４３】以上の結果から、シゾキトリウム属SR21株
は、実用的な培養法である通気攪拌培養でも良好な増殖
を示すとともに、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量の
高い油脂を効率よく蓄積することが示された。ドコサヘ
キサエン酸（ＤＨＡ）の生産量は、最大で培地１リット
ル当たり7.2ｇに達し、その生産性はきわめて優れてい
る。

【００４４】〔実施例４〕実施例１〜３により得られた
油脂に含まれるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、イコサ
ペンタエン酸（ＥＰＡ）などの n-3脂肪酸それぞれの含
有割合と、全 n-3脂肪酸に対するドコサヘキサエン酸
（ＤＨＡ）の割合を表５に示す。シゾキトリウム属SR21
株より得られるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有油脂
は魚油に多く含まれるイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の
含有割合が 1.0重量％以下で、また、全 n-3脂肪酸に対
するドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有割合が98重量％
以上である。これらのことは、魚油がイコサペンタエン
酸（ＥＰＡ）を10重量％前後含んでいることに比べる
と、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の濃縮分離・精製の
操作を容易にする利点を持っていることを示すものであ
る。

【００４５】

【表５】

【００４６】〔参考例〕従来公知の微生物と、本発明の
シゾキトリウム属SR21株とのドコサヘキサエン酸生産能
の比較を行った。表６に、微生物としてスラウストキト
リウムアウレウム(ATCC 34304)を用いて培養を行って
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の生産を行った場合〔P.
Bajapai,P. K. Bajapai and O. P. Ward, Appl. Miocro
biol. Biotechnol. 35:706(1991) 、A. Kendric and C.
Ratledge, Lipids, 27:15(1992) 及びP.K.Bajapai, P.
Bajapai and O.P.Word, J. Am. OilChem. Soc., 68:509
(1991) を引用〕、微生物としてジャポノキトリウム s
p.(ATCC28207) を用いて培養を行ってドコサヘキサエン
酸（ＤＨＡ）の生産を行った場合（特開平1-199588号公
報を引用）、及び微生物としてシゾキトリウムアグレ
ガタム(ATCC 28209)〔A. Kendric and C. Ratledge, Li
pids, 27:15(1992) を引用〕並びに本発明のシゾキトリ
ウム属SR21株を用いて培養を行ってドコサヘキサエン酸
（ＤＨＡ）の生産を行った上記実験No.105、204 及び30
2 の、培地１リットル当たりの菌体量、乾燥菌体当たり
の油脂又は脂肪酸含有割合、全脂肪酸中のドコサヘキサ
エン酸（ＤＨＡ）含有割合及び培地１リットル当たりの
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）量を示す。

【００４７】

【表６】

【００４８】表６に示したように、本発明のシゾキトリ
ウム属SR21株を用いて培養を行うと従来公知の微生物と
比較して培地当たりの菌体量が非常に多く、SR21株は増
殖性が優れるということがわかる。また、本発明のシゾ
キトリウムSR21株は従来公知の微生物と比較して油脂の
含有割合も非常に高い。また、本発明によれば、全脂肪
酸中のドコサヘキサエン酸含有割合も30重量％と高いこ
とから、培地１リットル当たりのドコサヘキサエン酸量
は、従来公知の微生物を用いた場合と比較して10〜100
倍程度と高い値となり、SR21株はきわめて高いドコサヘ
キサエン酸生産能を有することが明らかである。更に従
来公知の微生物によれば、イコサペンタエン酸含有割合
が数重量％の油脂が得られるのに対し、シゾキトリウム
属SR21株によれば、イコサペンタエン酸含有割合が 1.0
重量％以下ときわめて低い油脂が得られることがわか
る。

【００４９】

【発明の効果】本発明の微生物は、増殖性及び油脂蓄積
性に優れ、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産能が高
い。よって、本発明の微生物を用いると、食品、医薬品
の分野で有用なドコサヘキサエン酸含有量の高い油脂を
従来にない高収率で効率よく製造することができる。ま
た、本発明の製造方法により得られるドコサヘキサエン
酸含有油脂は、イコサペンタエン酸含有割合が低いの
で、該油脂からのドコサヘキサエン酸の分離・精製が容
易である。したがって、そのドコサヘキサエン酸含有油
脂から効率よくドコサヘキサエン酸を製造することがで
きる。すなわち、本発明により、特に現在、魚油から分
離精製されているドコサヘキサエン酸含有油脂に代わ
る、培養法によるドコサヘキサエン酸含有油脂であっ
て、イコサペンタエン酸含有割合の極めて低いドコサヘ
キサエン酸含有油脂の優れた製造法を提供することがで
きた。

【図面の簡単な説明】

【図１】シゾキトリウム属SR21株の遊走子の形態を示す
光学顕微鏡写真である。

【図２】シゾキトリウム属SR21株の遊走子の鞭毛の構造
を示す透過型電子顕微鏡写真である。

【図３】シゾキトリウム属SR21株の栄養細胞塊と原形質
とのネットワークを示す光学顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 7/64 C12N 1/14 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ドコサヘキサエン酸生産能を有するシゾ
キトリウム(Schizochytrium)属SR21株。
【請求項２】シゾキトリウム(Schizochytrium)属に属
し、ドコサヘキサエン酸含有油脂生産能を有する微生物
であって、前記油脂中のイコサペンタエン酸含有割合が
1.0重量％以下である油脂生産能を有する微生物を培地
中で培養し、培養物から前記ドコサヘキサエン酸含有油
脂を採取することを特徴とする、前記ドコサヘキサエン
酸含有油脂の製造方法。
【請求項３】シゾキトリウム(Schizochytrium)属に属
し、ドコサヘキサエン酸含有油脂生産能を有する微生物
であって、前記油脂に含まれる全 n-3脂肪酸に対するド
コサヘキサエン酸の含有割合が98重量％以上である油脂
生産能を有する微生物を培地中で培養し、培養物から前
記ドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することを特徴と
する、前記ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項４】微生物がシゾキトリウム(Schizochytriu
m)属SR21株である、請求項２又は３に記載のドコサヘキ
サエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項５】請求項２〜４のいずれか１項に記載のド
コサヘキサエン酸含有油脂からドコサヘキサエン酸を分
離することを特徴とする、ドコサヘキサエン酸の製造方
法。