JPH07505048A - γ−リノレン酸を含有するシングルセルオイルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 γ−リルン酸を含有するシングルセルオイルの製造方法本発明は、炭素含有化学 物質を含むが、実質的に澱粉類および糖類を含まない工業排液を処理する生物学 的方法に関する。本発明は、また微生物の培養法並びに該微生物から有益な代謝 産物を回収することにも関連する。

発明の背景 炭素を主体とする工業的化学的方法は、しばしば種々の炭素含有化合物を含有す る水性排液流を生ずる。かくして、例えば炭化水素類、脂肪族アルコール類、ア ルデヒド類およびケトン類を一酸化炭素の接触的水素添加により生成するシント ール（ＳｙｎｔｈｏＬ）またはフィッシャー−トロプシュ（Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔ ｒｏｐｓｃｈ）合成法が、「フィッシャートロプシュ有機酸流（Ｆｉｓｃｈｅｒ 　Ｔｒｏｐｓｃｈ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｔｒｅａｍ）Ｊとして知られ ている水性副生成物またはｉＪＦ液流を生ずる二ｙは公知である。この流れは、 典型的には１％〜３％の範囲内の０２〜Ｃ，モノカルボン酸を、非−酸性の化学 物質、例えばケトン類およびアルデヒド類と共に含んでいる。従来は、この流れ を活性化スラッジてス）　ＩＪッピング処理して、該流れの炭素含有率を減じた 後に、該精製水をプラントの冷却回路に再循環するかあるいは河川または海に流 していた。得られたバイオマスは焼却するか、あるいは肥料として処分できる。

関連のない技術分計において、油性生物として知られるある種の微生物がシング ルセルオイル（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅ１ｌ　０ｉｌ）またはＳＣＯ’　ｓとして公 知となっている食用オイルを産生じ得ることが知られてイル（例えば、概説シン グルセルオイル（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅ１ｌ　０ｉｌ）、　Ｒ，Ｓ−モルトン（Ｍ ｏｒｅｔｏｎ）　１１！、ロングマンサイエンティフィック＆テクニカル（Ｌｏ ｎｇｍａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　＆　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）社刊、　１９８ ｇを参照のこと）。

上記モルトンの研究によれば、最初の真に工業的なＳＣＯ法は英国のスタージバ イオケミカルズ（Ｓｔｕｒｇｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社のプラントで実 施されたものであり、そこではγ−リルン酸（ＧＬＡ：　６゜９．１２−オクタ デカトリエン酸）に富む液体が生成される。ジョン＆ε、スタージリミテッド（ Ｊｏｈｎ　ａｎｄε、　Ｓｔｕｒｇｅ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）のに、Ｗ、シンデン（ Ｓｉｎｄｅｎ）の報告［Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　 １９８７．　Ｖｏｌ　９゜ＰＩ）、　１２４−１２５］によれば、ＧＬＡに富む 微生物オイルは、グルコースを主成分とする純粋な規定された基質上で培養され たムコール（Ｍ二）肚、により生産される。

γ−リルン酸は母乳、マツヨイグサオイル、エンバクおよび他の産物を包含する 数種の天然産物中に見られる高価値製品である。人体並びに動物体内において、 該γ−リルン酸はプロスタグランジンε、に転化され、このプロスタグランジン Ｅ１は身体機能、例えば腎臓、肝臓、肺、脳、神経系および免疫系を調節する重 要な局所ホルモン型の生成物の一つである。ＧＬＡを含有する製品は、現在健康 食品品目の成分として、世界中の多くの場所で広く利用されている。

文献中には、多数の油性生物が報告さている。このような油性生物を培養して脂 質を生成し得る供給原料の範囲は極めて多岐に渡る。文献の報告によれば、この ような供給原料は機密、ノくナナ、ホエーおよび馬鈴薯澱粉から、外来種の炭素 源、例えばペントース、ヘキソース糖、二層、グリセロール、アミノ酸およびエ タノールに及ぶ。一般的に、このような全ての生物はグルコースおよび他の糖を 同化し得、また幾つかは澱粉を同化し得る。炭素含有化学物質、例えばエタノー ルおよびグリセロール等の単純な形状の化学物質で培養できる微生物に関する報 告が存在するが、これらは特定のＳＣＯを産生する少数の生物のみにＩＭＩ！Ｌ 、ているに過ぎ一キ製造または食品加工工場から放出される排水で培養可能であ ることを報告している。このような排水が、これら微生物の成長を維持するため の公知の栄養分である澱粉および／または糖類を含むことは容易に理解されるで あろう。

更に、ライオン株式会社（Ｌｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による欧州特許 出願第０２６９３５１号には、幾つかのγ−リルン酸産生微生物が脂肪酸または 脂肪酸エステル、より詳細にはγ−リルン酸産生のための炭素源としての炭素原 子数８〜２２の脂肪酸により培養可能であることが報告されている。

ルン酸に富む脂質を生産でき、また該培養の効率を酢酸またはアルカリ金属酢酸 塩の添加により高めることが可能であることを報告している。

上記のことから、γ−リルン酸に富む脂質をより単純な形状の炭素源材料から生 成し得る方法を提供するのに明らかに有利であるような、γ−リルン酸に富む脂 質の他の生産体およびかかる微生物用の炭素源として使用するための他の供給原 料に関する研究が進められつつあることは明白であろう。

今や、２〜５個の範囲内の炭素厘子を有するモノカルボン酸、および特に酢酸を 主成分とする非−澱粉および非−糖性炭素を含有する幾つかの組成物が、価値あ るシングルセルオイル類を産生じ得る幾つかの油性微生物の培養用の供給原料と して使用可能であることを見出した。この予想外の発見は、この問題とする供給 原料が全ての油性微生物の成長を推持しないという事実により、より一層予想外 のものとなる。更に、現在入手可能な結果によれ　′ば、このような供給原料は 、問題とする生物のライフサイクル全体に渡り該生物の成長を維持するとは考え られない。これらの生物は該供給原料に導入された胞子から発芽し、かつその菌 糸状態にまで成長するが、該生物は一般的には胞子形成段階までは進行せず、該 炭素源が枯渇するまで、この問題とする供給原料が連続的なライフサイクルを持 続できる該生物の自然に発展する生息地を構成し得るものと考えられるような結 果を与える。この不完全なライフサイクルにも拘らず、この問題とする生物が、 問題とする供給原料中に存在する単純な化合物を高価値のオイルおよび他の化学 製品に転化し得ることを見出した。

更に、Ｃ，−Ｃ，モノカルボン酸を含む該フィッシャー−トロプシュ有機酸流が 、幾つかの種の油性微生物の培養用の供給炭素源として使用可能であることをも 見出した。

発明の目的 従って、本発明の目的の一つは、新規な供給原料組成物中で幾つかのＳＣＯ産生 微生物を培養する方法を提供し、また該培養したバイオマスからを用な脂質を回 収することにある。本発明のもう一つの目的は、排液流を処理して、該排液流か ら幾つかの炭素を主成分とする化学物質を除去する方法を提供することにある。

発明の詳細な説明 本発明によれば、γ−リルン酸を含むシングルセルオイルの製造法が提供され、 該方法は少なくとも１種のムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）目の微生物を、炭 素源物質として、少なくとも１種の２〜５個の炭素原子を存するモノカルボン酸 を含み、かつ実質的に澱粉および糖を含まない増殖培地中で培養し、該生成する 培養微生物バイオマスから該オイルを回収することを特徴とする。

本発明の一態様によれば、該微生物はモルチェレラセアエ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ ｌａｃｅａｅ）科、好ましくはモルチェレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属およ び最も好ましくはＭｏ、イサベリナ（ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ｋｌｏ、ｏンギ コる。

本発明の別の態様によれば、該微生物は、好ましくはムＨ５ｆアエ（Ｍｕｃｏｒ ａｃｅａｅ）科の微生物である。

かくして、該微生物は、好まし、くはアクチノムコール（Ａｃｔｔｎｏ１１１竺 ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）　、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）および ユゾブス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）　（９モノスカビ）民からなる群から選ばれる微 生物である。

本発明のこの態様において、該微生物は、最も好ましくは、４ｐＭｕ、　シルシ ネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）　ｆ、シルシネロイデスＭｕ、ヒ エマリス（ｈｉｅｍａｌｉｓ）　ｆ、ヒエマリス（ｈｉｅｍａｌ　ｉｓ）Ｍｕ、 ミヌタス（ｒｎｉｎｕｔｕｓ） Ｍｕ、オブロンギスボラス（ｏｂｌｏｎｇｉｓ　ｏｒｕｓ）Ｍｕ、リカーバス（ ｒｅｃｕｒｖｕｓ）変異株（ｖａｒ、　）インディカス最も好ましい本発明の態 様によれば、該微生物はムコールジャバニカスベメール（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａ ｎｉｃｕｓ　ｗｔ＋ｅｍｅｒ）　（これはＺｅｎｔｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｐａｒ ａｓｉｔ　Ｋｄｅ、　Ａｂｔ、、　１９００．２．６二６１９に記載されている ）を含み、これは初めインドネシア、ジャワの［チャイニーズ酵母（Ｃｈｉｎｅ ｓｅ　ｙｅａｓｔ）Ｊ　（ラギ（Ｒａｇｉ））から単離されたものである。この オランダ、バーンのオーブンコレクションオブセントラールビューロープールシ メルクルチュールズ（ｏｐｅｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｎｔｒａａ ｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手でき る。もう一つの最も好ましい生物はムコールルキシー（Ｍｕｒ、ｏｒ　ｒｏｕｘ ｉｉ）であり、これも同様にＣＢＳから入手可能であり、かつ該クルチュールコ レクションのオーブンコレクシ３ンに承認番号ＣＢＳ　４１６．７７の下で寄託 されている。

該増殖培地中の有機物質は、該培地の０．５％〜１０％の範囲内、好ましくは１ ％〜３ｚの範囲を構成し得る。

本発明の特定のＢ様によれば、該増殖培地はフィッシャー−トロプシュ合成工程 由来の有機酸流を含み、また典型的には重量／重量基準で以下の組成をもつこと ができる。

ＣＨａＣＯＯＨ０，６％〜１．１５％ ＣＪｓＣＯＯＨ０，２％〜０．４％ ｉ−ＣオＨｔＣＯＯＨ０，０６％〜０．１９％ｎ−ＣａＨｔＣＯＯＨ０，０９％ 〜０−４０％ｉ　Ｃ４ｆ（ｓｃＯＯ）１　０．０２％〜０．１０％ｎ−Ｃ，Ｈ＊ Ｃ０ＯＨｏ、　ｏ３％〜０．０５％有機化合物の残部　０．０２％〜０．０４％ 無機物質　０．００６％未満 水　１００％の残部 該培地の全酸含有率が１０　ｇ／Ｉを越えないことが好ましい。

好ましい有機酸培地は、およそ以下の比率で同化可能な栄養源を含むように改良 される。

Ｃ：　Ｎ　二　Ｐｍ２Ｏ３＋　１４　：４該栄養分混合物は、好ましくは更に同 化可能なカリウムおよび好ましくは硫酸塩としての硫黄源を、およそ以下のの比 率となるように含有する： Ｃ：Ｎ：Ｐ：に：Ｓ＝　１００　二　１４　：　４　：　３　：　１該窒素は、 該生物が一旦初期〜中期指数増殖期に達したら、Ｃ：Ｎ−１００：２まで減じる ことが可能である。

該排液に添加される同化可能な窒素並びに燐酸栄養分は、勿論該培地自体が工業 的方法由来のものであって、このような栄養分に欠けている場合においてのみ必 要となる。添加することが必要な場合には、該−次栄養分は一般的に水酸化アン モニウムおよび燐酸として添加できる。燐ｒＪ！塩を該増殖培地に添加すること も可能である。

該培地が該生物の成育に必要とされる痕跡元素を含まない場合には、かかる痕跡 元素の混合物を該成長培地に添加できる。この点に関連して、上記した増殖培地 であって、更に元素ＡｓＳＨｇ、　Ｌｉ、Ｍｎ、　Ｃｒ、　Ｃｕを０．１　ｍｇ ／１未満の量で、また元素Ｃｄ、　Ｃｏ、　ＺｎおよびＦｅを０゜１〜１　ｍｇ ／ｌの量で、更に元素Ｎａ、　Ｃａ、　Ｓｉ、　Ｃｌ５Ｐｂ、　Ｎ１５Ｆを１〜 １０ｍｇ／ｌの範囲内の量で含有する増殖培地が問題とする微生物の成育を維持 するのに適していることも分かった。

該生物を培養する際には、好ましくは該培地１１７当たり１０４個を越える量の 胞子を懸濁することにより、該増殖培地を該胞子で接種する。最も好ましくは、 該胞子の量は該培地１１当たり１０”個を越えない値である。これらの胞子は− 好ましくは糖および／または澱粉を主成分とする栄養源物質を粉末化し、その上 で該接種物が胞子形成段階まで培養された混合物の形状で該排液に適用される。

この胞子を接種した培地のインキュベーションは、好ましくは２５〜３２°Ｃの 範囲内の温度にて、最も好ましくは３０°Ｃにて、４０〜１２ＯＳ間、通気しつ つ実施して、該増殖培地中に溶解した酸素濃度を０．５〜３．５　、好ましくは 約２．０〜２．５　ｍｇ／ｌに推持しつつ、該胞子が該生物の初期〜中期指数増 殖期におけるゐ糸状態のバイオマスに発育するまで実施する。次いで、窒素の供 給を減する。その後、該生物が静止増殖期に達したら、このバイオマスを該培地 から分離する。

このインキニベーシ」ン後の、該バイオマスおよび水の分離は任意の有利な様式 、例えば濾過により実施することができる。

この分離されたバイオマスは、その後これからＳＣＯを回収すべく抽出処理され る。この抽出は、好ましくはへ牛サンまたはクロロホルムを使用して実施し、か つその後肢溶媒画分を分別蒸留することによりその各成分部分に分離する。

タンパクに富む、抽出後のバイオマス残渣は単胃動物の飼料、例えば家禽の飼料 として使用できる。

ＳＣＯを生産し、かつ該フィッシャー−トロプシュの有機酸流から有機物質を除 去するという２つの目的で、本発明の方法を実施する場合、該バイオマスを除去 した、即ち実質的に炭素−含有物質に枯渇させた後の該水性画分は、その流れを 排水として棄却する場合には、必要ならば過剰の燐酸塩および／またはアンモニ アを除去するように精製される。しかしながら、この流れを希釈水として再循環 することが好ましい。

この収穫されたバイオマスを、その収穫後に処理して、そこからＳＣＯ、スクア レンおよび／またはキトサンを回収することもできる。

以下本発明の実施例を記載するが、本発明の範囲はこれら記載される８１ｍによ って同等限定されるものではない。

実施例１：フィッシャーートロブシュ宥機酸水溶液によるムコールジ士バニカス （Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の培養フィッシャーートロブンユ合成装置 からの有機酸流の試料を分析し、水中に主成分として約１．４％（ｍ／’ｍ）の モノ−カルポン酢か含まれることを見出した。これらの酸類はおよそ以下の比率 で存在していた。

ＣＨｓＣＯＯＨ３０部 ＣＪｉＣＯＯＨ１０部 ｉ−Ｃ，Ｈ７ＣＯＯＨ２−００部 ｎ−ＣａＨｔＣＯＯＨ４，００部 １−ＣＪｓＣＯＯＨ１，００部 ｎ−ＣａＨｓＣＯＯＨ１，ｏｏ部 この酸排液は、また他の所謂非−酸型の化学物質をも含み、これらはより少量で 存在し、かつ全体として該排液の約０，０４％程度に過ぎなかった。該酸排液は 、更に無機物質を約０．００６％含んでいた。

コノ試料ヲ、水ノ添加ニヨリＷａ度４０００ｍｇ／ｌまで希釈し、１７４の醗酵 装置に入れた。この醗酵装置を３０’Ｃに維持し、以下の実施例２に記載するよ うにして調製したムフールジャバニカス（Ｍｕｃｏｒｌｏ”個の胞子を含む。こ の混合物に、以下に記載する栄養分をも添加した。

Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ＊ＯＯ，７６５ｇ に！ＨＰ０．　１．７８５　ｇ ＮＨ，（２５％）　２０　ｍ１ ＨｓＰＯ−（８５％）　１．７　ｍｌ この混合物を混合し、溶解酸素濃度を２．０ｍｇ／ｌに維持するように通気しつ つ、上記温度にて２４時間インキュベートした。この通気は、好ましくはエアー リフトを設定するように実施して、該導入された空気によっても該培養培地が混 合されるように実施する。

必要に応じて新鮮な供給原料を、あるいは必要ならば５ＭのＮａＯＨ溶液を添加 することにより、この混合物のｐＨを５．８に維持した。この醗酵を供給バッチ 、ｐＨ１ｌＪ＠、エアーリフト醗酵の組み合わせを基礎として実施することが有 利であることを見出した。生成したバイオマス部分を該醗酵ブロスから篩を使用 して分離し、乾燥し、かつ秤量した。

該乾燥バイオマスをヘキサンで抽出し、該ヘキサンを除去して、１００ｇの乾燥 バイオマス当たり５．５ｇの粗製オイルを得た。

この粗製オイル画分を分析したところ、特にＣＢおよびＣ１，脂肪酸を含有する ことが分かった。

この粗製オイル画分の脂肪酸組成は、ＧＣ分析により以下の通りであることが示 された。

２５％　ＣＩ８＋。（バルミチン酸） １７％　Ｃ＋ｓ＋＋　（パルミトレイン酸）２．１％　Ｃ，１，、（ステアリン 酸）２４．６％　Ｃ＋ｓ＋＋　（オレイン５＆）２３．６％　Ｃ１ｌ！　（リノ ール酸）２２．９％　Ｃ，、、、（γ−リルン酸）勿論、このオイル画分を蒸留 して、相互に分離された該各成分を得ることができる。スクアレンおよびキトサ ンも該バイオマスから回収できる。

小麦粉から作成した澱粉マトリックスにムコールジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ　ｊ ａｖａｎｉｃｕｓ）を接種することにより調製した。この接種物質を湿潤雰囲気 中で３０℃にて８日間放置し、その間に、該微生物は他の生物を実質的に排除し 、かつ胞子形成段階まで活発に成長した。

このマトリックスを乾燥し、微粉状態にまで粉砕した。胞子数を計数したところ 、該粉末が１ｚ当たり約１０’個の胞子を含有することが分かった。

実施例３ フィッシャー−トロプシュ有Ｗ、酸水（ＦＴ水）中に存在する単純なモノカルボ ン酸を、γ−リルン酸（ＧＬＡ）を含有する脂質に転くの菌株がセントラールビ ューロープールシメルクルチュールズ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏ ｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、デルフト（Ｄｅｌｆｔ）（オランダ 国）から得られ、また２工“ＣにてＹＭ寒天斜面［ライツカ−ハム（Ｗｉｃｋｅ ｒｈａｍ）、　１９５Ｌ）　上に維持された。

５００　ｍｌの三角フラスコ中に入れた２００　ｍｌの培養培地に接種するのに 、白金耳一杯の胞子を使用し、その後振盪器上で３０°Ｃにてインキュベートし た［１５０ｒｐｍｌ。この培養培地は０．１０　ｇ／ｌの酵母抽出物、０．２５ 　ｇ／ｌのＭｇ５Ｏ□・７Ｈ１０，１０，００ｇ／１（ＤＩｈＨＰＯａ、０．６ ２　ｇ／ｌのＮｌ２　、Ｏ，０５ｇ／ｌのＣａＣ１ｚ　”　２Ｈ，０および３３ ３　ｍｌ／ｌのＦＴ水を含み、全酸量４ｇ／ｌを与えた。ｐＨは５．８に設定し た。

成長につきテストした菌株の幾つかはこの培地内で成育しないことが観測された 。検討した菌株のうち、成長に関して最良の性能をもつ４０種を、ｌｏ００ｍｌ 三角フラスコ中に入れた培養培地１００　ｍｌを使用して再度テストした。各培 養を３回繰り返し、該培養物を３つの異なる時点で収穫した。ＧＬＡ産生は培養 の継続時間に依存し、密度は時間と共に増大し、かつその後に減少することが観 測された。

収穫：　該培養物をファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）のＮｏ、１１紙を使用して 濾過することにより収穫し、その後肢細胞物質を凍結乾燥した。

ガスクロマトグラフィー（メガボア（Ｍｅｇａｂｏｒｅ）カラム）［コック（Ｋ ｏｃｋ）等、　１９８５］を使用した脂肪酸の分析ニスクリユー−キャップ（テ フロン−ライニングしたもの）を備えたガラス管中の、０．１２ｇの凍結乾燥し た真菌物質に、５０％のＣＩ□ＤＩ（／Ｈ，Ｏ中に溶解した１５％ＫＯＨ溶液５ ．０ｍｌを添加した。また、内部標準としてメタノール中に溶解した６％のラウ リンａ［１２：Ｏ］３０μｌを、各ガラス管【こ導入した。これらのガラス管を 打止し、沸騰水浴中で連続的に振盪しつつ１時間加熱した。室温まで冷却した後 、該ガラス管の内容物のｐＨを、３２％）ＩｃＩ溶液１．５ｍｌの添加により２ に調節した。２０％ＢＦ！／ＣＨ，ＯＨ錯体〔メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシ ュタット）　３−Ｏｍｌを添加し、Ｎ、でフラッシングした後、各ガラス管を再 度封止し、沸騰水浴中で連続的に振盪しつつ１５分間加熱した。各反応混合物を 再度室温まで冷却し、０．２５ｍ１の飽和ＮａＣ１溶液を添加し、メチル化され た脂肪酸を、１：４　ＣＨＣｌ、／Ｃ，Ｈｌ、（ヘキサン）の６ｍｌアリコート て連続して３回抽出した。併合した抽出液をＮ２の緩やかな流れの下でＱ縮し、 該メチル化された脂肪酸を再度１８ｍ１のＣ，Ｈ，、に溶解し、テフロン−ライ ニングを有するスクリュー−キャップを備えた２ｍｌのガラスバイアルビンに移 した。

ガスクロマトグラフィーを、ＦＩＤ検出器を備えたノくリアン（Ｖａｒｊａｎ） 　３３００ガスクロマトグラフを使用して実施した。分離のために、極性のスペ ルコワックス（Ｓｕｐｅｌｃｏｗａ：ｘ）　１０カラム（３０ｍ　Ｘｏ、７５ｍ ｍ、内径〕およびキャリヤーガスとしてＮ、　（流量：５ｍｌ／分）を使用した 。

該ＧＬＡ含量（ｍｇ／ｇ凍結乾燥真菌物質）は、応答基準としての該ガスクロマ トグラム上の該内部像＊［１２：０１からのピークの表面積を使用して計算した 。

これらの測定結果を以下の表１に示すが、表１においてｖ１測された最大のＧＬ Ａ　ｍ生が該最良の性能をもつ菌株各々につき並びにこれを収穫した時点におい て犯行された。異なる収穫時点において、異なる収率が得られた。種々の苗株が オランダ国バーンにおけるＣＢＳのオーブンコレクシシンから入手できるそのＣ ＢＳ番号も表１に与えた。

表１ 種　ＣＢＳ　ａ＋ｇＧＬＡ　収穫時点 株（ｖａｒ、　）ラマニアナ（ｒａｍａｎｎｉａｎａ）Ｍｏ、パルビスボラ（ｐ ａｒｖｉｓｐｏｒａ）　３０４．５２　０．０８　１６８民：ムコール（Ｍｕｃ ｏｒ） Ｍｕ−アンフィビオラム（ａｍｐｈｉｂｉｏｒｕｍ）　７６３．７４　３２−９ ９　４８Ｍｕ、アルドウラエンギクタス（ａｒｄｈｌ−２１（Ｃ８１１，５２５ ２柱坦止鳳■ Ｍｕ、アジゴスポラス（ａｚｙｇｏｓｐｏｒｕｓ）　２９２Ｊ３　１３．１８　 １６８Ｍｕ、バイニエリ（ｂａｉｎｉｅｒｉ）　２９３Ｊ３　２７−６７　４４ Ｍｕ、シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅ−１１６，０８２４，８９４４１１ｏ ｉｄｅｓ）　ｆ、グリセオシアヌス（ｇｒｉｓｅｏｃｙａｎｕｓ） Ｍｕ、シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅ−１１９，０８３０，９０４４１１ｏ ｉｄｅｓ）　ｆ、シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ） Ｍｕ、　シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅ−２３２，２９２４，３２４４１１ ｏｉｄｅｓ）　ｆ、ジャンセニー （ｊａｎｓｓｅｎｉｉ） Ｍｕ、　シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌ−２０３，２８３６，７２４４ ｏｉｄｅｓ）　ｆ、シルシネロイデス （ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ） Ｍｕ、シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅ−１０８，１７３０Ｊ２　５２曲、フ ラジリス（丁ｒａｇｉｌｉｓ）　２３６．３５　２４．９５　５２Ｍｕ、ブルン ベウス（ｐｌｕｍｂｅｕｓ）　１１１．０７　１８．８５　９８Ｍｕ−ブラヤゲ ンシス（ｒａｙａ　ｅｎｓｉｓ）　８１６．７　２７−７８　４８Ｍｕ、パリオ スポラス（ｖａｒｉｏｓ　ｏｒｕｓ）　８３６．７　３３．４２　４８属、リゾ ムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）柱■旦匹） リゾブスミクロスボラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　６３１．８２　１３．３４　４４ リゾブスミクロスポラス（ＲｈｉｚＯｕＳ５３６．８　１１．６１　４８ｍ１ｃ ｒｏｓｐｏｒｕｓ）変異株（ｖａｒ、　）リゾパジホルミス（ｒｈｉｚｏｐａｄ ｉｆｏｒｍｉｓ）リゾブスオリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　１１ ２．０７　１０．２７　４４０ニフエア（ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ） 実施例２に記載の方法とは別の、実施例３に記載した接種物を調製するためのも う一つの方法を開発した。

サブロー寒天培地をルー（ＲＯＬＩりフラスコ（またはフラスコ中のペンシリン （ｐｅｎｃｉｌｌｉｎ））に置き、ベトリ皿中で育成した培養物由来の生物をｌ ｏｍｌの燐酸バッファーで洗浄することにより、該培地を骸生物により接種した 。該洗液は該ルーフラスコ内のサブロー寒天培地上に展開し、その後肢フラスコ を湿潤し、滅菌した空気を該フラスコに強制的に送りつつ、３０°Ｃにて２〜５ 日間インキュベートした。生成した育成物を、０．２％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） 　８０を含む燐酸バッファーで該フラスコから洗い串し、これを接種物として使 用した。

を同化する能力を更に明確にするために、増殖培地を以下の如く調製した。

ＨＪ　４１！ クエン酸　０．５ｇ ＮＨ，Ｃ１３，２ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０１，，６ｇ Ｋ１１２ＰＯＪ　６．０ｇ ＣａＣ１ｔ　・２Ｈｘ０　０．１ｇ 酵母抽出物　２．０ｇ 酢酸　８．０ｇ ｐ）（はＫＯＨで５．５に設定した。

以下の成分をａ跡成分として添加した。

Ｆｅ５Ｏ−・７ＨｚＯＯ，０１ｇ／ｌ Ｚｒ１ＳＯａ　４ｋｈ０　０．０１　ｇ／ｌＭｎ５Ｏ（−４Ｌｏ　ｏ、ｏｏｔ　 ｇ／ＩＣＵＳＯ４−５Ｈ＊０　０．０００５　ｇ／１４ｉの撃培地を５１の醗酵 装置に入れ、攪拌し、通気したボトル内で６００ｒｐｍ、３０°Ｃにて２４時間 の成育期間に渡り育成することにより調製した接種物４００　ｍｌ　（即ち１０ ％）で接種した。この接種培地の組成は以下の通りであった。

Ｈｚｏ　ａｏｏ　ｍｌ グルコース　２４　ｇ ＫＨ□Ｐ０．　５．６ｇ ＮａＪＰＯａ　１．６　ｇ ＭｇＳＯ，・７Ｈｚ０　１．２　ｇ 酵母抽出物　１．２ｇ ＣａＣｌ２０．０８　ｇ グルタミン酸ナトリウム　２．４ｇ 全ての培地をオートクレーブ処理した。

該５１の醗酵装置内の育成条件は以下の通りであった。

ｐＨ５，５ 攪拌速度　７００　ｒｐｍ 温度　３０°Ｃ 通気　０．５ｖｖω 消泡剤　醗酵工程の開始時点にて少量（３滴）添加した。

供給用リザーバからの５０％酢酸を該培地に添加して、該成育期間中ｐＨを５． ５に維持した。

この酢酸の使用量は、該供給用リザーバからの使用すべき酢酸の体積およびｔ＆ 醒酵装置内の培養物の体積に応じて決定した。

時間に伴うバイオマスの増加、バイオマスの百分率で表した脂質含有率および生 成した脂肪酸のγ−リルン酸含有率を測定した。得られた結果を以下の表２に示 す。

時間　バイオ　残留　利用され　バイオマス　Ｆ、Ａ、中のマス　Ｎ１　た酢酸 　中の脂質含 （ｈｒ、）　（ｇ／Ｌ）　［ＮＨ＜　”］　（ｍｌ／Ｌ）　有率（％）　ＧＬＡ 　（％）０　０．１ １３　２．４　枯渇 ２０　４．１　９．４　１８．２　１３．９３７　６．０−２０．１　２１．０ 　１６．２４４　６．２−２３．１　２０．０　１５．６６１　５．４−２８． １　２１．５　１５．７６８　６．９−２９．０　２１．６　１５．４８５　７ ．８−３１．９　１９．５　１６．０該培地中のλ素が１３時間以内に利用し尽 くされたという事実から、該生物が置かれている栄養ストレス状態が高いＧＬＡ 産主に寄与するものと考えられる。本発明の方法により、約１０−２０ｇ／ｌを 越える濃度において該生物にとってｆ害な酢酸は、核酸の全体としての含有率が 存寄な濃度を越えないように、該培養培地に徐々に瀘下する。この方法により、 該生物が全体として３１．９ｍｌ／ｌの酢酸を利用したことを理解するであろう 。

Ａ産生性能を、炭素源材料として醗酵を使用した場合のその性にとと比較した。

この実験で使用した菌株は実施例５の実験で使用した菌株とは同一ではないが、 同様にＣＢＳ　１０８．１６なる承認番号の下で、オランダ国バーンのＣＢＳオ ーブンフレクションから入手可能である。

５ノのｆｆ１ｌｆｆ装置に、以下のような水中での組成をもつグルコースを主成 分とする増殖培地４１を投入した。

グルコース　５０　ｇ／１ （ＮＨ＜＞ｔＳＤ−１−７ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４２，Ｏｇ／ｌ Ｍｇ５Ｏ＊・７Ｈ２００，５ｇ／ｌ ＣａＣ１＊　・２ＨｉＯＯ，２ｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７ＨｚＯＯ，０１ｇ／ｌ Ｚｎ５Ｏｔ　＋　７ＨｔＯＯ，Ｏ１ｇ／ｌＭｎ５Ｏ＊　＊　４Ｈｚ０　０．００ １ｇ／ｌＣｕ５Ｏ，・５Ｈ＊０　０．０００５　ｇ／ｌ醪母抽出物　１　ｇ／ｌ 該培地のｐＨはＫＯＨで５．５に設定した。

上記と同様な組成を有し、実施例５に記載のようにして調製しｌ；接種培地中に ムコールジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｊｃｕｓ）　’ＧＡ株を含む接 種物４００　ｍｌを使用して、上記増殖培地に接種した。この際の育成条件は実 施例５に記載の条件と同一であった。

比較実験において、５１の醗酵装置に、以下の組成を有する酢酸を主成分とする 増殖培地４Ｉ！を投入した。

ＨｘＱ　４　ｊ’ クエン酸　０．５ｇ ＮＨａＣ１５，５２ｇ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，０１，６ｇ ＫＨｘＰＯｉ　ａ、　０ｇ ＣａＣ１＊　”　２Ｈｚ０　０．１ｇ 酵母抽出物　４．０ｇ 酢酸　２０．０ｇ 実施例５に記載した量の痕跡元素も該増殖培地に添加した。

この培地を、上記のようなＭ、ジャバニカス（ＣＢＳ　１０８−１６）を含む接 種物４００　ｍｌで掩覆した。増殖条件は上記のグルコースを主成分とする増殖 培地に関するものと同一であった。しかしながら、増殖期間全体を通して、５０ ％（Ｖ／Ｖ）酢酸水溶液を、リザーバから該増殖培地に徐々に滴下して、該増殖 培地のｐＨを５．５に維持した。このようにして、該増殖培地の酢酸含有率が５ ｇ／　ｌなる準一致死（即ち、非毒性）レベルに確実に維持した。この培養は１ ６２時間に渡つて、この様式で実施し、この期間中、該リザーバがら使用された 酢酸の体積および該醗酵装置内の培養物の体積に基いて決定した酢酸の使用量は ８１．４ｍｌ／ｌであることが分かった。この量か元々該醗酵装置内に存在すれ ば該生物にとって有害であった。

種々の測定を実施して、２種の培養培地上での該微生物の性能を比較した。得ら れた結果を以下の表３に示す。

パラメータ □　ｓｏ　ｇル　５　ｇ／Ｌ カビの全脂質含有率（Ｘ、　ｗ／ｗ）　２２．７　（７２ｈ）　２２．６　（９ ２ｈ）全中性脂質（ＮＬ）Ｎ分（Ｌ　ｗ／ｖ）　２０．４　（７２ｈ）　１８． １（９２ｈ）ＮＬ−画分中の全Ｆ、　Ａ、のＧＬＡ（％）　１５．１　（７２ｈ ）　１３．９　＜９２ｈ＞カビ（ＮＬ−Ｎ分）のＧＬＡ含ｉ（％、ｗ／＊）　３ ．１　２−５バイオマス！ＩＩ”　４０時間ｍ　１２．０　１１．４（ｇ　ｄｗ ／Ｌ）：　７０時間後　１６．６　１４．４８５時間後　１６．５　１５．４ バイオマス収率（ｇｄｗ／　４０時間後　０．３０　０．３６　”゛　使用した 源”）：　７０時間後　０．３３　０．２９８５時間後　０．３３　０．２８ ＧＬＡ−収率ｇＧＬ、Ａ／使用４０時使用４俊した源″）：　７０時間後　０． ０！２　０．００７８５時間後　０．０１２　０．００９ 生産時ＭＣｈ）　９２　１６２ Ｉ１１質収率（ｇ脂質／　４０時間後　０．０７　０．０ν使用した源）＝７０ 時間後　０．　０８　０．　０６８５時間後　０．０７　０．０６ 脂質含ｆ早（ｇ／Ｌ）４０時間後　２．　９　２．３。

（％脂質ｘ７）：　７０時間後　３．　８　３．　０８５時間後　３．　６　３ ．　４ ＧＬＡ　を育率（ｇル）４０時間後　０．４１　０−２４”（Ｘ　ＧＬＡｘ１２ ）　：　７０時Ｍ後　０．５７　０．３３８５時間後　０．５７　０．４５ ＧＬＡ含有率（ｍｇ／ｇ　ｄｗ）　４０時間後　３４．２　１９−２′″［１３ ／７］：　７０時間後　３４．　８　２３．　０８５時間後　３４．５　２ＬＤ 注：使用した全課において、接種物から約１２ｇのグルコースを除外する（１２ ｇグルコース／１０％接種物として添加された４００ｍ１）。示された値は、醗 酵装置内の培地中の使用されたグルコース（５０ｇ／Ｌ）および酢酸を主成分と する培地に対して使用した酢酸の量（ｍｌ）を表す。

Ｆ−Ａ−：脂肪酸 ｄｗ　：乾燥重量 ＋：４４時間後時間数した試料 全てのデータはグラフから読み取ったものであり、かつ四捨五入処理した値であ る。

上記の測定で使用した方法は以下の通りである。

乾燥１ｆ′Ｉｋ測定：４ｍｌの培養物を予め秤量したメンブランフィルタ（ＧＰ ／Ｂ　：）７ツトマン（Ｗｂａｔｍａｎ））を通して濾過し、蒸留水（６ｘ２ｍ ｌ）で洗浄し、１１０℃にて一定重量となるまで乾燥することにより培養物のバ イオマス重量を測定した。この手順を２回実施した。

脂質抽出：これは、ケンドリック＆ラトレソジ（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ　＆　Ｒａｔ ｌｅ＜ｉｇｅＸ１９９２）に記載されたような凍結乾燥物質について実施した。

これはホルヒ（Ｆｏｌｃｈ）等（１９５７）により記載されたような、クロロホ ルム／メタノール（２：１．　ｖ／ｖ）による抽出、蒸留水による３回の洗浄お よび最終的な有機相の蒸発工程を含む。脂質物質を最終的に最小体積のジエチル エーテルに溶解し、予め秤量したバイアルビンに移した。脂質重量の測定のため に、５０℃にてＰＪｓ上で真空オーブン中で一定重量となるまで該試料を乾燥し た。

抽出した膠質の分画；抽出したＲＫ質をクロロホルムに溶解し、（１１０℃にて 一夜加熱することにより）活性化した珪酸カラム（１４０ｍｍｘ　２０ｍｍ）の 処理にかける。中性−、スフィンゴ−および糖−脂質（結合した国分としての） 並びに極性脂質を、ケンドリック＆ラドレッジＣＫｅｎｄｒｉｃｋ　＆　Ｒａｔ ｌｅｄｇｅ）（１９９２）に記載されたように、有機溶媒の連続的な適用により 溶出した。最終的な溶媒の除去および保存は全脂質抽出物と同様にした。次いで 、各面分を薄層クロマトグラフィーによって更に精製した。

薄層クロマトグラフィー二中性−、スフィンゴ−および糖−脂質画分のｆｉｔｒ ｆ！Ｉクロマトグラフィーは、裏打としてのアルミニウムを有するシリカゲル′ ＲＨ板（メルク（Ｍｅｒｃｋ））上で実施した。燐脂質を含有する該極性画分は クロロホルム／メタノール／水／酢酸（体積比６５：４３：３：１）を使用して 分離した。

該中性脂質画分は石油エーテル（６０−８０°Ｃ）／ジエチルエーテル／酢酸（ 体積比８５：１５：１）を使用して分離した。併合されたスフィンゴ−および糖 −脂質画分はクロロホルム／メタノール／ＮＨ．ＯＨ（比重０．　８８０）　（ 体積比８０：２０：０．２）を使用して分離した。＃薄層板を上昇法により一次 元的に展開し、１，蒸気に暴露することにより可視化した。更に、コリン會″４ Ｆ脂質を特異的に染色するドラジェンドルフ（Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ）試薬、 遊離アミノ基をもつ脂質を検出するためのニンヒドリン（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉ ｎｓ）、　１９８７）および一般的に燐酸基含有脂質を染色することにより燐脂 質を検出するためのモリブデンブルー試薬スプレー（ディットマー＆レスター（ Ｄｉｔｔｍｅｒ　＆　Ｌｅｓｔｅｒ）、　１９６４）で染色することにより、燐 脂質を可視化した。糖−脂質はα−ナフトール溶液を吹き付けることにより可視 化した（ヒギンズ（Ｉ（ｉｇｇｉｎｓ）、　１９８７）。更なる同定は、適当な 信頼すべきａ！Ｐ−物質を、実験試料と共に試験することにより達成した。

脂肪酸分析：脂質をクロロホルムに溶解し、バット（Ｂｕｔｔｅ：　１９８３） により記載されたように、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＮ）を 添加することによりメチル化した。

ＦＡＭεは、ケンドリック＆ラトレソジ（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ　＆　Ｒａｔｌｅｄ ｇｅＸ１９９２）に記載されたように、フィリップス（ＰｂｉｌＬｉｐｓ）　Ｐ ｕ　４５００ガスクロマトグラフイーおよび１０％ジエチレングリコールサクシ ネートカラム（２＋ｎ　ｘ４　ｍｍ）を使用して分析した。ピークの同定は！頼 できる標準物質を基準として行った。

グルコース分析ニゲルコースはボッド−ベリラドテスト（ＧＯＤ−ＰＥＲＩＤ　 Ｔｅ５ｔ）　（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ））によって分析した。

窒素分析：これは、インドフェノール法（カニ−（Ｃｈａｎｅｙ）、　Ａ−Ｌ。

およびマーバッハ（Ｍａｒｂａｃｈ）、ε、Ｐ、、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、　１９６２゜８、１）、　１３０）によって、アンモニアを評価 することにより実施した。

表３に示した結果から、グルコース上でのＭ、ジャバニカスＣＣＢ５１０８、　 ｉ６）の性能が、見掛は上は本明細丑に記載した方法で使用した酢酸上での性能 と同一であったことが理解されよう。これが最も予想外の結果である。

上記実施例で言及した参考文献は以下の通りである。

バット（Ｂｕｔｔｅ）、　Ｗ、、　１９８３：　エステル交換反応に関する、ト リメチルスルホニウムヒドロキシドを使用した、油脂からの脂肪酸プロフィール の測定のための迅速法。ジャーナルオブクロマトグラフィ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、　２６１．　ｐｐ、１４２−１４５゜ ディット？−Ｊ、Ｃ，＆レスターＬ、（Ｄｉｔｔｎ＋ｅｒ、　Ｊ、Ｃ，＆　Ｌｅ ｓｔｅｒ、　Ｌ、）。

１９６４　：薄層クロマトグラム上の燐脂質の検出用の、簡単かつ特異的なスプ レー。ジャーナルオブリピッドリサーチＱｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ）、　５．　ｐ、　１２６゜ホルヒ（Ｆｏｌｃｈ）、　Ｊ、、リ ース（Ｌｅｅｓ；、　Ｍ、　＆スロアンースタンレー（Ｓ１ｏａｎｅ−Ｓｔａｎ ｌｅｙ）、　Ｇ、Ｈ，（１９５７）：動物組織からの全脂質を単離し、かつ精製 するための単純な方法。ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　２２６．　ｐ ｐ、　４９７−５０９゜ ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）、　Ｊ、Ａ、、　（１９８７）：　膜脂質成分の分 離および分析。バイオロジカルメンプランズーアブラクティカルアブローチ（Ｂ ｉｏｌｏｇｊｃａｌ　Ｉｎｅｍｂｒａｎｅｓ　−ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐ ｐｒｏａｃｈ）、　ｐｐ、　１０３−１３７゜Ｊ、　Ｂ、　Ｃ，フィントレー（ Ｆｉｎｄｌａｙ）　＆　Ｗ、Ｈ，エバンス（Ｅｖａｎｓ）　纏、ワシントンＤ、 Ｃ，，ＩＲＬブレス刊。

ケンドリック＆ラドレッジ（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ、　Ａ、Ｊ、　＆　Ｒａｔｌｅｄ ｇｅ、　Ｃ，Ｘ１９選択されたカビの脂質。リビッズ（Ｌｉｐｉｄｓ）、鉦、　 ｐｐ、　１５−２０゜コック（Ｋｏｃｋ）、　Ｊ、Ｌ、Ｆ、等（１９８５）：　 ｘンドマイセタセアエ（Ｅｎｄｏｍｙｃ：ｅｔａｃｅａｅ）の４種間の識別のた めの迅速法。５ｈｏｒｔ　Ｃｏｍｍ、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３１．　ｐｐ、　３３９３−３３９６゜本発明の多 くの変法を、本発明の精神を逸脱することなしに工夫することができる。即ち、 本発明の２酵法は連続工程で実施できる。

１ｍ−Ａ＠ｄ１ｃｍｌｂｍＮ鴫ＰｃＴｌＧ日””ｏ２２”８フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１１Ｃ３１００２１１ ５−４Ｈ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥＩ （７２）発明者　コック　ヨハン　ロープウィック　フランシスカス 南アフリカ共和国　オレンジ自由州　９３３０ブルームフオンテイン　ランゲン ホベンパーク　シェーマンストリート　ピー　ジエイ　８ （７２）発明者　ボータ　アルフレッド南アフリカ共和国　オレンジ自由州　９ ３０１ブルームフオンテイン　ペリシア　ポレニーズ　ブレイス　１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アーリノレン酸を含有するシングルセルオイルの製造方法であって、ムコラ レス（ＭｕｃｏｒａｌｅＳ）目の少なくとも１種の微生物を、実質的に澱粉およ び糖を含まず、かつ炭素源物質として少なくとも１種の炭素原子数２〜５のモノ カルボン酸を含有する増殖培地で培養し、得られた該培養微生物のバイオマスか ら該オイルを回収することを特徴とする上記方法。 ２．該微生物がモルチエレラセアエ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）科の微 生物、好ましくはモルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の微生物、最も好 ましくはＭｏ．イサベリナ（ｉｓａｂｌｌｉｎａ）Ｍｏ．ロンギコリス（ｌｏｎ ｇｉｃｏｌｌｉｓ）およびＭｏ．ラマニアナ（ｒａｍａｎｎｉａｎａ）変異株（ ａｒ．）ラマニアナ（ｒａｍａｎｎｉａｎａ）からなる群から選ばれる微生物で ある請求の範囲第１項に記載の方法。 ３該微生物がムコラセアエ（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ）科のものである請求の範囲 第１項に記載の方法。 ４．該微生物がアクチノムコール（Ａｃｔｉｍｏｍｕｃｏｒ）、ムコール（Ｍｕ ｃｏｒ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）およびリゾパス（Ｒｈｉｚｏ ｐｕｓ）属からなる群から選ばれるものである請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．該徴生物が、以下に挙げるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する種からなる群 から選ばれる微生物である請求の範囲第４項に記載の方法： Ｍｕ．アンフィビオラム（ａｍｐｈｉｂｉｏｒｕｍ）Ｍｕ．アルドゥラエンギク タス（ａｒｄｈｌａｅｎｇｉｋｔｕｓ）Ｍｕ．アジゴスポラス（ａｚｙｇｏｓｐ ｏｒｓ）Ｍｕ．バイニエリ（ｂａｉｎｉｅｒｊ）Ｍｕ．シルシネロイデス（ｃｉ ｒｃｎｅｌｌｏｊｄｅｓ）ｆ．グリセオシアヌス（ｇｒｉｓｅｏｃｙａｎｕｓ） Ｍｕ．シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ｆ．シルシネロイデ ス（ｃｉｒｃｉｎｌｌｏｉｄｅｓ） Ｍｕ．シルソネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ｆ．ジャンセニー（ ｊａｎＳＳｃｎｉｉ） Ｍｕ．シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ｆ．ルシタニカス（ ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ） Ｍｕ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｍｕ．フスカス（ｆｕｓｃｕｓ） Ｍｕ．ヒエマリス（ｈｉｅｍａｌｉｓ）ｆ．ヒエマリス（ｈｉｅｍａｌｌｓ）Ｍ ｕ．ミヌタス（ｍｉｎｕｔｕｓ） Ｍｕ．ムサネンシス（ｍｏｕｓａｎｅｎｓｉｓ）Ｍｕ．オブロンギスポラス（ｏ ｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）Ｍｕ．プルンベウス（ｐｌｕｍｂｅｕｓ）Ｍｕ．プ ラヤゲンシス（ｐｒａｙａｇｅｎｓｉｓ）Ｍｕ．リカーバス（ｒｅｃｕｒｖｕｓ ）変異株（ｖａｒ．）インディカス（ｉｎｄｉｃｕｓ） Ｍｕ．リカーバス（ｒｅｃｕｒｖｕｓ）変異株（ｖａｒ．）リカーバス（ｒｅｃ ｕｒｖｕｓ）Ｍｕ．ルキシー（ｒｏｒｘｉｉ） Ｍｕ．シネンシス（ｓｉｎｃｎｓｉｓ）Ｍｕ．ズプチリシムス（ｓｕｂｔｉｌｉ ｓｓｉｍｕｓ）ｍｕ．チューバークロスポラス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｐｏｒｕ ｓ）Ｍｕ．バリアビリス（ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）Ｍｕ．バリオスポラス（ｖａ ｒｉｏｓｐｏｕｓ）Ｍｕ．ジィカエ（ｚｙｃｈａｅ）変異株（ｖａｒ．）ジィカ エ（ｚｙｃｈａｅ）６．該増殖培地が酢酸と、窒素および燐酸塩の同化可能な源 との混合物を含む上記請求の範囲第１〜５項の何れか１項に記載の方法。 ７．該増殖培地が、更にプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、ｎ−バレリアン酸およ びｉ−バレリアン酸の少なくとも１種をも含み、かつカリウムおよび硫黄の同化 可能な源をも含み、更に微生物の成長を維持するのに必要な痕跡元素をも含有す る請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．該炭素源物質がフィッシャー−トロブシュ工程由来の水性有機酸流である請 求の範囲第１項に記載の方法。 ９．該培養培地の全有機酸含量を、該酸が該微生物によって利用されるのに応じ て該酸を添加することにより、１０ｇ／１未満、より好ましくは１〜５ｇ／１の 範囲に維持する請求の範囲第１項に記載の方法。 １０．フィッシャー−トロブシュ工程由来の水性有機酸流のモノカルボン酸含量 を減ずる方法であって、増殖培地としての該酸流と共にムコラレス（Ｍｕｃｏｒ ａｌｅｓ）目から選ばれた微生物を培養し、該培養により生成したバイオマスを 該培地から分離する工程を含む上記方法。 １１．シングルセルオイルを生産するための、ムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ ）目の微生物の培養における、一次炭素源としてのＣ２〜Ｃ５モノカルボン酸の 使用。 １２．上記請求の範囲第１〜９項の何れか１項に記載の方法により生産されたγ −リノレン酸を含むオイル。