SU352468A1 - Всесоюзная i - Google Patents

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

Изобретение относитс  к способу получени  антибиотиков и антибиотических комплексов.

Известен способ получени  антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, состо щий Б культивировании микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том числе содержащей углеводород, в аэробных услови х с последующим выделением комплекса из культуральной среды.

Используемый углеводород содержитс  преимущественно во фракци х минеральных масел , например нефти, сланцевого или угольного дегт . Он может представл ть собой керосин , газойль смазочные масла, экстракты, полученные при регенерации смазочных масел.

Углеводород обычно состоит из смеси углеводородов , содержащих не менее 10 атомов углерода.

В качестве источников углерода можно использовать моносахара, молочную сыворотку, мелассу, кукурузную барду, соевую муку, хлопковый жмых и т. д.

Источниками азота служат азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, аммиак, мочевина , автолизат и гидролизат дрожжей, соева  мука, хлопковый жмых и т. д.

фитопатогенных микроорганизмов культивирование продуцента осуществл ют в две стадии с использованием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода Candida, в частности С. tropicalis и С. lipolytica, а во второй стадии - плесневых грибов рода Penicillium, в частности Р. grseofulvum-ATCC 11855 и Р. nigricans-ATCC 9439, и выдел ют антибиотический комплекс в виде углеводородной

0 фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода. В первой стадии соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составл 5 ет обычно не меньше 20: 1, нреимущественно 10 : 1 а во второй стадии - не меньше 80 : 1, рН на первой стадии 4,5-5,0, на второй 5-8. Используемый углеводород выдел етс  вместе с микроорганизмом первой и второй стадии таким образом, что микроорганизм на первой стадии способен метаболизировать только лишь часть углеводорода, а на второй стадии способен метаболизировать по меньшей мере ту часть углеводорода, котора  не была мега5 болизирована ранее.

Антибиотик раствор етс  в углеводороде используемом в качестве растворител , способного растворить более 1 мг культуры на 1 л раствора, преимущественно О ,001-5 г/л и

Потребление углеводорода микроорганизмом при определенных услови х реакции может быть таким, что незначительное количество остаточного углеводорода не сможет растворить гризеофульвин, который при этих услови х в значительных количествах присутствует в водной фазе. Дл  перевода всего гризеофульвина в углеводородную фазу желательно добавить в культивируемый продукт углеводородсодержащую среду, котора  может быть той же самой или отличатьс  от уже использованного углеводорода.

Обычно гризеофульвин переходит в углеводородсодержащую фазу, а микроорганизм - в водную. Дл  выделени  используют метод фильтровани  и/или центрифугировани .

Все стадии могут быть проведены одновременно и непрерывно.

Состав, содержащий раствор гризеофульвина в углеводороде, пригоден дл  использовани  в сельском хоз йстве, в частности в качестве соматического антибиотика, в концентрации 0,1-0,4 г,1л, преимущественно 0,25 г/л. Его можно использовать дл  обработки почвы , растений, деревьев или сем н при борьбе с Alternaria, Helminthosporium, Fusarium, Oidium.

Пример 1. В колбу емкостью 1 л, оборудованную системой аэрации, высевают 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):

Кукурузна  выт жка48

Глюкоза50

Фосфорнокислый калий4

Хлористый натрий1

Смесь разбавл ют 1000 ч. м гкой воды, содержащей микроэлементы.

Соотношение между углеродом и азотом в смеси 20: 1. В 48 г кукурузной выт жки содержитс  4 г азота.

К этой смеси добавл ют 50 мл суспензии спор штамма Р. griseofulvum-ATCC 11885 и выдерживают при 26°С и рН 4,5-5 при аэрации культуры со скоростью 200 об/час.

Через трое суток мицелий отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают равным объемом среды, состав которой указан ниже.

Мицелий высевают в колбу емкостью 1 ./г с системой аэрации, содержащей 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):

Азотнокислый натрий2

Газойль200

Фосфорнокислый калий4

Хлористый калий1

Сернокислый магний0,5

Раствор микроэлементов5 мл

Водопроводна  вода1000 мл

Сернокислый цинк0,1

Сернокислый марганец0,01

Молибденовокислый калий 0,01 Минеральна  вода100 мл

Аэрацию провод т со скоростью 600 об,1час. Вначале добавл ют 50 г газойл  и затем через 1 сутки 16 г, через 2 суток 16 г, через 3 суток 16 г и через 4 суток 50 г газойл .

С целью регенерации неметаболизированного газойл  и -биомассы, культуру фильтруют иа воронке Бюхиера через носледующие четверо суток, получа  фильтрат, состо щий из водной фазы и газойл , и остаток, содержащий

мицелий.

Мицелий сразу же дважды обрабатывают гексаном н сущат при 90°С. Из фильтрата выдел ют газойль с растворенным гризеофульвином .

Содержание антибиотика в неметаболизированном газойле определ ют биологическим способом по Fusarium culmorum. Содержание антибиотика в мицелии онредел ют следующим способом.

Мицелий сущат при 50°С, взвешивают и измельчают . К 1 г мицели  добавл ют 10 мл бутилацетата и перемешивают 1 час при 50°С. После фильтровани  на воронке Бюхнера фильтрат концентрируют в вакууме при 50°С,

остаток обрабатывают гексаном и нерастворимую фракцию раствор ют в ацетоне в пропорции 1 мл ацетона на 1 г остатка смеси. Эту смесь снова фильтр)ют на воронке Бюхнера и содержаиие гризеофульвина в ацетонном

растворе из.мер ют спектрофотометрически в УФ-свете при 288 ммк. Результаты, полученные дл  Р. griseofulvum, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Установлено, что мице.чий почти свободен от антибиотика .

Пример 2. Повтор ют способ обработки,

описанный в примере 1, но вместо 50 г глюкозы в первой стадии обработки культуры в

качестве источника углерода используют 150 г

газойл .

Смесь разбавл ют 1000 ч. м гкой воды, содержащей микроэлементы. Результаты представлены в табл. 1.

Пример 3. Повтор ют способ, описанный Таблица 2 Т желые жирные кислоты получают при гидролизе дрожжей, выращенных на фракции нефти, в 10%-ном спиртовом растворе едкого кали в течение 3 час при температуре кипени . После этого полученую смесь обрабатывают петролейным эфиром до восстановлени  пены т желых кислот с последующим окислением и промыванием водой. Остаток представл ет собой фракцию т желых жирных кислот. Результаты опыта представлены в табл. 1. iB примерах 2-6, как и в примере 1, в качестве микроорганизма используют Р. griseolulvum . Пример 4. Дл  получени  культуры мицели  повтор ют первую стадию способа по примеру 1, но культуру выдерживают на кукурузно-глюкозном субстрате в течение дев тн суток при аэрации со скоростью 200 об/час в течение трех суток и при аэрации со скоростью 400 об/час в последующие дни. Затем культуру смешивают с 20%-ным газойлем и выдел ют антибиотик, как в примере 1. Результаты опыта представлены в табл. 3. Пример 5. Повтор ют способ по примеру 4, но культуру выдерживают в течение семи суток на кукурузно-глюкозном субстрате и газойль перемешивают с культурой в течение 66 час. Полученные результаты приведены в табл.3. Таблица 3 Антибиотик, мг Пример 6. Повтор ют способ по примеру 5, но в культуру добавл ют газойль и выдел ют культуру в три стадии. Сначала перемешивают культуру 1 час в 20%-ном газойле с последуюндей регенерацией газойл , затем 1 час в 20%-ном свежем газойле с последуюп 1 ,ей регенерацией газойл  и, наконец, 2 час в 20%-ном свежем газойле с последующей регенерацией газойл . 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 50 В целом ЭТО соответствует перемешиванию 1 л культуры с 600 мл газойл  в течение 4 час. Полученные результаты представлены в табл. 3. П р и м е р 7. В ферментер-},1ешалку емкостью 15 л заливают 10 л водиой минеральной среды , содержащей (в вес. %): Фосфат натри  трехосновный3,4 Хлористый калий0,6 Сернистый магний0,3 Сернистый аммоний2,5 Состав разбавл ют 1000 ч. м гкой воды, содержащей микроэлементы. В ферментер дополнительно внос т несколько миллионов единиц дрол жевого экстракта, а затем 50 г штамма культуры С. tropicalls в виде водной пены, содержащей 20 вес. % сухого материала и 150 г т желого газойл , содержащего 20 вес. % углеводородов парафинового р да. Температура культуры 30±1°С, рН 4. Услови  аэрации и перемешивани  поддерживаютс  такими, что в 1 мин в 1 л среды ввод т кислорода. Растворение аммиака контролируют автоматическим рП-метром. Когда нлотг1ость  чеек пены достигает 4 г/л, скорость аэрации ферментера составл ет 0,1 . К этому времени содержание газойл  в ферментере повышаетс  до 120 г/л. Обработанную среду удал ют из ферментера, добавл ют (в г/л): 2 азотнокислого кали , 4фосфорнокислого калн , 1 хлористого каЛИЯ и 150 газойл  и к 1 л смеси примешивают инокул т, состо щий из Р. griseofnlvum, выращенного на кукурузно-глюкозном экстракте, к к указано в примере 1. Эту смесь перемещнвают с аэрацией четверо суток. За это врем  происходит регенераци  газойл . Он содержит 2 г/л антибнотнка. Дл  получени  дрожжевого экстракта к верхней фазе, полученной после удалени  65%-ной отработанной среды и замены ее водонроводной водой, добавл ют 0,5 г/л неионного моющего средства «НП-29 и в результате конденсации получают продукт, который содержит 1 г-л;оль лаурннового снирта и 8,75 г-моль окиси этилена. После центрифугнровани  регенерируют (в г/л): Отработанна  минеральна  вода839 Неметаболнзированный газойль112 Пастообразна  масса мнкрооргаиизма49 п Пастоооразную массу микроорганизма про:у1ывают водой при комнатной температуре и центрифугируют. Полученна  пастообразна  :,асса дрожжей содержпт 65-70% воды. ДТЯ получени  иастообразной массы дрожже; , содержащей 50 вес. % сухих дрожжей и 50 вес. % воды, из нее удал ют избыток воды. После этого сырые дрожжи внос т под давлением в экстрактор, представл ющий собой горизонтальной оси. В сырые дрожжи добавл ют смесь {при соотношении между смесью и сухими дрожжами 8:1), состо щую из 507о гексана и 50% изопропанола. Дрожжи с водой и растворитель выдерживают 30 мин ири 50°С, затем удал ют растворитель, содержащий основную часть загр зн ющих веществ. Оставщуюс  часть сырых снова обрабатывают смесью растворителей при 50°С в течение 30 лшн, использу  1 ч. воды, 4 ч. смеси , состо щей из 50% гексана и 50% изопропанола , на 1 ч. сухих дрожжей. После удалени  экстракта, содержащего загр знени , остаток обрабатывают 2 ч. смеси, содерл ащей 80% н-гексана и 20% изопропанола. Смесь выдерживают 10 лшн при 50°С, удал ют из нее под давлением растворитель, повтор   процесс очистки четыре раза. Дрожжевой продукт высушивают перегретым паром. Результаты анализа дрожжей до и после регенерации смесью растворителей представлепы в табл. 4. т а б л 11 ц а 4 Полученный дрожжевой продукт, свободный от загр знений, может быть использован в качестве кормового материала. Характеристика используемогов опытах газойл : Уд. вес. при ,8698 ,4835 Температура помутнени , С+16 Температура застывани , °С-|-15 Содержание серы, %1,67 Содержание н-парафина, %14,7 Предмет изобретени  1. Способ получени  антибиотического комплекса , содержащего гризеофульвин, включающий культивирование микробиологического щтамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том, числе содержащей углеводород , в аэробных услови х и последующее выделение антибиотического комплекса из культуральной среды, отличающийс  тем, что, с целью получени  комплекса, непосредственно пригодного дл  использовани  против фитопатогенных микроорганизмов, культивирование продуцента осуществл ют в две стадии с использоваиием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода Candida, в частности С. tropicalis и С. lipolytica, и во второй стадии - плесневых грибов рода Penicillium, в частности Р. griseofuIvum-ATCC 11885 и Р. nigricans-ATCC 9439, а выделение антибиотического комплекса провод т в виде углеводородной фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода. 2. Снособ по п. 1, отличающийс  тем, что соотношение между углеродом и азотом в нитательной среде составл ет в первой стадии кзльтивировани  не менее 20 : 1, а во второй стадии культивировани  не менее 80: 1.