DE1932981A1 - Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase

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    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Description

Anmelder;
Toyο Joζο Kabushiki Kaisha
632-1, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase und betrifft ein solches Verfahren, bei dem Lipase durch Fermentation produziert wird, sowie das Verfahren zur Gewinnung der Lipase aus der Permentationsbrühe.
Es ist bekannt, daß es eine große Anzahl von Lipase produzierenden Mikroorganismen gibt, wie beispielsweise solche der Gattung Aspergillus, der Gattung Penicillinum, der Gattung Rhizopus, der Gattung Mucog, der Gattung Absidia, der Gattung Candida, der Gattung Torulopsie, der Gattung Brettanomyoes, der Gattung Bacillus, der Gattung Streptococcus, der Gattung Pseudomonus, der Gattung Clostridium, Solerotlnia und dergleichen, jedoch
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ist es bisher nicht bekannt gewesen, daß man mittels Mikroorganismen der Gattung Chromobacterium Lipase produzieren kann.
Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung sind Lipase produzierende Mikroorganismen, die als Substrat tierische oder pflanzliche Fette, speziell Emulsionen von Schweinefett verbrauchen können, untersucht und durchsiebt worden, und es wurde gefunden, daß sich ein stark wirksames und beständiges Enzym Lipase produzieren läßt aus einem Bazillus mit negativer Gramfärbung, der abgeschieden worden war aus einer Schlammbodenprobe des an der Sardinenbank bei Numazu-shi, Shizuoka-ken, Japan, vorbeifliessenden Flusses.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein beständiges und hochwirksames Enzym Lipase mittels eines in industriellem Maßstab vorteilhaft durchführbaren Verfahrens unter Verwendung eines bisher unbekannten Mikroorganismus als Lipase-Produzent zu schaffen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Mikroorganismus der Gattung Chromobacterium in einem Nährmedium, das eine Lieferquelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, gezüchtet und das gebildete Enzym von dem Nährmedium abgetrennt wird.
Aus der nachfolgenden Beschreibung der Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind im einzelnen die Vorteile und Merkmale dieses Verfahrens für den Fachmann erkennbar.
Der zuvor erwähnte Mikroorganismus hatte folgende taxonomischen Eigenschaften:
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(a) Wachstumsbedingungen:
(1) Mikroskopische Beobachtung Maß: 0,6 - 1,2 αχ Form: kurze Stäbchen Beweglichkeit: schwach Sporen: keine Sporulation
(2) Charakteristiken der Kolonie
Oberfläche: rund, konvex, glänzend und viskos . Färbung: fahl gelblich-braun
Pigment: nicht gebldet
Prüfmedium: a) Mannit HefeeXtrakt Agar Medium
b) Glucose Pepton Medium
c) Nähragar Medium
d) Kartoffelextrakt Agar Medium. . (3) Wachstumsbedingungen in verschiedenen Medien Bouillon: Wachstum Boui11on-Agar-Medium: Wachstum Glucose Bouillon Agar Medium: gutes Wachstum Gelatine Medium: . Wachstum Aqua Pepton: Wachstum Kartoffel Medium: Wachstum Lakmusmilch: Wachstum, Säurebildung
(b) Physiologische Eigenschaften (l)Optimale Wachstumsbedingung pH : 6,5
Temperatur: 260C aerob oder anaerob: aerob (2)Wachstumsbedingung pH : 5,5 - 9,0
Temperatur: 5 - J57°C aerob oder anaerob: aerob
(3) Gramfärbung: negativ
(4) Säure-Beschleunigung:
(5) Methylrot-Prüfung:
(6) Voges-Proskauer-Reaktion:
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(7) Indöl-Bildung:
(8) Schwefelsäurebildung:
(9) Ammoniakbildung: +
(10) Nitratreduktion: +
(11) ·Katalasebildung: +
(12) Gelatineverflüssigung: +
(13) Kaseinverflüssigung: &
(14) Stärkehydrolyse:
(15) Verbrauch von Citrat: +
(16) Koagulierung von Milch:
(17) Lakmusreduktion: +
(18) Methylenblau-Reduktion:
(19) Verbrauch von Ammoniumsalz und Harnstoff:
(c) Verbrauch von Kohlenstoff-Lieferquellen
Arabinose + Raffinose
Xylose - Sorbit
Glucose + Inosit
Mannose + . Glycerin
Fructose , + Salic in
Galactose + Inulin
Lactose - Dextrin
Maltose - Stärke
Saccharose + Cellulose
Trehalose +
Wenn man den Mikroorganismus mit diesen taxonomischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf "Manual for the identification of Medical Bacteria" von S.T. Cowan und K.J. Steel, Cambridge Univ. Press, I965, hinsichtlich seiner taxonomischen Einordnung prüft, dann kann man im Hinblick auf die negative Gramfärbung, die Stäbchenform, die Beweglichkeit, das aerobe Wachstum, die positive Reaktion auf Katalase, die negative Reaktion auf Oxidase und zur oxidativen Zersetzung von Zucker diesen Stamm als zur Gattung Chromobacterium gehörig einstufen.
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Wenn man die taxonomischen Eigenschaften dieses Chromobacteriums und der Kulturen, die zu der aus der amerikanischen Type Culture Collection erhaltenen Gattung Chromobacterium gehören, vergleicht, dann erhält man die Bestätigung, daß dieser Lipase produzierende Stamm das Bakterium Chromobacterium viscosum ist.
In der nachfolgenden Tabelle werden die charakteristischen Unterschiede zwischen dem beim erfindungsgemäßen /erfahren eingesetzten Mikroorganismus und Chromobacterium iscosum ATCC 6918 illustriert.
erfindungsgemäß Chromobacterium verwendeter Stamm viscosum ATCC
6918
Verflüssigung von Kasein ί +
Verbrauch von Citrat +
" Arabinose +
" Lactose - + --
" Raffinose - +
" Sorbit - +
" Dextrin - +
Diese beiden Stämme haben jedoch beträchtliche Ähnlichkeit hinsichtlich vieler anderen taxonomischen Eigenschaften, wie beispielsweise die Charakteristiken auf zahlreichen Medien und physiologische Eigenschaften, und,, daher weisen diese Stämme nicht so deutliche Unterschiede auf wie verschiedene Arten von Chromobacterium. Entsprechend wird dieser Lipase produzierende Stamm in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum bezeichnet. Er wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan, hinterlegt und deren ständiger Kultur-Kollektion unter der Hinterlegungsnummer KO HATSU KEN KIN KI No. 137 zugeordnet.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch gefunden, daß Chromobacterium viscosum ATCC 6918 und Chromobacterium violaceum ATCC 12472 fähig sind, ein Enzym Lipase zu produzieren.
Der zuvor beschriebene Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum ist lediglich ein Beispiel für die Mikroorganismen, die man beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen kann, für dessen Durchführung man auch andere Lipase produzierende Stämme, die zur Gattung Chromobacterium gehören, einsetzen kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Lipase in der Weise produziert, daß man ein geeignetes Nährmedium mit Lipase produzierendem Chromobacterium, beispielsweise mit Chromobacterium viscosum var. pralipolyticum, beimpft.
Nährmedien, die man für die Produktion von Lipase verwenden kann, sollten zweckmässig eine Lieferquelle für Kohlenstoff, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke, Dextrin, Melaasen oder dergleichen enthalten; es sollte darin eine assimilierbare Lieferquelle für Stickstoff vorhanden sein, wie beispielsweise Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, pulverisierte Trockenhefe, Kronweichwasser, Kaseinhydrolysat, Harnstoff, Ammoniumsalz und dergleichen vorhanden sein. In dem Medium ist weiterhin vorteilhaft ein Salz, wie beispielsweise Magnesium-, Calcium-, Kaiium-Phosphat oder dergleichen enthalten. Und es können ferner gewisse organische oder anorganische Materialien, die für das Wachstum des Mikroorganismus und/oder die Enzym-Produktion von Wert sind, dem Medium zugesetzt werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß sich die Lipase-Produktion erhöhen läßt, wenn der zur Gattung Chromobacterium gehörende Lipase produzierende Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, das zusätzlich öle und Fette enthält. Demzufolge bezfeht sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf eine Arbeitsweise zur Produktion von Lipase, die in der Weise durchgeführt wird, daß man den die Lipase produzierenden Mikroorganismus, der zur Gattung Chromobacterium gehört, in einem solchen Medium züchtet, das öle und Fette enthält, und das Enzym Lipase daraus isoliert.
Beispiele für öle und Fette, die man beim erfindungsgemäßen Verfahren dem Nährmedium zusetzen kann, sind tierische und pflanzliche Fette und öle, wie beispielsweise Schweineschmalz, Rinderfett, Butter, Walfischöl, Fischöl oder Olivenöl, Sojabohnenöl, Baumwollsaatöl, Sesamöl, Rapssaat öl, Erdnußöl, Kokusnußöl, und dergleichen. Diese Fette und öle kann man in der geeigneten Menge, vorzugsweise in etwa 0,5 bis 3%» dem Medium zusetzen. Feste Fette, wie beispielsweise Schweineschmalz, Rinderfett oder Butter, lassen sich durch Dampfsterilisation in dem Medium suspendieren, und daher können sie von den Lipase produzierenden Mikroorganismen verbraucht werden.
Die Züohtung der "beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen kann in verschiedener Weise, beispielsweise als Flüssigkultur oder als Festkultur durchgeführt werden. Für die im industriellen Maßstab durchzuführende Produktion ist die wirtschaftlichste Art der submerge Aerationskulturprozess.
Zur Durchführung der Züchtung der für die Lipase-Produktion gemäß der Erfindung benutzten Organismen kann man
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die Züchtungstemperatur ganz allgemein über den Bereich ändern, in dem die Lipase produzierenden Mikroorganismen zu wachsen vermögen und die Lipase produzieren können, vorzugsweise über den Bereich von 24 - 28°C. Die Zeitdauer für die Züchtung liegt im allgemeinen bei 2 bis Tagen, wenngleich diese Zeitspanne je nach dem im Spezialfall benutzten Bedingungen variieren kann, und zu dem Zeitpunkt, an dem die Kulturbrühe die höchste Potenz an Lipase-Produktion zeigt, sollte das Züchten natürlich beendet werden.
Es ist unnötig, den pH-Wert des Mediums zu kontrollieren. Dieser pH-Wert ist in den meisten Fällen konstant. Jedoch ist es vorteilhaft, ihn bei der Zubereitung des Mediums auf pH 6 - 7 einzustellen.
Man kann die Isolierung der Lipase aus dem Nährmedium in einer üblichen für die Abtrennung und Reinigung des Enzyms Lipase bekannten Weise vornehmen. Wenn es sich um eine feste Kultur handelt, dann kann man eine Extraktion mit Wasser oder dergleichen durchführen, entsprechend den bekannten Verfahren, mit denen sich eine Extraktflüssigkeit gewinnen läßt. In den Fällen, in denen es sich um , eine flüssige Kultur handelt, kann man sich einer besonders vorteilhaften Arbeitsweise, wie beispielsweise Vakuumfiltration, Zentrifugieren oder dergleichen bekannter Methoden bedienen, wobei die gesamte Flüssigkeit filtriert wird, um die Mycelien abzutrennen und ein Filtrat zu erhalten.
Zu diesem Extrakt oder Filtrat, das man konzentrieren oder in nicht konzentrierter Form einsetzen kann, werden lösliche Salze, wie beispielsweise Kochsalz, Ammoniumsulfat oder dergleichen, oder mit Wasser mischbare
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organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthanol, Aceton oder dergleichen, hinzugegeben, um die Lipase auszufällen. Alternativ kann man das Piltrat auch sprühtrocknen und dazu sekundäre Stabilisatoren, wie beispielsweise Malzdextrin, Lactose, Carboxymethylcellulose, Polyäthylenglykol, Magermilch, Kasein, Sorbit oder dergleichen zusetzen. Ferner gibt es noch die weiteren Methoden der Lyophilisation^ Absorption an Kationenoder Anionenaustauscherharzen, Gelfiltration oder ähn-]iche Arbeitsweisen, die man ebenfalls benutzen kann.
Isolations- und Reinigungsschritte können entwejer einzeln oder kombinativ eingesetzt werden, und dah-"i erhält man das Enzympulver, das Lipase-Aktivität aufweist.
Die erfindungsgemäß gewonnene Lipase ist stabil und aktiv. In dieser Beziehung weist das rohe Lipasepulver, das man wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben gewinnt, die folgenden Eigenschaften auf:
Stabilität gegen verschiedene pH-Werte bei 20°C über 24 Stunden: im Bereich von pH 4,0 - 9,0 machte die
verbleibende Aktivität mehr als 8o# aus;
im Bereich von pH 3 - 10 betrug sie mehr als 70$.
Optimaler pH-Wert: Die Aktivität liegt in einem weiten
pH-Bereich von 4,0-9*0*
die maximale Aktivität liegt bei pH 6 - 7.
Die Aktivitätsrate betrug: bei pH 6 = 100
bei pH 4 * 80
bei pH 9 = 80
bei pH 10= 70
bei pH 3 = 40
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- ίο -
Wärmestabilität nach 10 Minuten langer Behandlung bei Temperaturen von 37 - 95 C:
90$ an Aktivität verblieb bei einer Temperatur von weniger als 8o C;
blieb bei einer Temperatur von unterhalb 90 C.
Optimale Temperatur: bei etwa 5O0C.
Die so erhaltene Lipase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden war, ist extrem stabil und aktiv, wie beispielsweise die rohen Proben von durch Alkohol-Ausfällung gewonnenem Enzym. Daher kann man das Enzym Lipase für eine Vielzahl von Verwendungszwecken benutzen, beispielweise als Digestivum, Reinigungsmittel, Mittel zur Abwasserklärung, und dergleichen.
Die Zusammenstellung der Zersetzungsraten von rohem Lipasepulver, wie es bei dem zuvor beschriebenen Alkohol· Ausfällungs-Verfahren gewonnen wird, ist in Tafeelle I veranschaulicht (wobei die Zersetzungsrate von Olivenöl als 1,0 gesetzt ist).
Tabellel Substrat Zersetzungsrate
Olivenöl 1,0 -
BaumwQllsaatöl 0,90
Sesamsaatöl 0,86
Sojabohnenöl 2,20
Erdnußöl 0,90
Rapssaatöl 0,90
Schweineschmalz 2,0
Rinderfett 1,2
Butter 1,2
Tween 60 0,50
909883/1113 ·
- li -
Versuchsmethode: Zubereitung: 2k■VoI.-Teile Wasser
1 Vol.-Teil Substrat
37*5 mg Lipasepulver je 1 g Substrat
Bebrütet wurde 10 Stunden lang bei 300C und pH 7,0.
Die erfindungsgemäß gewonnene Lipase wird von Metallionen inhibiert, wie dies in der nachfolgenden Tabelle II angezeigt 1st:
Tabelle II
Metal lion (10"5g Ion / 1 , K+. Na+, Pb++,
„ ++ „ +++
on , on ,		 Inhibierung %
Pe++,
Co++,
Ba++,		 Mn++/
Ca++ 		. Ni++, 1%++ ·
Zn++, Al+++, Hg++ 10 - 20#
Cu+, Cu++, mehr als 20$
In den nachfolgenden Beispielen, die lediglich zur Illustration aber nicit zur Begrenzung der Erfindung dienen, 1st die angegebene Lipase-Aktiv!tat nach folgender Prüfmethode geprüft worden:
Prüfmethode I. Olivenöl als Substrat (a) Reaktionsgemisch
Enzym-Lösung , 1 ml pH 7*0, 0,1 m Phosphatpuffer 5 ml
Olivenölemulsion 10 ml
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Die zuvor erwähnte Olivenölemulsion wurde durch Homogenisierung eines Gemisches aus 80 ml einer 2#igenTwässerigen Lösung von Polyvinylalkohol und 20 ml eines Olivenöls (einer für pharmakologische Zwecke in Japan benutzten Qualität) bei 5 - 10 C 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 11000 UpM zubereitet.
(b) Arbeitsweise
Die Reaktion wurde 50 Minuten lang bei 37°C durchgeführt. Danach wurde die Emulsion durch plötzliche Zugabe von ^O ml eines Gemisches aus Äthanol und Aceton ( 1:1 ) zerstört. Dann wurde mit 0,05 π NaOH in Anwesenheit von Phenolphthalein als Indikator titriert. Es wurde auch eine Kontrollprobe an denaturiertem Enzym 10 Minuten lang bei 1000C erhitzt. Die Potenz wird gezeigt anhand der Anzahl von ml, um die sich die Kontrollprobe und die oben erwähnten Proben bei der Titration unterscheiden (wobei 1 ml 1 Einheit anzeigt).
Prüfmethode II. Schweineschmalz als Substrat
(a) Reaktionsgemteh
Enzym-Lösung 1 ml
pH 7,0, 0,1 m Phosphatpuffer 5 ml Schweineschmalzemulsion 10 ml
Die zuvor erwähnte Schweineschmalzemulsion wurde durch Homogenisieren eines Gemisches aus 20 g geschmolzenem Schweineschmalz, 10 ml an Tween 60 und 70 ml Wasser 10 Minuten lang mit 11000 UpM zubereitet.
(b) Arbeitsweise
Das in ein L-Rohr eingefüllte Reaktionsgemisch wurde in einem Monod-Schüttler 60 Minuten lang bei 40°C geschüttelt, danach wurde die Emulsion durch plötzliche Zugabe von 30 ml eines Äthanol-Aeeton-Gemisches (1:1) zerstört. Danach wurde mit 0,05 η NaOH in Anwesenheit von Phenolphthalein als Indikator titriert. A^s Kontrollprobe wurde 10 Minuten bei 1000C erhitztes denaturiertes Enzym verwendet. 909 8 83/1533
Die Potenz wird anhand der Anzahl von ml, die als Unterschied zwischen der Kontrollprobe und der bei der Titration der Prüfprobe verbrauchten mL erscheinen, angegeben ( wobei 1 ml 1 Einheit anzeigt).
Beispiel 1
100 ml eines wässerigen Mediums ( pH 6,5 )> das aus 2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem Sojabohnenpulver, Q,~5% Ammoniumsulfat, 0,2$ KH2PO^, 0,5% CaCO^ und 0,1$ MgSO2, · 7HpO bestand, wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingebracht, 20 Minuten lang bei 1200C sterilisiert, iann mit Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum beimpft und 4 Tage lang bei 200C in einer rotierenden Schütteleinrichtung mit 300 UpM gezüchtet. Es wurden 75 ml an Kulturfiltrat gewonnen, die 11,5 Einheiten/ml .an Lipase, bestimmt mit der Prüfmethode II, enthielten.
Zu der filtrierten Brühe wurde Äthanol bis' zu einer Alkoholkonzentration von 75$ zugegeben, und es wurden 3,4:5 g an rohem Lipasepulver gewonnen.
Die Potenz dieses Enzympulvers betrug I98 Einheiten/g, bestimmt mit der Prüfmethode II»
Das so gewonnene rohe Lipasepulver zeigte Spuren an Protease-Aktivität neben einer starken Lipase-Aktivität, α-Amyläse-, ß-Amylase- und Lipoproteinlipase-Aktivität und dergleichen wurden nicht festgestellt.
Beispiel 2
Es wurde die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise, jedoch ohne Zusatz von Schweineschmalz in dem Medium, wiederholt, und man erhielt 26 g an rohem Lipasepulver mit 15 Einheiten/gο
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Beispiel 3
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Schweineschmalz Olivenöl verwendet. Dabei wurden 3,01 g an rohem Lipasepulver gewonnen. Die Aktivität des Enzympulvers, bestimmt nach der Prüfmethode I, betrug 109 Einheiten/g.
Beispiel 4
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Schweineschmalz SojabohnenÖl benutzt. Dabei wurden 3,32 g an rohem Lipasepulver gewonnen. Die Potenz dieses Enzympulvers, bestimmt nach der Prüfmethode I, betrüg 100 Einheiten/g.
Beispiel 5
20 Liter eines wässerigen Mediums (pH 6,5)» das aus 2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem Sojabohnenpulver, 0,3$ Ammoniumsulfat, 0,2$ KH2PO21., 0,5$ CaCO.,, 0,1$ MgSO1^TH2O bestand und 5 ml Antischaummittel (Handelsprodukt mit der Bezeichnung "Disform CA 220" der Firma Nippon Oils and Fats Co., Ldt., Tokyo) enthielt, wurden in eine Leidener-Flasche als Fermentierbehälter eingefüllt und 30 Minuten lang bei 1200C sterilisiert. Der Fermentierbehälter hatte ein Fassungsvermögen von 30 Litern.
1 Liter an Kulturmedium von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum, das in dem gleichen Medium 2 Tage lang bei 26°C gezüchtet worden war, wurde zum Beimpfen dazu gegeben, und dann wurde 2 Tage lang bei 260C unter Belüften mit 20 l/min, und Umrühren mit 300 UpM bebrütet.' Die gewonnene Kulturbrühe hatte eine Lipase-Aktivität von 8,3 Einheiten/ml. Die Brühe wurde in 400 1 an ste-
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rilisiertem wässerigen Medium, das aus dem gleichen Medium wie zuvor angegeben bestand, in einem Fermentations-Behälter aus Edelstahl, eingebracht (100 ml an Antischaummittel wurden zugegeben). Es wurde % Tage lang bei 26°C unter Belüftung mit 400 l/min, und Rühren mit 300 UpM gezüchtet, und dabei wurden 265 1 an Kulturbrühe erhalten, nachdem zweimal mittels einer Sharples-Zentrifuge zentrifugiert worden war.
Die Potenz der Brühe betrug, bestimmt nach der Prüfmethode II, 13,0 Einheiten/ml.
Weiterhin wurde dieses Piltrat durch Sprühkonzentrierung (Verdampfung 25 l/Std., Temperatur 300C) auf 125 1 konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat wurde bei einer Einlaßtemperatur von 1200C und einer Auslaßtemperatur von 70°C sprühgetrocknet, und es wurden 8,1 kg an rohem Lipasepulver erhalten. Dieses zeigte eine Aktivität von 251 Einheiten/g, bestimmt nach der Prüfmethode II.
Beispiel 6
20 1 an flüssigem Medium (pH 6,5), bestehend aus 2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem Sojabohnenmehl, 0,3% Ammoniumsalfat, 0,2$ KH2POj+, 0,5$ CaCO,, 0,l# MgSO1+ '7H2O und 5 ml Antischaummittel, wurden in eine 30 Liter fassende Leidener-Flasche als Fermentier-Behälter eingefüllt. Nach 30-minütigem Sterilisieren bei 1200C wurde zum Beimpfen 1 Liter an wässeriger Kultur von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum, die 2 Tage lang bei 26°C in dem gleichen Medium fermentiert worden war, beigegeben, und dann wurde 4 Tage lang bei 26°C unter Belüftungsbedingungen von 20 l/min, und Umrühren mit 3OO UpM kultiviert. Die Mycelien wurden abfiltriert, und es wurden 14,8 1 an Filtrat gewonnen, das eine Lipase-Aktivität von 11,4 Einheiten/ml, 'bestimmt gemäß der Prüfmethode II, hatte.
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490 g an Malzdextrin wurden dem Filtrat zugegeben. Danach wurde bei einer Einlaßtemperatur von 120 C und einer Auslaßtemperatur von 700C sprühgetrocknet, und es wurden 927 g an rohem Lipasepulver erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 126 Einheiten/g, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode.
Beispiel 7
Es wurde wie in Beispiel £ beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Schweineschmalz Olivenöl veerwendet, und dabei wurden 15,6 1 an Kulturbrühe mit einer Potenz von 5,9 Einheiten/ml, bestimmt gemäß der Prüfmethode I, erhalten.
Diese Kulturbrühe wurde unter Verwendung einer schnell konzentrierenden Vorrichtung bei ^00C mit einer Verdampfungsgeschwindigkeit von 25 l/Std. konzentriert, und es wurden 7»5 1 an Konzentrat (Lipase-Aktivität: 11,0 Einheiten/ml) gewonnen. Dazu wurde Äthanol bis zu 75^iger Konzentration zugegeben, und es wurden 495 g an rohem Lipasepulver daraus erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 107 Einheiten/ml, bestimmt nach der gleichen zuvor beschriebenen Prüfmethode.
Beispiel 8
Aceton wurde tropfenweise zu 80 ml des Kulturfiltrats, das wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen worden war, (Lipase-Aktivität 11,0 Einheiten/ml, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode II) bei 50C zugegeben, bis die Aceton-Konzentration J5O# betrug. Dann wurde durch Zentrifugieren mit 9000 UpM die Ausfällung abgetrennt, Die verbliebene überstehende Flüssigkeit wurde in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben behandelt, und dabei wurden bei Jeweils 6o4lger und 80#iger Konzentration an
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Aceton die Ausfällungen abgetrennt.
Diese ausgefällten Produkte, die bei 3($iger, 6C$iger und 80$iger Aceton-Konzentration isoliert worden waren, wurden mit jeweils entsprechend 3C$ig, 6C$ig und 80#ig konzentriertem Aceton gewaschen und die Waschlösungen wurden getrennt aufbewahrt.
Die gleiche Arbeitsweise wurde nochmals wiederholt* und dann wurden die Ausfällungen im Vakuum getrocknet.
■>le Aktivität und Ausbeute an trockenem Lipasepulver, die dabei erhalten wurden, waren folgende:
zeSt?at"ion «) Aktiv^!t(Einhe"/s) Auebeute (g)
KonzeSt?ation
30 15 1,05
60 60 0,70
80 1530 0,31
Beispiel 9
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, ^iI-doch wurde Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum durch Chromobacterium viscosum ATCC 6918 bzw. Chromobacterium violaöeum ATGiC 12472 ausgetauscht, und dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Rohes Lipasepulver
Ausbeute Potenz
Chromobacterium ^ g ^ Einheiten/g viscosum ATCC 6918
Chromobacterium ^5 g ^5 Einheiten/g violaceum ATCC 12472
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Claims (6)

1932881 Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Llpase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Chromobacterium in einem Nährmedium, das eine Lieferquelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, gezüchtet und das gebildete Enzym von dem Nährmedium abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem solchen Nährmedium gezüchtet wird, das zusätzlich öle und/oder Fette enthält.
3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Stamm von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum KO HATSU KEN KIN KI No. lJ7i oder Chromobacterium viscosum ATCC 6918 oder Chromobacterium violaceum ATCC 12472 eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus 2-6 Tage lang bei 24 - 280C gezüchtet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium verwendet wird, das essentielle Mengen an anorganischen oder organischen Salzen enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das produzierte Enzym unter Verwendung von Ausfällmitteln durch Absorption oder durch Sprühtrocknen aus dem Kulturmedium abgetrennt wird.
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