DE2319242A1

DE2319242A1 - Verfahren zur herstellung von dextranase

Info

Publication number: DE2319242A1
Application number: DE2319242A
Authority: DE
Inventors: Fumiko Hojho; Kunio Imamura; Nobuyoshi Ishikawa; Kagawa Kanonji; Kenichi Kotera; Kazuo Shimada; Takaaki Uemura; Kiyoshi Ugawa
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1972-04-17
Filing date: 1973-04-16
Publication date: 1973-10-25
Also published as: US3912594A; CH581191A5; FR2185682A1; DE2319242B2; GB1433261A; JPS5020155B2; FR2185682B1; JPS49487A; DE2319242C3

Description

PATENTANWÄLTE

Dipl.-Ing. P.WIRTH · Dr. V. SCHM1ED-KOWARZIK

Dipl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD ■ Dr. D. GUDEL

281134 β FRANKFURT AM MAIN

287014 QR ESCHENHEIMER STRASSE 30

SK/SK OP/WG/S.K/1-2

Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University

c/o Osaka University,

Oaza Yamada Kami, Suita-city,

Osaka Prefecture /' Japan

Verfahren zur Herstellung van Dextranase

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase, das dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Flavobacteriura oder einer Mutante desselben gehörenden, Dextranase bildenden Mikroorganismus züchtet und die Dextranase aus der Kulturbrühe gewinnt.

Dextranase ist zur Herstellung von Dextran verwendet worden, das in der Medizin weitgehend als Blutersatz verwendet wurde und sich in den letzten Jahren weiterhin äußerst zweckmäßig _ai_s Enzym zur Hydrolyse von Dextran erwiesen hat, das durch die· ' Wirkung von Caries oder Zahnverfall bewirkenden Mikroorganismen gebildet wird.

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Aus diesem Grund ist angenommen worden, daß die Einverleibung von Dextranase in Zahnpulver bzw. -pasta oder andere Mundreinigungsmittel eine deutlich präventive und schützende Wirkung gegen. Zahnverfall ergibt.

Bisher sind viele, zur Bildung von Dextranase fähige Mikroorganismen vorgeschlagen worden, wie z.B. Schimmel, wie zur Gattung Penicillium, Aspergillus, Spicaria und Chaetomium gehörende Fungi, Bakterien, wie sie z.B. zu Lactobacillus und Celivibrio gehören usw.

Aufgrund neuer¹ intensiver Untersuchungen mit vielen verschiedenen Mikroorganismen einschließlich der oben genannten unter Verwendung von Dextran und "Sephadex" (Handelsname für ein durch Epichlorhydrin überbrücktes Dextranpolymerisat, das von der Firma Pharmacia Co., Ltd., Uppsala, Schweden/ hergestellt und im Handel ist) als Substrat wurde erfindungsgemäß in unerwarteter Weise gefunden, daß ein zur Gattung Flavobacterium gehörender Mikroorganismus ein potentes, Dextran hydrolysierendes Enzym bildet, und daß das so hergestellte· Enzym weiterhin eine äußerst starke Hydrolysewirksamkeit gegen solche Dextrane ausübt, die durch die Einwirkung verschiedener, Zahnverfall verursachender Mikroorganismen gebildet werden.

Der im. erfindungsgemäßen Verfahren verwendete. Dextranase bildende Mikroorganismus hat die folgenden mikrobialen Eigenschaften: (a) morphologische Eigenschaften

1. Form und Größe der Zellen etwa : Stäbe (1,0-3,0) χ (0,5 - 0,7) ,u ^:

2. Polymorphismus der Zellen : beobachtet

3. Motilität : nicht-motil

4. Sporen : nicht gebildet

5. Gram- Färbung : negativ

6. Säurebeständigkeit : keine

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fb) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien 1. Nähr-Agarplatte

2. geneigte. Nähr-Agarebene

3. Nährbrühe

4. Durchstoßen von Bouillon-Gelatine ("bouillon-gelatin stab")

5. Lakmus-Milch

6. Kartoffel .

(c) phyiologische Eigenschaften

1. Bereich der Wachstumsbedingungen

2. Verhalten gegenüber Sauerstoff

3. Reduktion von Nitraten

: gutes Wachstum, Kolonien sind ringförmig, halbkugelförmig oder flach, tautropfenartig, glatt und undurchsichtig; glänzende und viskose gelbe nicht-diffundierende Pigmente

: gutes Wachstum
: gutes Wachstum

: Wachstum von der Oberfläche der Kultur entlang der durchstoßenen Linie, keine Verflüssigung

: Wachstum mit leichtem Säuerwerden : gutes Wachstum, gelbe Kolonien

etwa etwa

: pH/5,5 -* 8,5; Temp.:/ 5-31°G. "

: fakultativ anaerob

: aus Nitraten werden Nitrite gebildet

4.	Methyl-Rot-Test	: negativ
5.	Voges-Proskauer-Test	:. negativ
6.	Indol	: negativ
7.	Bildung von Schwefelwasserstoff	i negativ
8.	Hydrolyse von Stärke	: positiv
9.	Ausnutzung von Citrat	: negativ
1Ö	. Bildung von Pigment	: positiv (nicht diffundierend]
11	. Urease	: negativ
12	. Oxidase	: positiv
13	. Catalase	: positiv
14	. Säurebildung aus Kohlenstoffquellen
	(i) L-Arabinose	: positiv
	(2) D-Xylose	: positiv
	(3) D-Glucose	ί posfciv
	(4) D-Mannose	: positiv
	(5) D-Fructose	: positiv
	(6) D-Galactose	: positiv
	(7) Maltose	. positiv
	(θ) Saccharose	positiv
	(9) Lactose	. negativ

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_ 4 -	(1O) Trehalose	2319242	. negativ
(IT) D-Sorbit	negativ
(12) D-Manriit	negativ
(13) Inosit . :	negativ
(.14) Glycerin :	negativ
(15) Stärke ,. :	positiv
(d) andere Eigenschaften
1. Beständigkeit gegen Natriumchlorid :	etwa 0-2,5 Gew./VoI.⁰/)
2._. Oxidation von Gluconsäure . :	negativ
3. Hydrolyse von Arginin :	negativ

Aufgrund der Untersuchungsergebnisse auf der Basis der oben genannten mikrobialen Eigenschaften unter Bezugnahme auf das ."Manual for the Identification of Medical /Bacteria", S.T. Cowan et al, Cambridge Univ. Press, (1965) und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", Breed et al., 7. Auflage, gehört der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus laut Bestimmung in Hinblick auf gram-negative Stäbe, Nicht-Motilität, aerobes Wachstum, Katalasepositiv, Oxidase-positiv, Bildung eines gelben, nicht-diffundierenden Pigmentes

lrfundie (genus)

und der Säurebildung aus verschiedenen Zuckern zur Gattung/Flavobacterium.

Die vorliegende Erfindung auf der Basis der oben genannten Ergebnisse bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einem zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextranase biosynthetisierenden Mikroorganismus in einem Nährmedium züchtet und die Dextranase aus. der Kulturbrühe gewinnt.

Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Herstellung von Dextranase in großtechnischem Maßstab, da Dextranase eine hohe hydrolysierende Wirksamkeit gegenüber Dextran, insbesondere dem durch die Zahnverfall bewirkenden Mikroorganismen gebildeten Dextran, zeigt.

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Beispiele der erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen sind Stämme, wie Flavobacterium BK-OI — 06 (hinterlegt bei dem Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science's Technology, Japan, mit den Bezugszeichen FERM-P Nr. 1194 bzw. 1285 bis 1288); man kann jedoch auch mit Vorteil andere, zur Gattung Flavobacterium gehörende Stämme sowie alle Mutanten verwenden, die aus den oben beschriebenen Mikroorganismen mittels verschiedener üblicher Variationsverfahren gebildet werden können und in der Lage sind, Dextranase zu bilden, wie z.B. solche Mutanten, die sich als Stärkehydrolysenegativ zeigen oder keine gelben Kolonien bilden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zur Gattung Flavobacterium gehörende, Dextranase bildende Mikroorganismus in einem natürlichen oder synthetischen Nährmedium· gezüchtet. Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium kann flüssig oder fest sein, für eine großte-chnische Herstellung

("submerged culture"}

ist jedoch die Verwendung einer von flüssigem Nährmedium bedeckten Kultur / zu bevorzugen. Die erfindungsgemäß verwendbaren Nährstoffquellen können alle .üblicherweise zur Züchtung eines Mikroorganismus verwendeten Quellen sein. Als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff können z.B. Materialien, wie Dex-. trän, Glucose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke usw., verwendet werden. Die Stickstoffquelle im Nährmedium kann z.B. Pepton, Fleischextrakt, Hefe— extrakt, Kaseinhydrolysat, Ammoniumsalze, wie Ammoniumphosphat, usw., sein. Als anorganische Salze können z.B. Salze mit Phosphorsäure, Magnesium, Kalium usw., verwendet werden. Die Züchtungstemperatur liegt zwischen etwa 5-31 C,

etwa
vorzugsweise zwischen/ 20 —30 C. Der pH-Wert des Kulturmediums"kann auf etwa

etwa

5,5-8,5, vorzugsweise/6,5—7,5, eingestellt werden. Die Züchtungsdauer variiert in Abhängigkeit von den anderen Züchtungsbedingungen, beträgt jedoch gewöhnlich etwa 3—7 Tage in einer stationären Kultur und etwa 1 Tag in einer untergetauchten Kultur. Die Kulturbrühe, in welchem der Mikroorganismus unter

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den oben genannten Bedingungen reichlich gewachsen ist, wird steril zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird davon'abgetrennt, und die erhaltenen zentrifugieren Rückstände werden zur Gewinnung von roher Dextranase mit Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung, z.B. M/15 Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5, extrahiert. Die· so erhaltene rohe Dextranase kann per se als Endprodukt verwendet werden. Es kann jedoch zweckmäßig sein, eine gereinigte Enzymlösung durch Anwendung verschiedener. Verfahren, wie z.B. Konzentration unter vermindertem Druck, Ausfällen durch Aussalzen, organische Lösungsmittelextraktion und Kolonnenfraktionierung, die allein oder in Kombination verwendet werden können, zu erhalten.

Wie festgestellt wurden, enthält das erfindungsgemäß hergestellte Dextranase-

produkt hauptsächlich Endodextranase; dies zeigt sich daraus, daß "Dextran" z.B. "Dextran 2000" (Handelsname eines von der Firma Pharmacia Co., Litd., Uppsala, Schweden, hergestellten und verkauften Dextrans) durch Kolonnenchromatographie auf "Bio—Gel" bei 37 C. für 5 Minuten in ein Dextran mit einem Molekular-

etwa

gewicht nicht über/20 000 — 40 0OD hydrolysiert wurde und das durch die Einwirkung des erfindungsgemäßen Enzyms eine schnelle Verringerung der Viskosität des" so erhaltenen Dextrans festgestellt wurde.

Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen ist die Kurve der Ergebnisse der Kolonnen— Chromatographie auf "Bio-Gel P-100" (Handelsname für ein Polyacrylamidgel, das von der Firma Bio-Rad Laboratories, 32nd und Gräfin, Richmond, Ca.;, USA hergestellt und verkauft wird). Bei der Erstellung der Kurven wurde "Dextran 2000" in 1,0 Gew./VoI.% mit dem erfindungsgemäßen Enzym oder der von der Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, USA (im folgenden als "N.B.C." abgekürzt) verfügbaren Dextranase (Kontroll-Nr. 9313) in gleichen Mengen gemischt, die Mischung wurde bei 37 C. 5 Minuten unter einem pH-Wert von 5,8 stehen gelassen und dann der Kolonnenchromatographie auf "Bio-Gel P-1000" (Kolonne: 1,1 χ 55 cm;

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Eluierungsmittel: M/50 Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösung bei pH 10,0; Eluierungsgeschwindigkeit: 14 ccm/std). Weiterhin zeigt das erfindungsgemäße Enzym eine ausgezeichnete Wirkung auf das durch die Zahnverfall verursachenden Mikroorganismen gebildete Dextran,, insbesondere solche AHT Mikroorganismen, die zur Gruppe I gehören (vgl. Jablon, J₄-Vl. et al: "J.Bacteriol.", 92, 1950:1966).

Es ist weiterhin bekannt, daß ein Dextran mit Vorteil als Induzierungsmittel zur Erzielung einer hohen Ausbeute in das Nährmedium einverleibt werden kann. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise auch gefunden, daß die Einverleibung eines durch Zahnverfall verursachende Mikroorganismen gebildeten Dextrans als

ι
Induzierungsmittel in das Nährmedium äußerst wirksam bei der Verbesserung der Hydrolyseaktivität einer erfindungsgemäß hergestellten Dextranase gegenüber Dextran im Vergleich zu derjenigen der anderen Dextranarten ist. Um diese Wirkung zu zeigen, wurde ein Vergleichstest unter Anwendung der zur Aufstellung von Fig. 1 verwendeten Kolonnenchromatogaphie durchgeführt. Bei diesem Test wurden vier Arten von Streptococcen-Dextranen geschaffen, die durch Einverleibung des Induzierungsmittels "Dextran 10" oder "AHT Dextran" gebildet waren. Die so erhaltenen rohen Enzymlösungen wurden einer Kolonnenchromatographie oder Gel-Filtration unterworfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. In Fig. 2 beziehen sich die Bezeichnungen "AHT Dextran", "BHT Dextran",¹¹CHT Dextran" und "HHT Dextran" auf Dextrane, die durch die zu Streptococcus, Stamm AHT, Stamm BHT₁ Stamm CHT bzw. Stamm HHT gehörenden Mikroorganismen gebildet wurden. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß das durch das Induzierungsmittel ¹¹AHT Dextran" gebildete Dextran vollständig zu einem Dextran mit niedrigem Molekulargewicht hydrolysiert worden ist.

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-B-

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Dextranase oder ihr

etwa
Präparat hat sich bei einem pH-Wert von/4,0 — 8,5 als aktiv erwiesen, wobei die maximale Wirksamkeit bei einem pH-Wert von etwa 6,5 — 7,5 liegt; und sie ist bei einer Temperatur von etwa 55 C. oder niedriger stabil.

Die erfindungsgemäß hergestellte Dextranase kann leicht in eine Zahnpaste oder -pulver, Einreib salbe oder -lotion, Mundwasser, Kaugummi, Nahrungsmittel, Getränk oder einen Wasserstrahl-Zahnreiniger in solcher Weise einverleibt

etwa
werden, daß diese Produkte mit/1000 — 200 000 Einheiten Dextranase pro g

der Formulierung versehen sind (vgl. die belgische Patentschrift 718 645).

Das folgende Beispiel veranschaulicht die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel - . "

6 1 flüssiges Kulturmedium (auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt) , das 1,5 Gew./Vol.⁰/o Polypepton, 0,1 Gew./Vol$4 Hefeextrakt, 0,2 Gew./Vol.% Monokaliumphosphat, 0,2 Gew./Vol.^o Monoammaiumphopshat, 0,1 Gew./Vol.% Magnesiumsulfat und 0,5 Gew./VoI.⁰/) "Dextrans 10" (Handelsname eines von der oben erwähnten Firma Pharmacia Co., Ltd., hergestellten und verkauften Dextrans) enthielt^ wurden in einen 10-1-Fermentierungsbehälter gegossen und sterilisiert. Dann wurde das Medium mit einem Stamm des zur Gattung Flavobacterium gehörenden Mikroorganismus wie in Tabelle 1 angeimpft. Die Züchtung erfolgt unter belüftetem Rühren bei 30°C. für etwa 20-24 Stunden.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde zum Sammeln von lebendem Mycelium aseptisch zentrifugiert. Die so gesammelten Zellen wurden mit einer M/15 Phosphat-Pufferlösung durch Zugabe von 10 % der Zellen (bezogen auf das nasse Zellengewicht) zur Lösung und Rühren der erhaltenen Mischung bei 36 C. für 2-3 Tage extrahiert. Der so erhaltene Extrakt wurde zur Abtrennung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, die in den anschließenden Verfahren als rohe Enzym-

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— 9 -» lösung verwendet wurde.

Die Aktivität des wie oben hergestellten Enzyms wurde durch Verwendung von Dextranase (Kontroll-Nr. 9313, hergestellt und verkauf von N.B.C.) als Kontrolle bei den folgenden Verfahren zur Bestimmung der Aktivität bestimmt. Verfahren 1

"Dextran T70" (Handelsname eines von der oben genannten Firma Pharmacia Co., Ltd.^:, hergestellten und verkauften Qe>trans) und ein durch den Zahncaries verursachendenden Streoptococcus Stamm AHT gebildetes Dextran wurden als Substrat verwendet. Zu 10 ecm einer 1-°/oigen (Gew./VoI.), Lösung jedes Dextrans wurden 4 ecm einer 0,1M Acetatpufferlösung und 1 ecm der rohen Enzymlösung zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten bei einem pH-Wert von 5,8 bei 37 C. stehen gelassen, dann wurde nach dem Somogyi-Verfahren (vgl. M.Scmogyi: "J.Biol.Chem.", 160,60 (1945)) eine erhöhte Menge an reduzierendem Zucker festgestellt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt, wobei eine Einheit pro ecm der rohen Enzymlösung gegeben wird} und eine Einheit wird definiert als die Enzymmenge, die zur Freisetzung von 1 rri/uM reduzierendem Zucker pro

Minute fähig ist. ■ "

Tabelle 1

Stamm; Flavo- Substrat Substrat

bacterium "Dextran T70" Dextran*, gebildet/'durch den zu

Streptococcus, Stamm AHT gehörenden Mikroorganismus, der Zahncaries verursacht

243.

524 · 296 260

^ 125

231

BK-01	263
BK-03	591
BK-04	311
BK-05	295
BK-06	142
Kontrolle **	368

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* = J.M. Jablon et al "J.Bacterial.", 92, 1950, 196Θ

** β 1-Pydige (Gew./Vol.) Lösung fungaler Dextranse (Kontroll-Nr., 9313,

von der N,B.C. erhältlich; vgl. CF. Schachtele et al: "Infection ■

and Immunity" Feb. 1972, Seite 263-266).

Verfahren 2

Zu 10 ecm einer 5-%igen (Gew./Vol.) Lösung von "Dextran 2000" wurden 4 ecm einer Ο,ΙΜ-Acetatpufferlösung und 1 ecm der rohen Enzymlösung zugegeben. Die Mischung wurde bei einem pH-Wert von 5,8 bei 37 C. stehen gelassen. Dann wurde die notwendige Zeit für eine Abnahme der anfänglichen Viskosität des Dextrans auf die Hälfte, d.h. die Zeit zur halben Verminderung der Viskosität, mittels eines Ostwald-Viskometers gemäß der Lehre in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 8067/1969 gemessen. .

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt:.

Tabelle 2 ■

Stamm; Flavo- erforderliche Zeit zur Verminderung der Viskosität bacterium" auf die Hälfte; min

BK-O1 .20

BK-03 7

BK-04 17

BK-05 19

BK-06 ; ; 31

Kontrolle . _; _38 _____: . _

Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich,'daßdas erfindungsgemäß hergestellte Enzym Endodextranase ist, die durch eine höhere Viskositätsverringerung als Produktivität an reduzierendem Zucker charakterisiert ist.

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In den beiliegenden Zeichnungen ist in'Fig. 1 auf der Abszisse das Volumen des Eluates in ecm und auf der Ordinate der Zuckergehalt in ,ug/ccm, gemessen nach dem Anthrone-Verfahren (vgl. F.A. Loewus "analytical Chemistry", 24, 219 (1952)) angegeben, die Kurve (i) bedeutet "Dextran 2000" ,vor Behandlung mit Dextranase, die Kurve (2) nach Behandlung mit Dextranase von BK-03 und die Kurve (3) nach Behandlung mit Dextranase von N.B.C.

/
Fig. 2 stellt die Gel-Filtration von Produkten aus Dextranen einiger cariogener Streptococcx durch mit "Dextran.10" oder "AHT Dextran" induzierte Enzymherstellung dar. Auf der Abszisse ist das Volumen in ecm angegeben, während die Ordinate die Kohlehydrate als Glucose in /ug/ccm aufführt. Die oberste Reihe der Kurven ist die Kontrolle ohne Enzym, die mitt-lere Reihe gibt die mit "Dextran 10" induzierten Ergebnisse, und die unterste Reihe steht für die mit "AHT-Dextran" induzierten Ergebnisse.

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Claims

Patentansprüche

fi^- Verfahren zur Herstellung von Dextranase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextranase biosynthetisierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet und die darin akkumulierte Dextranase, aus dem Medium gewinnt.
2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Flavobacterium BK-O1, BK-02, BK-03, BK-04, BK-05 und BK-06 verwendet.

. 3.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung des Mikroorganismus im Kulturmedium durch Verwendung eines Dextrans als Induzierungsmittels durchgeführt wird, das durch einen Zahncaries' verursachenden Mikroorganismus gebildet wird.

. 4,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von 5—31'C. erfolgt.

5,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung ' bei einem pH-Wert von 5,5-8,5 erfolgt.

Der Patentanwalt:

V/

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