DE2944042A1 - Anaerobes thermophiles kultursystem - Google Patents

Anaerobes thermophiles kultursystem

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DE2944042A1 DE19792944042 DE2944042A DE2944042A1 DE 2944042 A1 DE2944042 A1 DE 2944042A1 DE 19792944042 DE19792944042 DE 19792944042 DE 2944042 A DE2944042 A DE 2944042A DE 2944042 A1 DE2944042 A1 DE 2944042A1
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Description

R-3784
UNITED STATES DEPARTMENT OF ENERGY, Washington, D.C. 20545,
V.St.A.
Anaerobes thermophiles Kultursystem
1300ie/OS6O
29U042
Die Erfindung betrifft ein gemischtes Kultursystem anaerober, thermophiler Mikroorganismen und insbesondere eine gemischte Kultur des neuentdeckten thermophilen glycolytischen Anaerobiers Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum. Die Erfindung betrifft auch ein neues Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Cellulose durch Fermentation in einem Nährmedium mit einer gemischten Kultur aus biologisch reinen Kulturen von Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum. Die Erfindung ist das Ergebnis eines Kontraktes mit dem U.S. Department of Energy.
Es wurden bisher relativ wenige anaerobe Mikroorganismen, die auf Kohlehydraten wachsen (d.h. glycolytisch sind) und unter thermophilen oder extrem thermophilen Bedingungen Ethanol liefern, isoliert und charakterisiert. Repräsentative Beispiele für gut charakterisierte glycolytische anaerobe Bakterien, die auf einer Nährkultur im thermophilen bis extrem thermophilen Bereich wachsen, gehören zur Genus Clostridium. Hierzu gehören: C. thermoaceticum, C. tartarivorum, C. thermosaccharolyticum, C. thermocellum, C. thermocellulaseum und C. thermohydrosulfuricum. Stämme der zuletzt genannten Organismen wurden von J. Wiegel und L. G. Ljundahl (Vgl. Abstract I 75 des Abstract of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology, Las Vegas, Nevada, U.S.A., 1978 und J. Bacteriology, September 1979, im Druck) isoliert und charakterisiert. Ein neotypischer Stamm von C. thermohydrosulfuricum E 100-69 wurde aus den Flüssigkeiten einer österreichischen Zuckerrübenfabrik von F. Hollaus und U. Sleytr (Vgl. Arch. Mikrobiol. 86: 129-146, 1972) isoliert.
Zusätzlich zu diesen bekannten Species wurden zwei, keine Sporen bildende Stämme isoliert, welche eine neue Species eines neuen Genus darstellen,und charakterisiert. Die neuentdeckten thermophilen, Anaerobier wurden in Form biologisch reiner Kulturen isoliert und als Thermoanaerobacter ethanolicus bezeichnet. Ein repräsentativer Stamm dieses
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neuen Mikroorganismus in biologisch reiner Subkultur wurde als JW 200 bezeichnet und in der Stammsammlung für Patentzwecke des American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt. Die von der American Type Culture Collection ausgegebene Hinterlegungsnummer für diesen Stamm ist ATCC 31550. Bei der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der neu aufgefundenen Species, bei der es sich nicht um ein Clostridium handelt, wurde festgestellt, daß die neue Species ein wirksamer Produzent von Ethanol aus verschiedenen Kohlehydraten, insbesondere den üblichsten Mono- und Disacchariden ist.
Thermoanaerobacter ethanolicus ist in der mit der internen Aktenbezeichnung R-3785 der selben Anmelderin und des selben Erfinders am gleichen Tage hinterlegten Patentanmeldung beschrieben. In dieser Anmeldung wird offenbart, daß T. ethanolicus in wässrigem Nährmedium unter anaeroben, thermophilen Bedingungen kultiviert wird und bei einem neuen Verfahren zur Herstellung von Ethanol eingesetzt wird, bei dem man Kohlehydrate, insbesondere die Saccharide,der Fermentationswirkung des neuisolierten Mikroorganismus T. ethanolicus in biologisch reiner Kultur unterworfen wird, um Ethanol zu gewinnen. Anschließend wird das Ethanol gewoninen. Während T. ethanolicus eine Vielzahl von Zuckern unter Bildung von Ethanol wirksam fermentiert, ist eines der Charakteristika des Anaerobiers, daß er Cellulose nicht fermentiert. Es ist bekannt, daß der 1950 isolierte anaerobe Mikroorganismus Clostridium thermocellum Cellulose zu Wasserstoff, Kohlendioxid, Ethanol, Formiat, Acetat, Lactat und in geringerem Ausmaße zu Dicarbonsäuren, bei thermophilen Temperaturen fermentiert (vgl. McBee, R. H. 1950, The anaerobic thermophilic cellulolytic bacteria, Bacteriol. Rev. 14: 51-63). Es wurde jedoch festgestellt, daß bei dem während dieser Fermentation produzierten clostridialen Cellulasesystem einige durch die Einwirkung der Cellulase gebildeten Produkte, beispielsweise Cellobiose, und Glucose zur Inhibierung des Wachstum von C. thermocellum neigen, wodurch das Cellulase-Enzymsystem zurückgedrängt wird. Andere
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Zucker, die möglicherweise in einem Fermentationsmedium vorliegen, beispielsweise Lactose, können ebenfalls die Cellulase inhibieren. Während C. thermocellum diese Zucker verwendet, ist das Wachstum nur langsam und die Ausbeute an Produkten, beispielsweise Ethanol, ist gering.Obgleich C. thermocellum in biologisch reiner Form zum Abbau der Cellulose brauchbar ist, fermentiert er jedoch das gebildete Zuckersubstrat nicht wirksam, so daß in der Tat durch die Substratakkumulation die Fermentation inhibiert wird. Ein neuisolierter, repräsentativer Stamm von C. thermocellum, der als JW 20 bezeichnet wurde, wurde in der Stammsanunlung für Patentzwecke des American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., hinterlegt. Die diesem Stamm von C. thermocellum zugeordnete Hinterlegungsnununer ist ATCC 31549.
Diese Mikroorganismen sind selbstverständlich brauchbar ftür eine anaerobe Fermentation verschiedener Kohlehydrate, beispielsweise von Sacchariden, und zur Verwendung in gemischten Kulturen zum wirksamen Abbau von Cellulose zur Herstellung von Ethanol und anderer Fermentationsprodukte unter thermophilen Bedingungen. Hefefermentation (Saccharomyces Species) von Zucker muß bekanntlich bei weniger als ungefähr 37 C unter semiaeroben Bedingungen durchgeführt werden, um Ethanol zu liefern. Darüber hinaus müssen die Bedingungen sorgfältig gesteuert werden, um eine Kontamination mit schädlichen Bakterien, Fungi und Schimmel zu vermeiden.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues, gemischtes Nährkultursystem von Mikroorganismen zu schaffen, das unter anaeroben thermophilen Bedingungen Ethanol liefert. Der Erfindung liegt auch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Ethanol zu schaffen, indem man biologisch reine Kulturen bestimmter thermophiler Anaerobier kuppelt. Es sollen auch biologisch reine Kulturen des neuentdeckten Mikroorganismus T. ethanolicus
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- Jt--
-C-
und des bekannten Mikroorganismus C. thermocellum gekuppelt werden, um eine wirksame Fermentation von Cellulose unter Bildung von Ethanol zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird ein gemischtes Kultursystem des neu aufgefundenen Mikroorganismus T. ethanolicus und des Mikroorganismus T. thermocellum geschaffen. Diese Mikroorganismen wurden in einem gemischten Nährkulturmedium, das Cellulose enthält gekuppelt und kultiviert, um die Cellulose wirksam zu fermentieren, wobei gewinnbare Mengen an Ethanol gebildet wurden. Die neue Fermentation wird unter anaeroben, thermophilen Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ist das neue erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Herstellung von Ethanol unmittelbar aus Cellulose. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Cellulose der Fermentationswirkung des neuisolierten Mikroorganismus T. ethanolicum, gekuppelt mit dem Mikroorganismus C. thermocellum, in einer gemischten Nährkultur unter Bildung von Ethanol unterwirft und das Ethanol gewinnt. Dieses Verfahren wird unter anaeroben, thermophilen Bedingungen und auch unter extrem thermophilen Bedingungen durchgeführt.
In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Begriff "thermophil" eine Kulturtemperatur zwischen ungefähr 45°C und 700C. Der Begriff "extrem thermophil" bezieht sich auf Kulturtemperaturen oberhalb ungefähr 700C.
Obgleich nicht vorgesehen ist, das erfindungsgemäße Verfahren auf irgendeine besondere Theorie festzulegen, ergibt sich aus der nachfolgenden Beschreibung und dem Beispiel, daß das Kuppeln von T. ethanolicus und T. thermocellum den Celluloseabbau wesentlich verstärkt, eine Inhibierung der wie hier beschriebenen Fermentation verhindert und die Fermentation in Richtung einer Bildung von Ethanol verschiebt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform.
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Wie in der parallelen Patentanmeldung R-3785 (S.N. P-54669) beschrieben, wurde der Mikroorganismus T. ethanolicus aus Bodenproben der heißen Quellen im Yellowstone National Park, Wyoming, U.S.A., aufgefunden und isoliert. Ein Stamm JW-201 wurde aus einer sauren Quelle, die als "Dragon Mouth" bezeichnet wird und einen pH von ungefähr 5,5 aufweist, isoliert. Der zweite Stamm JW-200 wurde aus einer alkalischen Quelle, genannt "White Creek", mit einem pH von ungefähr 8,8 isoliert. Die Stämme sind einander sehr ähnlich und wurden in Verbindung mit den zuvor erwähnten anaeroben,thermophilen Clostridiastämmen aufgefunden.
Obgleich die neuen Mikroorganismenstämme mit dem zuvor erwähnten Clostridia die Fähigkeit zur Fermentation von Kohlehydraten bei thermophilen Temperaturen gemeinsam haben, bilden sie jedoch keine Sporen und lassen sich daher dem Genus Clostridium nicht unterordnen. Im Hinblick auf die Morphologie- und Fermentations-Charakteristika wird angenommen, daß es sich bei den neuen Stämmen um ein neues Genus und eine neue Species handelt und als Thermoanaerobacter ethanolicus bezeichnet wird, wobei ATCC 31550 für diese Stämme repräsentativ ist.
Die Isolierung von T. ethanolicus in biologisch reiner Form wurde unter Anwendung der anaeroben Technik von Hungate, Bacteriol. Rev. 14: 1-49, modifiziert von Bryant und Robinson, J. Dairy Science 44: 1446-1456, welche Arbeitstechniken dem Fachmann bekannt sind, in biologisch reiner Form erzielt. Das zur Isolierung, zur Herstellung der Anreicherungskulturen und zur Haltung der isolierten Stämme verwendete Medium weist die folgende bevorzugte Zusammensetzung auf: KH2PO4 1,5 g/l; Na2HPO4·12H2O 4,2 g/l; NH4Cl 0,5 g/l; MgCl2 0,18 g/l; Hefeextrakt (Difco) 2,0 g/l; Glucose 8,0 g/l; Wolfes Mineral Solution 5 ml. Das Medium wird unter anaeroben Bedingungen hergestellt und muß unter einer Atmosphäre aus Inertgas, beispielsweise Stickstoff oder Argon, gelagert werden. Der pH des Mediums liegt im Bereich von ungefähr 6,8 bis 7,8, vorzugsweise bei 7,3, und wird - wie erforderlich - mit einer sterilen, anaeroben Lösung von NaOH oder HCl eingestellt. Die Stammkulturen werden
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auf dem gleichen Medium gehalten, das mit 2% Agar verfestigt und bei 4°C gelagert wird. Flüssige Medienkulturen können nach Zugabe eines gleichen Volumens Glyzerin bei -18°C gelagert werden.
Obgleich im beispielhaft genannten Nährmedium Glucose das bevorzugte Kohlehydratsubstrat darstellt, kann man auch andere Monosaccharide, beispielsweise Xylose, Ribose, Mannose, Fructose und Galactose, oder Disaccharide, beispielsweise Sucrose, Lactose, Maltose und Cellobiose, einsetzen. Das Wachstum erfolgt auch auf Pyruvat, Pectin und Stärke. Es ist zu bemerken, daß T. ethanolicus für das Wachstum Hefeextrakt benötigt. Ohne Hefeextrakt wird in den nachfolgenden Subkulturen kein Wachstum erzielt. Obgleich das Wachstum in Abwesenheit von Glucose wesentlich geringer ist, können Hefeextraktkonzentrationen von oberhalb 0,5% als einzige Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und Energie dienen. Wie jedoch im Beispiel dargestellt wird, fermentieren reine Kulturen von T. ethanolicus Cellulose nicht.
Biologisch reine Kulturen von Thermoanaerobacter ethanolicus ATCC 31550 (JW 200) zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung können bequem hergestellt werden, indem man dasselbe zur Isolierung verwendete Nährmedium unter anaeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen ungefähr 36°C und 78°C verwendet, wobei die optimale Wachsturnstemperatur ungefähr 68°C beträgt. Die Verdopplungszeit bei 68°C beträgt ungefähr 90 Minuten. Ein derartiges Wachstum ist nicht vom pH abhängig, so daß Wachstum im sehr weiten pH-Bereich von 4,5 bis 9,8 erfolgt. Für ein optimales Wachstum sollte der pH des Mediums zwischen ungefähr 5,7 und 8,6 liegen, wobei der bevorzugte pH ungefähr 7,3 beträgt.
Clostridium thermocellum wurde von einer ganzen Reihe von Forschern isoliert, kultiviert und charakterisiert.
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— to —
Zusätzlich zu der zuvor genannten Literaturstelle von McBee wird auf die folgenden Literaturstellen verwiesen:
Alexander, J. L. 1969, Purification and specificity of cellobiose phosphorylase from Clostridium thermocellum J. Biol. Chem. 243: 2899-2904.
Patni, N. J. und J. K. Alexander. 1971a. Utilization of glucose by Clostridium thermocellum. Presence of glucokinase and other glycolytic enzymes in cell extracts. J. Bacteriol. 105: 220-225.
Patni, N. J. und J. K. Alexander. 1971b. Catabolism of fructose and mannitol in Clostridium thermocellum. Presence of phosphoenolpyruvate: fructose phosphotransferase, fructose 1-phosphate kinase, phosphoenolpyruvate; mannitol phosphotransferase and mannitol 1-phosphate dehydrogenase in cell extracts. J. Bacteriol. 105: 226-231.
Bee B. H. and T. H. Blackburn. 1975. Cellulose production by a thermophilic Clostridium species. Appl. Microbiol. 30: 346-353.
Ng, T. K., P. J. Weimer and J. G. Zeikus. 1977. Cellulolytic and physiological properties of Clostridium thermocellum. Arch. Misrobiol. 114: 1-7.
Ein Stamm von C. thermocellum ATCC 31549 (JW 20) wurde von der Anmelderin aus einem Baumwollballen aus Louisana, U.S.A., isoliert. Wie bei T. ethanolicus wurde dieser Stamm von C. thermocellum in biologisch reiner Form isoliert, wobei man die von Bryant and Robinson modifizierte Hungate-Technik anwendete. Das zuvor für T. ethanolicus verwendete und beschriebene Nährmedium wurde zur Isolierung und zur Anreicherung von C. thermocellum verwendet, mit der Ausnahme, daß man anstelle von Glucose Cellulose (10,8 g/l)
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als Substrat verwendet und die Menge an Hefeextrakt auf 5,0 g/l anhob. Das Medium wird unter anaeroben Bedingungen hergestellt und muß unter einer Inertgasatmosphäre, beispielsweise Stickstoff oder Argon, gelagert werden. Der pH des Mediums liegt im Bereich von ungefähr 6,8 bis 7,8, vorzugsweise bei 7,3.
C. thermocellum kann bequem im selben Substratmedium,wie zur Isolierung verwendet, gezüchtet werden. Man arbeitet unter anaeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen 45°C und 65°C, wobei die optimale Wachstumstemperatur ungefähr 600C ausmacht
ungefähr 7,5.
600C ausmacht. Der bevorzugte pH für das Wachstum beträgt
Das gleiche Cellulose-enthaltende Medium, das zur Isolierung und Kultivierung von C. thermocellum eingesetzt wird, wird für die gekuppelte Fermentation von Cellulose unter Verwendung von T. ethanolicus und C. thermocellum unter anaeroben, thermophilen Bedingungen eingesetzt. Wie in nachstehenden speziellen Beispiel dargestellt, ergibt eine derartige direkte Fermentation von Cellulose eine beträchtliche Ausbeute an Ethanol. Bei einer Temperatur von 60°C und einem pH von 7/5 werden unter anaeroben Bedingungen bis zu 1,46 Mol Ethanol pro Glucoseeinheit der Cellulose gebildet. Das bei dieser Fermentation produzierte Ethanol kann durch übliche Destillationstechniken gewonnen werden.
Das nachfolgende spezifische Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung und stellte eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Beispiel
CeIlulosefermentation
Die CeIlulosefermentationen wurden unter Verwendung von
T. ethanolicus und C. thermocellum in reinen Kulturen und in gemischten Kulturen durchgeführt. Sämtliche Fermentationen
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wurden unter einer Argonatmosphare während 168 Stunden bei 600C durchgeführt. Man inkubierte in 50 ml Medium, das wie nachstehend beschrieben ist, mit 54O mg Cellulose (anstelle von Glucose) und mit 0,5% Hefeextrakt. Der anfängliche pH ist 7,5. Die Ergebnisse dieser Fermentationen sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.
Tabelle
C.thermocellum T. ethanolicus
C.thermocellum T. ethanolicus C.thermocellum +
T.ethanolicus
Cellulose mg 351 13 4 ,024 500 ,05 372 27
fermentierte· mM 2, 79 0 ,05 3 ,45 2, 33
Ethanol 1, 0 4 2,
produzierte mM 84 __ ,46 05
Ethanol(Mol) 0, 1 1,
Glycoserest
der Cellulose
Im Experiment A wurde der pH während der Fermentation gesteuert und bei 7,5 gehalten, während man im Experiment B den pH aufgrund der Bildung von Säuren sinken ließ.
Dieses Beispiel zeigt, daß durch Kuppeln von C. thermocellum mit T. ethanolicus die Celluloseabbaurate wesentlich erhöht wird und das Kuppeln die Fermentation zu einer wesentlich größeren Produktion von Ethanol verschiebt. Das Beispiel zeigt auch, daß man bessere Ergebnisse erzielt, wenn der pH durch die gesamte Fermentation hindurch gesteuert wird.
Mit dem Ausdruck "Sucrose" wird gelegentlich die Saccharose bezeichnet.
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Claims (7)

χ- Patentansprüche
1. Gemischtes Kultursystem der Mikroorganismen Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum.
2. Gemischtes Kultursystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultursystem bei Fermentation in einem wässrigen Nährmedium mit einem Gehalt an Cellulose zur Produktion von Ethanol in gewinnbaren Mengen befähigt ist.
3. Gemischtes Kultursystem, enthaltend einen biologisch reinen Stamm des Mikroorganismus Thermoanaerobacter ethanolicus und einen Stamm des Mikroorganismus Clostridium thermocellum in einer wässrigen Nährkultur.
4. Gemischtes anaerobes, thermophiles Kultursystem der Mikroorganismen Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum.
5. Verfahren zur Kultivierung von Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem gemischten Nährkulturmedium mit einem Gehalt an Cellulose unter anaeroben, thermophilen Bedingungen kultiviert, bis eine gewinnbare Menge Ethanol produziert ist.
6.J Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Cellulose, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cellulose der Fermentationswirkung von Mikroorganismen Thermoanaerobacter ethanolicus und Clostridium thermocellum in einer gemischten Nährkultur unterwirft, um Ethanol zu bilden, und das Ethanol gewinnt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man es unter anaeroben, thermophilen Bedingungen durchführt.
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