DE102008006101B4

DE102008006101B4 - Verfahren zur Herstellung von Erythrulose

Info

Publication number: DE102008006101B4
Application number: DE102008006101.8A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Vorlop Klaus-Dieter; Claus Decker; Dr. Rose Thomas; Dr. Willke Thomas; Dr. Wach Wolfgang; Dr. Klingeberg Michael
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2016-11-24
Anticipated expiration: 2028-01-26
Also published as: DE102008006101A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Erythrulose aus einem Erythrit-haltigen Ausgangssubstrat, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit einem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, der auch bei einer Erythrulose-Konzentration von ≥ 140 g/L Erythrit-oxidierende Aktivität aufweist und (b) Gewinnung der während der Inkubation gebildeten Erythrulose.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythrulose aus einem Erythrit-haltigen Ausgangssubstrat durch einen Erythrulose-toleranten Mikroorganismuses der Gattung Gluconobacter.
Erythrulose findet unter anderem in Kosmetika als Selbstbräuner Verwendung. Die Bräunungsreaktion kommt durch Reaktion der Keto-Gruppe der Erythrulose mit freien Aminogruppen von Proteinen unter Bildung eines bräunlichen Polymers zustande. Darüber hinaus ist aus der WO 2006/128680 A1 die Verwendung von Erythrulose zur Herstellung eines Lebensmittels bekannt. Die Herstellung von Erythrulose aus Erythrit ist bereits seit Jahrzehnten bekannt. Whistler und Underkofler (J. Amer. Chem. Soc. 60 (1938), 2507–2508) beschreiben die Umsetzung von L-Erythrulose durch den Mikroorganismus Acetobacter suboxidans aus meso-Erythrit. Die WO 01/42483 A1 beschreibt die Herstellung von L-Erythrulose aus meso-Erythrit durch Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter und Acetobacter. Nach diesem Verfahren ist die Umsetzung in einem Medium vorgesehen, das neben meso-Erythrit auch mindestens ein weiteres Polyol enthält.
Nachteilig an den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Erythrulose ist die geringe Ausbeute. Haas und Matz beschreiben eine Umsetzung von Erythrulose aus Erythrit mit einer Ausbeute von 23% (Haas und Matz, Liebigs Ann. Chem. 1974, 342 bis 344).
Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Erythrulose bereitzustellen, das zum Einen eine hohe Ausbeute an Erythrulose und zum Anderen eine hohe Endproduktkonzentration an Erythrulose ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Erythrulose aus einem Erythrit-haltigen Ausgangssubstrat gemäß der Patentansprüche, insbesondere eines Verfahrens, in dem in einem ersten Verfahrensschritt (a) eine Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit einem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter durchgeführt und in einem zweiten Verfahrensschritt (b) die während der Inkubation gebildete Erythrulose gewonnen wird. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus ein solcher, der nicht nur bei einer Erythrulosekonzentration von < 140 g/L, sondern insbesondere und vorteilhafterweise auch ≥ 140 g/L weiterhin und fortdauernd Erythrit-oxidierende Aktivität aufweist. In besonders bevorzugter Ausführungsform sind diese Mikroorganismen in der Lage, bei Erythrulosekonzentrationen von ≥ 140 g/L weiterhin und fortdauernd Erythrit-oxidierende Aktivität und zwar mit einer hohen Ausbeute von ≥ 90% aufzuweisen. Demgegenüber stellen Mikroorganismen, die nicht Erythrulose-tolerant sind, bei einer Erythrulosekonzentration von ≥ 140 g/L ihre Erythrit-oxidierende Aktivität vollständig ein.
Die Erfindung setzt also vorteilhafterweise einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter ein, der in hohem Maße Erythrulose-tolerant ist und so in vorteilhafter Weise in der Lage ist, auch hohe Produktkonzentrationen im Kulturmedium bereitzustellen. Diese Lehre ist insofern überraschend, als dass davon auszugehen war, dass Erythrulose mit seiner reaktiven Ketogruppe zellschädigend und toxisch auf die Mikroorganismen wirkt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Erythrulose aus einem Erythrit-haltigen Ausgangssubstrat bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit mindestens einem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, vorzugsweise in einem wässrigen Kulturmedium, und
(b) Gewinnung, insbesondere Isolierung, der während der Inkubation gebildeten Erythrulose, vorzugsweise aus dem wässrigen Kulturmedium, wobei der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus in bevorzugter Ausführung ein Mikroorganismus ist, der auch bei einer Erythrulosekonzentration von ≥ 140 g/L weiterhin Erythrit-oxidierende Aktivität aufweist.

Die vorliegende Erfindung erlaubt demgemäß die Fermentation von Erythrit zu Erythrulose, das heißt die Bereitstellung von Erythrulose, insbesondere L-Erythrulose, in ausgesprochen hohen Konzentrationen und in einer vollständigen oder nahezu vollständig quantitativen Ausbeute, bezogen auf eingesetztes Erythrit, insbesondere meso-Erythrit.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einem „Erythrulose-toleranten Mikroorganismus” ein Mikroorganismus zu verstehen, der auch noch Erythrit-oxidierende Aktivität in Anwesenheit des gebildeten Reaktionsprodukts Erythrulose aufweist. Unter einer Erythrulose-Toleranz ist in diesem Zusammenhang die fortdauernde Erythrit-oxidierende Aktivität des Mikroorganismus bei Erythrulose-Produktkonzentrationen von ≥ 140 g/L zu verstehen, und zwar dergestalt, dass der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus auch bei hohen Erythrulosekonzentrationen keinen erkennbaren toxischen und zellschädigenden Einflüssen unterliegt und fortdauernd Erythrit-oxidierende Aktivität aufweist, vorzugsweise in gleicher Aktivität wie bei geringeren Erythrulosekonzentrationen. Im Gegensatz dazu ist unter Erythrulose-Intoleranz bedingt durch die toxische und zellschädigende Wirkung der Erythrulose das völlige oder im Wesentlichen völlige Fehlen von Erythrit-oxidierender Aktivität eines Mikroorganismus bei Erythrulose-Konzentrationen von ≥ 140 g/L zu verstehen. Der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus ist also in der Lage, auch bei hohen Erythrulose-Konzentrationen in einem Bereich von mindestens 140 g/L, vorzugsweise mindestens 200 g/L, bevorzugt mindestens 250 g/L, weiterhin Erythrit-oxididierende Aktivität aufzuweisen und so Erythrulose zu produzieren, insbesondere so, dass eine Ausbeute von ≥ 90% erzielt wird.
Das Auffinden eines Erythrulose-toleranten Mikroorganismus kann durch ein Screeningverfahren durchgeführt werden. Dazu werden zu untersuchende Mikroorganismen bei einer bestimmten und zu überprüfenden Erythrulose-Konzentration kultiviert und festgestellt, ob diese bei dieser Erythrulosekonzentration weiterhin Erythrit zu Erythrulose oxidieren. Bevorzugt liegt die Erythrulose-Konzentration in einem Bereich von mindestens 140 g/L, vorzugsweise mindestens 200 g/L, weiterhin bevorzugt mindestens 250 g/L. Ein geeigneter Erythrulose-toleranter Mikroorganismus ist durch eine andauernde und weiterhin bestehende Erythrit-oxidierende Aktivität auch bei diesen hohen Erythrulose-Konzentrationen gekennzeichnet. Ein solches Verfahren zum Auffinden eines Erythrulose-toleranten Mikroorganismus ist in den Beispielen 2.1 und 2.2 angegeben.
In bevorzugter Ausführungsform können die Mikroorganismen natürlicherweise in der Natur vorkommende Mikroorganismen aber auch gentechnisch veränderte Mikroorganismen sein, sofern sie Erythrulose-Toleranz gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Vorzugsweise wird der Erythrulose-tolerante Mikoorganismus in Schritt (a) in immobilisierter Form eingesetzt, zum Beispiel in Gel.
Bevorzugt enthält der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus eine Dehydrogenase als Erythrit-oxidierendes Enzym, besonders bevorzugt ist das Erythrit-oxidierende Enzym Quinoprotein membrane-bound meso-erythritol dehydrogenase (QMEDH).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (a) als Erythrulose-toleranter Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Art Gluconobacter sp. eingesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt (a) der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus der Art Gluconobacter sp., hinterlegt unter der Nummer DSM 21030 (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) am 20.12.2007 eingesetzt.
Die Erfindung betrifft daher auch einen Mikroorganismus der Art Gluconobacter sp., hinterlegt unter der Nummer DSM 21030.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden auch funktionell äquivalente Mutanten eines Mikroorganismuses der Gattung Gluconobacter eingesetzt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter einer funktionell äquivalenten Mutante” ein Mikroorganismus zu verstehen, der bezogen auf die erfindungsgemäße Produktherstellung im Wesentlichen die gleichen oder verbesserte Eigenschaften und Funktionen wie der ursprüngliche, insbesondere der vorstehend hinterlegte, Mikroorganismus, insbesondere im Hinblick auf seine taxonomische Abstammung und seine biokatalytischen Eigenschaften besitzt, insbesondere die gleiche oder verbesserte Erythrit-oxidierende Funktionalität, vorzugsweise besonders hohe Erythrulose-Toleranz und besonders hohe Aktivität aufweist. Solche funktionell äquivalenten Mutanten eines bestimmten Mikroorganismuses können durch an sich bekannte Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch randomisierte Mutagenese nach UV-Bestrahlung, oder eine Behandlung mit alkylierenden Agenzien oder durch weitere bekannte Verfahren, die Mutationen auslösen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Erythrit-haltige Ausgangssubstrat Erythrit in reiner Form, Roherythrit, Roherythrit aus der Umsetzung eines Erythritvorläufers, Roherythrit aus der Umsetzung von Saccharose oder Glucose, Roherythrit aus der Umsetzung von Saccharose und/oder Glucose und/oder Fructose, ein Fermentationsrohstoff, fermentierbare Kohlenhydrate, fermentierbare Kohlenhydratgemische, ein Gemisch von Saccharose und Erythrit oder ein Erythritgemisch ist. Bevorzugt ist auch vorgesehen, dass das Erythrit-haltige Ausgangssubstrat aus der Umsetzung von Fetten, Ölen, Polyolen oder Kohlenhydraten stammt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Erythrit-haltige Ausgangssubstrat vor Durchführung von Schritt (a) in einem Schritt (a0) durch Umsetzung eines Erythrit-Vorläufers, insbesondere von Saccharose oder Glucose, zu Erythrit durch einen Mikroorganismus erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein solcher Erythrit-Vorläufer auch ein Fett, ein Öl, ein Polyol, ein Kohlenhydrat oder Gemische einer oder mehrerer dieser Komponenten sein.
Bevorzugt ist vorgesehen, in Schritt (a0) zur Umsetzung eines Erythrit-Vorläufers zu Erythrit eine osmophile Hefe einzusetzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass der Mikroorganismus, der die Umsetzung des Erythrit-Vorläufers katalysiert, insbesondere von Saccharose zu Erythrit, vor Durchführung von Schritt (a) und nach Schritt (a0) in einem Schritt (a1) inaktiviert wird.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass der Inaktivierungsschritt (a1) eine Hitzeinaktivierung umfasst. Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Hitzeinaktivierung bei 70°C bis zu 12 h durchgeführt wird. In einer bevorzugten alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Inaktivierung in Schritt (a1) durch UV-Bestrahlung oder durch das Einstellen eines hohen oder niedrigen pH-Werts durchgeführt wird. Durch die erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehene Inaktivierung der Mikroorganismen in Schritt (a1) ist es vorteilhafterweise möglich, die nachfolgenden Schritte (a) und (b) in Anwesenheit der inaktivierten Mikroorganismen durchführen zu können, ohne die Mikroorganismen aus Schritt (a1) in weiteren, zusätzlichen Verfahrensschritten abtrennen zu müssen.
Bevorzugt ist also vorgesehen, dass die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus in Schritt (a) in Anwesenheit der inaktivierten Mikroorganismen aus der Umsetzung des Erythrit-Vorläufers zu Erythrit, das heißt aus Schritt (a0) und (a1) stattfindet.
In einer weiteren Ausführungsform kann alternativ vorgesehen sein, die Mikroorganismen, die Erythrit gebildet haben, vor der Umsetzung des Erythrits zur Erythrulose zu entfernen, zum Beispiel mittels Zentrifugation oder Filtration.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 10 bis 50°C durchgeführt, bevorzugt bei einer Temperatur von 15 bis 30°C, weiter bevorzugt bei einer Temperatur von 20 bis 25°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 23 bis 24°C.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats in einem Kulturmedium, vorzugsweise einem wässrigen Kulturmedium, zum Beispiel einem wässrigen Hefeextrakt aufweisenden Kulturmedium, durchgeführt. In bevorzugter Ausführungsform wird auch die in erfindungsgemäß besonders bevorzugter Ausführungsform vorgesehene vorgelagerte Erythrit-Herstellung aus einem Erythrit-Vorläufer in einem Kulturmedium, insbesondere einem wässrigen Kulturmedium, insbesondere einem zum Beispiel Hefeextrakt-haltigen wässrigen Kulturmedium durchgeführt. In bevorzugter Ausführungsform können beide Medien, das heißt das Medium zur Herstellung von Erythrit aus einem Erythrit-Vorläufer und das Medium zur Herstellung von Erythrulose aus Erythrit, gleiche Medien sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können auch verschiedene Medien für diese beiden Umsetzungen eingesetzt werden, beispielsweise ein Hefeextrakt-haltiges, insbesondere allein Hefeextrakt-haltiges, wässriges Medium für die Erythrit-Herstellung und ein mit Vitaminen und Spurenelementen angereichertes Hefeextrakt-haltiges wässriges Medium für die Umsetzung von Erythrit zu Erythrulose.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation des Erythrits unter aeroben Kulturbedingungen durchgeführt. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation in einem Propellerschlaufenreaktor, insbesondere mit mindestens einer Schikane, durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einem pH-Wert von 4 bis 8 durchgeführt wird, bevorzugt bei einem pH-Wert von 3,5 bis 7, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4 bis 7, weiter bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 6, werter bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 5, besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 4,5.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Substratkonzentration von 100 bis 300 g/L durchgeführt wird, bevorzugt von 150 bis 250 g/L, besonders bevorzugt von 180 g/L.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Produktkonzentration von Erythrulose von 100 bis 300 g/L durchgeführt wird, bevorzugt von 150 bis 250 g/L, besonders bevorzugt bei 230 g/L.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Produktkonzentration von Erythrulose von ≥ 140 g/L durchgeführt wird, und zwar so durchgeführt wird, das eine Ausbeute von mindestens 90% erreicht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus über einen Zeitraum von 125 bis 200 Stunden durchgeführt, bevorzugt von 60 bis 180 Stunden, weiter bevorzugt von 140 Stunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Herstellung von Erythrulose im Batch-Verfahren, das heißt in einem diskontinuierlichen Verfahren, durchgeführt.
Erfindungsgemäß ist in einer bevorzugten Ausführung vorgesehen, die Herstellung von Erythrulose im Fedbatch-Verfahren durchzuführen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Herstellung von Erythrulose im Repeated-Fedbatch-Verfahren durchgeführt. Im Repeated-Fedbatch-Verfahren ist erfindungsgemäß in bevorzugter Weise vorgesehen, die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus über einen ersten Zeitraum ablaufen zu lassen. Nach Ablauf des ersten Zeitraums der Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter ist erfindungsgemäß vorgesehen, die gebildete Erythrulose zu einem Großteil, vorzugsweise zu 80 bis 100%, aus dem Reaktionsgefäß zu entfernen, die Mikroorganismen aber im Kulturmedium zu belassen. In einem anschließenden weiteren Verfahrensschritt wird das Reaktionsgefäß mit frischem Substrat, also Erythrit-haltigem Ausgangssubstrat, insbesondere frischem Substrat in frischem Kulturmedium, wieder aufgefüllt und die Inkubation über einen zweiten Zeitraum durchgeführt. Dieser Ablauf mit Inkubation, Entfernen des Produkts und Wiederauffüllen mit Substrat und Medium wird über einen Zeitraum von bis zu 200 Stunden mehrfach wiederholt. Das erfindungsgemäße Repeated-Fedbatch-Verfahren ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise ein schnelles und kostengünstiges Verfahren, insbesondere dadurch, dass die sogenannte Lag-Phase der Mikroorganismen verkürzt werden kann.
Die Erfindung betrifft daher auch ein vorgenanntes Verfahren, wobei die Verfahrensschritte (a) und (b) mindestens zweifach, vorzugsweise vielfach, hintereinander durchgeführt werden, und zwischen jeder einzelnen dieser Abfolgen der Verfahrenschritte (a) und (b), insbesondere nach der Gewinnung von Erythrulose, insbesondere der Entnahme von Erythrulose-haltigem Kulturmedium, frische Substratlösung, also Erythrit-haltiges Ausgangssubstrat gegebenenfalls mit Kulturmedium, dem verbliebenen Kulturmedium hinzugegeben wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Gewinnung und Isolierung der gebildeten Erythrulose durch chromatographische Verfahren durchgeführt wird.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Ausführungsbeispiele
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert. Die Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen.
1 zeigt die Umsetzung von Saccharose zu Erythrit im Schüttelkolben. Die Edukte Saccharose, Glucose und Fructose werden als Glucoseäquivalent zusammengefasst.
2 zeigt die Umsetzung von Erythrit (c₀ = 200 g/L) zu Erythrulose im Schüttelkolben.
3 zeigt die Umsetzung von Roherythrit (c₀ = 180 g/L) zu Erythrulose im Schüttelkolben. Bei den Ansätzen ohne Biomasse [ohne BM] ist die Biomasse des Pilzes SZ101 durch Zentrifugation entfernt worden. Bei den Ansätzen mit Biomasse [mit BM] ist die Biomasse des Pilzes SZ101 durch Hitzeeinwirkung deaktiviert worden.
4 zeigt ein Schema des Repeated-Batch-Verfahrens.
5 zeigt die Umsetzung von Erythrit zu Erythrulose im Repeated-Batch-Verfahren im Schüttelkolben.
6 zeigt die Umsetzung von Erythrit zu Erythrulose im Fedbatch-Verfahren in einem 2 L Fermenter mit einer Gesamterythrtit-Konzentration von 255 g/L.
Mikroorganismus zur Erythrit-Produktion
Die hier beschriebenen Experimente werden mit einer osmophilen Hefe durchgeführt. Im Folgenden wird der Stamm SZ101 genannt.
Mikroorganismus zur Erythrulose-Produktion
Bei dem verwendeten Mikroorganismus zur Erythritoxidation handelt es sich um den Stamm DSM 21030 (Gluconobacter sp.), welcher in der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) hinterlegt ist (Hinterlegungsdatum: 20.12.2007). Im Folgenden wird der Stamm DSM 21030 genannt.
Beispiel 1: Erythrit-Produktion
Beispiel 1.1: Umsetzung von Saccharose zu Erythrit im Schüttelkolben
Das Standardmedium zur Produktion von Erythrit aus Saccharose wird in Tab. 1 angegeben. In einem 300 mL Erlenmeyerkolben mit 3 Schikanen werden 50 mL des Standardmedium vorgelegt und mit 2 mL einer aktiven Kultur des Stammes SZ101 angeimpft. Die Inkubation erfolgt in einem Schüttelschrank bei 33°C bei 120 rpm mit einer Auslenkung von 50 mm. Tab. 1: Standardmedium zur Erythritproduktion mit dem Stamm SZ101

475 g Saccharose

10 g Hefeextrakt (Fa. Merck)

Ad. 1000 mL H₂O

pH 6,5–7,0
Die Probenentnahme erfolgt aseptisch. Durch die Verdunstung von Wasser und Ethanol sowie die Bildung von CO₂ verlieren die verwendeten Schüttelkolben an Gewicht. Um dies auszugleichen, wird die Gewichtsdifferenz der Schüttelkolben nach der Probenentnahme und vor der darauffolgenden Probenentnahme bestimmt und durch steriles deionisiertes Wasser ersetzt. Dadurch wird gewährleistet, dass die angegebene Produktkonzentration als Mindestwert anzusehen ist. 1 zeigt den Verlauf der Edukt- und Produktkurve sowie die Verläufe des Nebenproduktspektrums. Die Größe GÄ (Glucoseäquivalent) wird eingeführt, um die Eduktverläufe Saccharose, Fructose und Glucose zusammenzufassen. Nach einer Zeit von ca. 150 h wird bereits die Endkonzentration des Produkts, also Roherythrit, mit einer Erythrit-Konzentration von 200 g/L erreicht. Zum Ende der Fermentation sind nahezu keine Nebenprodukte mehr nachweisbar. Beispiel 1.2: Produktion von Erythrit aus Saccharose Standardmedium:

400 g Saccharose

10 g Hefeextrakt (Fa. Merck)
Saccharose sowie Hefeextrakt werden jeweils getrennt autoklaviert und beide Lösungen steril auf ein Endvolumen von 1000 mL vereinigt.
Stammhaltung:
In drei 300 mL Erlenmeyerkolben mit je drei Schikanen werden je 50 mL Standardmedium mit 2 mL einer vorhandenen Vorkultur des Pilzes SZ101 (ebenfalls Standardmedium, nach 48 h Inkubation) angeimpft (4% (v/v)). Nach 96 h Inkubation bei 33°C und 120 rpm werden die Kulturen (auf zwei 500 mL Zentrifugenbecher aufgeteilt und) 10 Minuten bei 6.500 g abzentrifugiert. Die Überstände werden verworfen und die Pellets zweimal mit jeweils 150 mL frischem Standardmedium gewaschen. Schließlich werden die beiden Pellets ad 100 mL frischem Standardmedium vereinigt und resuspendiert. Nach Mischen mit 200 mL sterilisiertem Pharma-Glycerin wird die Glycerinstockkultur zu jeweils 2 mL in sterile 2,5 mL Reaktionsgefäße mit Schraubkappe überführt und zuerst mit flüssigem Stickstoff schockgefrostet und anschließend bei –80°C gelagert. Zur Stammhaltung wird die Kultur alle 48 h übergeimpft. Bei längeren Ruhezeiten wird mit Kulturen aus den Kryostocks wieder neu angeimpft.
Produktionsdurchführung:
300 mL Erlenmeyerkolben mit je drei Schikanen werden mit 50 mL Standardmedium befüllt und mit einer Impföse Zellen von einer MA-(Malzextraktagar)Platte angeimpft. Anschließend wird bei 33°C und 120 rpm (Auslenkung 50 mm) für 48 h inkubiert (visuelle Prüfung, ob die Inkubationsdauer ausreichend war beziehungsweise OD-Messung (Biomasse-Bildung)). Falls das Medium nur unzureichend bewachsen scheint, wird für weitere 24 h inkubiert und erneut geprüft.
Wenn Biomasse (BM) gebildet worden Ist, werden 2 mL der Zellsuspension zu 50 mL Standardmedium im 300 mL Erlenmeyerkolben mit je drei Schikanen gegeben. Es erfolgt eine weitere Inkubation für 48 h. Das so gewonnene Inokulum ist für eine Erythritproduktion besonders geeignet.
Beispiel 2: Erythrulose-Produktion
Beispiel 2.1: Umsetzung von Erythrit zu Erythrulose im Schüttelkolben

Das Standardmedium zur Produktion von Erythrulose aus Erythrit ist in Tab. 2 angegeben. In einem 300 mL Erlenmeyerkolben mit 3 Schikanen wird 75 mL des Standardmedium vorgelegt und mit 4 mL einer aktiven Kultur der Art Gluconobacter sp. DSM 21030 angeimpft. Die Inkubation erfolgt in einem Schüttelschrank bei 24°C bei 120 rpm mit einer Auslenkung von 50 mm. Tab. 2: Medium zur Erythrulose-Produktion

Lösung (A)
	Na₂HPO₄·2H₂O	2,0 g
	KH₂PO₄	1,0 g
	deion. Wasser	250 mL
Lösung (B)
	(NH₄)₂SO₄	1,4 g
	CaCl₂·2H₂O	0,1 g
	MgSO₄·7H₂O	0,2 g
	Hefeextrakt	0,25 g
	Spurenelementelösung
	DSMZ SL-144 (5fach)	2 mL
	deion. Wasser	250 mL
Lösung (C)
	Erythrit	200 g
	deion. Wasser	ad. 500 mL

Mit 1 M HCl wurde der pH-Wert von Lösung (A) auf einen Wert von 6,2 eingestellt. Die Lösungen (A), (B) und (C) werden für 20 min bei 121°C autoklaviert und anschließend aseptisch vereinigt. Nach dem Abkühlen werden den Lösungen 1 mL der sterilfiltrierten Vitaminlösung DSMZ VL-141 (10fach) zugesetzt. Die Zusammensetzungen der Vitamin- und Spurenelementelösungen finden sich in Tab. 3 und Tab. 4. Tab. 3: Zusammensetzung der Vitaminlösung DSMZ VL-141

Biotin	2,0 mg
Folsäure	2,0 mg
Pyridoxin-HCl	10,0 mg
Thiamin-HCl·2H₂O	5,0 mg
Riboflavin	5,0 mg
Nicotinsäure	5,0 mg
D-Calciumpantothenat	5,0 mg
p-Aminobenzoesäure	5,0 mg
Vitamin B12	0,1 mg
Liponsäure	5,0 mg
deion. Wasser	1000 mL

Tab. 4: Zusammensetzung der Spurenelementlösung DSMZ SL-144

Nitrilotriessigsäure	12,8 g
NaCl	1,0 g
FeCl₂·4H₂O	200 mg
MnCl₂·4H₂O	100 mg
CoCl₂·6H₂O	170 mg
CaCl₂·2H₂O	100 mg
ZnCl₂	100 mg
CuCl₂	20 mg
H₃BO₃	10 mg
Na₂MoO₄·2H₂O	10 mg
NiCl₂·6H₂O	26 mg
Na₂SeO₃·5H₂O	20 mg
deion. Wasser	1000 ml

2 zeigt die korrespondierenden Kurven der Erythritabnahme sowie der Erythrulosezunahme. Nach einer Kultivierungsdauer von 191 h wurde eine Produktkonzentration von 185 g/L erreicht, was einem Umsatz von 91,7% entspricht. Beispiel 2.2: Produktion von Erythrulose aus Erythrit Standardmedium:

SM Ery 100

Lösung A
Na₂HPO₄·2H₂O	2,0 g
KH₂PO₄	1,0 g
in 200 mL H₂O

Lösung B
(NH₄)₂SO₄	1,4 g
CaCl₂·2H₂O	0,1 g
MgSO₄·7H₂O	0,2 g
Hefeextrakt (Merk)	0,25 g
DSM-VL-141 (10fach)	2 mL sterilfiltriert
DSM-SL 144 (5fach)	2 mL
in 300 ml H₂O

Lösung C
Erythrit	100 g
in 500 mL H₂O

Das Gesamtvolumen beträgt insgesamt 1000 mL, was einer Gesamterythritkonzentration von 100 g/L entspricht.
Die Lösungen werden getrennt autoklaviert und danach aseptisch vereinigt. Der pH-Wert der Lösungen A und B wird auf pH 6,2 eingestellt. Die Vitaminlösung VL-141 wird nach dem Autoklavieren mit einem Sterilfilter zugegeben.
Stammhaltung:
Zur Stammhaltung werden 75 mL SM Ery 100 mit 3 mL Inokulum (DSM 21030) in einem 300 mL Erlenmeyerkolben mit 3 Schikanen angeimpft. Die Inkubation erfolgt bei 24°C im Schüttelschrank bei 120 rpm (Auslenkung 50 mm) für 20 h. Die OD_600nm sollte ca. 1 betragen (~0,4 g BTM/L (Biotrockenmasse/L)). Nach Mischen mit 75 mL sterilisiertem Pharma-Glycerin wird die Glycerinstockkultur zu jeweils 2 mL in sterile 2,5 ml Reaktionsgefäße mit Schraubkappe überführt und zuerst mit flüssigem Stickstoff schockgefrostet und anschließend bei –80°C gelagert.
Produktionsdurchführung:
300 ml Erlenmeyerkolben mit je drei Schikanen werden mit 75 mL Standardmedium befüllt und mit zwei Kryokulturen (DSM 21030) angeimpft. Anschließend wird bei 24°C und 120 rpm, Auslenkung 50 mm, für 20 h inkubiert. Nach einem weiteren Überimpfen nach 20 h ist das so gewonnene Inokulum für eine Erythruloseproduktion besonders geeignet.
Zur Stammhaltung wird die Kulturbrühe alle 48 h übergeimpft. Bei längeren Ruhezeiten wird mit Kulturen aus den Kryostocks wieder neu angeimpft.

Der pH-Wert der Brühe sinkt bereits nach 20 h deutlich ab. Vitaminlösung VL 141:

Biotin	20 mg
Folsäure	20 mg
Pyridoxin-HCl	100 mg
Thiamin-HCl·2H₂O	50 mg
Riboflavin	50 mg
Nicotinsäure	50 mg
D-Calciumpantothenat	50 mg
p-Aminobenzoesäure	50 mg
Vitamin B12	1 mg
Liponsäure	50 mg
H₂O	1000 ml

(10fach ansetzen, und dann entsprechend kleinere Mengen zusetzen. Spurenelementelösung SL 144

Nitrilotriessigsäure	12,8 g
FeCl₂·4H₂O	0,2 g
MnCl₂·4H₂O	0,1 g
CoCl₂·6H₂O	0,17 g
CaCl₂·2H₂O	0,1 g
ZnCl₂	0,1 g
CuCl₂	0,02 g
H₃BO₃	0,01 g
Na₂MoO₄·2H₂O	0,01 g
NiCl₂·6H₂O	0,026 g
NaCl	1,0 g
Na₂SeO₃·5H₂O	0,02 g
ad 1 L deion. H₂O
pH 7,5

(5fach ansetzen, und dann entsprechend kleinere Mengen zusetzen)

Beispiel 3: Umsetzung von Roherythrit zu Erythrulose im Schüttelkolben
Die Erythrit-haltige Fermentationsbrühe aus Beispiel 1.1 wird als Medium für die Erythrulose-Produktion eingesetzt. In Ansatz 1 werden 45 mL Fermentationsbrühe in einem 300 mL Schüttelkolben mit 3 Schikanen gegeben. Die enthaltene Biomasse wird durch 12-stündiges Erhitzen auf 70°C inaktiviert. In Ansatz 2 wird die Fermentationsbrühe ebenfalls für 12 h auf 70°C erhitzt und danach die enthaltene Biomasse durch Zentrifugation entfernt. Vom zellfreien Überstand werden ca. 40 mL in sterile 300 mL Erlenmeyerkolben mit 3 Schikanen überführt. Die Schüttelkolben sowohl mit als auch ohne die Biomasse aus der Erythritproduktion werden mit 2 mL Inokulum der Art Gluconobacter sp. DSM 21030 beimpft.
In 3 sind die Produkt- und Eduktverläufe der Ansätze 1 (mit BM) und 2 (ohne BM) gezeigt. Bei den Versuchen ohne BM ist nach 168 h eine Erythrulose-Konzentration von 168 g/L gemessen worden. Bei den Versuchen mit Biomasse ist innerhalb von 168 h 155 g/L Erythrulose gebildet worden.
Beispiel 4: Repeated-Batch-Verfahren zur Herstellung von Erythrulose
Im Repeated-Batch-Verfahren wird ein 300 mL Schüttelkolben mit Schikanen verwendet. Es werden 75 mL Selektivmedium 150 (SM Ery 150) (entspricht SM Ery 100 aus Beispiel 2.2 bis auf c_Erythrit = 150 g/L) vorgelegt und mit 3 mL einer gut bewachsenen Bakteriensuspension von DSM 21030 beimpft. Nach 72 h Inkubationsdauer werden 70 mL der Brühe entfernt und durch 70 mL frisches Medium SM150 ersetzt. Die verbleibenden 8 mL der Lösung werden als Animpflösung für den darauffolgenden Batch verwendet. Das Verfahrensschema dieser Repeated-Batch-Durchführung ist in 4 dargestellt. Die Untersuchung ist nach 3 abgeschlossenen Batch-Durchführungen und nach 270 h beendet worden.
Die Ergebnisse des Repeated-Batch-Verfahrens sind in 5 dargestellt.
Beispiel 5: Fedbatch-Verfahren zur Herstellung von Erythrulose
Im Fedbatch-Verfahren wird in einem 2 L-Fermenter eine Erythrit-Anfangskonzentration von 105 g/L eingestellt. Der pH-Wert wird mit NaOH auf pH 4,2 gehalten. Nach 48 h, 72 h und 98 h werden jeweils 50 g Erythrit pro Liter Fermenterinhalt zugefüttert. Nach 147 h werden 235 g/L Erythrulose gebildet. Dies entspricht einer Ausbeute von 92% und einem vollständigen Umsatz.
Die Ergebnisse des Fedbatch-Verfahrens sind 6 dargestellt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Erythrulose aus einem Erythrit-haltigen Ausgangssubstrat, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit einem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, der auch bei einer Erythrulose-Konzentration von ≥ 140 g/L Erythrit-oxidierende Aktivität aufweist und (b) Gewinnung der während der Inkubation gebildeten Erythrulose.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus in Schritt (a) in immobilisierter Form eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Erythrulose-tolerante Mikroorganismus eine Dehydrogenase als Erythrit-oxidierendes Enzym enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erythrit-oxidierende Enzym Quinoprotein membrane-bound meso-erythritol dehydrogenase (QMEDH) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der in Schritt (a) eingesetzte Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Art Gluconobacter sp., hinterlegt unter der Nummer DSM 21030, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erythrit-haltige Ausgangssubstrat Erythrit in reiner Form, Roherythrit, Roherythrit aus der Umsetzung eines Erythrit-Vorläufers, Roherythrit aus der Umsetzung von Saccharose oder Glucose, ein Gemisch von Saccharose und Erythrit, ein Fermentationsrohstoff, ein fermentierbares Kohlenhydrat oder Kohlenhydratgemisch oder ein Erythritgemisch ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erythrit-haltige Ausgangssubstrat vor Durchführung von Schritt (a) in einem Schritt (a0) durch Umsetzung eines Erythrit-Vorläufers, insbesondere von Saccharose oder Glucose, zu Erythrit durch einen Mikroorganismus erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus in Schritt (a0) eine osmophile Hefe ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die die Umsetzung des Erythrit-Vorläufers von Saccharose zu Erythrit bewirkenden Mikroorganismen vor Durchführung von Schritt (a) und nach Schritt (a0) in einem Schritt (a1) inaktiviert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt (a1) eine Hitzeinaktivierung umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9 oder 10, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus in Schritt (a) in Anwesenheit der inaktivierten Mikroorganismen aus Schritt (a1) stattfindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 10 bis 50°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einem pH-Wert von 4 bis 8 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Substratkonzentration von 100 bis 300 g/L durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Produktkonzentration von Erythrulose von 100 bis 250 g/L durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus über einen Zeitraum von 150 bis 190 h durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Herstellung von Erythrulose im Batch-Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verfahrensschrittfolge (a) und (b) vorzugsweise mindestens zweimal durchgeführt wird und der Reaktion zwischen jeder Abfolge dieser Verfahrensschritte (a) und (b) Erythrit-haltiges Ausgangssubstrat zugeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gewinnung der gebildeten Erythrulose durch chromatographische Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation des Erythrit-haltigen Ausgangssubstrats mit dem Erythrulose-toleranten Mikroorganismus bei einer Produktkonzentration von mindestens 140 g/L von Erythrulose durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verfahren zu einer Erythrulose-Ausbeute von mindestens 90% führt.
Mikroorganismus der Art Gluconobacter sp., hinterlegt unter der Nummer DSM 21030.