DE60307403T2 - Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus zum Produzieren von Riboflavin und ein Verfahren zum Produzieren von Riboflavin unter Verwendung desselben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Mutante von Bacillus subtilis mit verstärkter Riboflavinproduktivität im Vergleich zum Elternstamm, und ein Verfahren zum Produzieren von Riboflavin unter Verwendung derselben.
  • Riboflavin, das auch als Vitamin B2 bekannt ist, ist ein wasserlösliches Vitamin, das durch Biosynthese von verschiedenen Mikroorganismen und Pflanzen hergestellt wird. Jedoch kann Riboflavin von Wirbeltieren und dem Menschen nicht durch Biosynthese hergestellt werden. Riboflavin ist eine Vorstufe für Flavinadenindinukleotid (FAD) und Flavinmononukleotid (FMN), Coenzyme, die an den Oxidations-Reduktionsreaktionen aller Zellkörper beteiligt sind, und ist daher ein essentieller Nährstoff für Tiere und den Menschen. Mangel an Riboflavin kann zu Entzündungen im Mund und der Schleimhautmembran des Rachens, Hautentzündung und anderen Hautverletzungen, Konjunktivitis, Sehschwäche, Wachstumsinhibierung und Gewichtsverlust führen. Deshalb wird Riboflavin als Vitaminprodukt zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen verwendet, die mit dem zuvor genannten Vitaminmangel in Zusammenhang stehen oder als Futtermittelzusatzstoff in der Tierzucht. Insbesondere konzentriertes Riboflavin wird selbst als Nahrungsstoff verwendet. Die derzeitige Produktion an Riboflavin beträgt weltweit 3000 Tonnen pro Jahr, wovon 75 % als Futtermitteladditiv verwendet wird und der Rest für Nahrungsmittel oder Pharmazeutika verwendet wird.
  • Derzeit wird Riboflavin durch chemische Synthese oder durch Fermentierungsmikroorganismen gebildet. Bei der chemischen Synthese wird hochreines Riboflavin in einem mehrstufigen Prozess unter Verwendung einer Vorstufe wie D-Ribose produziert. Aufgrund der hohen Kosten des Ausgangsmaterials, sind jedoch auch die Produktionskosten für die chemische Synthese hoch. Deshalb wurde ein Fermentierungsprozess für Riboflavin durch Mikroorganismen entwickelt. Mikroorganismen für den Fermentierungsprozess können jegliche Riboflavin produzierende Mikroorganismen sein, die in der Natur vorkommen oder Riboflavin überproduzierende Mikroorganismen, die durch Gentechnik, chemische oder physikalische Prozesse transformiert sind. Diese Mikroorganismen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so dass sie Riboflavin produzieren. Das produzierte Riboflavin wird aus der Kultur gewonnen.
  • Mikroorganismen, die für Riboflavinproduktion bekannt sind, sind Saccharomyces sp. und Candida sp., die zur Gruppe der Hefen gehören, Clostridium sp., Bacillus sp. und Corynebacterium sp, die zur Gruppe der Bakterien gehören und Eremothecium sp. und Ashbya sp., die zur Gruppe der Pilze gehören.
  • US-Patent Nr. 5,231,007 offenbart ein Verfahren zur Produktion von Riboflavin unter Verwendung der Hefe Candida famata. Es wird berichtet, dass genetisch veränderte Bacillus subtilis und Corynebacterium ammoniagenes, die die Gene der Enzyme überexprimieren, die an der Riboflavinbiosynthese beteiligt sind, Riboflavin mit 4,5 g/l bzw. 17,4 g/l bilden [Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22:8-18, 1999]. Das Europäische Patent Nr. EP 0821063 offenbart ein Verfahren zur Produktion von Riboflavin unter Verwendung eines rekombinanten Bacillus subtilis. US-Patent Nr. 5,837,528 offenbart einen rekombinanten Stamm von Bacillus subtilis zur Überproduktion von Riboflavin, das durch Einführen des rib-Operons in den Elternstamm unter Verwendung einer Rekombinantentechnologie erhalten ist. US-Patent Nr. 3,900,368 lehrt, dass Stämme von Bacillus subtilis mit erhöhter Riboflavinproduktion durch Screening von Mutanten auf Resistenz gegen Purinanaloge erhalten werden können. Außerdem gibt es Ascomycetespilze Eremothecium ashbyii und Ashbya gossypii, von denen Windholz et al. berichten [The Merck Index, Merck & Co., S. 1183, 1983], dass sie Mikroorganismen zur Riboflavinproduktion sind. Insbesondere wird berichtet, dass Kultur von Mutanten dieser Ascomycetespilze in Nährmedien, die Melasse oder Pflanzenöl als hauptsächliche Kohlenstoffquelle enthalten, zu 15 g Riboflavin pro 1 Liter einer Fermentierungslösung führen [Bigelis, Biotechnology, Band 7b, S. 243, 1989]. Produktion von Riboflavin unter Verwendung von Ashbya gossypii ist in WO95/26406 offenbart.
  • Es besteht jedoch noch Bedarf an der Entwicklung von Mikroorganismen mit verstärkter Produktivität für Riboflavin zur Massenproduktion von Riboflavin.
  • Indessen wird beim Fermentierungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen ein Mikroorganismenstamm mit Osmosedruckbeständigkeit entwickelt, um Kulturprodukte in hoher Konzentration und hoher Ausbeute zu erhalten. Der Mikroorganismenstamm mit Osmosedruckbeständigkeit ist in der Lage, Kulturprodukte in hoher Ausbeute zu bilden, weil sein Wachstum und Stoffwechsel nicht durch eine Erhöhung des äußeren Osmosedrucks inhibiert werden, der durch überschüssige Kohlenstoffquellen und Akkumulation von Kulturprodukten bedingt ist. Auf Basis des zuvor genannten haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismenstamm entwickelt, der 5'-Inosinsäure in hoher Konzentration und in hoher Ausbeute bildet, indem ein Mikroorganismenstamm entwickelt wird, der gegen Prolinanaloge resistent ist, um seine Fähigkeit zur Prolinbiosynthese zu verbessern und dadurch die Osmosedruckresistenzeigenschaften des Mikroorganismus verbessert, was im KR-Patent Nr. 330712 offenbart ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Riboflavin produzierenden Bacillus subtilis zur Verfügung, der gegen Prolinanaloge resistent ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen von Riboflavin zur Verfügung, das den Bacillus subtilis verwendet.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Riboflavin produzierende Bacillus subtilis CJKB0001 (Zugangsnummer: KCCM-10445) zur Verfügung gestellt, der gegen Prolinanaloge resistent ist.
  • Bei der Suche nach Mikroorganismen mit verbesserter Riboflavinproduktivität haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Induzieren von Mutation bei Bacillus subtilis und Einführen von Resistenz gegen Prolinanaloge zu Osmosedruckbeständigkeit und Verbesserung der Produktivität für Riboflavin führt. Unter diesen Stämmen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Riboflavin überproduzierende und hohe Ausbeuten erzielende Stämme ausgewählt und Riboflavin im großen Maßstab unter Verwendung der ausgewählten Stämme produziert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen von Riboflavin zur Verfügung gestellt, das Kultivieren von Bacillus subtilis und Gewinnen von Riboflavin aus der Kultur umfasst.
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
  • Der Bacillus subtilis der vorliegenden Erfindung ist eine Mutante von Bacillus subtilis AS5. Weil er gegen Prolinanaloge resistent ist und erhöhte Prolinbiosynthese produziert, was zu verbesserter Osmosedruckresistenz führt. Deshalb produziert er hohe Konzentrationen an Riboflavin in hoher Ausbeute.
  • Die meisten Mikroorganismen erhöhen den Osmosedruck im inneren Bakterienkörper durch Akkumulieren von Kaliumionen und organischen Soluten, die Osmolyten genannt werden, so dass osmotische Dehydra tation verhindert wird, wenn der Osmosedruck im äußeren Bakterienkörper zunimmt. Die Osmolyten beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, L-Prolin, Glutaminsäure, Zucker und N-methylierte Aminosäurederivate. Darunter ist L-Prolin dafür bekannt, dass es ein kritischer Faktor bei der Osmosedruckregulation ist. Es wird berichtet, dass der Osmosedruck im äußeren Brevibacterium lactofermentum zunimmt, die Aktivität von Pyrrolin-5-carboxylatreductase zunimmt, die ein kritisches Enzym der L-Prolinbiosynthese ist, was zur Akkumulation von L-Prolin im inneren Bakterienkörper führt [Agr. Bio. Chem., 53(9):2475-2479, 1989]. Außerdem gibt es einen Bericht über die Akkumulation von L-Prolin im inneren Bakterienkörper von Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens usw., die durch den Osmosedruck auf den äußeren Bakterienkörper bedingt ist [J. Bacteriol., 163:296, 1985].
  • Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Mutation am Bacillus subtilis AS5 induziert, so dass Osmosedruckresistenz entsteht, und dann die Mutanten mit Prolinanalogenresistenz ausgewählt, die in Kulturmedien wachsen können, das hohe Konzentrationen an Prolinanalogen enthält. Darunter wurde eine Mutante mit der höchsten Riboflavinproduktivität ausgewählt.
  • Die Prolinanalogen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, 3,4-Dehydroprolin, L-Azetidin-2-carboxylsäure, Thiaprolin, L-Thiazolidin-4-carboxylsäure, (S)-2,2-Dimethyl-4-oxazoldecarboxylsäure, (S)-5,5-Dimethyl-4-thiazolidcarboxylsäure, (4S,2RS)-2-Ethylthiazolidin-4-carboxylsäure, (2S,4S),4-Hydroxy-2-pyrrolincarboxylsäure, 2-Piperidincarboxylsäure und 2,5-Pyrrolidindion.
  • Der hier verwendete Elternstamm ist Bacillus subtilis AS5 (BIONOM-S. Moskau, Russland).
  • Herkömmliche physikalische oder chemische Prozesse können Mutation am Elternstamm induzieren. Zum Beispiel kann der Elternstamm Röntgenstrahlen oder UV-Licht ausgesetzt werden oder einer chemischen Substanz wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), Diethylsulfat und Ethylamin.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Stämme mit induzierter Mutation in Medien kultiviert, die verschiedene Konzentrationen an Thiaprolin als Prolinanaloges enthalten. Mutanten, die in der Lage sind, in Gegenwart einer hohen Konzentration von Thiaprolin zu wachsen, wurden ausgewählt. Darunter wurde die eine Mutante mit der höchsten Riboflavinproduktivität ausgewählt. Die ausgewählte Mutante wurde als Bacillus subtilis CLKB0001 bezeichnet und im Korean Culture Center of Microorganisms am 18. November 2002 hinterlegt (Zugangsnummer: KCCM-10445).
  • Der Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung kann sogar bei bis zu 70 mg/l Thiaprolin enthaltendem Medium wachsen. Hingegen kann der Elternstamm Bacillus subtilis AS5 nicht in Gegenwart von mehr als 40 mg/l Thiaprolin wachsen.
  • Deshalb weist der Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung Prolinanalogenresistenz auf, und selbst wenn eine hohe Konzentration an Gelöstem auf dem äußeren Bakterienkörper akkumuliert, kann der Bacillus subtilis CJKB0001 eine hohe Konzentration an Riboflavin in einem Kulturmedium akkumulieren, indem eine hohe Konzentration an Prolin im inneren Bakterienkörper akkumuliert wird und dadurch im Vergleich zum Elternstamm effektiv die Inhibierung des Wachstums und Metabolismus durch Osmosedruck verhindern.
  • Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemerkt, dass der Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfin dung in einer Kolbenkultur 8,0 g/l Riboflavin akkumuliert, was 11 % mehr ist als beim Bacillus subtilis AS5 und in einer Fermenterkultur von 5 Litern akkumulieren sie auch 26,8 g/l Riboflavin, was 19,6 % mehr ist als beim Elternstamm.
  • Deshalb weist Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu Bacillus subtilis AS5 verstärkte Resistenz gegen Prolinanaloge auf und weist wesentlich verbesserte Riboflavinproduktivität auf, indem er Osmosedruckresistenz aufweist.
  • Zum Bilden von Riboflavin wird der Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung unter einer geeigneten Bedingung kultiviert.
  • Im Detail wird Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) auf ein herkömmliches Medium geimpft, das eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen aufweist, und bei bestimmter Temperatur und pH unter aeroben Bedingungen kultiviert. Beispiele der Kohlenstoffquelle beinhalten Glucose, Melasse, Lactose, Sucrose, Maltose, Dextrin, Stärke, Mannitol, Sorbitol und Glycerin. Bevorzugt werden Glucose und Melasse verwendet. Beispiele der Stickstoffquelle beinhalten eine anorganische Quelle wie Ammoniak, Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat und eine organische Quelle wie Pepton, NZ-Amin, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt, Maislauge (corn steep liquor), Caseinhydrolysat, Fisch oder Fischmehl und entfettete Sojabohne oder Sojamehl. Bevorzugt werden Hefeextrakt oder Maislauge gewählt. Beispiele der anorganischen Verbindungen beinhalten Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat. Falls nötig können Vitamine und auxotrophe Basen verwendet werden. Für die Kultur kann Schüttelkultur oder Rührkultur mit Belüftung verwendet werden. Die Kulturtemperatur liegt im Bereich von 30 bis 45 °C, und bevorzugt 37 bis 40 °C. Bei der Kultur wird der pH bevorzugt auf einen ziemlich neutralen Wert eingestellt. Die Kulturdauer beträgt 5 bis 6 Tage.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) auf ein Keimmedium geimpft und bei einer Belüftungsströmungsrate von 1 vvm, 37 °C und 800 Upm 20 Stunden lang kultiviert. Die Keimkultur wird auf ein Fermentationsmedium überimpft und einer Schüttelkultur bei einer Belüftungsströmungsrate von 1 vvm, 40 °C, 800 Upm und pH 7,0 über 60 bis 70 Stunden unterzogen. Bei der Schüttelkultur wird die Fermentierungskultur mit einem Glucosezusatzmedium versorgt, das die restliche Glucose in der Kultur auf einem Wert von 0,5 bis 1 % hält, bis der Gesamtgehalt an Glucose in der Fermentierungskultur 20 % erreicht. Riboflavin wird im Vergleich zum Elternstamm mit einem erhöhten Wert von ungefähr 19,6 gewonnen.
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung spezieller durch Beispiele beschrieben. Die folgenden Beispiele sind jedoch nur zur Erläuterung angegeben und daher ist die vorliegende Erfindung nicht durch sie oder auf sie beschränkt.
  • Beispiel 1
  • Auswahl von Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung
  • Um den Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird Bacillus subtilis AS5 als der Elternstamm einer Mutation unterzogen. Dann werden Mutanten von Bacillus subtilis AS5 in einem Thiaprolin enthaltenden Medium kultiviert, um Kolonien zu erhalten. Unter diesen Kolonien wurde ein Mutantenstamm mit der höchsten Riboflavinproduktivität als der Bacillus subtilis CJKB0001 ausgewählt.
  • Der Bacillus subtilis AS5 als der Elternstamm wurde von BIONOM-S. Ltd. (Obolensk, Moskau, Russland) erhalten. Der Bacillus subtilis AS5 wird in Phosphatpuffer bei pH 7,0 oder Citratpuffer bei pH 5,5 suspendiert, so dass eine Zelldichte von 107 bis 108 Zellen/ml erhalten wird. Die Mutation induzierende Substanz, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin wird der Suspension zugesetzt, bis seine Konzentration 10 bis 50 μg/ml beträgt. Die erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur oder 30 °C 30 bis 60 Minuten lang inkubiert, so dass die Mutation induziert wird. Dann wird die Mischung drei Mal mit 0,85 % Salzlösung gewaschen und in geeigneter Weise verdünnt. Die verdünnte Lösung wird auf 1,8 % Agar enthaltendes Minimalmedium mit verschiedenen Konzentrationen an Thiaprolin aufgetragen und bei 37 °C 5 Tage lang kultiviert, so dass Kolonien erhalten werden. In diesem Fall liegt die Konzentration an Thiaprolin im Bereich von 0 mg/l bis 100 mg/l. Die gebildeten Kolonien werden auf Nähragarmedium überimpft und bei 37 °C 24 Stunden lang kultiviert. Die erhaltenen Nährstoffkulturen werden auf Fermentationsmedium überimpft und bei 37 °C 4 bis 5 Tage lang kultiviert. Der das meiste Riboflavin produzierende Stamm wird ausgewählt. Alle Mediumzusammensetzungen sind in Tabelle 1 angegeben. Zusammensetzungen von Medien zur Auswahl von Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung Tabelle 1
    Figure 00090001
    Figure 00100001
  • Die Produktivität an Riboflavin wird durch HPLC gemessen. HPLC wird unter Verwendung einer Säule Waters 510 gekoppelt mit Kromasil C18 (5 μm) (Innendurchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) durchgeführt. Ein Lösemittelgemisch von 5 mM Natriumhexansulfonat und 20 mM H3PO4 und Acetonitril (89:11, v/v) wird als mobile Phase verwendet. Die Strömungsrate der mobilen Phase beträgt 1 ml/min. Die Probeninjektionsmenge beträgt 15 μl und es wird destilliertes Wasser zur Probenverdünnung verwendet. Außerdem wird ein UV-Detektor (TSP UV2000, UV 260 nm) als Detektor verwendet.
  • Gemäß den Testergebnissen zeigen Mutanten, die auf 70 mg/l Thiaprolin enthaltendem Medium wachsen, ausgezeichnete Riboflavinproduktivität. Darunter wurde eine Mutante mit der höchsten Riboflavinproduktion ausgewählt und als Bacillus subtilis CJKB0001 bezeichnet. Der Bacillus subtilis CJKB0001 wurde im Korean Culture Center of Microorganisms am 18. November 2002 unter der Zugangsnummer: KCCM-10445 hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Bestimmung der Resistenz von Bacillus subtilis CJKB0001 und Bacillus subtilis AS5 gegen Thiaprolin
  • In diesem Beispiel werden zur Bestimmung der Resistenz gegen Thiaprolin, Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) von Beispiel 1 und Bacillus subtilis AS5 als Elternstamm in verschiedenen Konzentrationen des Thiaprolin enthaltenden Mediums kultiviert. Im Detail werden die entsprechenden Stämme auf Thiaprolin enthaltende Medien geimpft, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, und bei 37 °C 5 Tage lang kultiviert. In diesem Fall liegt die Konzentration an Thiaprolin im Bereich von 0 bis 100 mg/l.
  • Gemäß den in Tabelle 2 gezeigten Testergebnissen, kann der Bacillus subtilis AS5 nicht in mehr als 40 mg/l Thiaprolin enthaltendem Medium wachsen. Hingegen kann Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung sogar in 70 mg/l Thiaprolin enthaltendem Medium wachsen. Bestimmung der Resistenz von Bacillus subtilis CJKB0001 und Bacillus subtilis AS5 gegen Thiaprolin Tabelle 2
    Figure 00110001
    • +: Wachstum, –: kein Wachstum
  • Beispiel 3
  • Fermentierungsfähigkeit von Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung im Kolben
  • Die Fermentierungsfähigkeit von Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) und Bacillus subtilis AS5 im Kolben wird bestimmt. Jeder Stamm wird in ein Keimmedium überimpft und kultiviert. Dann wird jede Keimkultur in ein Fermentationsmedium in einem Kolben überführt. Das Keimmedium wird durch Einbringen von 5 ml eines Keimmediums in ein Reagenzglas mit einem Durchmesser von 18 mm und Sterilisieren des Reagenzglases unter Druck bei 121 °C über 15 Minuten hergestellt. Sowohl Bacillus subtilis CJKB0001 wie Bacillus subtilis AS5 werden auf das Keimmedium geimpft und eine Schüttelkultur bei 200 Upm und 37 °C über 20 Stunden durchgeführt. Wenn die Keimkultur beendet ist, werden 1 ml jeder Keimkultur auf ein Fermentationsmedium in einem Kolben überimpft und eine Schüttelkultur bei 200 Upm und 37 °C über 90 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium wird durch Sterilisieren eines Mediums FA und eines Mediums FS unter Druck in der selben Weise wie bei der Herstellung des Keimmediums hergestellt und 15 ml des Mediums FA und 5 ml des Mediums FS in einen 250 ml Schüttelkulturkolben gegeben, der unter Druck vorsterilisiert ist. Nach Beendigung der Fermentation, wird die Konzentration an in der Fermentationskultur akkumuliertem Riboflavin auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Alle Zusammensetzungen des in diesem Beispiel verwendeten Keimmediums und Fermentationsmediums sind in Tabelle 3 angegeben. Zusammensetzungen von Medium für die Fermentation im Kolben Tabelle 3
    Figure 00130001
  • Gemäß den Testergebnissen produziert Bacillus subtilis AS5 als der Elternstamm 7,2 g/l Riboflavin. Hingegen produziert Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung 8,0 g/l Riboflavin, was 11 % mehr ist als bei Bacillus subtilis AS5.
  • Beispiel 4
  • Fermentierungsfähigkeit von Bacillus subtilis CJKB0001 der vorliegenden Erfindung im 5-Liter-Fermenter
  • Die Fermentierungsfähigkeit von Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) und Bacillus subtilis AS5 im 5-Liter-Fermenter wird vergleichend bestimmt. Jeder Stamm wird in ein Keimmedium überimpft und kultiviert. Dann wird jede Keimkultur in ein Fermentationsmedium überimpft und im Fed-Batch kultiviert. Hierfür wird zunächst 1 Liter jedes Keimmediums in einen Laborfermenter mit einer Kapazität von 2,5 Litern eingebracht und unter Druck bei 121 °C 10 Minuten lang sterilisiert, so dass ein Keimmedium gebildet wird. Nachdem das Keimmedium abgekühlt ist, werden 10 ml jeder Suspension von Bacillus subtilis CJKB0001 und Bacillus subtilis AS5 in Salzlösung auf die Keimkultur geimpft. Dann wird jede Stamm enthaltende Keimkultur unter steriler Belüftung mit einer Rate von 1 vvm bei 37 °C und 800 Upm über 20 Stunden inkubiert. Bei der Keimkultur wird der pH nicht eingestellt. Nachdem die Keimkultur beendet ist, wird jede Keimkultur auf ein Fermentationsmedium überimpft und im Fed-Batch kultiviert. Das Fermentationsmedium wird durch Einbringen von 1,4 Litern eines Fermentationsmediums in einen Laborfermenter mit einer Kapazität von 5 Litern, gefolgt von Drucksterilisation bei 121 °C über 20 Minuten hergestellt. Nachdem das Fermentationsmedium abgekühlt ist, werden 200 ml jeder Keimkultur auf das Fermentationsmedium überimpft und unter Belüftung mit einer Rate von 1 vvm bei 800 Upm und 40 °C kultiviert. Bei der Fermentation wird jede Fermentationskultur mit einem Glucosezusatzmedium versorgt, so dass die restliche Glucose in der Kultur bei einem Wert von 0,5 bis 1 % gehalten wird, bis der Gesamtgehalt an Glucose in der Fermentationskultur 20 erreicht. Bei der Fermentation wird der pH unter Verwendung von wässrigem Ammoniak bei 7,0 gehalten. Die Fermentationsdauer beträgt 60 bis 70 Stunden. Wenn die Fermentation beendet ist, wird die Konzentration an in der Fermentationskultur akkumuliertem Riboflavin auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Alle Zusammensetzungen des Keimmediums und Fermentationsmediums in diesem Beispiel sind in Tabelle 4 angegeben. Zusammensetzungen von Medien für die Kultur im 5-Liter-Fermenter Tabelle 4
    Figure 00150001
  • Gemäß den Testergebnissen produziert Bacillus subtilis AS5 als der Elternstamm 22,4 g/l Riboflavin. Hingegen produziert Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445) der vorliegenden Erfindung 26,8 g/l Riboflavin, was ungefähr 19,6 % mehr ist als bei Bacillus subtilis AS5.
  • Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich ist, weist der Bacillus subtilis der vorliegenden Erfindung eine hohe Resistenz gegen Prolinanaloge auf und zeigt eine erhöhte Synthese an Prolin im Inneren des Bakterienkörpers, so dass erhöhter Osmosedruck entsteht, was zur Produktion einer hohen Konzentration an Riboflavin in hoher Ausbeute führt. Deshalb kann eine große Menge an Riboflavin gewonnen werden.

Claims (2)

  1. Riboflavin produzierender Bacillus subtilis CJKB0001 (KCCM-10445).
  2. Verfahren zum Herstellen von Riboflavin, das das Kultivieren von Bacillus subtilis nach Anspruch 1 und das Gewinnen von Riboflavin aus der Kultur umfasst.
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