DE2417337A1

DE2417337A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin und mutante zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2417337A1
Application number: DE2417337A
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Katsumata; Mamoru Kohata; Kiyoshi Nakayama; Tadaaki Nomura; Yoshitake Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-04-10
Filing date: 1974-04-09
Publication date: 1974-10-31
Also published as: GB1446987A; DE2417336C3; GB1452688A; FR2225517B1; FR2225520B1; DE2417337C3; JPS49125590A; CA1023292A; DE2417336B2; DE2417337B2; FR2225517A1; US3907641A; JPS5039153B2; US3907637A; DE2417336A1; CA1023291A; FR2225520A1

Description

¹¹ Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin und Mutante zur Durchführung des Verfahrens "

Priorität: 10. April 1973, Japan, Nr. 40 043/1973

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin und die Mutante zur Durchführung des Verfahrens.

L-Lyßin ist eine essentielle Aminosäure, für die in der Nahrungsmittelindustrie ein großer Bedarf besteht. Die Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine Mutante eines Mikroorganismus, der bestimm- · te Aminosäuren benötigt und bzw. odor eine Resistenz gegenüber L-Lysinanalogen aufweist, in einem Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe und organische Säuren als Kohlcnstoffquelle enthaltenden Nährmedium gezüchtet. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Versuche unternommen, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, als Kohlenstoffquelle einzusetzen. Besondere Beachtung wurde Methanol geschenkt, da diener Alkohol nicht nur billig zur Ver- _l

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ORIGINAL INSPECTED

fügung steht, sondern bei biotechnischen Verfahren auch leicht zu handhaben ist. In den US-Patentschriften 3 707 441 und 3 708 395 ist die Verwendung von Alkoholen zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin vorgeschlagen, jedoch ist weder ein • praktisches noch ein konkretes Verfahren in diesen Patentschriften offenbart.

In der US-Patentschrift 3 595 751 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle durch einen Stamm der Gattung" Corynebacteriura, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus und Nocardia beschrieben. Ferner ist in der US-Patentschrift 3 663 370 ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattung Methanomonas, Protaminobacter und Microcyclus offenbart.. In der britischen Patentschrift 1 210 770 ist speziell die Herstellung von L-Lysin aus Methanol durch Züchtung von Hefen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium beschrieben. Es werden Mikrobenzellen zusammen mit bestimmten Aminosäuren, einschließlich L-Lysin, erhalten. Ferner ist in der japanischen Patentveröffentlichung 25 273/70 die Herstellurg von L-Lysin und anderen Aminosäuren aus Methanol unter Verwendung von Stämmen der Gattung Achromobacter und Pseudononas beschrieben. Keines der bekannten Verfahren verläuft jedoch in befriedigender Ausbeute hinsichtlich der Bildung von L-Lysin.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin aus Methanol in hoher Ausbeute unter Verwendung von Mikroorganismen zu schaf-_j

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fen, die L-Lysin produzieren. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß Methanol verwertende Mutanten der Gattung Protaminobacter, die gegen S-2-Arainoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent sind, beträchtliche Mengen an L-Lysin bilden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Mutante der Gattung Protaminobacter, die Methanol verwerten kann und gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent ist, in einem Methanol als Hauptkohlenstoff quelle enthaltenden Nährmedium züchtet und aus der Gärmaische L-Lysin isoliert.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten, die Methanol verwerten, können in Gegenwart verhältnismäßig hoher Konzentrationen an S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin wachsen. Die Elternstämme besitzen nicht diese Eigenschaft. Eine besonders bevorzugte Mutante für das erfindungsgemäße Verfahren ist Protarainobacter thiaminophagus SLR-77 (ATCC 21926), die sieh von einem Methanol verwertenden Stamm von Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371 ableitet, der in der US-PS 3 663 370 beschrieben ist. Diese Mutante ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegt, und sie steht der Öffentlichkeit für Forschungszwecke zur Verfügung.

Obwohl die bevorzugte Mutante für das erfindungsgeraäße Verfahren sich von Protaminobacter thiaminophagus ableitet, kann Jeder j

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Mikroorganismus der Gattung Protaminobacter verwendet werden, der Methanol verwertet und der einer mutagenen Behandlung unter worfen werden kann unter Bildung einer Mutante, die gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent ist.

Zur Herstellung der für das erfindungsgeraäße Verfahren geeigneten Mutanten können übliche Verfahren zur Induktion der Mutation angewendet werden, wie künstliche mutagene Mittel, beispielsweise Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Behandlung mit Stickstoff-Lost oder mit Nitrosoguanidin. Beispielsweise werden Mikrobenzellen eines Methanol verwertenden Stammes der Gattung Protaminobacter in einem Tris-Maleat-Puffer mit einem pH-Wert von 6 suspendiert, der 100 y/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin enthält. Die Zellenkonzentration beträgt 5 x 10 /ml. Die Suspension wird 1 Stunde stehengelassen, sodann werden die Zellen abgeschleudert und mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Hierauf werden die Zellen in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sodann auf eine Agarplatte folgender Zusammensetzung aufgestrichen und inkubiert:

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-5-	L-Threonin	2417337 π
S-2-Aminoäthyl-L-cystein	20 mg/ml
Natriumeitrat	10 mg/ml
(NH₄)₂S0₄	1,5 mg/ml
KH₂PO₄	3,0 mg/ml
K₂HPO₄	2,0 mg/ml
MgSO₄.7H₂O	7,0 mg/ml
MnSO₄.4H₂O	0,5 mg/ml
FeSO₄.7H₂O	8 mg/Liter
Thiamin-hydrochlorid	10 mg/Liter
Biotin	1,0 mg/Liter
L-Methioriin	10 y/Liter
Methanol	1,0 mg/ml
Agar	20 .ml/Liter
20 g/Liter

Die erhaltenen Kolonien werden in an sich bekannter Weise isoliert. Auf diese Weise wird ein Stamm mit Resistenz gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin erhalten. Die Resistenz gegen diese beiden Verbindungen, die die zu isolierenden Mutanten besitzen, hängt von der¹ Konzentration an S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin im Medium ab. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird gewöhnlich eine Mutante mit einer Resistenz gegenüber mindestens 10 mg/ml S-2-Aminoäthyl-L-cystein und mindestens 20 mg/ml L-Threonin verwendet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes Kulturmedium verwendet werden, sofern es Methanol als Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Wuchsfaktoren enthält, die für den jeweils verwendeten Stamm erforderlich sind.

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Das als Kohlenstoffquelle verwendete Methanol ruft bisweilen eine Wachstumshemmung des Mikroorganismus hervor, wenn es im Medium in hoher Konzentration vorliegt. Vorzugsweise wird die Methanolkohzentration im Medium unterhalb eines Wertes von etwa 3 Prozent (Volumen/Volumen) gehalten. Gute Ergebnisse werden mit einem Nährmedium erhalten, das anfänglich eine niedrige Konzentration, z.B. 0,5 bis 3 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthält und die Züchtung unter kontinuierlichem Einspeisen von Methanol in einer Menge von 0,3 bis 0,6 Volumprozent, bezogen auf das Volumen des Mediums und pro Stunde oder absatzweise in einer Menge von 0,5 bis 2 Volumprozent, bezogen auf das Volumen des Mediums zu Jedem Zeitpunkt, und unter gleichzeitigen Verbrauch des Methanols durch den Mikroorganismus eingespeist wird.

Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphdsphat und Ammoniumnitrat, Ammoniak, oder Harnstoff verwendet werden. Ferner können als Stickstoffquelle Casaminosäure, Fepton und Hefeextrakt verwendet werden. Diese organischen Verbindungen natürlicher Herkunft enthalten Vitamine und andere wachstumsfördernde Stoffe, und sie sind daher gut geeignet zur Verkürzung der Züchtungsdauer und zur Förderung der Bildung von L-Lysin, wenn sie dem Medium als Stickstoffquelle in geringen Mengen einverleibt werden. Zusätzlich können anorganische Verbindungen, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Eisen- und Mangansalze, zugesetzt werden.

Venn der verwendete Stamm einen Nährstoffbedarf hat, muß dem Medium natürlich eine geeignete Quelle für den Nährstoff züge- _j

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setzt werden. Protaminobacter thiaminophagus benötigt beispielsweise Thiamin zum Wachstum. Bei Verwendung einer Mutante von Protaminobacter thiaminophagus muß daher reines Thiamin oder ein Naturprodukt dem Medium einverleibt werden, das Thiamin enthält.

Die Züchtung wird im allgemeinen während 2 bis 5 Tagen unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 40⁰C durchgeführt. Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird der pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung im Bereich von 4 bis 9» vorzugsweise um den Neutralpunkt gehalten. Der pH-Wert kann durch Zusatz von Calciumcarbonat, verschiedenen Pufferlösungen oder alkalisch reagierenden Lösungen eingestellt werden. Nach beendeter Züchtung werden die Mikrobenzellen aus der Gärmaische abgetrennt, beispielsweise äbfiltriert. Das im Filtrat enthaltene L-Lysin wird in an sich bekannter Weise isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen und Umkristallisation.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Protaminobacter thiaminophagus SLR-77 (FERM-P Nr. 2020; ATCC 21926) wird in 10 ml eines Vorkulturmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem Reagensglas überimpft und 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln inkubiert:

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Methanol 20 ml

(NH₄J₂SO₄ 10 g

KH₂PO₄ 2 g

K₂HPO₄ 7 g

MgSO₄.7H₂O 0,5 g

FeSO₄.7H₂O 10 mg·

MnSO₄.4H₂O . 8 mg

Thiamin-hydrochlorid 1 rag

Biotin · 10 ^g

Hefeextrakt ' 0,1 g

CaCO₃ 20 g

Wasser auf 1 Liter (pH-Wert 7,2)

Die erhaltene Vorkultur wird in jeweils 10 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in Reagensröhrchen in einem Verhältnis von 1 ml überimpft. Die Fermentation wird 72 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Nach I6stündiger Züchtung werden 1 Prozent Methanol und nach 25 bzw. 40stündiger Züchtung 2 Prozent Methanol zugegeben. Nach beendeter Züchtung sind in der Kulturbrühe 1,5 mg/ml (als Hydrochlorid) L-Lysin gebildet.

Die Kulturbrühen in den Reagensgläschen werden vereinigt. Es wird ein Gesamtvolumen von 2 Liter erhalten. Die Mikrobenzellen werden aus der Kulturbrühe abgetrennt. Die zellfreie Lösung wird an einem stark sauren Kationenharzaustauscher adsorbiert. Sodann wird der Kationenaustauscher mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird eingedampft und mit Salzsäure neutralisiert. Nach der Umkristallisation werden 2,4 g kristallines L-Lysin-hydrochlorid erhalten.

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Claims

- 9 - Patentansprüche ■

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante der Gattung Protarainobacter, die Methanol verwerten kann und gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent ist, in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium züchtet und aus der Gärmaische L-Lysin isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante der Art Protaminobacter thiaminophagus durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21926 durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 20 bis 4O⁰C durchführt.
5. Mutante der Gattung Protaminobacter, die die Fähigkeit zur Verwertung von Methanol hat und gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent ist, zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1.
6. Mutante nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm zur Art Protaminobacter thiaminophagus gehört.

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7. Mutante nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Protaminobacter thiaminoph^gus ATCC 21926 ist.

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