DE2417336A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin, l-asparaginsaeure, l-alanin, l-valin, l-leucin und l-arginin und mutante zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin, l-asparaginsaeure, l-alanin, l-valin, l-leucin und l-arginin und mutante zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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Description
" Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin,
L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-VaUn5 L-Leucin. und L-Arginin
und Mutante zur Durchführung des Vorfahrens H
Prioritäti 10. .April 1973, Japan, Kr. 40 043/1973
Die Erfindimg betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von L-Lysin, L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-Valin,
L~Leucin und L-Arginin und 'eine Mutant« zur Du roh führung des
Verfahrens.
Es sind verschiedene Verfahren zur Her:;teilung von Amino .vlmr en
auf biotechnischem liege unter Verwendung entweder von Wi.! .:1c er'·rn
men oder" Mutanten von Mikroorganismen in einem Kohlenhydrate,
Kohlenwasserstoffe und organische Säuren als Kohlenstoffquelle
enthaltendenNährmediuEi bekannt. In den letzten Jahren wurde
versucht, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, zur Fermentation zu verwenden. Besondere Beachtung wurde Methanol geschenkt, da
Methanol nicht nur billig zugänglich ir-t, sondern bei Fermentationsverfahren
auch leicht zu handhaben ist. In den US-Patentschriften 3 707 441 und 3 70S 395 ist die Verwendung von Aiko-
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holen zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin vorgeschlagen^
es sind jedoch weder praktische noch konkrete Verfahrensbeispielc offenbart. In der US-PS 3 595 751 ist die Herstellung
von L-Lysin aus Äthanol unter Verwendung eines Stammes der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus
und Nocardia beschrieben. In der US-PS 3 663 370 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Methanol
unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattungen Methanomonas, Protarninobacter und Microcyclus beschrieben. In
der britischen Patentschrift 1 210 770 ist die Züchtung von Hefen in einem Methanol enthaltenden Nährmediura zur Herstellung
von Mikrobenzellen sowie bestimmter Aminosäuren beschrieben. Schließlich ist in der japanischen Patentveröffentlichung
25 273/70 beschrieben, daß bei der Züchtung von Stämmen .der Gattungen
Achromobacter und Pseudomonas unter Verwendung von Methanol
als Kohlenstoffquelle Aminosäuren im Nährmedium angereichert v;erden. Die bekannten Aminosäurebildner aus Methanol
sind jedoch unbefriedigend, da sie entweder eine zu geringe ' Produktivität aufweisen oder die Zahl der herzustellenden Aminosäuren
zu gering ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biotechnischen
Herstellung von Aminosäuren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem diese Aminosäuren in beträchtlichen
Mengen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Kährmediu» gebildet werden. Die Lösung dieser Aufgabe beruht
auf dem Befund, daß eine neue Mutante, die sich von Protarninobacter th.iaminophagus ATCC 21371 ableitet, die in der
US-PS 3 663 "370 beschrieben ist, sich durch eine verbesserte J
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- ■ ■ . - 3 - 2Λ17336 π
Aminosäureproduktion auszeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen
Herstellung von L-Lysih, L-Asparaginsäure, L-Alanin,
L-Valin, L-Leucin und L-Arginin, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man Protaminobacter thiaminophagus K-217- (ATCC 21927)
in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und die gebildeten Aminosäuren
in an sich bekannter Weise aus der Gärmaische abtrennt und isoliert.
Die erfindungsgemäß verwendete Mutants Protcminobacter
thiaminophagus K-217 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., unter dor Kummer
ATCC 21927 hinterlegt und steht der Öffentlichkeit für Forschungszwecke zur Verfügung. Diebe Mutante wurde durch Screening einer
Population von Protaaincbaoter thiaminophagus ATCC 21371 isoliert.
Als Nährmedium kann im erfindungsgemäßen Verfahren jedes synthetische
oder natürliche Nährmedium verwendet v/erden, sofern es
Methanol als Kohl enstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische
Verbindungen, Vitamine und wachstumsfördernde Nährstoffe in entsprechender Konzentration enthält.
Methanol, das als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, erzeugt
bisweilen eine Wachstumshemmung der Mikroorganismen, \renn es in
hohen Konzentrationen im Nährmedium vorliegt. Vorzugsweise wird
die Konzentration des Methanols im Medium unter einem Wert von L -J
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etwa 3 Prozent (Volu^en/Volu^en) gehalten. Gute Ergebnisse
können erhalten werden, wenn ein Nährmedium eingesetzt wird, das zu Beginn eine niedrige Konzentration von Beispielsweise
0,5 bis 3 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthält und die Züchtung unter kontinuierlichem Einspeisen von Methanol in
einer Menge von 0,3 bis 0,6 Prozent (Volumen/Volumen)f bezogen
auf daß Volumen des Mediums und pro Stunde oder absatzweise in
einer Menge von 0,5 bis 2 Prozent (Volumen/Volumen^ bezogen
auf das Nährmediuin zu jedem Zeitpunkt und in dem Maße eingespeist
wird, wie das Methanol vom Mikroorganismus verbraucht v/i rd.
Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumphosph?.t und Ammoniumnitrat, Ammoniak
oder Harnstoff verwendet v/erden. Ferner können Casaminosäure,
Pcpton und Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet werden.
Diese organischen Verbindungen natürlicher Herkunft enthalten Vitamine vnd andere wachsturnsfordernde Stoffe, die deshalb
wirkungsvoll die Züchtungsdauer vermindern und die Bildung der .Aminosäuren fördern, wenn sie in geringen Mengen dem Medium
als Stickstoff quelle einverleibt v/erden. Ferner können anorganische
Verbindungen, wie- Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Eisen- und Magner-;.lumsalze verwendet werden. Der im erfindungsgoraaßen
Verfahren verwendete Stamm Protaminobacter thiaminophagus
K-217 (ATCC 21927) benötigt für sein Wachstum Thianiin. Deshalb
müssen dem Nährmedium Thiamin oder Produkte natürlicher Herkunft einverleibt werden, die Thiamin enthalten.
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Die Züchtung wird im allgemeinen 2 bis 5 Tage unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 20 bis AO0C durchgeführt.
Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird der pH-Y/ert des Nührmediums
während der Züchtung bei 4 bis 9, vorzugsweise um den Neutralpunkt gehalten. Der pH-Wert kann durch Zusatz von Calciumcarbonate
verschiedenen Pufferlösungen oder alkalischen Lösungen eingestellt werden.
Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Kulturbriihe
abfiltriert, und aus dem Filtrat werden die gebildeten Aminosäuren
in an sich bekannter V/eise abgetrennt und isoliert, z.B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, und beispielsweise
durch Urakristallisation gereinigt.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Protaminobacter thiaminophagus K-217 (FERM-P Nr. 2021;
ATCC 21927) wird in 10 ml eines Vorkulturmediums der nachstehend aufgeführten Zusammensetzung in einem Reagensglas überimpft
und 20 Stunden unter Schütteln bei 300C gezüchtet:
L -1
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| 2417336 | ml | |
| 20 | g | |
| 6 | g | |
| 2 | g | |
| 7 | 5 g | |
| ο, | mg | |
| 10 | mg | |
| 8 | mg | |
| 1 | ng | |
| 10 | 1 g | |
| ο, | Dig | |
| 10 | Liter | |
| 1 |
Methanol
(NH4)2S04
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4.7H2O
FeSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
Thiamin-hydrochlorid
Biotin
Hefeextrakt
Phenolrot (pH-Indikator)
Wasser auf
(pH-Wert 7,2)
Die erhaltene Vorkultur wird in einer Menge von jeweils 1 ml in 10 ml eines Nährmediums der gleichen ZusammenSetzung in
Reagensgläschen überimpft. ,Die Zu cn tu/ig wird 96 Stunden unter
Schütteln bei 300C durchgeführt. Nach 24, 48 und 72 Stunden
werden jeweils 2 Prozent Methanol zugesetzt. Die Gesamtmenge an Methanol beträgt 6 Prozent. Der pH~V/ert der Kulturflüssigkeit
wird mit I4prozentiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen V."ex*t
um den Neutralpunkt eingestellt. Nach beendeter Züchtimg haben
sich in der Kulturbrühe 0,2 mg/ml L-Asparaginsäure, 0,8 mg/ml L-Alanin, 1,0 mg/ml L-Valin, 1,2 mg/rnl L-Leucin, 0,7 mg/ml
L-Arginin und 0,3 mg/ml L-Lysin (als L-Lysin-hydrochlorid) angesammelt.
Nach dem Abtrennen der Mikrobenzellen durch Filtrieren werden die Aminosäuren in an sich bekannter Weise durch
lonenaustöuschbehandlung isoliert, Aus 1 Liter der KulLurbrühe
werden 0,14 g L-Asparaginsäure, 0,48 g L-Alanin, 0,6 g L-Valin,
0,72 g L-Leucin, 0,49 g L-Arginin und 0,21 g L-Lysin erhalten. J
409844/0731
Claims (3)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin,
L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-VaIin, L-Leucin und L-Arginin,
dadurch gekennzeichnet, daß man Protaminobacter thiaminophagus K~217 (ATCC 21927) in einem
Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Hährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und die gebildeten Aminosäuren in
an sich bekannter Weise aus der Gärmaische abtrennt und isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Züchtung bei Temperaturen von 20 bis AO0C durchführt.
3. Mutante Protaminobactor thiaminophagus K-217 (ATCC 2192?)
zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1.
L 409844/0731
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