DE2903315C2

DE2903315C2 -

Info

Publication number: DE2903315C2
Application number: DE2903315A
Authority: DE
Inventors: Shigeru Yokohama Kanagawa Jp Nakamori; Hajimu Kawasaki Kanagawa Jp Morioka; Fumihiro Fujisawa Kanagawa Jp Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1978-02-01
Filing date: 1979-01-29
Publication date: 1987-08-27
Also published as: DE2903315A1; JPS54105293A; NL7900770A; JPS5722319B2; US4224409A; FR2416264A1; FR2416264B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentation.

Bisher waren als L-Prolin bildende Mikroorganismen Mutanten mit Isoleucin- oder Arginin-Bedarf des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium (JP-AS 11 751/1968), eine gegen Sulfaguanidin resistente Mutante mit Isoleucin-Bedarf des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium (JP-AS 4 014/1976) und eine Mutante mit Histidin- und Methionin-Bedarf des Genus Bacillus oder Escherichia bekannt (JP-AS 1 198/1969).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Mutanten zur Verfügung zu stellen, die mit ausgezeichneter Wirksamkeit zur Produktion von L-Prolin befähigt sind.

Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß diese Aufgabe mit Hilfe von Mutanten des Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium gelöst werden kann, die resistent gegen DL-3,4-Dehydroprolin sind (vgl. hierzu die nachstehende Erfindungsdefinition).

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin durch Züchten eines L-Prolin bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnen des angereicherten Prolins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als L-Prolin bildenden Mikroorganismus Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1219, Brevibacterium flavum NRRL-B-11422, Corynebacterium glutamicum NRRL-B-11423 oder Microbacterium ammoniaphilum NRRL-B-11424 züchtet.

Erfindungsgemäß geeignete Mutanten sind folgende Mikroorganismen:

Brevibacterium lactofermentum AJ 11225=FERM-BP 1219
Brevibacterium flavum AJ 11226=NRRL-B-11422
Corynebacterium glutamicum AJ 11227=NRRL-B-11423
Microbacterium ammoniaphilum AJ 11228=NRRL-B-11424

Der unter der Bezeichnung FERM BP-1219 hinterlegte Mikroorganismus war ursprünglich unter der Hinterlegungsnummer FERM P-4370 beim Fermentation Research Institute, Chiba-shi, Japan, hinterlegt und wurde von der Hinterlegungsstelle selbst in die Internationale Hinterlegung umgewandelt. Die unter den Hinterlegungsbezeichnungen NRRL-B-11 422, 11 423 und 11 424 bei der Northern Utilization Research and Development Division des US-Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegten Stämme waren ursprünglich bei dem Fermentation Research Institute unter FERM P 4371, 4372 und 4373 hinterlegt.

Die vorstehend erwähnten Mutanten leiten sich von den Elternstämmen des Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium ab, die für die Bildung von L-Prolin bekannt sind, oder sind abgeleitet von Wildstämmen des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium.

Das Wachstum der Elternstämme wird durch DP inhibiert, die Inhibierung wird jedoch teilweise oder vollständig durch L-Prolin unterdrückt.

Die Art und Weise, in der die erfindungsgemäßen Mutanten durch Induzieren aus den Elternstämmen gebildet werden, ist üblich und bekannt und besteht beispielsweise in der Behandlung der Elternstämme mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 2000 µg/ml bei 0°C während 20 Minuten.

Wenn die erfindungsgemäßen Mutanten zusätzliche Eigenschaften haben, wie einen zusätzlichen Nährstoffbedarf oder Resistenz gegen andere Wirkstoffe, so bilden sie gewöhnlich höhere Mengen an L-Prolin.

Experimentelle Daten für das relative Wachstum der Elternstämme und der daraus erhaltenen, erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten in einem DP enthaltenden Medium sind in Tabelle 1 gezeigt (das relative Wachstum in einem von DP freien Medium ist als 100 festgelegt).

Das in Tabelle 1 gezeigte relative Wachstum wird in folgender Weise bestimmt: Die Mikroorganismen wurden vorher 24 Stunden lang bei 30°C auf Schrägagar mit einem Gehalt an 1,0 g/dl Pepton, 1,0 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl NaCl gezüchtet. Jeweils eine Platinöse einer Impfkultur der Zellen auf dem Schrägagar wurde in ein Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0 übertragen, das 2,0 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Ammoniumsulfat, 0,25 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl kH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl FeSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl MnSO₄ · 7 H₂O, 20 µg/dl Thiamin · HCl, 5 µg/dl Biotin und die in Tabelle 1 gezeigte Menge an DP enthielt.

Tabelle 1

Für die Züchtung von Brevibacterium flavum AJ 3416 und AJ 11226, die beide für ihr Wachstum L-Isoleucin benötigen, wurden dem Kulturmedium außerdem 500 µg/ml L-Isoleucin zugesetzt. Nach 24stündiger Züchtung bei 30°C unter Schütteln wurde das Wachstum durch Messung der optischen Dichte des wäßrigen Kulturmediums bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Die erfindungsgemäße Methode, L-Prolin mit Hilfe der vorstehend definierten Mutanten herzustellen, kann nach jeder bekannten, für die fermentative Herstellung von L-Prolin angewendeten Verfahrensweise durchgeführt werden. Die geeigneten Kulturmedien sind übliche Medien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und erforderlichenfalls andere organische Spurennährstoffe enthalten, wie Vitamine und Aminosäuren.

Als Kohlenstoffquelle eignen sich Kohlenhydrate, wie Rüben- oder Rohrzuckermelassen, Stärkehydrolysate, organische Säuren, wie Essigsäure, und Alkohole, wie Äthanol. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise gasförmiges Ammoniak, wäßriges Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise bei 6 bis 9 gehalten. Die Züchtung wird während einer Dauer von 20 bis 100 Stunden vorgenommen.

Das in der gebildeten Kulturflüssigkeit angereicherte L-Prolin kann nach jeder üblichen bekannten Methode gewonnen werden, wie beispielsweise durch Verwendung eines Ionenaustauscherharzes.

Beispiel 1

20-ml-Anteile eines Kulturmediums mit einem pH-Wert von 7,0, das 10 g/dl Glucose, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,08 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 100 µg/dl Thiamin · HCl, 0,1 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 6,0 g/dl (NH₄)₂SO₄, 1 mg/dl FeSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl MnSO₄ · 4 H₂O, 450 µg/l Biotin und 5,0 g/dl CaCO₃ enthielt, wurden in 500-ml-Schüttelkolben gegeben und durch Erhitzen sterilisiert. Jeder Anteil des Mediums wurde mit Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1219 (AJ 11225) angeimpft und 72 Stunden lang bei 30°C geschüttelt. In der erhaltenen Kulturflüssigkeit war L-Prolin in einer Menge von 22,5 g/l angereichert.

Beispiel 2

Brevibacterium flavum AJ 3416 (eine L-Isoleucin benötigende Mutante), das nicht resistent gegen DP ist, und Brevibacterium flavum NRRL-B-11422 (AJ 11226), das restistent gegen DP ist und von AJ 3416 abgeleitet ist, wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise in dem Medium gemäß Beispiel 1 gezüchtet, welches zusätzlich 150 mg/l L-Isoleucin enthielt. Der Stamm AJ 11226 bildete 36,2 g/l L-Prolin, während AJ 3416 32,3 g/l L-Prolin bildete.

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum NRRL-B-11423 (AJ 11227) wurde in der in Beispiel 1 erläuterten Weise gezüchtet. Dabei wurden 12,0 g/l L-Prolin gebildet.

Beispiel 4

Microbacterium ammoniaphilum NRRL-B-11424 (AJ 11228) wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, wobei 3,3 g/l L-Prolin gebildet wurden.

Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin durch Züchten eines L-Prolin bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnen des angereicherten Prolins, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Prolin bildenden Mikroorganismus Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1219, Brevibacterium flavum NRRL-B-11422, Corynebacterium glutamicum NRRL-B-11423 oder Microbacterium ammoniaphilum NRRL-B-11424 züchtet.