DE2411209C2

DE2411209C2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Valin

Info

Publication number: DE2411209C2
Application number: DE2411209A
Authority: DE
Inventors: Takayasu Kawasaki Kanagawa Tsuchida; Fumihiro Fujisawa Kanagawa Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-03-09
Filing date: 1974-03-08
Publication date: 1982-12-09
Also published as: DE2411209A1; FR2220580B1; JPS49116293A; FR2220580A1; US3893888A; IT1007422B; JPS52116B2; GB1433294A

Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch genannte Verfahren.

L-Valin ist eine der essentiellen Aminosäuren für die menschliche und tierische Ernährung, und es kann daher in weitem Umfang, beispielsweise zum Anreichern von Nahrungsmitteln, zur Herstellung von Nahrungsmittelwürzen und für medizinische Zwecke, eingesetzt werden.

Es ist bereits bekannt, L-Valin durch eine fermentative Methode mit Hilfe eines bestimmten Mutantenstamms herzustellen, der ein bestimmtes Nährstofferfordernis besitzt. Es war jedoch unmöglich, mit Hilfe eines solchen Mutantenstammes mit einem Nährstoffbedarf große Mengen an L-Valin zu erhalten.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, L-Valin in einfacher Weise und mit geringen Kosten aus leicht zugänglichen Rohmaterialien mit Hilfe eines neuen Mikroorganismentyps mit hoher Ausbeute herzustellen.

Es wurde gefunden, daß einige Bakterien mit Resistenz gegenüber 2-Thiazolalanin (nachstehend auch abgekürzt als »2-TA« bezeichnet) eine große Menge an L-Valin bilden, wenn sie in einem Nährmedium gezüchtet werden. Es wurde außerdem gefunden, daß ein Mutantenstamm mit Resistenz gegenüber 2-TA gemeinsam mit einem gewissen Nährstoffbedarf, eine noch bessere Befähigung zur Bildung von L-Valin hat, als ein Stamm, der nur Resistenz gegenüber 2-TA oder nur einen gewissen Nährstoffbedarf hat.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die gestellte Aufgabe gelöst.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind Stämme, die dem Genus Brevibacterium und Corynebacterium angehören, und Resistenz gegen die Wachstumshemmung durch 2-TA zeigen. Der Mikroorganismus kann auch eine Mutante sein, die weitere biologische Eigenschaften aufweist, wie

1. Gegen 2-TA resistente Mutanten, wie Corynebacterium glutamicum FERM P-1768, das aus dem Elternstamm Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus) ATCC 13 032 erhalten wurde; Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-1314, das aus dem Elternstamm Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13 870 erhalten wurde; und Brevibacterium lactofermentum FERM P-1945, dessen Elternstamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 ist

2. Mutanten, die einen Nährstoffbedarf zusätzlich zu der 2-TA-Resistenz haben, wie Corynebacterium glutamicium FERM P-1967 (Leucin-abhängige Mutante), FERM P-1968 (Threonin-abhängige Mutante) und FERM P-1966 (Isoleucin-abhängige Mutante), erhalten durch eine übliche künstliche mutationsauslösende Methode aus Corynebacterium glutamicum FERM P-1768 (2-TA-resistente Mutante); Brevibacterium lactofermentum FERM P-1964 (Leucin-erfordernde Mutante), FERM P-1963(lsoleucin-erfordemde Mutante) und FERM P-1965 (Threonin-erfordernde Mutante), die durch eine übliche künstliche mutationsauslösende Methode aus Brevibacterium lactofermentum FERM P-1945 (2-TA-resistente Mutante) erhalten wurden, und Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 (Isoleucin- plus Methionin-abhängige Mutante, die außerdem resistent gegen 2-TA ist), das durch Mutation aus Brevibacterium lactofermentum FERM P-1858 (Isoleucin- plus Methionin-erfordernde Mutante) erhalten wurde.

Diese Mutantenstämme haben die gleichen morphologischen Eigenschaften wie die entsprechenden Elternstämme. Die morphologischen Eigenschaften von Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 sind in der GB-PS 8 39 597 beschrieben, und die morphologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetoacidophilum 13 870 und Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 sind in der US-PS 3117 915 beschrieben. Kulturproben der durch FERM P-Nummern identifizierten Mikroorganismen sind von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of Industrial Trade and Industry, at 1-8-5, Inage Higashi, Chibashi, Chiba, Japan, für den Fachmann frei erhältlich.

Das verwendete Verfahren zur Herstellung von Mutantenstämmen ist eine übliche Methode ?.ur künstlichen Mutationsauslösung, wie beispielsweise in dem nachstehenden Versuch 1 erläutert wird. Die Wachstumshemmung der Mutante mit Resistenz gegen 2-TA und ihres Elternstammes, der diese Resistenz nicht hat, in einem mit 2-TA versetzten Medium wurde ebenfalls geprüft, wie in dem nachstehenden Versuch 2 erläutert wird.

Versuch 1

Ein Kulturmedium, das 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,5% NaCl und 0,5% Glucose enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte, wurde hergestellt 5 ml-Anteile des Mediums wurden in Reagenzgläser gegeben und sterilisiert Auf das Medium wurde Brevibacterium lactofermentum FERM P-1858 mit Methionin- und Isoleucin-Bedarf aufgeimpft, das mit Hilfe einer üblichen mutationserzeugenden Methode, beispielsweise die Obertragungsmethode (Replica-Methode), aus dein Elternstamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 erhalten worden war, und 16 Stunden bei 31⁰C gezüchtet

Aus der Kulturbrühe gewonnene Mikrobenzellen wurden in 5 ml einer Phosphatpufferlösung gegeben, die 250 μg N:trosoguanidin/ml enthielt, und die Pufferlösung mit den Zellen wurde unter Schütteln 30 Minuten bei 31⁰C gehalten. Dann wurden die Mikrobenzellen gewonnen und zweimal mit Phosphatpufferlösung gewaschen.

Die in der vorstehenden Weise behandelten Mikrobenzellen wurden auf eine Agarplatte der nachstehend gezeigten Zusammensetzung aufgeimpft und zwei Tage bei 31°C gezüchtet.

Zusammensetzung des Mediums:

Glucose

(NH₄J₂SO₄

KH2PO4

MgSO₄ · 7 H₂O

Fe⁺ +

Mn+ +

Biotin

Thiamin · HCl Harnstoff (gesondert

sterilisiert)

L-Leucin

DL-Methionin

2-Thiazolalanin (pH 7,0)

Die auf der Agarplatte erscheinenden Stämme wurden als 2-TA-resistente Stämme isoliert, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 wurde aus diesen resistenten Stämmen durch Untersuchung ihrer Fähigkeit zur Bildung von L-Valin isoliert.

Andere vorher durch ihre FERM P-Nummern spezifizierte Stämme wurden ebenfalls unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Methode aus jedem der angegebenen Elternstämme erhalten.

Versuch 2

Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 und sein Elternstamm Brevibacterium lactofermentum FERM P-1858, die vorher 24 Stunden bei 31⁰C auf Schrägagarmedien gezüchtet worden waren, die 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,5% NaCl und 0,5% Glucose enthielten, wurden je in einer geringen Menge des nachstehend angegebenen Grundmediums suspendiert.

MgSO₄ - 7 H₂O	0,01%
Fe+ +	2 ppm
Mn+ +	2 ppm
Biotin	50ug/l
Thiamin - HQ	100 u^l
L-Isoleucin	15 mg/dl
DL-Methionin (pH 7.0)	30 mg/dl

0,1 ml der Suspension wurden in 3 ml-Anteile des Grundmeüiums gegeben, zu dem 2-TA in einer in Tabelle 1 gezeigten Menge zugesetzt worden war, und die Züchtung wurde 24 Stunden unter Schütteln bei 30° C vorgenommen.

Die Konzentration der Mikrobenzellen in der zur Animpfen verwendeten Suspension betrug 0,078 bei dem Stamm FERM P-1845 und 0,088 für den Stamm FERM P-1858, angegeben als spezifische optische Dichte einer Lösung, die durch Verdünnen der Suspension auf das 26fache ihres ursprünglichen Volumens erhalten wurde, bestimmt durch Messen der Lichtabsorption bei 562 mu.

Das resultierende relative Wachstum (welches den Grad der Resistenz anzeigt) jedes Stammes in dem Medium, das unterschiedliche Anteile an 2-TA enthielt, ist in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt

Tabelle 1

2%	Konzentration	40	Wie aus dem	Relatives Wachstum	FERM P-1858
1%	30 an 2-TA	FERM P-1845
0,1% 0,04%	(y/ml)
2 ppm			100
2 ppm	0	100	65
50 g/l	35 250	99	25
100 g/l	500	100	0
	1000	100	0
O,5O/o	1500	98	0
15 mg/dl	2000	85
30 mg/dl		:ten Ergebnis
0,3%	in Tabelle 1 eezeis

Grundmedium:

Glucose

Harnstoff

(NH₄J₂SO₄

KH₂PO₄

K₂HPO₄

2%

0,2%

0,15%

0,1%

0,3%

ersichtlich ist, wurde das Wachstum von Brevibacterium lactofermentum FERM P-1858 (gegen 2-TA empfindlicher Stamm) durch Zugabe von 2-TA merklich gehemmt Im Gegensatz dazu war das Wachstum von Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 (das Resistenz gegenüber 2-TA besitzt) in einem mit 2000 γ 2-TA/ml versetzten Medium fast das gleiche, wie in einem Medium ohne 2-TA.

Es hat sich gezeigt, daß der Mutantenstamm FERM P-1845 selbst in einem Medium wächst, dem 5000 γ 2-TA/ml zugesetzt wurden.

Die künstlichen Mutanten aus einem Elternstamm von Corynebacterium glutamicum wurden in gleicher Weise, wie in Versuch 1 gezeigt ist, ausgelöst. Das Wachstum der Mutanten in einem mit 2-TA versetzten Medium wurde in gleicher Weise untersucht, wie in Versuch 2 gezeigt wurde.

Corynebacterium glutamicum FERM P-1768 mit Resistenz gegen 2-TA wurde aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 nach der in Versuch 1 beschriebenen Methode durch Mutation erzeugt. Zellen des Stammes FERM P-1768 wurden nach der Züchtung gewonnen und in einen Phosphatpuffer gegeben, der 250 μg Nitrosoguanidin/ml enthielt. Die Lösung wurde 20 Minuten unter Schütteln bei 30°C gehalten. Nachdem diese Mikrobenzellen zweimal mit der Phosphatpufferlösung gewaschen worden waren, wurden Mutan-

ten mit Nährstoffbedarf mit Hilfe der üblichen Übertragungsmethode (Replica-Methode) erhalten. Dabei konnten zahlreiche Mutantenstämme erzeugt werden, die einen Nährstoffbedarf gemeinsam mit Resistenz gegen 2-TA zeigten. Zu solchen Mutantenstammen gehören Corynebacterium glutamicum FERM P-I967 (Leu-), Corynebactenum glutamicum FERM P-1966 (Isoleu-) und Corynebacterium glutamicum FERMP-1968(Thr-).

Die Wachstumshemmung von Corynebacterium gluiimicum FERM P-1768 in einem Medium, dem 2-TA zugesetzt war, wurde in gleicher Weise wie in Versuch 2 geprüft Dabei wurde gefunden, daß das relative Wachstum eines Elternstammes, Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032, in einem Medium, dem 1000 y2-TA/ml zugesetzt worden waren, Null wurde. Im Gegensatz dazu betrug das relative Wachstum von Corynebacterium glutamicum FERM P-1768 in einem Medium, dem 2000 γ 2-TA/ml zugesetzt worden waren, mehr als 80%, und der Stamm konnte sogar in einem Medium wachsen, dem 5000y 2-TA/ml zugesetzt worden waren.

Das erfindungsgemäß zur Bildung von L-Valin verwendete Kulturmedium kann ein völlig übliches Medium sein. Es enthält eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und die üblichen Spurennährstoffe. Zu Beispielen für geeignete Kohlenstoffquellen gehören Kohlhenhydrate, wie Glucose, Maltose, Fructose, Stärke, Stärkehydrolysate, Cellulosehydrolysate oder Melassen, organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure oder Bernsteinsäure, Alkohole, wie Äthanol oder Glycerin, und Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine. Diese Substanzen können entweder für sich oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumchlorid oder gasförmiges Ammoniak. Anorganische Salze, wie Phosphate, oder Salze von Magnesium, Calcium, Mangan oder Ferrosalze und andere in Spuren vorliegende Metallsalze sind im allgemeinen anwesend. Bei Verwendung der Mutanten mit Nährstoffbedarf müssen auch die erforderlichen Nährstoffe vorliegen. Zum Erzielen eines guten Bakterienwachstums liegen zweckmäßig Aminosäuren, Vitamine, Sojabohnenhydrolysat, Hefeextrakte, Pepton und Caseinhydrolysat vor.

Die Züchtung erfolgt unter ganz üblichen Bedingungen. Die erfindungsgemäße Fermentation wird bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9, bei einer Temperatur so von 20⁰C bis 40⁰C unter aeroben Bedingungen während 1 bis 4 Tagen durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums kann durch Zugabe von sterilem Calciumcarbonat, wäßrigem oder gasförmigem Ammoniak, Mineralsäuren oder organischen Säuren während der Fermentation eingestellt werden.

Das erhaltene L-Valin wird mit Hilfe üblicher Methoden aus der Kulturbrühe gewonnen. Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildete L-Valin wurde aufgrund der Untersuchungsergebnisse identifiziert, die bei der Bestimmung des Rf-Werts im Papierchromatogramm, Elektrophorese und dem Ansprechen im mikrobiologischen Versuch erhalten wurden, und dabei mit den Ergebnissen verglichen, die bei Verwendung von authentischen Proben erhalten wurden.

Die Menge des in der Kulturbrühe gebildeten L-Valins wurde durch einen mikrobiologischen Versuch bestimmt

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt, und 20 ml-Anteile dieses Mediums wurden jeweils in 500 ml-Schüttelkolben gegeben.

Zusammensetzung des Mediums:

Glucose 10%
(NH₄)₂SO₄ 4%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Biotin 50 γ/\

Thiamin · HCl 300 y/1
Sojabohnenprotein-Hydrolysat 1 ml/dl

CaCO3(gesondert sterilisiert)
(pH 7,0, eingestellt mit KOH) 5%

Acht in Tabelle 2 gezeigte Stämme, die vorher 24 Stunden auf Bouillon-Schrägagar bei 30⁰C gezüchtet worden waren, wurden gesondert in jedes Medium eingeführt, dem die für jeden Stamm erforderliche Aminosäure in einer ebenfalls in Tabelle 2 gezeigten Menge zugesetzt worden war, und die Züchtung wurde während 72 Stunden bei 31,5° C durchgeführt. Das in jeder Kulturbrühe gebildete L-Valin wurde mit Hilfe einer biologischen Prüfmethode bestimmt und ist in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Verwendeter Stamm*)

Erforderliche	Aminosäure	Gebilde
Aminosäure	Menge	tes L- Valin
	(mg/dl)	(g/dl)
_	—	1,50
Isoleucin	15	2,51
Leucin	30	2,05
Threonin	30	1,96

Brevi. lactofermentum FERM P-1945
Brevi. lactofermentum FERM P-1963
Brevi. lactofermentum FERM P-1964
Brevi. lactofermentum FERM P-1965

Fortsetzung

Verwendeter Stamm*)

Erforderliche Aminosäure
Aminosäure Menge

(mg/dl)

Gebildetes L-Valin

(g/dl)

Cory, glutamicum FERM P-1768

Cory, glutamicum FERM P-1966 Isoleucin 15

Cory, glutamicum FERM P-1967 Leucin 30

Cory, glutamicum FERM P-1968 Threonin 30

Anmerkung: *) Alle genannten Stämme besitzen Resistenz gegen 2-TA.

1,20
2,30
1,70
1,51

tin Liter der Kuiturbrühe des Stammes FERM P-1964 und des Stammes FERM P-1966 wurde zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert; die in jedem Fall als obere Schicht erhaltene Flüssigkeit wurde durch eine mit einem Kationenaustauscherharz gefüllte Säule geleitet, und nach dem Waschen mit Wasser wurde L-Valin eluiert.

Aus dem Eluat wurden 9,3 g bzw. 11,2g kristallines L-Valin gewonnen.

Beispiel 2

20 ml-Anteile des nachstehend gezeigten Fermentationsmediums wurden jeweils in 500 ml-Schüttelkolben gegeben und sterilisiert Das Medium wurde mit Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 angeimpft (resistent gegen 2-TA; Nährstoffbedarf an Isoleu- plus Met-), das vorher 24 Stunden bei 30⁰C auf Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, und wurde unter Rühren und Belüften 72 Stunden bei 30° C bebrütet Es zeigte sich, daß die Kulturbrühe 2,38 g L-Valin/dl enthielt. Zum Vergleich wurde Brevibacterium lactofcrrnentum FERM P-1858 (!soleu- plus Met-) ohne Resistenz gegen 2-TA in gleicher Weise wie vorstehend gezüchtet, wobei nach 72stündiger Züchtung 0,9 g L-Valin/dl in der Kulturbrühe vorgefunden wurden.

Zusammensetzung des Mediums:

Glucose	8%
(NH₄J₂SO₄	4%
KH₂PO₄	0,1%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,04%
Biotin	50 y/1
Thiamin · HCl	300 y/1
Fe+ +	2 ppm
Mn+ +	2 ppm
L-Isoleucin	20 mg/dl
DL-Methionin	40 mg/dl
CaCO₃ (gesondert
sterilisiert) (pH 7,0)	5%

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Valin durch aero je Züchtung eines zur extrazellulären Bildung von L-Valin in einem Nährmedium befähigten Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, sowie für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche organische und anorganische Spurennährstoffe enthält, bis zur Anreicherung von L-Valin in dem Kulturmedium und Gewinnung des angereicherten L-Valins aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Mikroorganismen Brevibacterium lactofermentum FERM P-1945, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1963, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1964, Brevibacterium lactofermentum FERM P-1965, Corynebacterium glutamicum FERM P-1768, Corynebacterium glutamicum FERM P-1966, Corynebacterium glutamicum FERM P-1967, Corynebacterium glutamicum FERM P-1968, Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-1314 oder Brevibacterium lactofermentum FERM P-1845 züchtet.

einen, bestimmten Nährstoffbedarf und/oder Resistenz gegenüber anderen Reagenzien zusätzlich zu der Resistenz gegen 2-TA. Die zusätzlichen Eigenschaften können ein Nährstoffbedarf, wie Leucin-, Isoleucin-, Threonin- oder Isoleucin- und Methioninbedarf sein, und/oder Resistenz gegen andere Reagenzien, wie «-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure und Athionin.

Um eine gute Ausbeute an L-Valin zu erzielen, kann

es von Wert sein, einen Mutantenstamm zu verwenden,

ίο der beide Eigenschaften aufweist, nämlich Resistenz gegenüber 2-TA und den angegebenen Nährstoffbedarf.

Erfindungsgemäß geeignete Stämme sind folgende: