DE2102799B2 - Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von l-threonin und l-lysin auf mikrobiologischem wege - Google Patents
Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von l-threonin und l-lysin auf mikrobiologischem wegeInfo
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Description
Kosten durchgeführt werden kann und insbesondere 25 eine hohe Ausbeute an den beiden Aminosäuren
Es ist bekannt, daß die Aminosäuren L-Lysin und ergibt. Die Erfindung löst diese Aufgabe.
L-Threonir. in Getreideproteinen in unzureichender Gegenstand der Erf.ndung ist nun ein Verfahren
Menge vorhanden sind und daß der Nutzeffekt dieser zur gleichzeitigen Herstellung von !--Threonin und
Getreideproteine durch eine Anreicherung mit diesen L-Lysin auf biotechnischem Wege durch aerobe Züch-
beiden Aminosäuren beträchtlich erhöht wird. Weiter- 30 tung von Mikroorganismen in einem wäßrigen, Koh-
hin ist bekannt, daß L-Lysin und L-Threonin zur Er- lenhydrate, Stickstoffquellen, Mineralsalze und andere
höhung des Nährwerts von Nahrungsmitteln oder als Nährstoffe enthaltenden Nährmedium beim Tempe-
Zusatz zu Futtermitteln erhebliche Bedeutung haben. raturen von etwa 20 bis 40cC und bei einem pH-Wert
In der USA.-Patentschrift 2 979 439 ist ein Verfah- von etwa 4 bis 9, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
ren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologi- 35 man einen Mikroorganismus aus der Gruppe von
schem Wege beschrieben worden, das zum ersten Mal Corynebacterium glutamicum ATCC 21488, -ATCC
die Herstellung von L-Lysin in wirtschaftlich durch- 21649 und -ATCC 21650 oder daß man die beiden
führbarer Weise gestattet. Jedoch wird nach diesem Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum ATCC
Verfahren kein L-Threonin gebildet, da hierbei der 21651 und Brevibacterium flavum ATCC 21269 in
verwendete Mikroorganismus zur Biosynthese von 40 Mischkultur einsetzt. Die vorstehend genannten
Threonin ungeeignet ist. ATCC-Stämme von Corynebacterium und Brevi-
Andcrerseits sind mehrere Verfahren zur Herstellung bacterium besitzen bestimmte Resistenzen, die in den
von L-Threonin auf mikrobiologischem Wege bekannt. Beispielen beschrieben werden.
Hierbei werden jedoch Mikroorganismen verwendet, Die Erzeugung von i.-Lysin und L-Threonin nach
die zur Biosynthese von i.-Lysin ungeeignet sind und 45 dem Verfahren der Erfindung kann also auch durch
daher kein L-Lysin bilden. Außerdem ist bei diesen Verwendung einer gemischten Kultur von Coryne-
Verfahren die Ausbeute an L-Threonin im Kultur- bacterium glutamicum ATCC 21651 und Brevibacte-
medium sehr niedrig (vgl. zum Beispiel USA.-Patent- rium flavum ATCC 21269 erreicht werden. In diesem
schrift 2 937 121 und 2 937 122). Bei einem anderenen Zusammenhang muß darauf hingewiesen werden, daß
bekannten Verfahren wird als ein Ausgangsmaterial 50 bei Verwendung einer gemischten Kultur von bisher
das sehr teure L-Homoserin verwendet. Daher is.t bekannten, nährstoffbedürftigen, L-Lysin bzw. L-Thre-
dieses Verfahren aus wirtschaftlichen Gründen zur onin erzeugenden Stämmen diese beiden Aminosäuren,
Herstellung von Threonin nicht befriedigend. Darüber das heißt L-Lysin und !.-Threonin, entweder nicht
hinaus ist die Bildung von L-Lysin in diesem Kultur- oaer in vernachlässigbaren Mengen gebildet werden,
medium nicht beobachtet worden (vgl. USA.-Patent- 55 Beim Verfahren der Erfindung sind beliebige synthe-
schrift 3 099 604, japanische Patentanmeldung 2896/61 tische oder natürliche Nährmedien zur Züchtung der
und Sugawara, Nozaki und N i s h i m u r a Stämme geeignet, sofern sie die für das Wachstum der
in »Amino Acid and Nucleic Acid«, 10 [1964], S. 68). verwendeten Stämme erforderlichen Nährstoffe ent-
Auch beim Verfahren zur Herstellung von i.-Threonin halten. Solche Nährstoffe sind bekannt. Sie enthalten
unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen (vgl. 60 in geeigneten Mengen Kohlenstoffquellen (Kohlen-
Takayama, Abe und K i η ο s h i t a in »Amino hydrate). Stickstoffquellen, anorganische Salze und
Acid and Nucleic Acid«, 19 [1969], b. 121) und auch Spuren von essentiellen Nährstoffen, die von den ver-
beim Verfahren unter Verwendung eines Mikroorga- wendeten Mikroorganismen verwertet werden,
nismus, der gegen _\-Amino-/f-hydroxyvaleriansäure Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate,
resistent ist (vgl. »Agricultural and Biolugical Chemi- 65 wie Giycose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannose,
stry«, 33 [1969], S. 1152), wurde keine Bildung von Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder Glycerin,
•.-Lysin beobachtet. oder geeignete organische Säuren, z. B. Essigsäure,
Fs ist ferner bekannt, daß iv.an bei Verwendung des Milchsäure oder Brenztraubensäure. Diese Substanzen
können entweder einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Als Stickstoffquellen kommen die verschiedensten anorganischen oder organischen Verbindungen in
Frage, wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ä Timoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat oder Ammoniumcarbonat, oder natürliche, Stickstoff
enthaltende Verbindungen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl. Bouillon,
Caseinhydrolysate, Casaminosäuren, lösliche Produkte aus Fischen, Reiskleieextrakt, enzymatisch aufgeschlossenes
Casein, entfettete Sojabohnenkuchen, Aufschüeßungsprodukte, wie aufgeschlossenes Fischmehl
oder aufgeschlossener entfetteter Sojabohnenkuchen, oder Hydrolysate von Schmetterlingspuppen.
Auch diese Produkte können einzeln oder als Gemisch \cr\\endet werdt; .
tieispiele von verwendbaren anorganischen Verbindungen
sind Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, primäres und sekundäres Kaliumphosphat. Eisen(II)-sulfat,
Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid. Zinksulfat. Mangansulfat oder Calciumcarbonat.
Wenn die beim Verfahren de: Erfindung einzu- >.euenden ATCC-Stämme Spuren von essentiellen
Nährstoffen, wie Vitamine oder spezieile Aminosäuren, fur iur Wachstum benötigen, werden diese Substanzen
(-. die Beispiele) selbstverständlich dem Nährmedium
zugesetzt. Dies erübrigt sich, wenn sie bereits in den Bestandteilen des Nährmeciiums \orhanden sind. Beispiele
derartiger Nährstoffe sind Asparaginsäure, Methionin und oder Vitamine, wie BioJn, Thiamin oder
Cobalamin.
Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch Schüt-IeIn
oder unter Rühren und Belüften im Submersverfahren. Man arbeitet bei Temperaturen von etwa
20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 4 bis 9. Vorzugsweise hält man den pH-Wert während dei
Züchtung um den Neutralpunkt, um eine hohe Ausbeute zu erhalten. Diese besonderen Temperatur- und
pH-Bedingungen sind jedoch für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung nicht ausschlaggebend.
Nach einer Züchtung von 1 bis 5 Tagen haben sich in dem erhaltenen Kulturmedium gleichzeitig große Mengen
von L-Lysin und i.-Threonin angereichert.
Nach Beendigung der Züchtung kann das erhaltene Kulturmedium konzentriert und getrocknet werden.
Man erhält hierdurch ein an i.-Lysin und L-Threonin angereichertes Futterzusatzmittel. Gegebenenfalls können
die beiden Aminosäuren nach üblichen Verfahren aus dem Kulturmedium gemeinsam oder einzeln gewonnen
werden, z. B. durch Adsorption an einem Ionenaustauscher, Extraktion mit Lösungsmitteln,
Ausfällung, Absorption oder Chromatographie.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Prozentangaben auf
das Gewicht je Volumen.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Threonin als auch L-Lysin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21488 verwendet, der durch mutagene Behandlung von Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 (Synonym für Micrococcus glutamicus; vgl. auch USA.-Patentschrift 3 003 925)
erhalten wurde. Dieser Stamm, der sowohl gegen das Threonin-Analoge ix-Amino-^-hydroxyvaleriansäure,
als auch gegen das Lysin-Analoge S-(/?-Aminoäthyl)-cystein
resistent und methioninabhängig ist, wird 24 Stunden bei 300C unter aeroben Bedingungen und
Schütteln in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzi.ng gezüchtet: 2 Prozent Glucose, 1 Prozent
Pepton, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid. Dann wird 1 ml der entstandenen
Anzuchtkultur in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolbcn gegeben, der 10 ml eines Nährmediums der
ίο folgenden Zusammensetzung enthält:
10 Prozent Glucose,
0,05 Prozent K-HPO,,
0,05 Prozent KH-PO4,
2 Prozent (NH4J2SO4,
0,025 Prozent MgSO4 · 7 H-O,
0,025 Prozent MgSO4 · 7 H-O,
0,001 Prozent FeSO4 · 7 H2O,
0,001 Prozent MnSO4 · 4 H2O,
2 Prozent CaCO3,
400 μg Liter Biotin,
2 mg/Liter Thiamin-hydrochlorid,
400 μg Liter Biotin,
2 mg/Liter Thiamin-hydrochlorid,
0,5 Prozent enzymatisch aufgeschlossenes Casein.
Der pH-Wert des Nährmediums beträgt 7,2.
Man züchtet 3 Tage bei 30° C unter aeroben Bedingungen und Schütteln und erhält in dem entstandenen
Kulturmedium 5.5 mg L-Lysin und 9.0 mg L-Threonin pro ml. Nach dem Entfernen der Zellen
der Mikroorganismen und von CaCO3 werden L-Threonin und L-Lysin aus dem Kulturmedium durch
Adsorption an einem Ionenaustauscher gewonnen. Die Ausbeute an L-Lysin bzw. L-Threonin aus 1 Liter
Kulturmedium beträgt 4,4 g bzw. 6,3 g.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21649 verwendet. Dieser Stamm ist sowohl gegen das Threonin-Analoge
a-Amino-/?-hydroxyvaIeriansäure als auch gegen das Lysin-Analoge S-(/?-Aminoäthyl)-cystein resistent. Die
Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ausbeute an L-Lysin bzw. L-Threonin beträgt 4,1 mg bzw. 7,8 mg pro ml.
B e i s ρ i e 1 3
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21650 verwendet.
Dieser Stamm ist sowohl gegen das Threonin-Analoge a-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure als auch gegen das
Lysin-Analoge S-(/?-AminoäthyI)-cystein resistent und
methioninabhängig. Die Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im
Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute an L-Lysin bzw. L-Threonin beträgt 4,6 mg bzw. 6,9 mg pro ml.
Als Anzuchtmikroorganismen werden der L-Lysin erzeugende Stamm Corynebacterium glutamicum
ATCC 21651, der gegen das Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl)-cystein resistent ist, und der L-Threonin
erzeugende Stamm Brevibacterium flavum ATCC 21269, der gegen das Threonin-Analoge Λ-Amino-/J-hydroxyvaleriansäure
resistent ist, verwendet. Die Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt,
jedoch mit der Ausnahme, daß das Nährmedium
gleichzeitig mit diesen beiden Stämmen beimpft wird. Die erhaltenen Ausbeuten an L-Threonin bzw. i.-Lysin
betragen 3,6 mg bzw. 7,3 mg pro ml.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl !.-Threonin als auch L-Lysin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21488 verwendet. Dieser Stamm wird 24 Stunden bei 300C unter aeroben
Bedingen1"η und Schütteln in einem Nährmedium
der folgen \ ; Zusammensetzung gezüchtet: 4 Prozent Glucose, 2 Hrozent Pepton, 0,15 Prozent KH,PO4,
0,05 Prozent K2HPOj, 0,05 Prozent MgSO4-7H2O,
50 μg/Liter Biotin und 0,5 Prozent Hefeextrakt. 1 ml
der entstandenen Anzuchtkultur wird in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben gegeben, der 10 ml eines
Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:
10 Prozent Rohrzuckerschwarzmelasseiberedinet
als Glucose)
2 Prozent Sojabohnenkuchenhydrolysat
(erhalten durch Aufschließen mit 6n H2SO4 und Neutralisieren mit wäßrigem
Ammoniak; berechnet als Sojabohnenkuchen vor dem Aufschluß),
0,3 Prozent Harnstoff,
0,05 Prozent MgSO4 · 7 H„O,
0,07 Prozent KH2PO4,
3 Prozent CaCO3.
Der pH-Wert des Nährmediums beträgt 7,2.
Man züchtet 3 Tage bei 30"C unter aeroben Bedingungen
und Schütteln. Die Ausbeute an gebildetem und in dem entstandenen Kulturmedium angereicherten
L-Lysin bzw. L-Threonin beträgt 10,3 mg bzw. 15,2 mg pro ml.
Wie aus den Beispielen 1 bis 5 hervorgeht, erhält man beim crfindungsgemäßen Verfahren bei 72stündiger
Züchtung 4,1 bis 10,3 mg L-Lysin pro ml und 3,6 bis 15,2 mg L-Threonin pro ml, während man nach
ίο dem Verfahren der deutschen Offenlegungsschrift
1 903 162, wie aus dem dortigen Beispiel 1 hervorgeht, nur 3,97 mg i.-Lysin und 2,35 mg L-Threonin pro ml
erhält. Außerdem beträgt nach dem Verfahren der genannten Offenlegungsschrift die Menge der beiden
Aminosäuren L-Lysin und L-Threonin nur etwa 13 Prozent der insgesamt gebildeten Aminosäuremenge,
während diese beiden Aminosäuren beim Verfahien der Erfindung etwa 81 Prozent der insgesamt
gebildeten Aminosäuren ausmachen. Im erfin-
ao dungsgemäßen Verfahren werden somit die beiden
genannten Aminosäuren praktisch als Hauptprodukt gebildet und lassen sich deshalb sehr leicht isolieren.
Außerdem ist im Verfahren der deutschen Offenlegungsschrift 1 903 162 die Verwendung von Cellulose
ein wesentliches Merkmal; insbesondere werden Cellulosestreifen und -säcke dem Züchtungssystem
zugegeben, um die vorerwähnten Ausbeuten zu erreichen. Demgegenüber ist beim erfindungsgemäßen
Verfahren kein Cellulosezusatz notwendig, was einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem Verfahren der
genannten deutschen Offenlegungsschrift darstellt.
Claims (2)
1. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von an L-I hreonin nur 0,3 mg, jeweils pro ml Fermen-L-Threonin
und L-Lysin auf biotechnischem Wege 5 tationsmedium (vgl. L. E. E r i c s ο η und W. G.
durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen in K u r ζ in »Biotechnol. Bioeng.«, 4 [1962], S. 23 und
einem sväßrigen, Kohlenhydrate, Stickstoffquellen, 37).
Mineralsalze und andere Nährstoffe enthaltenden In der deutschen Offenlegungsschrift 1 903 162 ist
Nährmedium bei Temperaturen von etwa 20 bis ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von ver-
40° C und bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 9, io schiedenen extrazellulären Aminosäuren, darunter
dadurch gekennzeichnet, daß man auch L-Lysin und L-Threonin, durch Züchtung von
einen Mikroorganismus aus der Gruppe von Micncoccus cerificans ATCC 14987 in einem Koh-
CorynebacteriumglutamicumATCC21488,-ATCC lenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium in Gegen-
21649 und-ATCC 21650 oder daß man die beiden wart von Cellulose beschrieben. Wie in Tabelle II
Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum 15 dieser Offenlegungsschrift angegeben, betragen die
ATCC 21651 und Brevibacterium flavum ATCC Ausbeuten nach 72stündiger Züchtung nur 3.Γ/ mg
21269 in Mischkultur einsetzt. 1.-Lysin und 2,35 mg 1.-Threonin pro ml.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren
zeichnet, daß man den pH-Wert des Kultur- zur gleichzeitigen Herstellung der beiden Aminosäuren
mediums während der Züchtung auf etwa 7,0 hält. 20 L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege
zu schaffen, da* die Nachteile der bekannten Verfahren
vermeidet, das wirksam und verhältnismäßig ein-
fach in technischem Maßstab und mit niedrigen
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |