DE1903336A1

DE1903336A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan

Info

Publication number: DE1903336A1
Application number: DE19691903336
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hagino; Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-01-24
Filing date: 1969-01-23
Publication date: 1969-10-16
Also published as: US3594279A; GB1189796A; FR2000641A1

Description

23Jan,1969

KYOWA HAKKO K06Y0 CO., LTD,, !EOKIO / JAPAN

Verfahren zur Herstellung von !-»Tryptophan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von E-Tryptophan. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Ver~ fahren zur Herstellung von !«Tryptophan durch Gärung. In ganz besonderer Weise bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von !»Tryptophan durch Gärung, und zwar durch Züchten von Histidin~erfordernden Mutantenstämmen in geeigneten Gärungsmedien.

Verfahren zur Herstellung von !-Tryptophan durch Gärung sind be-

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reits bekannt. Beispielsweise wird in der US-Patentschrift 2 999 051, der japanischen Patenfeveroffentlichung 12384/60, der japanischen Pat en ^Veröffentlichung 4632/64, der französischen Patentschrift 1 437 998 und der US-Patentschrift 3 293 141 die Zugabe von Xndol oder Anthranilsäure zu dem Züchtungsmedium beschrieben. Jedoch sind die Indol-oder die Anthranilsäure vor» läufer, die bei derartigen Verfahren eingesetzt werden, teuer. Daher haftet diesen Verfahren der Nachteil an, dass die Kosten zur Erzeugung von Tryptophan zu hoch sind. Darüber hinaus können keine grossen Mengen dieser Vorläufer verwendet werden, da sie das Wachstum der Mikroorganismen inhibieren.

Daher wurden Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan ohne Zu-=· gäbe von Vorläufern zu dem Medium entwickelt. Von derartigen Methoden sei beispielsweise die Metfeöde erwähnt, bei deren Durchführung Mutanten von EschericMs ooli eingesetzt werden (vergleiche "Journal of fermentation Technology _s Vol.43, Hr. 5» Seiten 30? - 310 (1965)")· Aueeerdaa» sei auf eine Methode hingewiesen, bei deren Durchführung ein Züohtungsmedium, daa Koh·= lenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle enthält, verwendet wird. Die bei diesen Methoden erzielten Ausbeuten sind jedoch niedrig, und zwar insbesondere bei der Durchführung der letzteren Methode. Die Ausbeuten liegen bei ungefähr nur 1 rag/l_o

Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von It~3iryptophan, durGh welches die Nachteile der bisher bekannten Verfahren überwunden werden. Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstelliing von L-Tryptophan durch Gärung zur Verfügung gestellt, das in wirkeamer und relativ einfacher Weise durchgeführt werden kann. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich in vorteilhafter V/eise in

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Maßstab© bei niedrigen Kosten durchführen, wobei hohe Produktausbeuten ©raielt werden.

Sie Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass Mutantenbakte= rien, welche Histidin für ihr Wachstum erfordern und »u den Genera Bacillus, Cerynebaoterium oder Arthrobacter gehören, direkt merkliche Mengen an L-Tryptophan erzeugen und anreichern, wenn derartige Bakterien in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Es wird auf diese Weise möglich, auf billige Weise grosse Ii~2xyptophan~Ausbeuten durch Verwendung von billigen Kotil ens t off quellen * wie beispielsweise Kohlehydraten« Kohlenwasserstoffen oder dergleichen, zu erzeugen.

Geeignete Mikroorganismen, äie sich erfiadungsgemäss verwenden lassen, sind K? kanten von Mikroorganismen, welche zu den Genera Bacillus, CoryiiebacteriuEi und Arthrobacter gehören und wenigstens Hi&ti&iFi ffe ihx» Wachstum eirfordersi. natürlich können gleichzeitig @&9h. KutaJiteii verwendet werden, die neben Histidin andere

erfordeoi. Dieme L—2ryptophan~erzeugenclen Stfimme Ja sich in einfeelier Weise durch eine übliche Mutationsbehandlung erhalten, beispielsweise durch, eine UY=Bestrahlung eine mit versuMedan@n Strahlen, wie beispielsweise oder E©i3alt«6O«Stra!ilen_f eine Behandlung mit chemischeis. Mitteln ader dergleieheü, v/obei mau. sich gleichseitig einer entsprechenden Selektionsiaethode bedient.

Zum Züchten der erfindimgsgeiEäss eingesetzten Stämme kann man entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nähnsedium verwenden., vora'asgesetst, dasa es die für das V/achs·=· turn des verwendetes Stammes wesentlichen NfibfMittel enthält. Derartige Nährmittel sind "bekannt. Ss handelt sich bsiepiels«*

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weise um Substanzen, wie z.B. eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen, wobei diese Substanzen von dem eingesetzten Mikroorganismus in den entsprechenden Mengen verbraucht werden. Als Kohlenstoff quelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, Mannose, Glycerin oder dergleichen, erwähnt. Man kann auch irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle verwenden, beispielsweise organische Säuren, beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure oder dergleichen. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden.

Werden Kohlenwasserstoff-assimilierende Mikroorganismen eingesetzt, dann können in dem Nährmedium Kohlenwasserstoffe, bei» spieleweise η-Paraffine, Kerosin oder Erdölfraktionen, wie z.B. Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle oder dergleichen, als Kohlenstoff quelle verwendet werden. Diese Kohlenwasserstoffe können auch in Kombination mit einem Kohlehydrat oder einer Kohlehydratmischung als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniurasulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumaoetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder dergleichen. Ferner können natürliche Substanzen verwendet wer» den, die Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Maisflüssig-= keit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton_p Fischmehl, Fleischbrühe, Easeinhydrolysate (wie KZ-Amin), Casaminosäure, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt, entfetteter Sojabohnenkuchen, Chrysalishydrolysat oder verschiedene Digestionssub-

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stanzen davon oder dergleichen. Auch diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden„

Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kallumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen(II)»sulfat, Manganohlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat oder dergleichen.

Da die Mikroorganismen, welche in geeigneter Weise erfindungs« gemäss eingesetzt werden, natürlich besondere Nährmittel für ihr Wachstum erfordern, sollten die entsprechenden Mengen der« artiger Nährmittel erforderlichenfalls dem Kulturmedium zugesetzt werden. Diese Nährmittel sind gewöhnlich in den stick« stoffhaltigen organischen Substanzen, welche als Stickstoffquellen bezeichnet wurden, enthalten, so dass durch Verwendung entsprechender Mengen dieser Substanzen derartige Anforderungen erfüllt werden. Jedoch müssen die stickstoffhaltigen organischen Substanzen-nicht in notwendiger Weise dem Medium zu dem Zweoke zugesetzt werden, es mit dem erforderlichen Nährmittel zu versorgen. Auch andere Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Amino» säuren, Vitamine, wie z.B. Thiamin, Cobalamin oder dergleichen, oder Biotin, können natürlich dem Medium zugesetzt werden.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder unter Belüften und Rühren einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise ungefähr 20 «· 40⁰G und bei einem pH von beispielsweise ungefähr 4,0 - 9,5» Zur Erzielung von hohen Ausbeuten an !«-Tryptophan ist es zweckmässig, den pH des

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Kulturmediums auf ungefähr 7,0 zu halten, ffach ungefähr 2- bis 5-tägigem Züchten unter diesen Bedingungen werden Merkliche Mengen an L-iDryptophan erzeugt und in der erhaltenen Kulturbrühe angereichert. Fach Beendigung des Züchtens werden die Mikroorganismenzellen aus der Kulturbrühe entfernt, worauf das !-Tryptophan aus der Flüssigkeit nach üblichen Methoden abgetrennt wird, beispielsweise durch Ionenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Ohroma·» tographie, Konzentrierung oder dergleichen. Eine besonders geeignete Methode ist die Behandlung mit einen Ionenaustauscherharz, wie sie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro 1 Wasser. In den Beispielen werden ferner Beispiele für Mikroorganismen erwähnt, welche in vorteilhafter Weise sau: Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzt werden können,,

Beispiel 1

Arthrobacter paraffineus ΚΪ7112 ASCC 21333, ein Histidin-erf ordernder Mutantenstamm, wird als Impftoikroorganismus verwendet. Dieser Stamm wird auf einen konischen 250 ml-Kolben auf geimpft, der 30 ml eines Kulturmediums (pH 7,4) enthält. Dieses Medium enthält 2 # Sorbit, 1 # fleischextrakt, 0,5 $> Hefeextrakt und 0,3 $> Natriumchlorid. Das Züchten wird unter aerobem Schütteln bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Gewinnung einer Impfkultur durchgeführt.

2 ml der erhaltenen Impfkultur werden auf einen konischen

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ml-Kolben auf geimpft, der 20 al eines Gärungsmediums (pH 7,4) enthält. Dieses Medium besitzt folgende Zusammensetzung:

10 $ Sorbit

2 #

0,2 f>

0,2 £ Na₂HPO.

0,1 # HgSO₄.7H₂O

10 Bg/1 FeSO₄.7H₂O

10 Bg/1 MaSO₄.4H₂O

10 mg/1 ZnSO₄.7HgO

5 mg/1 Thiaminhydrochlorid

0,3 $ Hefeextrakt

1 i NZ=Amin

2 $ OaCO₃

Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur in dem uärungsmedlum bei 30*C während einer Zeitspanne von 4 Sagen durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne beträgt die Menge des erzeugten L-Tryptophans in der Kulturbrühe 500 mg/1.

Die erhaltene Kulturbrtthe wird zur Entfernung der microorganism mensellen zentrifugiert. 5 1 der erhaltenen überstehenden Flue« sigkelt werden durch das stark saure Kationenaustauscherharz Diaion SK 104, Η-Typ, zur Adsorption des L-Tryptophans geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird der durch Eluierung mit 0,5 n-Ammoniakwasser erhaltene Abfluss zur Trockne einge=· dampft, worauf das erhaltene rohe kristalline Tryptophanpulver in einer kleinen Menge einer heissen wässrigen (50 ^f) Äthanollösung gelöst wird. Die Lösung wird mit Aktivkohle entfärbt und weiter abgekühlt« Auf dieoe V/eise werden 1,5 g li-Tryptophan= Kristalle erhalten.

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Beispiel 2

Der Histidin-erfordernde Mutantenstamm Artkeobacter paraffiueus KY7112 ATCC 21333 wird als Impfmikroorganismus verwendet. Das Zueilten wird in der gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Gärungsmedium IO #■ Kerosin an Stelle von Sorbit als Kohlenstoff quelle enthält. Nach 4-=tägigem Züchten sind 400 mg/1 !■-Tryptophan in der erhaltenen Kulturbrühe angereichert.

Beispiel 5

Bacillus subtilia ATCG 14662 (ein Histidin, Adenin, Tyrosin und Arginin erfordernder Mutautenstamm) wird ale Impfjaikroorganismus verwendet. Er wird em£ einen konischen 250 ml~Kolben aufgeimpft, der 30 ml eines Kulturmediums (pH 7»4) enthält. Dieses Kulturmedium besteht aus 2 % Glucose, 1 f Hefeextrakt, 1 # Pepton und 0,25 # Natriumchlorid. Der Stamm wird unter- aerobem Schütteln bei 30⁹C 24 Stunden lang zur Gewinnung einer Impfkultur ge« züchtet.

2 ml der erhaltenen Izapfkultur werden auf einen konischen 250 ml-Kolben auf geimpft, der 20 ml eines Gärungsmediums enthalte welches folgende Zusammensetzung besitzt;

5 %	Glucose
o_fo5 ?ε	K₂HPO₄
0_Γ05 ϊ	KH₂PO₄
1 #	(NH₄)₂S0.
0,025 #	MgSO₄.TH₂O
30 jig/1	Biotin
0,1 ?δ	Hefeextrakt
0_s25 JS	HZ=AmIn
.? 55	CaCOr,

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- 9 Der pH des Gärungsmediums beträgt 7,4.

Das Züchten wird unter aerobem Schütteln der KuItür bei. 3O°C während einer Zeitspanne von 4 Tagen durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne haben sich 200 mg/l !^-Tryptophan in der erhaltenen Kulturbrühe angesammelt.

Beispiel 4

Corynebacterium glutamic&m ΚΪ91Ο4 AICCO 21334, ein Histidinerfordernder Mutantenstaram, wird als Impfmikroorganismus verwendet. Das Züchten wird in der gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Als Ergebnis erhält man jQ»Tryptophan in der Xulturbrühe in einer Menge von 500 mg/1.

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Claims

- ίο -

Patentansprüche

1. Verfahren sur Herstellung von i-fryptoplian, dadurch gekernt= zeichnet, dass ein Histidin~erfoMe?n<ie? Mikroorganismus, der zu dem Genus Corynebacterium, Ärtiarobacter oder Bacillus gehört, wobei ein derartiger Mikroorganismus dazu in der Lage 1st, unter

w aeroben Bedingungen !»«Tryptophan zu erzeugen, in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird und L-Trypiophan in der erhaltenen Kulturbrühe angereichert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ZUchten bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 40⁰C und bei einem pH von ungefähr 4,0 » 9,5 äurolagafüiirt wird.

3» Verfahren mach Anspruch. 1, iaümrcis gekennzeichnet, dass das verwendete lüirmedium wenigstens ©Im £$hlehy&rat als Kohlenstoff= quelle enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurcl. gekesanseichnet, dass das verwendete Nährmedi'am wenigstens einen E0hlen^as^3rsto£f als Kohlenstoffquelle enthält.

5. Verfahren sur Herstellung von L^fryptöphang dadurch belohnet, dass ein Histidin~erfordernder Mikro&rganisiE zu dem ßeaue Oor^nebacterium, Arthrobactei' oder Bacillus gehört, wobei ein derartiger Mikroorganismus dazu in d@r lage ist, unter aeroben Bedingungen L-üteyptopiiaa ^u erzeugen, Im einem wässrigen Nährmedium bei einer temperatur von 20 - 40®C und bei einem pH von ung^fihr 4t 0 - 9»f> wird und Ir~3?ryptophan in der erhaltenen Sultiirbrühe wird.

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β* Verfahren nach Anspruch 5* dmfcirch gekemEeicfenet» dass der pH viährea/i des ZÜofetejig auf einem Wert in der Gegend von 7 gehalten wird.

7. Verfahren nach. Anspruoh 5_S dadurch gekennseichnet, dass der verwendete liikr^organisjnus aus Arthroi^acter paraffineus ASGC 21333 besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet; dass der verwendete MiJr.roorganisniUB aus Bacillus suhtills AXCC 14662 besteht.

9* Verfahren. na$h Anspruoh 5, dadurch gelcenase.tchnet, dass der verwendete Milsroorganlsmtts aus Corynebacterium glutaraioma A5CC 21334 beoteht«

OO₄ Verfahren nach Anspruch ?₉ dadurch gekennzeichnet _t dass das verwendete liälirmediiaH ein Kohlehydrat odor Kerosin als Kohlenstoffquelle enthalt.

11. Verfahre!?, nach Anopmich 5» dadurch golcajmaoichnet, &SS ü»3iryptophan vosi der erhaltenrn ICulturbsrühe mittels einer

abgstronnt wird.

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