DE1903336B - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von L Tryptophan - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle od. dgl., als Kohlenzur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan stoffquelle verwendet werden. Diese Kotilenwasserdurch aerobes Züchten von Mikroorganismen in stoffe können auch in Kombination mit einem Kohle- ; einem Kohlehydrate oder Kohlenwasserstoffe als hydrat oder einer Kohlehydratmischung als Kohlen- ■ Kohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nähr- 5 stoffquelle verwendet werden,
medium bei hierfür üblichen Temperatur- und Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten

pH-Werten. von anorganischen oder organischen Salzen oder

Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, durch Gärung sind bereits bekannt. Beispielsweise flüssiger Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beiwird in der USA.-Patentschrift 2 999 051, der japa- io spielsweise Ammoniumchlorid, Arnmoniumsulfat, nischen Patentveröffentlichung 12384/60, der japa- Ammoniumnitrat,, Ammoniumacetat, Ammoniumnischen Patentveröffentlichung 4632/64, der franzö- phosphat, Ammoniumcarbonat od. dgl. Ferner könsischen Patentschrift 1437 998 und der USA.-Patent- nen natürliche Substanzen verwendet werden, die schrift 3 293 141 dieffiugabe von Indol oder Anthrax Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Maisquellnilsäure zu dem ,Züchtungsmedium beschrieben. 15 wasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fisch-Jedoch sind die Indol- oder die Anthrafiilsäurevor- mehl, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, lösliche läufer, die bei derartigen Verfahren eingesetzt werden* Fischbestandteile, Reiskleieextrakt, entfetteter Sojateuer. Daher haftet,diesen Verfahren der Nachteil bohnenkuchen, Chrysalishydrolysat od. dgl. Auch an, daß die Kosten zur'Erzeugung von Tryptophan diese Substanzen können entweder für sich allein zu hoch sind. Darüber hinaus können keine großen 20 oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren SubMengen dieser Vorläufer verwendet werden, da sie stanzen eingesetzt werden.

das Wachstum der Mikroorganismen inhibieren. Anorganische Verbindungen, die dem Kultur-

Daher wurden Methoden zur Herstellung von medium zugesetzt werden können, sind beispiels-L-Tryptophan ohne Zugabe von Vorläufern zu dem weise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalium-Medium entwickelt. Von derartigen Methoden sei 25 hydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, beispielsweise die Methode erwähnt, bei deren Eisen(II)-sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Durchführung Mutanten von Escherichia coli einge- Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Caiciumsetzt werden (vgl. »Journal of Fermentation Techno-ί <■ carbortät od. dgl. (..;

logy«, Vol. 43, Nr. 5, S. 307 bis 310 [1965]). Außer- Da die Mikroorganismen, welche in geeigneter

dem sei auf eine Methode hingewiesen, bei deren 30 Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden, natürlich Durchführung ein Züchtungsmedium, das Kohlen- besondere Nährmittel für ihr Wachstum erfordern, Wasserstoffe als Kohlenstoff quelle enthält, verwendet sollten die entsprechenden Mengen derartiger Nährwird. Die bei diesen,.Methoden erzielten Ausbeuten mittel erforderlichenfalls dem Nährmedium zugesind jedoch niedrig, und zwar insbesondere bei der setzt werden. Diese 'Nährmittel sind gewöhnlich in Durchführung der letzteren Methode. Die Ausbeuten 35 den stickstoffhaltigen organischen Substanzen, welche liegen bei ungefähr nur 1 mg/1. als Stickstoffquellen bezeichnet wurden, enthalten,

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein so daß durch Verwendung entsprechender Mengen verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Trypto- dieser Substanzen derartige' Anforderungeii,erfüllt phan zu schaffen, durch welches die Nachteile der werden. Jedoch müssen die stickstoffhaltigen orgabisher bekannten Verfahren überwunden werden. 4° nischen Substanzen nicht in notwendiger W6iSe dem Das erfindungsgemäße Verfahren zur biotech- Medium zu dem Zwecke zugesetzt werden, es mit nischen Herstellung von L-Tryptophan durch aerobes '^f'-' dem ^erforderlichen Nährmittel zu versorgen!' Auch Züchten von Mikroorganismen in einem Kohle- andere Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise hydrate oder Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoff quelle Aminosäuren, Vitamine, wie z. B. Thiamin, Cobalamin enthaltenden wäßrigen] Nährmedium bei hierfür üb- !45. Od. dgl.;, oder Biotin, können--natürlich dem Medium liehen Temperatur- und pH-Werten ist dadurch, zugesetzt werden.

gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen

Corynebacterium glutamicum ATCC 21334 oder durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln ', Arthrpbacter paraffifieus ATCC 21333 einsetzt. ■ -,,- _r oder unter Belüften und Rühren, und zwar bei einer " Zum Züchten'der erfindungsgemäßen eingesetzten '50 Temperatur von beispielsweTse ungefähr 20 bis 40° C Stämme kann man entweder ein synthetisches Nähr- und bei einem pH von beispielsweise ungefähr 4,0 medium oder ein natürliches Nährmedium verwen- bis 9,5. Zur Erzielung von hohen Ausbeuten an den, vorausgesetzt, daß es die für das Wachstum des L-Tryptophan ist es zweckmäßig, den pH des Kulturverwendeten Stammes wesentlichen Nährmittel ent- mediums auf ungefähr 7,0 zu halten. Nach ungefähr hält. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt 55 2- bis Stägigeih Züchten unter diesen Bedingungen sich beispielsweise um Substanzen, wie z. B. eine werden merkliche Metigen;. an L-Tryptophan erzeugt Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische und in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit ange-Verbindungen od. dgl., wobei diese Substanzen von reichert. Nach Beendigung des Züchtens werden die dem eingesetzten Mikroorganismus in den entspre- Mikroorganismenzellen aus dem vergorenen Nährchenden Mengen verbraucht werden. Als Kohlen- 6° medium entfernt, worauf das L-Tryptophan aus der stoff quelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie Flüssigkeit nach üblichen Methoden abgetrennt wird, (V z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, beispielsweise durch Ionenaustauschharzbehandlung, C ^ Stärkehydrolysate, Melassen, Mannose, Glycerin Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorp- i'ö od. dgl., erwähnt. Diese Substanzen können entweder tion, Chromatographie, Konzentrierung od. dgl. Eine Ca für sich allein oder in Mischungen aus zwei oder 65 besonders geeignete Methode ist die Behandlung mit ·■'■'--> mehreren Substanzen verwendet werden. einen Ionenaustauscherharz, wie sie in dem nach- ■'"'^:>

Es können in dem Nährmedium auch Kohlen- folgenden Beispiel 1 beschrieben wird.
Wasserstoffe, beispielsweise η-Paraffine, Kerosin, Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Volumen.

Beispiel 1

Arthrobacter paraffineus ATCC 21333, ein Histidin erfordernder Mutantenstamm, wird als Impfmikroorganismus verwendet. Dieser Stamm wird auf einen konischen 250-ml-Kolben aufgeimpft, der 30 ml eines Kulturmediums (pH 7,4) enthält. Dieses stark saure Kationenaustauscherharz Diaion SK 104, Η-Typ, zur Adsorption des LTryptophans geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird der durch Eluierung mit 0,5 n-Ammoniakwasser erhaltene Abfluß zur Trockne eingedampft, worauf das erhaltene.rohe kristalline Tryptophanpulver in einer kleinen Menge einer heißen wäßrigen (50 %) Äthanollösung gelöst wird. Die Lösung wird mit Aktivkohle entfärbt und weiter abgekühlt. Auf diese Weise wer-

Medium enthält 2% Sorbit, 1% Fleischextrakt, io den 1,5 g L-Tryptophan-Kristalle erhalten.

0,5% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid. Das Züchten wird unter aerobem Schütteln bei 30°"C während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Gewinnung einer Impfkultur durchgeführt.

Beispiel 2

Der Histidin erfordernde Mutantenstamm Arthrobacter paraffineus ATCC 21333 wird als Impfmikro-

2 ml der erhaltenen Impfkultur werden auf einen 15 Organismus verwendet. Das Züchten wird in der konischen 250-ml-Kolben aufgeimpft, der 20 ml eines gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie Produktionsmediums (pH 7,4) enthält. Dieses Me- im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der dium besitzt folgende Zusammensetzung: Ausnahme, daß das Produktionsmedium 10% Kero

sin an Stelle von Sorbit als Kohlenstoffquelle enthält, ao Nach 4tägigem Züchten sind 400 mg/1 L-Tryptophan in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit angereichert.

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum ATCC 21334, ein Histidin erfordernder Mutaritenstamm, wird als Impfmikroorganismus verwendet. Das Züchten wird in der gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Als Ergebnis erhält man L-Tryptophan in der Fermentationsflüssigkeit in einer Menge von 500 mg/1.

10%	Sorbit
2%	NH4Cl
0,2%	K2HPO4
0,2%	Na2HPO4
0,1%	MgSO4 · 7H2O
10 mg/1	FeSO4 · 7H2O
10 mg/1	MnSO4 · 4H2O
10 mg/1	ZnSO4-7H2O
5 mg/1	Thiaminhydrochlorid
0,3%	Hefeextrakt
1%	NZ-Amin

2%

CaCO,

Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur in dem Produktionsmedium bei 30° C während einer Zeitspanne von 4 Tagen durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne beträgt die Menge des erzeugten L-Tryptophans in der Fermentationsflüssigkeit 500 mg/1.

Das vergorene Nährmedium wird zur Entfernung der Mikroorganismenzellen zentrifugiert. 51 der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit werden durch das

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate oder Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21334 oder Arthrobacter paraffineus ATCC 21333 einsetzt.