DE2102799C3 - Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege - Google Patents
Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem WegeInfo
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Description
ren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologi- 35 man einen Mikroorganismus aus der Gruppe von
schem Wege beschrieben worden, das zum ersten Mal Corynebacterium glutamicum ATCC 21488, -ATCC
die Herstellung von L-Lysin in wirtschaftlich durch- 21649 und -ATCC 21650 oder daß man die beiden
führbarer Weise gestattet. Jedoch wird nach diesem' MikroorganismenCorynebacteriumglutamicumATCC
Verfahren kein L-Threonin gebildet, da hierbei der 21651 und Brevibacterium flavum ATCC 21269 in
verwendete Mikroorganismus zur Biosynthese von 40 Mischkultur einsetzt. Die vorstehend genannten
Threonin ungeeignet ist. ATCC-Stämme von Corynebacterium und Brevi-
Andererseits sind mehrere Verfahren zur Herstellung bacterium besitzen bestimmte Resistenzen, die in den
von L-Threonin auf mikrobiologischem Wege bekannt. Beispielen beschrieben werden.
Hierbei werden jedoch Mikroorganismen verwendet, Die Erzeugung von L-Lysin und L-Threonin nach
die zur Biosynthese von L-Lysin ungeeignet sind und 45 dem Verfahren der Erfindung kann also auch durch
daher kein i.-Lysin bilden. Außerdem ist bei diesen Verwendung einer gemischten Kultur von Coryne-
Verfahren die Ausbeute an l·Threonin im Kultur- bacterium glutamicum ATCC 21651 und Brevibacte-
medium sehr niedrig (vgl. zum Beispiel USA.-Patenl- rium flavum ATCC 21269 erreicht werden. In diesem
schrift 2 937 121 und 2 937 122). Bei einem anderenen Zusammenhang muß darauf hingewiesen werden, daß
bekannten Verfahren wird als ein Ausgangsmaterial 50 bei Verwendung einer gemischten Kultur von bisher
das sehr teure L-Homoserin verwendet. Daher ist bekannten, nährstoffbedürftigen, L-Lysin bzw. L-Thre-
dieses Verfahren aus wirtschaftlichen Gründen zur onin erzeugenden Stämmen diese beiden Aminosäuren,
Herstellung von Threonin nicht befriedigend. Darüber das heißt L-Lysin und L-Threonin, entweder nicht
hinaus ist die Bildung von i-Lysin in diesem Kultur- oder in vernachlässigbaren Mengen gebildet werden,
medium nicht beobachtet worden (vgl. USA.-Pateni- 55 Beim Verfahren der Erfindung sind beliebige synthe-
schrift 3 099 604, japanische Patentanmeldung 2896/61 tische oder natürliche Nährmedien zur Züchtung der
und Sugawara, Nozaki und N i s h i m u r a Stämme geeignet, sofern sie die für das Wachstum der
in »Amino Acid and Nucleic Acid«, 10 [1964], S. 68). verwendeten Stämme erforderlichen Nährstoffe ent-
Auch beim Verfahren zur Herstellung von L-Threonin halten. Solche Nährstoffe sind bekannt. Sie enthalten
unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen (vgl. 60 in geeigneten Mengen Kohlenstoffqiiellen (Kohlen-
T a k a y a m a, Abe und K i η ο s h i t a in »Amino hydrate), Stickstoffquellen, anorganische Salze und
Acid and Nucleic Acid«, 19 [1969], S. 121) und auch Spuren von essentiellen Nährstoffen, die von den ver-
beim Verfahren unter Verwendung eines Mikroorga- wendeten Mikroorganismen verwertet werden,
nismus, der gegen .v-Amino-/?-hydroxyvaIerian.säiire BeispielevonKohlcnstoffqucllcn sind Kohlenhydrate,
resistcnt ist (vgl. »Agricultural and Biological Chenii- 65 wieGlycose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannose,
stry«, 33 [1969], S. 1152), wurde keine Bildung von Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder Glycerin,
-Lysin beobachtet. oder geeignete organische Säuren, z. B. Essigsäure,
Es ist ferner bekannt, daß man bei Verwendung des Milchsäure oder Brenztraubensäure. Diese Substanzen
können entweder einzeln oder als Gemisch \erwendet V, L-HJiTlI.
Als Stickstoffquellen kommen die verse,liedensten
anorganischen oder organischen Verbindungen in I rage, wie Harnstoff. Ammoniak oder Ammoniumsalze,
wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosp!ni
oder Ammoniumcarbonat, oder natürliche, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Maisquellwasser,
I k-feextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouü-
!»■!!. Caseinhydrolysate, Casaminosäuren. lösliche Proli.ilae
aus Fischen, Reiskleieexlrakt, enzymatisch aufgc-.-hlossenes
Casein, entfettete Sojaböhnenkiichen, A'.ifschließungsprodukte, wie aufgeschlossenes Fischmehl
oder aufgeschlossener entfetteter Sojabohnenkuchen, oder Hydrolysate von Schi-etterlingspuppen.
Auch diese Produkte können einzeln oder als Gemisch \cr* endet werden.
Beispiele von verwendbaren anorganischen Verbindungen sind Magnesiumsulfat, Natriumphosphat,
primäres und sekundäres Kaliumphosphat. Eisen(II)-v.jlfat,
Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid.
Zinksulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat.
Wenn die beim Verjähren der Erfindung einzusetzenden
ATCC-Stämme Spuren von essentiellen Nährstoffen, wie Vitamine oder spezielle Aminosäuren,
für hr Wachstum benötigen, werden diese Substanzen (s. die Beispiele) selbstverständlich dem Nährmedium
zugesetzt. Dies erübrigt sich, wenn sie bereits in den Bestandteilen des Nährmediums vorhanden sind. Beispiele
derartiger Nährstoffe sind Asparaginsäure, Methionin und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin oder
Cobalamin.
Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch Schütteln
oder unter Rühren und Belüften im Submcrsverfahren. Man arbeitet bei Temperaturen von etwa
20 bis 400C und einem pH-Wert von etwa 4 bis 9. Vorzugsweise hält man den pH-Wert während der
Züchtung um den Neutralpunkt, um eine hohe Ausbeute zu erhalten. Diese besonderen Temperatur- und
pH-Bedingungen sind jedoch für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung nicht ausschlaggebend.
Nach einer Züchtung von 1 bis 5 Tagen haben sich in dem erhaltenen Kulturmedium gleichzeitig große Mengen
von L-Lysin und i.-Threonin angereichert.
Nach Beendigung der Züchtung kann das erhaltene Kulturmedium konzentriert und getrocknet werden.
Man erhält hierdurch ein an i.-Lysin und L-Threonin
angereichertes Futterzusatzmittel. Gegebenenfalls können die beiden Aminosäuren nach üblichen Verfahren
aus dem Kulturmedium gemeinsam oder einzeln gewonnen werden, z. B. durch Adsorption an einem
Ionenaustauscher, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Absorption oder Chromatographie.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Prozentangaben auf
das Gewicht je Volumen.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl
i.-Threonin als auch !.-Lysin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21488 verwendet.
der durch mutagene Behandlung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Synonym für Micrococcus
glutamicus; vgl. auch USA.-Patentschrift 3 003 925) erhalten wurde. Dieser Stamm, der sowohl gegen das
Threonin-Analoge ,v-Amino-^-hydroxyvaleriansaure,
als auch gegen das Lysin-/.naloge S-(^-Aminoäthyi)-cystein
resistent s;nd methioninabhängig ist, wird 24 Stunden bei 300C i'nter aeroben Bedingungen und
Schütteln in einem Nährmedium der folgenden Zu- ^ainmensetzang gezüchtet: 2 Prozent Glucose, 1 Prozent
Pepton, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid. Dann wird 1 ml der entstandenen
Anzuchtkultur in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkol'oen gegeben, der 10 ml eines Nährmediums der
folgenden Zusammensetzung enthält:
10 Prozent Glucose,
0,05 Prozent K,HPO4,
0,05 Prozent KH2PO1,
2 Prozent (NH4)JSO4,
0,025 Prozent MgSO, · 7 H„O,
0,025 Prozent MgSO, · 7 H„O,
0,001 Prozent FeSO4 · 7 H,Ö,
0,001 Prozent MnSO1 · 4 H2O,
2 Prozent CaCO3,
400 μ§/ίίίβΓ Biotin.
2 mg/Liter Thiamin-hydrochlorid,
400 μ§/ίίίβΓ Biotin.
2 mg/Liter Thiamin-hydrochlorid,
0,5 Prozent enzymatisch aufgeschlossenes Casein.
Der pH-Wert des Nährmediuims beträgt 7,2.
Man züchtet 3 Tage bei 300C unter aeroben Bedingungen
und Schütteln und erhält in dem entstandenen Kulturmedium 5,5 mg i.-Lysin und 9,0 mg
L-Threonin pro ml. Nach dem Entfernen der Zellen der Mikroorganismen und von CaCO3 werden
L-Threonin und L-Lysin aus dem Kulturmedium durch Adsorption an einem Ionenaustauscher gewonnen. Die
Ausbeute an L-Lysin bzw. L-Threonin aus 1 Liter Kulturmedium beträgt 4,4 g bzw. 6,3 g.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicuro ATCC 21649 verwendet.
Dieser Stamm ist sowohl gegen das Threonin-Analoge oc-Amino-jS-hydroxyvaleriansäure als auch gegen das
Lysin-Analoge S-(/J-Aminoäthyl)-cystein resistent. Die
Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispie! 1 durchgeführt.
Die Ausbeute an L-Lysin bzw. L-Threonin beträgt 4,1 mg bzw. 7,8 mg pro ml.
Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl i.-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21650 verwendet.
Dieser Stamm ist sowohl gegen das Threonin-Analoge iH-Amino-/S-hydroxyvaleriansäure als auch gegen das
Lysin-Analoge S-(/J-Aminoäthyl)-cystein resistent und
methioninabhängig. Die Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im
Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute an L-Lysin bzw. 1 -Threonin beträgt 4,6 mg bzw. 6,9 mg pro ml.
Als Anzuchtmikroorganismen werden der L-Lysin erzeugende Stamm Corynebacterium glutamicum
ATCC 21651, der gegen das Lysin-Analoge S-{ß-Aminoälhyl)-cysteii>
resislent ist, und der L-Threonin
erzeugende Stamm Brcvibacterium flaviim ATCC
21269, der gegen das Threonin-Analoge Λ-Amino-/J-hydroxyvaleriansäurc
resistent ist, verwendet. Die
Züchtung wird in der gleichen Weise und unter den
gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt,
jedoch mit der Ausnahme, daß das Nährmedium
gleichzeitig mit diesen beiden Stämmen beimpft wird. Die erhaltenen Ausbeuten an i.-Threonin bzw. ι -Lysin
betragen 3,6 mg bzw. 7,3 mg pro ml.
B e i s ρ i e I 5
Als Anzuchtniikroorganismus wird der suwohl
i.-Threonin als auch i.-Lysin erzeugende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 21488 verwendet. Dieser Stamm wird 24 Stunden bei 30°C unier aerober·
Bedingungen und Schütteln in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: 4 Prozent
Glucose. 2 Prozent Peplon, 0,15 Prozent KH„Pü4,
0.05 Prozent K2HPO4, 0,05 Prozent MgSO4 · 7 H2O1
50 [ig/Liter Biotin und 0,5 Prozent Hefeextrakt. 1 ml der entstandenen Anzuchtkultur wird in einen 250 ml
fassenden Erlenmeyerkolben gegeoen, der 10 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:
10 Prozent Rohrzuckerschwarzmelasse( berechnet als Glucose)
2 Prozent Sojabohnenkuchenhydrolysat
(erhalten durch Aufschließen mil Ct. H2SO4 und Neutralisieren mit wäßrigem
Ammoniak; berechnet als Sojabohnenkuchen vor dem Aufschluß),
0,3 Prozent Harnstoff,
0,05 Prozent MgSO4 ■ 7 H,O,
OX7 Prozent KH2PO4,
3 Prozent CaCO3.
Der pH-Wert des Nährmediums beträgt 7,2.
Man züchtet 3 Tage bei 30 C unter aeroben Bedingungen und Schütteln. Die Ausbeute an gebildetem
und in dem entstandenen Kulturmedium angereicherten L-Lysin bzw. i.-Threonin beträgt 10,3 mg bzw.
15,2 mg pro ml.
Wie aus den Beispielen 1 bis 5 hervorgeht, erhält man beim erlindungsgemäßen Verfahren bei 72stündiger
Züchtung 4,1 bis 10,3 mg L-Lysin pro ml und 3,6 bis 15,2 mg J.-Threonin pro ml, während man nach
ίο dem Verfahren der deutschen Offenlegungsschrift
1 90', 162, wie aus dem dortigen Beispiel 1 hervorgeht, nur 3,97 mg L-Lysin und 2,35 mg i.-Threonin pro ml
erhält. Außerdem beträgt nach dem Verfahren der genannten Offenlegungsschrift die Menge der beiden
Aminosäuren L-Lysin und L-Threonin nur etwa 13 Prozent der insgesamt gebildeten Aminosäuremenge,
während diese beiden Aminosäuren beim Verfahren der Erfindung etwa 81 Prozent der insgesamt
gebildeten Aminosäuren ausmachen. Im erfindungsgemäßen
Verfahren werden somit die beiden genannten Aminosäuren praktisch als Hauptprodukt
gebildet und lassen sich deshalb sehr leicht isolieren. Außerdem ist im Verfahren der deutschen Offenlegungsschrift
1 903 162 die Verwendung von CeIIulose ein wesentliches Merkmal; insbesondere werden
Cellulosestreifen und -säcke dem Züchtungssystem zugegeben, um die vorerwähnten Ausbeuten zu erreichen.
Demgegenüber ist beim erfindungsgemäßen Verfahren kein Cellulosezusatz notwendig, was einen
wesentlichen Vorteil gegenüber dem Verfahren der genannten deutschen Offenlegungsschrift darstellt.
Claims (2)
1. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von an !.-Threonin nur 0,3 mg, jeweils pro ml Fermen-L-Threonin
und L-Lysin auf biotechnischem Wege 5 tationsmedium (vgl. L. E. E r ι c s ο ηι und \\ . O
durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen in Kurz in .»Biotechnol. Bioeng.«, 4 [ly&ZJ. 5. _j undeinem
wäßrigen. Kohlenhydrate, Stickstoffquellen, 37). .. .
Mineralsalze und andere Nährstoffe enthaltenden In der deutschen Ofrenlegungsscn.nit 1 Ab 16_ ist
Nahrmedium bei Temperaturen von etwa 20 bis ein Verfahren zur gleich/eiligen Herstellung \on -.er-40cC
und bei einem pH-Wert \on etwa 4 bis 9, io schiedenen extrazellulären Aminosäuren darunter
dadurch gekennzeichnet, daß man auch i.-Lysin und L-Threon.n durch Züchtung von
einen Mikroorganismus aus der Gruppe von Micrococcus ceriticans ATCC 14987 in einem Koh-Corynebacterium
glutamicum ATCC21488,-ATCC lenwasserstoffe enthaltenden Nahrmedium in Gegcn-21649
und-ATCC 21650 oder daß man die beiden wart von Cellulose beschrieben. Wie in labehell
Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum 15 dieser Offenlegungsschrift angegeben, betragen die
ATCC 21651 und Brevibacterium flavum ATCC Ausbeulen nach 72stündiger Züchtung nur 3.9, mg
21269 in Mischkultur einsetzt. i.-Lysin und 2,35 mg i.-Threonin pro ml.
2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekenn- Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren
zeichnet, daß man den pH-Wert des Kultur- zur gleichzeitigen Herstellung der beiden Aminosäuren
mediums während der Züchtung auf etwa 7,0 hält. 20 L-Threonin und 1 -Lysin auf mikrobiologischem Wege
zu schaffen, das die Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet, das wirksam und verhältnismäßig ein-
[ach jn technischem Maßstab und mit niedrigen
Kosten durchgeführt werden kann und insbesondere
25 eine hohe Ausbeute an den beiden Aminosäuren
Es ist bekannt, daß die Aminosäuren L-Lysin und ergibt. Die Erfindung löst diese Aufgabe.
i.-Threonin in Getreideproteinen in unzureichender Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren
Menge vorhanden sind und daß der Nutzeffekt dieser zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und
Getreideproteine durch eine Anreicherung mit diesen i.-Lysin auf biotechnischem Wege durch aerobe Züchbeiden
Aminosäuren beträchtlich erhöht wird. Weiter- 30 Hing von Mikroorganismen in einem wäßrigen, Koh-
hin ist bekannt, daß L-Lyr>in und L-Threonin zur Er- lenhydrate, Stickhtoffqucllen, Mineralsalze und andere
höhung des Nährwerts von Nahrungsmitteln oder als Nährstoffe enthaltenden Nahrmedium beim Tempe-
Zusatz zu Futtermitteln erhebliche Bedeutung haben. raturen von etwa 20 bis 40°C und bei einem pH-Wert
In der USA.-Patentschrift 2 979 439 ist ein Verfah- von etwa 4 bis 9, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
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Legal Events
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |