DE1517837C - Verfahren zur biochemischen Herstellung von delta-(N-Acetyl)-L-Ornithin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Paräcolobactrum coliforme ATCC 21031 in Citrullin oder Arginin und mindestens ein Pyrimidin oder einen Pyrimidin-Vorläufer als notwendige Wachstumsstoffe enthaltenden Nährmedien ansonsten üblicher Zusammensetzung bei üblichen Bedingungen züchtet.

o-(N-Acetyl)-L-Oniithin ist als Aminosäuiebestandteile von bestimmten spezifischen Pflanzen bekannt, jedoch wurde bisher kein Verfahren zur industriellen Herstellung desselben in der Praxis erfolgreich ausgeführt. Dies bedeutet einen großen Nachteil insofern, als <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin als brauchbares Süßungsmittel als auch als Bestandteil verschiedener Nahrungsstoffe, Medizinen u. dgl. wertvoll ist. Auf Grund der vorliegenden Erfindung ergibt sich die Herstellung durch einen bestimmten Mikroorganismen, so daß r5-(N-Acetyl)-L-Ornithin in der Fermentationsflüssigkeit gebildet und angesammelt wird. Es ist völlig neu, daß i5-(N-Acetyl)-L-Orn.ithin bei einem Fermentierverfahren mit einem Mikroorganismen in der Fermentationsflüssigkeit gebildet wird.

Somit kann zum ersten Mal die Herstellung von i%(N-Acetyl)-L-Ornithin im Industriemaßstab mit den sich daraus ergebenden wirtschaftlichen Vorteilen durchgeführt. Darüber hinaus werden bei dem vorliegenden Verfahren in der Fermentationsflüssigkeit niemals racemische Verbindungen gebildet, wie das bei den synthetischen Herstellungsverfahren üblich ist, und es wird nur die L-Förm des <%(N-Acetyl)-Derivats gebildet. Darüber hinaus ist es sehr einfach, das gewünschte Produkt aus der Fermentationsflüssigkeit zu gewinnen, da nur kleine Mengen an L-Ornithin sich im Kulturmedium als Nebenprodukt bilden. Da die im Vergleich zur Menge an <HN-Acetyl)-L-Ornithin gebildete Menge an L-Ornithin nur sehr klein ist und da auch <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin eine neutrale Substanz ist, läßt sich die Isolierung und Gewinnung dieser Substanz sehr einfach bewirken.

Der erfindungsgemäß verwendete Paräcolobactrum coliforme ATCC 21031 wurde durch Ultraviolettbestrahlung des Stammes Paracolobactrum coliforme erhalten, wobei der letztere Stamm gut bekannt ist, dessen bakteriologische Eigenschaften in Bergey's »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, 1957, S. 348, beschrieben sind. Paracolobactrum coliforme ATCC 21 031 unterscheidet sich von seinem Elternstamm insofern, als er Citrullin (welches auch durch Arginin ersetzt werden kann) und Pyrimidine, welche auch durch Pyrimidinvorläufer ersetzt werden können, für sein Wachstum benötigt. Somit ist der genannte Mutantenstamm ein Mikroorganismus mit Nährstoffmangelerscheinung gegenüber dem Eltern-. stamm. Tabelle I zeigt die für den Mutantenstamm Paracolobactrum coliforme ATCC 21 031 signifikanten Nährstofferfordernisse.

.

Tabelle I

Mutantenstamm Paracolobactrum coliforme

■ ATCC 21 031

Nährstoff bedürfnis: Citrullin oder Arginen und Pyrimidine wie Uracil, Uridin, Cyto

sin, Cytidin oder Carbamylasparaginsäure

Hinsichtlich der Zusammensetzung des für Para-

ao colobactrum coliforme ATCC 21 031 anzuwendenden Nährmediums sind sowohl synthetische als auch natürliche Nährmedien geeignet, solange sie die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des Mikroorganismus enthalten. Derartige Nährstoffe sind an

as sich bekannt, und hierzu gehören Substanzen wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl. sowie die für den angewandten Organismus wesentlichen Nährstoffe in geeigneten Mengen. So seien als Kohlenstoffquellen hier z. B.

aufgeführt: Glucose, Glyzerin, Fructose, Mannose, Galactose, Rohrzucker, Maltose, Lactose, verzuckerte Stärkelösung und Melassen. Die Kohlenstoffquelle kann aus einer einzigen dieser Substanzen oder aus Gemischen von zwei oder mehr bestehen. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumkarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat u. dgl., andere geeignete Nitrate, Harnstoff oder andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Bouillon, Kaseinhydrolysate, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Fischmehl, lösliche Brauereirückstände u. dgl., verwendet werden. Die Stickstoffquelle kann ebenfalls eine dieser Substanzen oder eine Kombination von zwei oder mehr derartiger sein. Anorganische Verbindungen, die zu dem Kulturmedium zugegeben werden können, umfassen Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Natriumchlorid sowie andere wasserlösliche Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, Nickel, Molybdän, Zink, Kobalt, Kupfer, Chrom

u. dgl., beispielsweise Magnesiumsulfat, Calciumkarbonat, Mangansulfat u. dgl.

Es ist auch hotwendig, zu dem Nährmedium Nährstoffe wie Aminosäuren und die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Pyrimidinsubstanzen zuzusetzen. Diese Nährstoffe können entweder durch Verwendung der reinen Stoffe oder durch Verwendung von Nährstoffen, in denen sie enthalten sind, beispielsweise natürliche organische Stickstoffquellen, geliefert werden. Für den Paracolobactrum coliforme ATCC 21 031 werden sowohl Citrullin als auch Arginin als; Aminosäurennährstoff und auch Pyrmidine (UraciL Uridin, Cytosin, Cytidin u. dgl.) dem Nährmediurr zugegeben. Arginin kann dem Nährmedium in Forrr eines aminosäurenhaltigen Materials, wie Bouillon Pepton, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysat, Hefe extrakt oder Gluten- oder Sojabohnenmehl-Hydro

lysat, aus dem die Glutaminsäure entfernt, ist oder als Hydrolysate von Fischmehl; Sojabohnenflecken, Kokons oder Fermentationsrückständen zugegeben werden. Die Pyrimidine oder deren Vorläufer können dem Kulturmedium in Form von hukleinsäurehaltigen Materialien, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt oder Bouillon, zugefügt werden. Somit können die hier aufgeführten Stoffe als Quelle für z. B. Arginin oder für die erforderlichen Pyrimidine oder deren Vorläufer verwendet werden.

Das Fermentierverfahren gemäß der Erfindung wird unter Aerobbedingungen, beispielsweise unter aerobem Schütteln oder durch Belüftung und Rühren bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40° C, vorzugsweise 28 bis 37°C durchgeführt. Der pH-Wert zeigt eine Neigung zum Abfallen während der Züchtung, und es ist notwendig, den pH-Wert auf einen Wert im Bereich von 5,5 bis 8,5 durch Verwendung geeigneter Neutralisiermittel am Beginn der Züchtung oder während der Züchtung einzustellen, damit eine hohe Ausbeute des Produktes erhalten wird. Zu den zu diesem Zweck verwendbaren Neutralisiermitteln gehören Alkalien, wie wäßriges Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd u. dgl., oder Verbindungen, wie Ammoniumkarbonat, Calciumkarbonat, Calciumhydroxyd u. dgl.

Die Kultivierung.wird im allgemeinen während 3 bis 5 Tagen fortgeführt. Während dieser Zeit sammeln sich bemerkenswerte Mengen an (5-(N-Acetyl)-L-Ornithin in der Fermentationsflüssigkeit an.

Nach beendeter Fermentierung kann das <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin aus dem Fermentationsfiltrat durch übliche Maßnahmen, beispielsweise Behandlung mit einem Ionenaustauschharz, Extraktion mit Lösungsmitteln sowie nach anderen physikalischen oder chemischen Verfahren, wie sie im allgemeinen zur Abtrennung und Reinigung von <$-(N-Acetyl)-L-Ornithin angewandt werden, abgetrennt werden. Das im folgenden Absatz beschriebene Verfahren mit einem Ionenaustauschharz kann mit Vorteil zur Abtrennung und Reinigung des <5-(N-Acetyi)-L-Ornithinproduktes verwendet werden.

Eine Fermentationsflüssigkeit, aus der die Bakterienzellen entfernt wurden, wurde in Berührung mit einem stark sauren Kationenaustauschharz (NH₄-Typ) gebracht. Anschließend wurde das <5-(N-Acetyl)-L-0rnithin m't Wasser eluiert, wobei vorteilhafter Gebrauch von den äußerst schwachen Adsorbtionseigenschaften von <3-(N-Acetyl)-L-Ornithin gemacht wurde. Infolgedessen wird ö-(N-Acetyl)-L-Ornithin mit Wasser aus der Kollone entfernt, während das Nebenprodukt t-Ornithin auf dem Ionenaustauschharz adsorbiert bleibt. Wie vorstehend ausgeführt, kann die (5-(N-Acetyl)-L-Ornithin enthaltende Lösung dann verschiedenen ... physikalischen oder chemischen Verfahren zur weiteren Abtrennung und Reinigung des 5-(N-Acetyl)-L-Ornithins unterworfen werden. Beispielsweise wird die vorstehend aufgeführte Eluierflüssigkeit, d. h. die das £-(N-Acetyl)-L-Ornithin enthaltende Lösung auf einen sauren pH-Wert eingestellt, in Berührung mit einem stark sauren Kationenaustauschharz (Η-Typ) gebracht und mit wäßrigem Ammoniak eluiert, nachdem mit Wasser gewaschen wurde. Die das f5-(N-Acetyl)-L-Ornithin enthaltenden Eluierfraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und der Abkühlung durch Stehenlassen nach Zugabe von geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, beispielsweise Methanol, Äthanol, n-Butanol u. dgl., überlassen. Dabei werden die Kristalle von 0-(N-Acetyl)-L-Ornithin erhalten. Gewünschtenfalls können die Kristalle weiterhin durch Umkristallisation gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Falls nichts anderes angegeben, sind die Prozentsätze GewichtS'/Volumprozent.

B eis pie! I

Paracolobactrum coliforme ATCC 21 031 wurde in ίο ein Nährmedium gebracht, das aus 2% Glucose, 1% Ammbniumsulfat, 0,3% Harnstoff, 2% Maisquellwasser, 400|i.g/ml Uracil und 1% CaCO₃ bestand. Die Züchtung wurde dann unter aerobem Schütteln während 24 Stunden ausgeführt. Die Kultur wurde als Impfkultur bei der nachstehend beschriebenen Fermentierung verwendet.

Mengen von etwa 5% der Impf kultur wurden zu einzelnen konischen Kolben von 250 ml gegeben, die jeweils; 20 ml eines Nährmediums von folgender Zur ao sammensetzung enthielten:

7% Glucose. ,

200 μg/ml Arginenhydrochlorid"
300 g/ml Uracil -

1,6% Ammoniumchlorid

0,15% KH₂PO₄

0,05% K₂HPO₄

0,05% MgSO₄-7H₃O

0,001 % FeSO₄ · 7H₂O '
0,002% MnSO₄-4H₂O

2% CaCO₃

Der pH-Wert des Fermentiermediums betrug 7,2. Die das Fermentiermedium enthaltenden Kolben wurden vor der Zugabe der Impf kühlflüssigkeit sterilisiert.

Die Züchtung wurde mit aeroben Schütteln der

Kultur bei 28° C während 5 Tagen durchgeführt. Die dabei erhaltene Durchschnittsmenge an <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin betrug in der Fermentationsflüssigkeit 4,5 mg/ml. Die Menge des Nebenproduktes L-Ornithin betrüg 1,3 ms/ml im Durchschnitt.

Nach beendeter Züchtung wurden die einzelnen Fermentationsflüssigkeiten aus jedem Kolben vereinigt, wobei ein Gesamtvolumen von ungefähr 11 erhalten wurde. Die Bakterienzellen wurden entfernt und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene bakterienfreie Lösung wurde auf eine mit"500 ml eines stark sauren Kationenaustauschharzes (NH₄-Typ) gepackte Ionenaustauschkolonne gegossen, und anschließend wurde Wasser durch diese Kolonne geführt, wobei die erhaltene Flüssigkeit gesammelt und auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt wurde. Die aus der Kolonne erhaltene Lösung wurde auf eine andere mit einem stark sauren Kationenaustauschharz H-Typ gepackte Kolonne gegossen und die nicht adsorbierten Substanzen durch Auswaschen mit Wasser entfernt, während der adsorbierte Anteil anschließend mit wäßrigem 2 η-Ammoniak eluiert wurde. ^L
Durch Unterteilen des erhaltenen Eluäts in 50-ml-Fraktionen und Vereinigung nur der auf ninhydrinpositiven Fraktionen und Einengen dieser unter vermindertem Druck, worauf hierzu die dreifache Menge des erhaltenen Volumsns an 98%ig3n Äthanol zur Auskristallisation des r5-(N-Acetyl)-L-Orn".thins zügegeben wurde, wurden.2,8 g roher Kristalle an ό-(Ν-Acetyl)-L-Ornithin erhalten. Die rohen Kristalle wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst, mittels Aktivkohle entfärbt und dann umkristallisiert. Die wesent-

lichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der .dabei erhaltenen Kristalle sind' folgende:

• Tabellen

*i (c = 1,5 n-HCl) Versuchswert

24,8

Werte erhalten durch
Elementaranalyse

C. 47,92⁰/₀

H 8,O5°/_O

N ... 16,00%

Literaturwert 24,0

48,3 %

8,0% 16,1 °/o

ATCC 21 031. erhalten wurden, wobei 0,5 °/₀ Pepton, 1,0% Maisquellwasser oder 0,7% Bouillon zu dem vorstehend aufgeführten Fermentierungsmedium als Argininquelle zugegeben worden war.

TabellelU

Weiterhin wurden beim Vergleich der papierchromatographischen Wanderung dieser Substanz bei den Lösungsmittelsystemen Butanol-, Essigsäure-, Wasser, Lutidin-Collidin (wassergesättigt), Phenol-Wasser und Äthanol-Wasser-Harnstoff, Rt-Werte von 0,47, 0,17, 0,84 und 0,64 erhalten. Diese Werte sind identisch mit den Rf-Werten für das Standardmaterial. Weiter- -hin ist auch das erhaltene Infrarotabsorptionsspektrum völlig identisch mit dem in der Literatur für ö-(N-Acetyl)-L-Ornithin angegebenen. Weiterhin wurden in einer Hydrolysatlösung der erhaltenen Kristalle, die durch Behandlung derselben mit verdünnter Schwefelsäure erhalten worden war, L-Ornithin und Essigsäure nachgewiesen.

Somit werden praktisch reine Kristalle von ö-(N-Acetyl)-L-Ornithin wirksam unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten.

B'ei.-spie-l .2

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Fermentierungsmedium die folgende Zusammensetzung hatte:

. 8% Glucose
300 μg/ml Uracil
2°/o Ammoniumsulfat
0,15% KH₈PO₄
0,05% K₂HPO₁
0,05% MgSO₄-7H₂O
2% CaCO₃

Der pH-Wert des Fermentiermediums betrug 7,2.

Aus der nachfolgenden Tabelle III ergeben si;h die Mengen an <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin und L-Ornithin, die bei der Züchtung von Paracolobactnim coliforme

: Zugabe zu dem Fermentierungsmedium ■'	<5-(N-Acetyl)- ' · L-Qrnithin ·'"·' gebildet	L-Ornithin ., gebildet
Maisquellwasser (1,0%) Pepton (0,5%) Bouillon (0,7%)	10,8 mg/ml 12,0 mg/ml 2,3 mg/ml	0,8 mg/ml 0,5 mg/ml 0,7 mg/ml

Es ergibt sich daraus, daß große Mengen von <5-(N-Acetyl)-L-Ornithin, insbesondere bei Verwendung von" Maisquellwasser oder Pepton gebildet werden, wobei nur sehr geringe Mengen an L-Ornithin als Nebenprodukt erhalten werden.

B ei sp i el 3

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 und mit dem gleichen Mikroorganismus ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zusammensetzung des Fermentiermediums folgende war:

14% Glucose
0,15% KH₂PO₄
0,05% K₂HPO₄
0,05% MgSO₄-7H₂O
1,7% Ammoniumsulfat
3% CaCO₃

Der pH-Wert des Kulturmediums betrug 7,2.

Die Mengen an 0-(N-Acetyl)-L-Ornithin im Kulturmedium bei Züchtung in Anwesenheit von 1,0 % Maisquellwasser, 0,75% Hefeextrakt oder 1,0 % Bouillon als Quelle für das erforderliche Arginin und die Pyrimidine sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

40 . Tabelle IV	<HN-Acetyl)- L-Ornithin gebildet	L-Ornithin -gebildet
Zugabe zu dem Fermentierungsmedium	4,4 mg/ml 5,3 mg/ml 3,3 mg/ml	0,8 mg/ml 0,4 mg/ml 0,2 mg/ml
45 Hefeextrakt (0,75%) .. Maisquell wasser (1,0%) Bouillon(1,0%) ......

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biochemischen Herstellung von i5-(N-Acetyl)-L-Ornithin, dadurch gekennzeichnet, daß man Paräcolobactrum coliforme ATCC 21 031 in Citrullin oder Arginin und mindestens ein Pyrimidin oder einen Pyrimidin-Vorläufer als notwendige Wachstumsstoffe enthaltenden Nährmedien ansonsten üblicher Zusammensetzung bei üblichen Bedingungen züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyrimidin Uracil, Uridin. Cytosin oder Cytidin zugesetzt wird.