DE1767612C - Verfahren zur Herstellung von 5-Dehydroshikimisäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen - Google Patents

Description

Pie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5-Dehydroshikimisäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen. 5-Dehydroshikimisäure kann sowohl als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von aromatischen Aminosäuren als auch als Medikament verwendet werden; es wird erwartet, daß ihr Gebrauch in Zukunft stark zunehmen wird. Der Grund hierfür besteht darin, daß 5-Dehydroshikimisäure von lebenden Körpern als Vorstufe in der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren benutzt wird, die in Proteinen und p-Aminobenzoesäure, die zur Vitamin B-Gruppe gehört, enthalten sind.

Frühere Forscher haben berichtet, daß 5-Dehydroshikimisäure durch Züchten von Escherichia coli (J. Am. Them. Soc, 75, S. 5567 [1953]) und Neurospora (Biochem. J. 68, S. 168 [1958]) gebildet wird. Fs wurde jedoch berichtet, daß Escherichia coli nur 100 bis 200>'/ml dieser Substanz speichern kann; bezogen auf die in das Nährmedium eingebrachte Kohlenstoffquelle entspricht dies einer Ausbeute von maximal 4°/„. Bei der Verwendung von Neurospora wurde Dehydroshikimisäure chromatographisch nachgewiesen; quantitative Ergebnisse wurden nicht angegeben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von 5-Dehydroshikimisäure mit höherer Ausbeute anzugeben.

Ausgehend von der Herstellung von 5-Dehydro-Miikimisäure durch aerobes Züchten von Mikroerzeugnissea in einem flüssigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen besteht die Erfindung darin, daß man Corynebacterium glutamicum ATCC 21 179 als Mikroorganismus einsetzt.

Eine Kultur des erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismus ist ohne Einschränkung der Öffentlichkeit zugänglich gemacht worden in der »American Type Culture Collection«, in der er als ATCC 21 179 identifiziert ist. Wie bereits oben festgestellt wurde, beträgt die Ausbeute an 5-Dehydroshikimisäure bei der bekannten Verwendung von Escherichia coli maximal 4ⁿ/_n. Unter Einsatz von Corynebactcrium glutamicum ATCC 21 179 wird eine um praktisch 50"I_n erhöhte Ausbeute erzielt.

Das Nährmedium enthält eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquclle. anorganische Substanzen und verschiedene andere Nährstoffe.

Als Kohlenstoffquelle wird im Nährmedium bevorzugt Glukose verwendet, aber auch andere ähnliche Kohlenstoffqucllen, wie z. 13. Frukto.se, Mannose, Cialaktose. Maltose, Saccharose, Stärkehydrolysat. Melasse. Glycerin, Essigsäure u. dgl. können allein oder im Gemisch verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können sowohl organische als liuch anorganische Verbindungen, wiez. [J.Ammoniak. Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Ammoniumsalze verschiedener anderer organischer Säuren u. dgl. Verwendung finden.

Anorganische Substanzen, welche in dem Nährmedium enthalten sein können, sind verschiedene Salze des Eisens, Mangans, Magnesiums, Kobalts, Zinks, Nickels, Chroms u. dgl. ebenso wie verschiedene Phosphorsäureverbindungen.

Als weitere Nährstoffe können dem Nährmedium auch wenigstens eine Aminosäure (z. B. Cystin, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin* Tryptophan, Glutaminsäure, Alanin und andere) und Vitamine (wie z. B. p-Aminobenzoesäure, Biotin, Thiamin, Pantothensäure u.dgl.) zugesetzt werden. Als nährstoffhaltige Materialien können auch noch Hefeextrakt, Sojabohnenmehl-Hydrolysatlösung, Maisquellwasser, Pepton, Proteinhydrolysat, Fleischextrakt, ein Hydrolysat mikrobieller Zellen, ein Fischeiweißhydrolysat u. dgl. Verwendung finden.
Die 5-Dehydroshikimisäuregärung wird unter aero-

iQ ben Bedingungen durchgeführt. Die Zuchttemperatur liegt bei 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei 27 bis 37° C. Da das pH des Nährmediums die Neigung zeigt, während der Fermentation zu sinken, ist es vorteilhaft, den pH-Wert mit einem geeigneten Neutmlisationsmittel auf 5,5 bis 7,2 einzustellen, um eine hohe Ausbeute zu erzielen.

Als Neutralisationsmittel können Alkalien wie z. B. Ammoniak, Natrium- oder Kaliumhydroxid verwendet werden. Es ist auch möglich, für diesen Zweck

ίο Ammoncarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxid, Harnstoff u. dgl. zu verwenden. Nach 3- bis otägigem Züchten ist 5-Dehydroshikimisäure angehäuft.

Nach dem Züchten werden die mikrowellen Zellen z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus dem Fermentationsmedium entfernt, und das Filtrat wird nach einer geeigneten Methode behandelt, z. B. durch Aktivkohle-Adsorption, Behandlung mit einem ionenaustauscherharz oder durch organische Lösungsmittel-Extraktion — einfach oder kombiniert —, um eine

3" 5-Dehydrcshikimisäure-Lösung zu erhalten. Die 5-Dehydroshikimisäure kann durch Konzentration unter reduziertem Druck und Kristallisation gewonnen werden. Die Kristalle des gewünschten Produktes werden auf übliche Weise abgetrennt.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Saatkultur des Corynebacterium glutamicum ATCC 21 179 wurde erhalten, indem ein Nährmedium, welches Pepton (1 g/dl), Fleischextrakt (1 g/dl). Hefeextrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und Glukose (2 g/dl) enthielt und ein pH von 7,0 aufwies, mit diesem Mikroorganismus beimpft und die Züchtung 24 Stunden fortgesetzt wurde.

Die Fermentation wurde ausgeführt .inter Verwendung eines Fermentationsmediums, das Glukose (10g/d!;, Ammonchlorid (0,5 g/dl). Ammonsulfat (1,5 g/dl). KH₂PO₁ (0,15 g/dl), K₂HPO, (0.05 g/dl). MgSO₄ · 7 H₂O (0,05 g/dl), FeSO₄ · 7 H₂O (0.002 g dl). MnSO, · 4 H₂O (0,002 g/dl), Phenylalanin (200>'/ml). Biotin (30)'/l) und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt. Portionen von je 20 ml des so hergestellten Mediums wurden in getrennte 500-ml-Sakagiici-Kolbcn eingebracht, und jeder Kolben wurde sterilisiert. Das s'.erile Fermentationsmedium in jedem der Kolben wurde mit I ml der Saatkultur beimpft. Die Fermentation wurde in 4Tagen unter Schütteln bei 28⁰C durchgeführt. In jedem Kolben wurde im Medium durchschnittlich 4,13 mg 5-Dehydroshikimisäure/ml angesammelt. Die Fermentationsmedien wurden dann vereinigt (1 I insgesamt) und zur Entfernung der mikrowellen Zellen filtriert. Das Filtrat wurde mit HCi auf ein pH von 3,0 eingestellt. Es wurden 500 g Aktivkohle zugesetzt, und os wurde gerührt, um so 5-Dehydroshikimisäure zu adsorbieren. Die adsorbierte 5-Dehydroshikimisäure wurde mit 98°/jgem Äthanol eluiert, und das Eluat

wurde unter reduziertem $ruck bei etwa 45°C konzentriert.

Der konzentrierte Sirup wurde mit 100 ml 98%igem Athanoi versetzt und der dabei entstehende Niederschlag durch Filtration abgetrennt. Nachdem das Athanoi abgedampft war, wurde der entstandene Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und eine kleine Menge 98°/_oiges Äthanol zugefügt. Durch Stehenlassen ließ man die erhaltene Lösung abkühlen und erhielt 1,83 g Rohkristalle von 5-Dehydroshikimisäure. Der Schmelzpunkt des umkristallisierten Produktes lag bei 150 bis 151,5°C. Das UV-Adsorptionsspektrum und der Rf-Wert bei der Papier-Chromatographie waren identisch mit denen, die bei den ersten Berichten genannt waren. Reduktion von ammoniakalischem Silbernitrat und Fehling-Reagens Sowie die Bildung von 2,4-DinitrophenyI-hydrazon wurden ebenfalls beobachtet. Die Bildung von Protecatechusäure wurde durch Lösen in konzentriertem HCl bei einer Konzentration von 1 g/dl und Erhitzen auf JOO⁰C beobachtet.

Beispiel 2

Wiederholte Vergärungen vurden in ähnlicher Weise ausgeführt wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch das Fermentationsmedium Glukose (10 g/dl), Ammonsulfat (1,5 g/dl), Ammonchlorid (0,5 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₁ · 7 H₂O (0,05 g/dl), FeSO₁ ■ 7 H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ · 4H₂O (0.002 g/dl), Biotin (30y/J) und CaCO₃ (2 g/dl) und

.4

außerdem Hefeextrakt, Fleischextrakt, NZ-Amin, Mieki oder Peplon enthielt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:

Tabelle

Zusatzston*	Zugesetzte Menge (g/dl)	Menge an erzeugter 5-Dehydro- shikimisäure (mg/ml)
Hefeextrakt Fleischextrakt NZ-Amin*) Mieki**) Pepton kein	1,0 2,0 0,25 1.5 0,25	5,82 4,83 2,31 4,92 5,12 1,8

NZ-Amin ist ein handelsübliches Caseinhydrolysal.
Mieki ist ein handelsübliches Produkt, welches aus der Rückstandslösung eines Glutans oder eines Sojabohnenmehlhydrolysats besteht, aus welchem die Glutaminsäure extrahiert worden ist.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 5-Dehydroshikimisäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum ATCC 21 179 einsetzt.