DE1767612A1 - Verfahren zur Herstellung von 5-Dehydroshikimisaeure durch Vergaerung - Google Patents

Description

, den 27, Mai I968 Patentanmeldung 30/GI-)

KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI KAISrtA No, 4, 1-chome, Ohtemaohi, Chiyoda-ku, Tokyo/Japan

Verfahren zur Herstellung von ^-Dehydroshikimisäure durch

Vergärung

5-Dehydroshikimisäure ist sowohl als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von aromatischen .Aminosäuren als auch als Medikament zu verwenden, und es wird erwartet, daß sein Gebrauch sich in Zukunft auch noch vergrößern wird, Pas ist der Grund dafür, daß 5-Dehydroshikimisäure von lebenden Körpern als Vorstufe in der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren benutzt wird, die in Proteinen und p-Aminobenzoesäure, die zur Vitamin B-Gruppe gehöht, enthalten sind·

Früba?e Forscher haben berichtet, daß 5~Dehydroshikimisäure durch Züchten von Escherichia coli JJj. Am. Chem. Soc., 75» 5567 (1953)J und. Neurospora [Biochem. J· 68, 168 (1958 )J gebildet wird. Es wurde jedoch berichtet, daß E, coli nur 100-200f·/ml der Substanz speichern kann.

Demzufolge ist ein Gegenstand der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von 5-I>ehydroshikimisäure vorzusehen, wobei eine größere Anhäufung derselben in der Zuchtbrühe erfolgt«

Ein weiterer Gegenstand ist, ein Verfahren zur Gewinnung von 5-Dehydroshikimisäure vorzusehen, welches in der Wirkung ökonomisch und für eine kommerzielle Bearbeitung höchst geeignet ist.

Wir haben gefunden, daß eine größere Anhäufung von 5-Deh,ycuj3hikimieäure erhalten werden kann, indem man einen KLiLt-'oprgdniiimua des Gecae Corynebacteriun in einem Zuchta<3di.;ua züchtet, dar eine Kohlenetoff- und eine S tickst off quelle, ca.niJ'jb«» Substfu^eu und verschiedene andere Nährstoffe

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Ein besonders geeigneter Mikroorganismus zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der B-032-Stamm, eine "utante des Gor^nflbacteriua glutamlcun ( syn. Micrococcus glutamicus, offenbart in der japanischen Patentschrift Ko. d698/1967 ). Bine Kultur dieses Organismus ist ohne Einschränkung - wie er hergestellt worden ist - der Öffentlichkeit zugänglich gemacht worden in der "American Type Culture Collection", in der er als ATCC 21,179 identifiziert ist. Neben diesem Stamm sind noch andere ähnliche Typen von Mutanten-Stämmen, die zum Corynebacterium glutamicum gehören^ und die auch in der erfindungsgemäßen Praxis verwendet werden können, entdeckt worden, aber die Menge des in der Zuchtbrühe angesammelten erwünschten Produktes wird in diesem Falle nicht so groß sein wie mit dem B-032-Stamm.

Der B-032-Stamm wird durch UV-Bestrahlung von Corynebacterium glutamicum (syn· Micrococcus glutamicus) MF 121, einem Glutaminsäure-bildenden Stamm, erhalten. Der erhaltene Mutanten-Stamm kann bezüglich seiner Fähigkeit, 5-Dehydroshikimisäure zu bilden, unterschieden werden. Die mikrobiologischen Charakteristiken des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Corynebacterium Klutamicum werden zuerst im " Bulletin of Agricultural Chemical Society of Japan", Bd. 22, 17§ (1958) berichtet, wo es als Micrococcue glutamicus identifiziert ist. Eine ent kürzlich vorgenommene weitere Studie wurde von Kinoshita u. anderen von mikrobiologischen und e Ge sichtspunkt tn aus durchgeführt. Sie berichteten in "imino acids", Bd, 2, 42 (1960) und in " Recent Progress in Microbiology", Bd. 8, 33* (1962), daß der Mikroorganismus zweck mäßig in Corynebaoterium einzustufen ist, und sie bezeichneten diesen KJLkxcatgamismua «le O: /nefeaefctrlum «J^fcamloua. Wie bereits früher festgestellt, kan Β»οο*Λ nur 10O>200γ/ml'an

anMuXen, wenn j · do oh jener Stamm des

Genus Go.gjy^^.iftsri^ erfir- -v^sgemäß verwendet wird, to kann 5»Dehy4roshikjjaisc'ure ⁴n i,.. Medium in einer lonsentration

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von 5 mg/ml oder sogar noch höher angehäuft werden. Dieses betont den hohen vorteilhaften Wert der Erfindung.

Als Kohlenstoffquelle wird in dem Zuchtmedium Glukose bevorzugt verwendet, aber auch verschiedene ähnliche C-Queilen, wie z.B. Fruktose, Mannose, Galaktose, Maltose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Melasse, Glycerin, Essigsäure u. dgl. können allein oder im Gemisch verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können sowohl organische als auch anorganische Verbindungen, wie z.B. Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumsulf#:t, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Ammoniumsalze verschiedener anderer organischer Säuren u. dgl. Verwendung finden·

Als anorganische Substanzen, welche in dem Zuchtmedium enthalten sein können, mögen verschiedene Salze des Eisens, Mangans, Magnesiums, Kobalts, Zinks, Nickels, Chroms u. dgl« ebenso wie verschiedene Phosphorsäureverbindungen erwähnt werden.

Ais ijähratoffe können wenigstens eine Aminosäure ( z.B. Cystin, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Glutaminsäure, Alanin und andere ) und Vitamine ( wie z.B. p-Aminobenzoesäure, Biotin, Thiamin, Pantothensäure u. dgl. ) zugesetzt werden· Hefeextrakt, Mieki ( eine Sojybohnenmehl-Hydrolyeatlöiung, die von der Ajinomoto Co., Ltd· hergestellt wird und auf dem offenen Markt in Japan zugänglich ist ), Maiewasser, Pepton» Proteinhydrolysat, Fleischextrakt, ein Hydrolysat mikrobieller Zellen, ein Fischeiweißhydrolysat u. dgl. können #uch als Mährstoff-haltige Materialien Verwendung finden· :.

^: 91· |-De«ydrothiki«ieäiuregiruB§ wird uAfcer aeroben Bed<5-.· gUfi(«A turofegefüJttfe· Sie Zuchtt«ap«*ßtU£ liegt bei 25-40⁰C, l; vortugflfei·· bei 27-37⁰O. Oa dai p_H der Brüh· dl· Neiguae '■^: eeigt, während der Fermente lion su linken, iet et vorteilhaft, din pjj-Wert mit eine» geeigneten Neutralitationamittel

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auf 5)5 -7»2 einzustellen, um eine hohe Ausbeute zu erzielen. Als Neutralisationsmittel können ein Alkali, wie z.B. Ammoniak, Natrium- oder Kaliumhydroxyd verwendet werden· Es ist auch möglich, für diesen Zweck Ammoncarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd, Harnstoff u. dgl. zu verwenden. Nach 3 - 6-tägigem Züchten ist 5-Dehydroshimisäure angehäuft, jedoch kann unter gewissen Zuchtbedingungen Protocatechusäure als Nebenprodukt gebildet werden.

Nach dem Züchten werden die mikrobiellen Zellen z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus der Brühe entfernt, und das Filtrat wird nach einer geeigneten Methode behandelt, z.B. durch Aktivkohle-Adsorption, Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz oder durch organische Lösungsmittel-Extraktion - einfach oder kombiniert -, um eine 5-Dehydroshikimisäure-Lösung zu erhalten. Die 5-DQhydroshikimisäure kann durch Konzentration unter reduziertem Druck und Kristallisation gewonnen werden, und die Kristalle des gewünschten Produktes werden auf übliche V/eise abgetrennt.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, aber sie sind nicht so aufzufassen, als ob sie diese einschränkten.

Beispiel 1

Ein Zuchtmedium wurde mit Oorynebacterium slutamicum ( syn. Micrococcus glutamicus ) B-032 beimpft, wobei das Zuchtmedium Pepton (1 g/dl), Fleischextrakt (1 g/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und Glukose (2g/dl) enthielt und ein Ptt von 7»0 aufwies. Um eine Saatkultur zu erhalten, wurde die Züchtung 24 Stunden fortgesetzt.

Die Fermentation wurde ausgeführt durch Verwendung eines Zuchtmediums, das Glukose (10 g/dl), Ammonchlorid (0,5 g/dl), Ammonsulfat (1,5 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HlO₄ (0,05 g/dl),

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MgSO₄ . 7 H₂O (0,0i? g/dl), J¹SSO₄ . 7 H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ 4 H₂O (0,002 g/dl), Phenylalanin (200y/ml), Biotin (30ip/l) und CaGO, (2 g/dl) enthielt. Portionen von je 20 ml des so hergestellten Mediums wurden in getrennte 500 ml-Sakagtici-Kolben eingebracht, und jeder Kolben wurde sterilisiert. Das sterile Zuchtmedium in jedem der Kolben wurde mit 1 ml der Saatkultur beimpft, deren Herstellung oben beschrieben war, Die Fermentation wurde in 4 Tagen unter Schütteln bei 28⁰C durchgeführt. In jedem Kolben wurdeji in dem Kulturmedium ein Durchschnitt von 4,13 mg/ml 5-DeJfctydroshikimisäure angesammelt. Die Brühen wurden kombiniert (11 insgesamt) und zur Entfernung der mikrobiellen Zellen filtriert« Das Filtrat wurde mit HCl auf ein Ρττ von 3>0 eingestellt, es wurden 500 g Aktivkohle zugesetzt und gerührt, um so 5-Dehydroshiki<nisäure zu adsorbieren. Die adsorbierte 5-Dehydroshikinisäure wurde mit 98 %ig. Äthanol eluiert, und das Bluat wurde unter reduziertem Druck bei ca. 45⁰C konzentriert. Der konzentrierte Sirup wurde in 100 ml 98 %ig. Äthanol gelöst und der dabei entstandene Niederschlag durch Filtration abgetrennt. Nachdem das Äthanol abgedampft war, wurde der entstandene Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und eine kleine Menge 98 %ig. Äthanol zugefügt. Durch Stehenlassen ließ man die erhaltene Losung abkühlen und erhielt 1,83 g Rohkristalle von 5-Dehydrοshikimisäure. Der Schmelzpunkt des umkristallisierten Produkts lag bei 150-151»5°C. Das UV-Adsorptionsspektrum und der Rf-Wert bei der Papier-Chromatographie waren identisch mit denen, die bei den ersten Berichten genannt waren· Reduktion von ammoniakalisehern Silbernitrat und Fehling-Reagens, sowie die Bildung von 2,4-Dinitro-

α
phenyl-hydrAzon wurden ebenfalls beobachtet. Die Bildung von Proticatechinsäure wurde durch Lösen in konz, HCl bei einer Konzentration von 1 g/dl und Erhitzen auf 100⁰C beobachtet.

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Beispiel 2

Wiederholte Vergärungen wurden in ähnlicher Weise ausgeführt wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß als Grundmedium Glukose (10 g/dl), Ammonsulfat (1,5 g/dl), Ammonchlorid (0,5 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄ . 7 H₂O (0,05 g/dl), PeSO₄ . 7 H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ . 4 H₂O (0,002 g/dl), Biotin (30vy/l) und CaCO₅ (2 g/dl) verwendet wurde, und daß bei jedem Versuch Hefeextrakt, Fleischextrakt, NZ-AmIn, Mieki oder Pepton zugesetzt wurde. Me dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden 2ab#ile ge- . zeigt: . .,_.,

Tabelle

Zusatzstoff

Hefeextrakt

Fleischextrakt

NZ-Amin ^x)

Mieki

Pepton

kein

Zugesetzte Menge an erzeug- Menge an Proto-Menge (g/dl) ter 5-Dehydro- catechusäure, shikimisäure die als Neben-(mg/ml) produkt erzeugt

ist (mg/ml)

1.0

2.0 O.25

1.5 0.25

5.82 4.83 2.31 4.92 5.12 1.8

1.30

Spuren 0.5

XXn

NZ-Amin ist der Handelsname des handelsüblichen Caseinhydrolysats. . ■.'■■.'.

Mieki ist der Handelsname des handelsüblichen Produkts, welches besteht aus der Rückstandslösung eines Glutans oder eines Sojybohnenmehlhydrolysats, aus welchem die Glutaminsäure extrahiert worden ist.

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Claims (7)

1. Pa tentansprüche

   1, Verfahren zur Herstellung von 5-DehydroshikJmisäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein b-Dehydrshikimisäure-erzeugender Mikroorganismus des Genus Corynebacterium in einem Nährboden für Kulturen aerob gezüchtet wird, der eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, anorganisches Material und Nährstoffe enthält, und daß die angesammelte 5-Dehydroshikimisäure aus dem Zuchtmedium gewonnen wird.
2. 2. Verfo nach Anspr. 1, dad. gek., daß der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ist»
3. 3e Verf. nach Anspr. 2, dad. gek., daß der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21,179 ist.
4. 4„ Verf. nach Anspr. 1, dad. gek., daß die Temperatur in dem Zuchtmedium im Bereich von 25-40⁰C gehalten wird.
5. 5. Verf. nach Anspr. 4, dad. gek., daß die Temperatur im Bereich von 27-37°C liegt.
6. 6. Verf. nach Anspr. 1, dad. gek., daß das p^ des Zuchtmediums im Bereich von 5,5 bis 7ϊ2 gehalten wird.
7. 7. Verf. nach Anspr. 1, dad. gek., daß das Züchten 3-6 Tage lang fortgesetzt wird.

   PAe Dr.AndreJewski, Dr.Honke

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