DE1900492A1 - Herstellung von 1-Leucin durch Fermentation - Google Patents
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Description
1900492 Andrejewski & Honke Patentanwälte
α ι. ι. "51 Q^B/K-
Diplom-Ingenieur
Essen, den 3· Januar I969
Kattwiger Straße 36
Patentanmeldung der Firma
Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha,
eine Körperschaft des öffentlichen Rechts
Japans,
No. 4, l-chome-Ohte-Machi, Chiyoda-ku,
Tokyo -to- Japan
Herstellung von 1-Leucin durch Fermentation
1-Leucin wird durch Züchtung eines 1-Leucin produzierenden
Mikroorganismus des Genus Corynebacterium in einem Kultur-Medium gewonnen, welches eine C-Quelle, eine
N-Quelle, anorganisches Material, Nährstoffe und einen Isoleucin-, Methionin-, Phenylalanin oder Valin-Promoter
enthält. Es können auch Promoter-Oemische verwendet werden.
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 301 und 21
sind sfur Verwendung in dem Verfahren besonders geeignete
Mikroorganismen. 1-Leucin ist eine wichtige Aminosäure,
und sie 1st als Nährstoffzusatz zu Lebensmitteln und Futtermitteln für Menschen und Tiere nützlich.
009838/0804
Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße
Frühere Forscher haben berichtet, daß 1-Leucin durch Verwendung
eines Mutanten-Stammes des Micrococcus Qlutamicus (Japanische Patentanmeldung No 14 395/1963) erhalten werden
kann· Es wurde jedoch berichtet, daß der Mutanten-Stamm speziell Valin zu seinem Wachstum erforderlich macht· Über
die dabei anfallende Menge an 1-leucin wurde nichts ausgesagt.
Infolgedessen 1st ein Gegenstand der Erfindung, ein verbessertes Verfahren für die Gewinnung von 1-Leucin vorzusehen.
Ein weiterer Gegenstand ist, ein Verfahren zur Gewinnung von 1-Leucin vorzusehen, welches im Betrieb wirtschaftlich
ist und für eine gewerbsmäßige Bearbeitung geeignet ist. Wir haben gefunden, daß 1-Leucin durch Züchten eines Mikroorganismus
des Genus Corynebacterium in einem Kulturmedium erhalten werden kann, das eine C-Quelle, eine N-Quelle,
anorganische Substanzen, verschiedene andere Nährstoffe und einen Isoleucin-, Methionin-, Phenylalanin oder Valin-Promoter
enthält, Promoter-Gemische können auch verwendet werden· Wie noch besser in den Beispielen beschrieben,ist
es erfindungsgemäß leicht und mit genügender Wiederholbarkeit möglich, 1-Leucin in einer Menge von mehr als Io mg/ml in
der Nährlösung (Zuckerkonzentration: 10 bis 20 g/dl) anzusammeln;
infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Industrielle Produktion sehr geeignet.
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Die Mutanten-Stämme erfordern Nährstoffe, welche sich von den Stämmen, die üblicherweise für die industrielle Fermentation
verwendet werden, und von den Mutanten-Stämmen, von denen in der japanischen Patentanmeldung No, 14 395/1963 berichtet
wurde, unterscheiden. Besonders geeignete Mikroorganismen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Stämme,
welche Mutanten von Coryriebacterium glutamicum ( syn.Micrococcus
glutamicus nach der japan.Patentanmeldung No. 8698/1967)
sind;Kulturen dieses Organismus sind ohne Einschränkung hinterlegt worden, so daß sie der Öffentlichkeit in der "American
Type Culture Collection", in der sie als A T C C 21 301 und 21 335 identifiziert sind, zugängig gemacht sind. Neben diesen
Stämmen sind andere ähnliche Typen von Mutanten-Stämmen, die zu Corynebacterium glutamicum gehören, gefunden worden und
können auch in der Ausführung der Erfindung verwendet werden. A T C C 21 301 und 21 335 werden aus dem 1-Glutaminsäure erzeugenden
Stamm Corynebacterium glutamicum K Y-IO IO8 bzw. MP - 142 durch Behandlung mit N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin
erhalten· Die erhaltenen Mutanten-Stämme können aus
den Mutter-Stämmen wie folgt erhalten werden;
Wenn sie unter Verwendung eines minimalen (minimal) Mediums (berichtet in Amino Acids and Nucleic Acids, 8, 53 (1964) )
in Gegenwart von loo ^ /ml Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Valin oder deren Gemischen in 30 Stunden bei 28° C gezüchtet
werden, so hat ihr Wachstum die folgenden Eigenschaften
(Tabelle 1) :
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kein Zusatz 0,00 - 0,05
Isoleucin 0,11 - 0,15
Methionin 0,16 - 0,20
Phenylalanin 0,16 - 0,20
Valin 0,06 - 0,10
Isoleucin und Phenylalanin > 0,20
Isoleucin, Methionin, Phenylalanin
und Valin ^ 0,20
Es ist aus der Tabelle zu ersehen, daß es möglich ist, die
Stämme in einem "minimal1* Medium ohne Zusatz einer Aminosäure,
jedoch mit einer extrem niedrigen Vermehrungsgeschwindigkeit zu vermehren· Die Promoterwirkung der Aminosäurezusätze
ist klar zu erkennen· Unter den Aminosäuren 1st die Promoterwirkung von Phenylalanin In der früheren Stufe
der Vermehrung am klarsten· Mit anderen Worten ausgedrückt 1st zu erkennen, daß die erhaltenen Mutanten-Stämme zu der
Klasse der Stämme gehören, die einen "relativen Bedarf"
an den Aminosäuregruppen haben·
Die bakteriologischen Eigenschaften des Corynebaoterium
glutamicum sind im Lichte des Berichtes in the Journal of General and Applied Microbiology, Band 18, 279-301 (1967)
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wohl bekannt. Nach diesem Bericht schließen die Mutanten-Stämme,
die die vorerwähnten Eigenschaften haben, z.B. jene ein, die von Mutter-Stämmen stammen, die imstande sind, 1-Glutaminsäure
zu produzieren und die in Microooccus-, Brevibacterium-,
Corynebacterium- und Mlcrobacterium-Oruppen
aufgeteilt sind.
Das Kulturmedium, das für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden kann, schließt jedes beliebige und alle synthetischen
oder natürlichen Medien ein, die geeignete Mengen an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, anorganische Substanzen
und andere Nährstoffe enthalten. Als C-Quelle wird in dem Kultur-Medium vorzugsweise Glukose verwendet, aber
verschiedene ähnliche C-Quellen, wie Iftiktose, Mannose,
Galaktose, Maltose, Saccharose, Stärke-Hydrolysat, Melasse,
Glycerin, Essigsäure u.dgl. können allein oder im Gemisch verwendet werden.
Als N-Quelle können sowohl organische als auch anorganische
Stickstoff-Verbindungen, wie z.B. Ammoniak, Harnstoff,
Ammonsulfat, Ammonchlorld, Ammonacetat oder Ammonsalze der
verschiedensten anderen organischen Säuren u.dgl. verwendet werdend
Als anorganische Substanzen, welche in dem Kultur-Medium mit
eingeschlossen sein können, sind verschiedene Salze des Eisens, Mangans, Magnesiums, Kobalts, Zinks, Nickels, Chroms
u.dgl. ebenso zu verwenden, wie verschiedene Phosphorsäureverbindungen.
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Als Aminosäuren, welche den spezifischen Anforderungen an die erfindungsgemäßen Stämme genügen, sind Isoleucin,
Methionin, Phenylalanin, Valin oder deren Gemische notwendig» Die Menge an zuzusetzender Aminosäure hängt von den Zuchtbedingungen,
den Typen und der Natur der verwendeten Aminosäuren ab j es ist jedoch vorzuziehen, 5o - 1000 Y. /ml Aminosäure
zu verwenden· Als Nährstoffe können Aminosäuren (z.B. Cystin, Cystein, Glutaminsäure u.dgl.) und Vitamine (z.B.
Biotin, Thiamin u.dgl.) falls erwünscht zugesetzt werden. Hefeextrakt, Mieki (eine Sojabohnenmehl-Hydrolysat-Lösung,
die durch Ajinomoto Co.Ltd· hergestellt und auf dem offenen
Markt in Japan erhältlich ist), Maiswasser, Pepton, Eiweiß-Hydrolysat, Fleischextrakt, ein Hydrolysat von mikrobiellen
Cellen u.dgl. können auch als Nährstoffe enthaltende Materialien verwendet werden.
Die 1-Leucin-Fermentation wird unter aeroben Bedingungen
ausgeführt. Die Zucht-Temperatur liegt bei 25 bis 4o° C,
vorzugsweise zwischen 27 und 37° C. Das p™ des Mediums
kann beträchtlich schwanken, jedoch ist es vorzuziehen, den Pjj-Wert mit Hilfe eines geeigneten Neutralisierungsmittels
(wie z.B. Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd,
CaIciumhydroxyd, Harnstoff u.dgl.)während des Züchtens auf
5,5 bis 8,5 einzustellen. Nach 3-6=tägigem Züchten hat sich 1-Leucin angesammelt, aber es kann sich unter bestimmten
Zucht-Bedingungen auch 1-Tyrosin als Nebenprodukt gebildet
haben.
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Nach dem Züchten werden mikrobielle Cellen, z.B. durch
Filtrieren oder Centrifugieren abgetrennt, und das Piltrat wird nach einer geeigneten Methode, z,b· durch Behandlung
mit einem stark sauren Kationenaustauscher-Harz, zwecks Gewinnung von 1-Leucin gereinigt. Das absorbierte 1-Leucin
wird eluiert, konzentriert und in üblicher Weise gekühlt, um rohe Kristalle von 1-Leucin zu erhalten.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, aber sie sollen sie nicht einschränken.
Ein Kultur-Medium wurde mit Corynebacterium glutamicum
KY-IO 108 - No.190 beimpft; das Kulturmedium enthielt
Pepton (1 g/dl), Fleischextrakt (1 g/dl), Hefeextrakt (o,5g/dl),
Natriumchlorid (o,3 g/dl) und Glukose (2g/dl); es hatte ein Pj, von 7#0· Zwecks Erhalt einer Saatkultur wurde die Züchtung
24 Stunden fortgesetzt.
Die Fermentation wurde unter Verwendung eines Kultur-Mediums
tie
ausgeführt, das Gluk<#r(l0g/dl), Ammonsulfat (2g/dl), KHgPO4 (0,15 g/dl), K2H PO4 (0,05g/dl), Mg So4,7 H2O (0,05 g/dl) , Phenylalanin (15O^/ml)# Isoleucin (loo y /ml), Methionin (100 y /ml), Valin (loo Y/ml), Biotin (100 &7ml) und CaCo, (2 g/dl) enthielt.
ausgeführt, das Gluk<#r(l0g/dl), Ammonsulfat (2g/dl), KHgPO4 (0,15 g/dl), K2H PO4 (0,05g/dl), Mg So4,7 H2O (0,05 g/dl) , Phenylalanin (15O^/ml)# Isoleucin (loo y /ml), Methionin (100 y /ml), Valin (loo Y/ml), Biotin (100 &7ml) und CaCo, (2 g/dl) enthielt.
20 ml-Portionen des so hergestellten Mediums wurden in getrennte
25o ml—Erlenmeyer-Kolben gefüllt und jeweils sterilisiert.
Das sterile Kultur-Medium in jedem dieser Kolben wurde
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mit 1 ml der Saatkultur beimpft, deren Herstellung oben beschrieben wurde. Die Fermentation wurde unter 5~tägigem
Schütteln bei 28° C durchgeführt. Es sammelte sich in dem
Kultur-Medium jedes Kolbens eine durchschnittliche Menge von 9,5 mg/ml 1-Leucin.
1 Liter des Materials wurde von den Brühen gesammelt und zwecks Entfernung der mikrobiellen Cellen zentrifugiert.
Das Piltrat wurde durch eine Harzkolonne, die mit Dianion SK So. 1 (einem stark sauren Kationen-Austauscher-Harz
ft», , x
der Mi)gubiski Kasei Kogyo K.K.,Japan) in seiner H-Porm
gefüllt war, geschickt. Dann wurde das Harz mit wässriger 0,2n Ammoniaklösung gewaschen, um 1-Leucin zu eluieren. Die
Fraktionen, die das eluierte 1-Leucin enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Nach dem Stehenlassen erhielt
man Roh-Kristalle (6,5g) von 1-Leucin, welche man Methanol zusetzte (700 ml, 70 Gewichts-^). Man erhitzte und ließ
dann die Lösung abkühlen. Der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und mit Methanol (70 Gew.-%) gewaschen, um gereinigtes
1-Leucin au erhalten.
Die analytischen Ergebnisse, die durch den Gebrauch von Papier-Chromatographie und von automatischen Aminosäure-Analysen
erhalten wurden, bewiesen, daß das 1-Leucin, das nach dem oben genannten Verfahren erhalten war, ähnliche
Charakteristiken hatte, wie das 1-Leucin, das nach dem konventionellen Verfahren erhalten war. Das naoh dem oben
genannten Verfahren erhaltene Produkt war biologisch aktiv
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und für das Wachstum von Stämmen verwendbar, die für die
biologische Prüfung von 1-Leucin brauchbar waren· Sein
Schmelzpunkt lag bei 2980C (zersetzt).
Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art - wie im Beispiel 1 beschrieben - ausgeführt, nur mit dem Unterschied, daß ein
Medium verwendet wurde, welches Glukose (I2g/dl), Hefeextrakt (o,5 g7dl), Ammonsulfat (2g/dl), KH2 PO4 (O,15g/dl), K3HPO4
(O,O5g)dl), MgSo4.7H2O (0,05g/dl), PeSO4.7H2O (0,002g/dl),
MnSO4.4H2O (0,002g/dl), Biotin (50 Ϋ/1) u. CaCO^g/dl)
enthielt·
Die Fermentation wurde in 4Tagen bei 29°C durchgeführt· Im Kulturmedium sammelten sich in jedem Kolben durchschnittlich
ll,o mg/ml 1-Leucin·
Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art - wie im Beispiel 1 beschrieben - mit dem Unterschied durchgeführt, daß Corynebacterium
glutamicum MF -142-No.53 und ein Medium verwendet wurden, das FeSo4.7H2O (0,002 g/dl), MhSo4.4H2O (0.002 g/dl),
Olukose (12 g/dl), Pepton (lg/dl), Ammonsulfat (2g/dl),
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AO
2^ (0,15 g/dl), K2HPO^ (o.05 g/dl), Mg SO^. 7H2O (0.002g/dl),
Biotin (50 Y/1) und CaCo3 (2g/dl) enthielt. Im Kulturmedium
sammelten sich in jedem Kolben durchschnittlich 11»4 mg/ml
1-Leucin.
Ansprüche :
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Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von 1-Leucin, dadurch gekennzeichnet,
daß man unter aeroben Bedingungen einen 1-Leucinproduzierenden
Mikroorganismus vom Genus Corynebacterium in einem Kulturmedium züchtet, das eine Kohlenstoff-Quelle,
eine Stickstoff-Quelle, anorganisches Material, Nährstoffe und einen Promoter enthält, der aus Isoleucin, Methionin,
Phenylalanin, Valin oder deren Gemischen besteht, und daß man zum Schluß das angesammelte 1-Leucin aus dem Kulturmedium
gewinnt·
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jener Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum A T C C 21
ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jener Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum A T C C 21
ist.
5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Temperatur des Kulturmediums im Bereich von 25-40° C gehalten
wird.
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Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honlte, 43 Essen, Kettwiger Straße
6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß jene Temperatur im Bereich von 27 - 37°C gehalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das pH des Kulturmediums im Bereich von 5·5· - 8.5 gehalten
wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Züchtung 5 bis 6 Tage fortsetzt.
PAe Dr.Andrejewski, Dr.Honke
009838/0804
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