DE2209078A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Ribosiden heterocyclischer organischer Basen - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Ribosiden heterocyclischer organischer BasenInfo
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Description
11 Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Ribosiden
heterocyclischer organischer Basen ".
Priorität: 26. Februar 1971, Japan, Nr. 9 298/71
14. April 1971, Japan, Nr.-23 041/71 und
Nr. 23 042/71
Es sind bereits einige Verfahren zur Herstellung von Ribosiden heterocyclischer organischer Basen bekannt. In der US-PS
3 535 207 ist z.B. die Umwandlung heterocyclischer Basen in die entsprechenden Nucleoside durch die Einwirkung bestimmter
Mutantenstämme von Bacillus subtilis offenbart. Aus der GBPS
1 148 058 ist die Herstellung von „ 5-IH^:Duracilribosid oder
6-Mercaptopurinribosid durch Züchten bestimmter Stämme von Bacillus subtilis oder Streptomyces fradiae bekannt. In den
vorgenannten Verfahren werden jedoch nicht immer zufriedenstellende Mengen der erwünschten Verbindungen angereichert.
Ferner ist aus der US-PS 3 269 917 die Herstellung von Purinribosiden aus Purinbasen durch die Einwirkung aerober
Bakterien bekannt. Bei diesem Verfahren ist jedoch die Anwesenheit eines Pentosyldonators erforderlich.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Ribosiden heterocyclischer
organischer Basen zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der vorgenannten Verfahren nicht aufweist und sich im industriellen
Maßstab mit geringen Kosten durchführen läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen
Herstellung von Ribosiden heterocyclischer organischer Basen der Formeln I, II oder III
$ Λ
HN'
XW
XH
0'-
HA
HOHxC
C
C
HV I/H
OH OH
C-
C ι
OH OH
OH OH
(ID- . (III)
in denen P und Q gleich oder verschieden sind und eine Hydroxyl- , Mercapto- oder Amiriogruppe, einen Alkylrest oder ein
Halogenatom bedeuten, R ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxyl- oder Aminogruppe oder ein Alkyl- oder Trihalogenmethylrest
ist, S und T gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxyl-, Amino-,
Benzylamino-, Hydroxylamino-, Mercapto-, Amid- oder Beii'/.ylgruppe
oder einen Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkylmercapto-,
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Alkyl- oder Alkoxyrest bedeuten und X und Y gleich oder verschieden
sind und.ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur
Produktion von Ribosiden heterocyclischer organischer Basen befähigten Mikroorganismus der Gattungen Brevibacterium,
Arthrobacter, Corynebacterium oder Micrococcus in einem Nährmedium züchtet, das mit einer heterocyclischen organischen Base
der Formeln IV, V oder VI
CH
I Il I
Γ f
H ·" .H
(V) ; (γι)
in denen P, Q, R, S, T, X und. Y die vorstehend angegebene Bedeutung
haben, versetzt wird,und das entsprechende, in der Kulturbrühe angereicherte Ribosid isoliert.
Das erfindungsgeniäße Verfahren läßt sich im industriellen
Maßstab wirtschaftlich und mit geringen Kosten durchführen.
Das cr.uindungsgemäße Verfahren beruht auf der Feststellung,
daß bei der Züchtung bestimmter, zu den Gattungen Bre\'ibacterium, Arthrobacter, Corynebacterium oder Micrococcus
gehörenden Stämmen beträchtliche Mengen der entsprechenden
Riboside in der Kulturbrühe angereichert v/erden, wobei die Gegenwart eines Pentosyldonators nicht erforderlich ist.
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Erfindungsgemäß kann das Nährmedium in jedem Stadium der Züchtung mit der heterocyclischen organischen Base versetzt werden.
Diese Base wird in einem äußerst hohen Verhältnis in das entsprechende Ribosid umgewandelt. Auf diese Weise wird ein Ribosid
einer heterocyclischen Base in hoher Konzentration gebildet und in der Kulturbrühe angereichert, aus der es leicht isoliert
werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß als Kohlenstoffquelle nicht nur Kohlenhydrate,
sondern auch billige Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine, und organische Säuren verwendet werden können.
Spezielle Beispiele erfindungsgemäß einsetzbarer heterocyclischer organischer Basen sind 6-Azauracil, 5-Aminouracil,
5-Methylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Chloruracil, 5-Bromuracil,
5-Joduracil, 5-Hydroxyuracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil,
Dithiothymin, 5-Fluorcytosin, 5-Chlorcytosin, 5-Hydroxycytosin,
2-Thiothymin, 4-Thiothymin, 2-Thiocytosin, 8-Azaadenin,
8-Azaguanin, 6-Mercaptoguanin, 2,6-Diaminopurin, 4-Hydroxypyrazolo-/3,4-d/-pyrimidin
(in der allgemeinen Formel VI bedeutet s. = OH, τ = H, X = CH und Y = N), 4-Aminopyrazolo-/^,A-dT'-pyrimidin^
(in der allgemeinen Formel VI bedeutet
S = NH2, T=H, X = CH und Y = N), 6-Chlorguanin, 6-Mercaptoxanthin,
8-Azaxanthin, 2-Methylhypoxanthin, 6-Mercaptopurin,
6-Hydroxylaminopurin, 6-Methylpurin, 6-Methylaminopurin,
2-Methyladenin, 6-Methylmercaptopurin, 2-Fluoradenin, 6-Chlor-.
purin, 6-Methoxypurin, 6-Äthoxypurin, 6-Methoxy-2-chlorpurin,
2-Chlorhypoxanthin, 2-Ii|e;thylhypoxanthin, 2-Äthylhypoxanthin,
2 2 2
2-Mercaptohypoxanthin, N -Methylguanin, N ,N -Dirnethylguanin,
N -Acetylguanin , N -Acetyladenin, N -Benzyladenin, 2-Hydroxy-
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N ,N -dimethyladenin, 8-Azahypoxanthin, 6-Mercaptoguanin,
2-Methoxypurin und 6-Methylhypoxanthin.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen gehören zu den Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter
und Micrococcus; sämtliche dieser Gattungen gehören zur Gruppe der Schizomyceten.
Brevibacterium ist eine zur Familie-Brevibacteriaceae, Ordnung
Eubacteriales, gehörende Gattung, die im allgemeinen durch
folgende Merkmale charakterisiert wird: kurze, unverzweigte Stäbchen; im allgemeinen unbeweglich; die Begeißelung beweglicher
Arten ist peritrich oder unbestimmt; manchmal chromogen, mit wasserunlöslichen rötlichen, rötlich-orangefarbenen, gelben
oder braunen Pigmenten; Nitrate werden oder werden nicht reduziert; ein glucosehaltiges Nährmedium wird im allgemeinen
sauer; Lactose wird nicht verbraucht; die proteolytische Wirkung
variiert mit den einzelnen Arten ; aerob oder fakultativ, anaerob; selten mikroaerophil.
Corynebacterium ist eine zur Familie Corynebacteriaceae, Ordnung Eubacteriales, gehörende Gattung, die im allgemeinen
durch folgende Merkmale charakterisiert wird: gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen mit unregelmäßig-gefärbten Segmenten, manchmal
Granulate; häufig werden keulenförmige Verdickungen beobachtet, durch das "Schnappen" bei der Zellteilung treten gewinkelte
und palisadenartige Zellanordnungen auf; unbeweglich mit Ausnahmen unter den pflanzenpathogenen Arten; gram-positiv,
wobei manchmal junge und manchmal alte Zellen den Farbstoff rasch verlieren; Granulate ausnahmslos gram-positiv; im allge-
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meinen aerob, wobei jedoch auch mikroaerdphile oder selbst anaerobe
Arten vorkommen; Katalase-positiv; verflüssigen oder verflüssigen nicht Gelatine; Nitrate v/erden oder v/erden nicht
zu Nitriten reduziert; Zucker werden oder v/erden nicht verbraucht, wobei selten, wenn überhaupt, eine hohe Acidität
auftritt; manche Arten oxidieren Glucose vollständig zu Kohlendioxid und Wasser, wobei keine sichtbaren Gasmengen gebildet
v/erden.
Arthrobacter ist eine zur Familie Corynebacteriaceae, Ordnung Eubacteriales,gehörende Gattung, die im allgemeinen durch folgende
Merkmale charakterisiert v/ird: in jungen Kulturen liegen stabellenförmige Zellen vor, die in Größe und Form von gerade
bis leicht gekrümmt, gekrümmt, verdickt oder keulenförmig variieren können; beim "Schnappen" bei der Zellteilung können
gewinkelte Zellanordnungen entstehen; insbesondere in flüssigkeitsreichen Medien können kurze Filamente mit rudimentären
Knospungen auftreten; gram-negativ oder gram-variabel, kokkoide
Zellen sind charakteristisch für ein oder mehr Tage alte Kulturen,
wobei diese kokkoiden Zellen in älteren Kulturen vorherrschen und gram-negativ bis gram-positiv sind; es treten
auch größere kokkoide Zellen (Cysten) auf, aus denen beim Überirnpfen
in frisches Nährmedium eine oder mehrere stäbcnenförmige
Zellen entstehen; im allgemeinen unbeweglich; Wachstum auf festen Nährböden weich oder viskos; Wachstum in flüssigen
Nährmedien im allgemeinen nicht üppig; die ineisten Arten verflüssigen
Gelatine; aus Kohlenhydraten wird nur wenig oder keine Säure produziert, Nitrate v/erden im allgemeinen zu Nitriten
reduziert; Indol wird nicht gebildet; aerob; die meisten
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Arten zeigen bei 37°C nur ein geringes oder kein Wachstum.
Micrococcus ist eine zur Familie Micrococcaceae, Ordnung
Eubacteriales, gehörende Gattung, die im allgemeinen durch folgende Merkmale charakterisiert wird: Zellen in unregelmäßigen
Haufen (niemals in Taschen); die Gattung wird als gram-positiv angesehen, obwohl einige Arten ihre Fähigkeit
zum Zurückhalten der Gramfärbung so rasch verlieren, daß sie häufig als gram-negativ bezeichnet werden; einige Arten sind
beweglich oder zeigen bewegliche Varietäten; auf Agar im allgemeinen
üppiges Wachstum; einige Arten bilden keine Pigmente, während andere gelbe, orangefarbene oder rote Pigmente bilden;
soweit bekannt Katalase-positiv; ein glueοsehaltiges Nährmedium
wird im allgemeinen schwach sauer? ein lactosehaltiges Nährmedium bleibt im allgemeinen neutral; Gelatine wird häufig,
jedoch niemals rasch verflüssigt; saprophytisch, fakultativr
parasitisch oder parasitisch.
Erfindungsgemäß können auch Mutantenstämme der vorgenannten
Mikroorganismen eingesetzt werden. Solche Mutantenstämme können nach jedem bekannten Verfahren, z.B. durch Behandeln entsprechender
Wildtypen mit Röntgenstrahlen, hergestellt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt folgende
Bakterienstämme eingesetzt:
Brevibacterium ammoniagenes, FERM-P Nr. 813, ATCC 21477,
Arthrobacter sp. Kr. 3489, FERM-P Nr. 811, ATCC 21647, Corynebacterium sp. Nr. 3546, FERI-I-P Nr. 812, ATCC 21648 und
Micrococcus sodonensis ATCC 19212.
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Die mikrobiologischen Eigenschaften einiger der vorgenannten
Stämme sind nachstehend zusammengestellt:
Arthrobacter sp. Nr. 3489, ATCC 21647
A) Morphologische Eigenschaften:
Zellform: kurze Stäbchen, die einzeln oder in V-förmigen Paaren als Folge des "Schnappens" bei der Zellteilung
auftreten; in einem Citrat-Nährmedium können verzweigte und verlängerte Ketten auftreten.
Größe: 0,3 bis 0,4 χ 1,0 bis 1,5p.
Beweglichkeit: unbeweglich.
Gramfärbung: positiv oder variabel.
B) Kultureigenschaften:
Gelatinestich: Verflüssigung, kraterförmig.
kreisförmig, 2 bis 4 mm Durchmesser, glatt?
flach, vollständig, glänzend, amorph, cremig-orangefarben, undurchsichtig,
üppiges Wachstum, fadenförmig, erhöht, glänzend, glatt, undurchsichtig, cremigorangefarben
.
fadenförmiges oder perlschnurförmiges Wachstum, bestes Wachstum am oberen Ende,
mäßiges Wachstum; kein Wachstum an der Oberfläche, flockiges Sediment; keine Gasbildung.
Kartoffelnähr- kein Wachstum.
boden . ·
Agarkolonien:
Agarschrägröhrchen:
Agarstich:
Flüssiges Kulturmedium:
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Lakmusmilch: Reduktion am unteren Ende. Telluritnährboden: schwache Kolonienbildung, grau oder
schwarz.
C) Physiologische Eigenschaften:
B.C.P.-Milch: schwach alkalisch* Indolbildung: negativ.
' Schwefelwasser- tritt in cysteinhaltigen Nährmedien
stoffbildung:
auf.
Zuckerhaltige aus Fructose wird Säure gebildet;
llährmedien:
Gasbildung tritt nicht auf.
Bildung von Acetyl- negativ, methylcarbinol:
Stärkehydrolyse: negativ,,
iiiti'Lte: werden aus Nitraten gebildet
Urease: -schwach positiv
Katalase positiv *
Hydrolyse von negativ , Cellulose:
Zum Wachstum ist Biotin erforderlich.
D) Wachstumsbedingungen:
Aerob.
Aerob.
Temperaturoptimum: 32°C; bei 410C" kein Wachstum
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Größe:
Beweglichkeit,: Gramfärbung:
- 10 -
Cornyobacterium sp. Mr. 3546, ATCC 2I648'
A) Morphologische Eigenschaften:
ZeLlform: kurze Stäbchen; manchmal treten Verzweigungen
auf; verlängerte Ketten in I.Oprozentigem Citrat-ilührmedium.
0,? bis 0,6 χ 0,6 bis 1,5 μ. unbeweglich ,
positiv oder variabel.
positiv oder variabel.
B) Kultureigenschaften:
GeIa tines t.Lch: Verflüssigung.
kreisförmig, A bis 10 ram Durchmesser,
glatt, konvex, vollständig, amorph, weiß, undurchsichtig, glänzend.
: müßiges Wachs tun, fadenförmig, flach,
güinzend, glatt, undurchsichtig, cremig-·
weiß, bu 11e ra rtig.
fadenförmig bis perlenschnurförmig, bestes V/achstum am oberen Ende*
Agarko Lonieii:
Agarstich:
Flüssiges Nähr- Kein Wachstum an der Oberfläche, mäßiges
medium:
Wachstum, kompaktes Sediment, keine.Gasbildung.
Kartoffelnährboden: kein Wachstum.
Lakmusmilch: schwach alkalisch.
Tollurit-Nährboden: schwaches V/achstum .
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C) Physiologische Eigenschaften:
B.C.P.-Milch: schwach alkalisch. •Indolbildung: negativ.
Schwefelwasserstoff- tritt in Cystein-haltigen Nährmedien bildung:
auf. · ·
Zuckerhaltige Nähr- aus Glucose, Saccharose, Raffinose,
medien:
Fructose, Mannit, Xylose, Maltose,
Dextrin, Inulin und Melibiose entsteht Säure, es tritt jedoch keine
Gasbildung auf.
Bildung von Acetylme- negativ,
thylcarbinol:
thylcarbinol:
Stärkehydrolyse: negativ.
Nitrite werden aus Nitraten gebildet. Urease: positiv.
Nitrite werden aus Nitraten gebildet. Urease: positiv.
Katalase: positiv.
Hydrolyse von Cellulose: negativ.
Zum Wachstum ist Biotin erforderlich.
Zum Wachstum ist Biotin erforderlich.
D) Wachstumsbedingungen:
Aerob
Aerob
Tempera turoptimuin: 30 C, kein Wachstum bei 41 C.
Im erfindungcgemäßen Verfahren können sowohl synthetische als
auch natürliche. Nährmedien verwendet werden, vorausgesetzt, daß das jeweilige Kährmedium geeignete Mengen einer Kohlenstoffquelle,
z.B. Kohlenhydrate, wie zuckerhaltige Materialien oder Kohlenwasserstoffe, eine organische oder anorganische Stickstoffverbindung,
anorganische Salze, und, falls notwendig,zusätzliche
Nähretof:.?c errlhiilt. Erfindungsgemäß können sämtliche Kohlenstoff -
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BAD 'ORIGINAL
und Stickstoff quellen verwendet v/erden, vorausgesetzt, daß sie
von den eingesetzten Stämmen verwertet werden können. Spezielle Beispiele erfindungsgemäß einsetzbarer Kohlenstoffquellen sind
verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannit, Galactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysatlösung
und Melasse, verschiedene organische Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure, Alkohole,
wie Glycerin, Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine und Kerosin,
und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Alanin, Glutamin und Asparagin. Bevorzugte Stickstoffquellen sind z.B. Ammoniak,
verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff, stickstoffhaltige
organische Substanzen, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl
oder abgebautes Fischmehl, und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure und Alanin. Als anorganische Salze werden vorzugsweise
z.B. Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Calciumcarbonat eingesetzt. Falls
erfindungsgemäß ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der weitere Nährstoffe benötigt, muß dem Nährmedium natürlich ferner ·
ein diesen Nährstoff enthaltendes Material zugesetzt v/erden.
Zur Bestimmung, ob ein spezieller Mikroorganismus zur Umwandlung einer heterocyclischen organischen Base in das entsprechende
Ribosid geeignet ist, kann jedes Standard-Screening-Verfahren verwendet werden. So kann z.B. ein zu untersuchender
Mikroorganismus in einem eine heterocyclische Base enthaltenden Nährmediura gezüchtet und die so erhaltene Kulturbrühe auf die
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Bildung des entsprechenden Ribosids untersucht werden.
Die heterocyclische organische Base kann dem Kulturmedium erfindungsgemäß
vor oder während des Züchtens zugesetzt werden. Erfindungsgemäß kann die Gesamtmenge der heterocyclischen organischen
Base zu einem bestimmten Zeitpunkt zugesetzt werden; die Zugabe kann aber auch absatzweise oder kontinuierlich
während des Züchtens des Mikroorganismus vorgenommen werden. Es können verschiedene Konzentrationen der heterocyclischen organischen
Base im Kulturmedium angewendet werden, wobei eine Konzentration von 1 g bis 20 g/Liter bevorzugt ist. Die heterocyclische
organische Base kann dem Kulturmedium auch in Form eines Salzes, z.B. als Sulfat oder Hydrochlorid, zugesetzt
werden. ' ■ ·
Das Züchten des Mikroorganismus wird z.B. unter aeroben Bedingungen
in Schüttelkultur oder in belüfteter und gerührter Sub'merskultur bei Temperaturen von vorzugsweise 20 bis 400C
durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums wird während des
Züchtens z.B. mit wäßriger Ammoniaklösung, Harnstofflösung
oder Natronlauge auf einen Wert von 4 bis 10, vorzugsweise auf einen Wert in der Nähe des Neutralpunktes, eingestellt. ·
Diese Temperatur- und pH~Bedingungen sind jedoch nicht erfindungswesentlich
und können je nach dem eingesetzten Mikroorganismus variieren.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus wird vorzugsweise zunächst in einem Anzuchtmedium gezüchtet^und die so
erhaltene Kultur wird anschließend zum Beimpfen des Kulturmediums verwendet. Das Anzuchtmedium wird unter günstigen
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Wachsturasbedingungen für den Mikroorganismus während eines zur Entwicklung einer geeigneten Population ausreichenden Zeitraumes,
z.B. etwa 24 Stunden, inkubiert. Die so erhaltene Anzuchtkultur wird dann zum Beimpfen des Kulturmediums verwendet. Das Züchten
des Mikroorganismus wird solange durchgeführt, bis sich eine beträchtliche Menge des Ribosids einer heterocyclischen organischen
Base gebildet und in der Kulturbrühe angereichert hat. Hierzu sind im allgemeinen 2 bis 8 Tage ausreichend.
Nach beendeter Züchtung wird das Ribosid aus der Kulturbrühe
durch Behandeln mit einem Ionenaustauscher isoliert, wie im nachstehenden Beispiel 1 gezeigt wird. Das erfindungsgemäß gebildete
Ribosid kann auch nach ,jeder anderen bekannten Be-
handlung mit Ionenaustauschern oder auf andere Weise, z.B. durch Adsorption, Ausfällung oder Extraktion isoliert v/erden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Riboside heterocyclischer organischer Basen sind wertvolle Arzneimittel. So ist z.B.
6-Azauracilribosid als wertvolles Krebsbekäinpfungsmittel anerkannt
.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Als Anzuchtstaram wird eine aus Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 6872 durch Ultraviolettbestrahlung erhaltene Mutante
(FERM-P Nr. 813, ATCC 21477) verwendet. Zur Herstellung einer
Anzuchtkultur wird diese Mutante in einem 2 Prozent Glucose,
1 Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt
und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzucht-
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medium 2 f stunden bei 30 C gezüchtet.
Es v/ird t-ir. Kulturmedium hergestellt, das in 1 Liter 13Og
Glucose, 1Cg Kaliumdihydrogenphosphat, 10 g Dikaliummonohydrogenphosphat,
10 g Magnesiumsulfat 0,1 g Calciumchlorid, 10 mg Eisen(II)-sulfat, 1 mg Zinksulfat, 10 mg Mangansulfat, 5 mg
Vitamin B^, 10 mg Calciumpantothenat, 20 mg Cystin, 30 ug
Biotin, 10 g Fleischextrakt, 10 g Hefeextrakt, 2 g Ammoniumsulfat und 2 g getrennt sterilisierten Harnstoff enthält. Das
Kulturmedium wird auf pH 7,8 eingestellt. 3 Liter dieses Mediums
werden in einen 5 Liter fassenden Glasfermenter gegeben,
und durch Erhitzen auf 1200C während 30 Minuten sterilisiert.
Das sterilisierte Kulturmedium wird mit 300 ml der Anzuchtkultur beimpft. Das Züchten v/ird'bei 320C durchgeführt,' wobei
der pjj-lvert rait wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 eingestellt
wird. 24 und 48 Stunden nach Beginn des Züchtens wird das Kulturmedium mit einer solchen Menge von 6-Azauracil versetzt,
die einer Konzentration von 5 g/Liter entspricht. 4 Tage nach Beginn des Züchtens sind im Kulturmedium 22,4 mg/ml 6-Azauracilribosid
enthalten.
1 Liter des durch Filtrieren zur Entfernung der Zellen uad
Niederschläge erhaltenen KuIturfiltrats wird über eine mit
Dov.-ex 1x2 (Dow Chemical Co.) " gefüllte Säule in der Chloridforia
gegeben, wobei 6-Azauracilribosid adsorbiert wird. Die Säule wird uit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure
elur'.crt. Die 6-Azauracilribosid enthaltenden Fraktionen
werden vereinigt , unter vermindertem Druck konzentriert und abgekühlt, wobei 18,4 g rohes 6-Azauracilribosid in kristalliner
Fon., erhalten v/erden. Das Rohprodukt wird aus einem
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BAD
Wasser-Äthanol-Gemisch umkristallisiert. Sämtliche Daten, die z.B. bei der Elementaranalyse, der Bestimmung des Basen- und
Zuckeranteils und aus dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum erhalten v/erden, und die bei der Papierchromatographie erhaltenen
R~-Werte zeigen, daß das erfindungsgemäß hergestellte Produkt
identisch ist mit 6-Azauracilribosid.
Das Züchten wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme,
daß als Anzuchtstamm Arthrobacter sp. Nr. 3489 (FERM-P Nr. 811,
ATCC 21647) verwendet wird, und daß das Kulturmedium 24 und 48 Stunden nach Beginn des Züchtens mit jeweils einer solchen
Menge 6-Azauracil versetzt wird, die einer Konzentration von 2,0 g/Liter entspricht. Nach beendeter Züchtung sind in der
Kulturbrühe 5,3.mg/ml 6-Azauracilribosid enthalten.
Das Züchten wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß als Anzuchtstamm·Corynebacterium sp. Nr. 3546
(FERM-P Nr. 812, ATCC 21648) verwendet wird,und daß das Kulturmedium
24 Stunden nach Beginn des Züchtens mit einer solchen Menge von 6-Azauracil versetzt wird, die einer Konzentration
von 3,0 g/Liter entspricht. Nach beendeter Züchtung sind in der Kulturbrühe 4,8 mg/ml 6-Azauracilribosid enthalten.
Das Züchten wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme,
daß als Anzuchtstamm Micrococcus sodonensis ATCC 19212 verwendet wird,und daß das Kulturmedium anstelle von Glucose 5 Prozent
η-Paraffine (C11 - C1^) enthält. Nach beendeter Züchtung sind in
209846/1241
der Kulturbrühe 7,3 mg/ml 6-Äzauracilribosid enthalten.
Beispiel 5
Als Anzuchtstamm wird eine aus Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 6872 durch Ultraviolett-Bestrahlung erhaltene Mutante (FERM-P Nr. 813, ATCC 21477) verwendet. Zur Herstellung einer
Anzuchtkultur wird diese Mutante in einem 2 Prozent Glucose,
1 Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt
und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium 24 Stunden bei 3O0C gezüchtet.
Es wird ein Kulturmedium hergestellt, das in 1 Liter 130 g
Glucose, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 10 g Dikaliumhydrogenphosphat,
10 g Magnesiumsulfat, 0,1 g Calciumchlorid, 10 mg Eisen(II)-sulfat, 1 mg Zinksulfat, 10 mg Mangansulfat, 5 mg
Vitamin B^, 10 mg Calciumpantothenat, 20 mg Cystin, 30 jag Biotin,
10 g Fleischextrakt, 10 g Hefeextrakt, 2 g Ammoniumsulfat und
2 g getrennt sterilisierten Harnstoff enthält. Das Kulturmedium wird auf Pu- 7,8 eingestellt. 3 Liter dieses'Mediums werden in
einen 5 Liter fassenden Glasfermenter gegeben und durch Erhitzen
auf 120 C während 30 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wird mit 300 ml der vorstehend hergestellten ·
Anzuchtkultur beimpft. Das Züchten wird bei 32°C durchgeführt,
wobei der ρττ-Wert mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 eingestellt
wird. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens wird das Kulturmedium mit einer solchen Menge von 5-Aminouracil versetzt,
die einer Konzentration von 5 g/Liter entspricht. 4 Tage nach Beginn des Züchtens sind in der Kulturbrühe 7,8 g/Liter
5-Aminouridin (5-Aminouracilribosid) enthalten.
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1 Liter des durch Filtrieren der Kulturbrühe zur Entfernung der Zellen und der Niederschläge erhaltenen Kulturfiltrats wird
über eine mit Dowex 1x2 gefüllte Säule in der Chloridform gegeben,
wobei 5-Aminouridin adsorbiert wird. Die Säule wird mit V/asser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure eluiert.
Die 5-Aminouridin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und abgekühlt, wobei
3,8 g rohes 5-Aminouridin in kristalliner Form erhalten werden. Das Rohprodukt wird aus einem Wasser-Äthanol-Gemisch umkristallisiert.
Sämtliche Daten, die z.B. bei der Elementaranalyse, der Bestimmung des Basen- und Zuckeranteils und aus den Ultraviolett-
und Infrarot-Absorptionsspektren erhalten werden, und die bei der Papierchromatographie erhaltenen R.,-Werte zeigen,
daß das erfindungsgemäß hergestellte Produkt identisch ist mit 5-Aminouridin.
Das Züchten wird unter Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 21477) als An'zuchtstamm gemäß Beispiel 5
durchgeführt, wobei die in der nachstehenden Tabelle I aufgeführten Pyrimidinanalogen dem jeweiligen Kulturmedium 24 Stunden
nach Beginn des Züchtens in einer solchen Menge zugesetzt v/erden, daß deren Konzentration 2 g/Liter beträgt. Die in den je-
Riboside der weiligen Kulturbrühen enthaltenen Mengen dervPyrimidinanalogen
sind in der Tabelle I zusammengestellt.
209846/12A1
Pyriraidinanaloge Verbindung
5-Methylcytosin 5-Fluoruracil
5-Hydroxyuracil 2-Thiouracil 4-Thiouracil
5-Chloruracil 5-Bromuracil
Ribosid in der Kulturbrühe , g/Liter
. 4,1 2,1 3,3 2,9 3,6
2,5 1.7 ■
Als Anzuchtstamm wird Arthrobacter sp-. Nr. 3489 (FERM-P-Nr.
811, ATCC 21647) verwendet. Das Kulturmedium enthält in 1 Liter 120 g Stärkehydrolysat (ausgedrückt als Glucose),
1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat,
0,5 g Magnesiumsulfat, 10 g Maisquellwasser, 5 g Hefeextrakt und 5 g Aramoniumchlorid. Der pH-Wert wird vor dem Sterilisieren
mit wäßriger Ammoniaklösung auf 752 eingestellt. Das Züchten
wird gemäß Beispiel 5 durchgeführt, 24 und 48 Stunden nach Beginn
des Züchtens v/erden die jeweiligen Kulturmedien mit solchen Mengen der in der nachstehenden Tabelle II aufgeführten
Pyrimidinanalogen versetzt, daß deren Konzentration 2 g/Liter beträgt. Das Züchten wird jeweils 4 Tage durchgeführt, wobei
der Pj--Y.rert während des Züchtens mit wäßriger Ammoniaklösung
auf Ί,? eingestellt wird. Die in den jeweiligen Kulturbrühen
enthaltenen I !engen der Riboside der Pyrimidinanalogen sind in
Tabelle II zusammengestellt.
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Pyrimidinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
Dithiothymin . 3,7
5-Fluorcytosin 4,8
Beispiel 8
Das Züchten wird gemäß Beispiel 7 unter Verwendung von Corynebacterium sp. Nr. 3546 (FERM-P Nr. 812, ATCC 21648) als
Anzuchtstamm durchgeführt. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die jeweiligen Kulturmedien mit den in der nachstehenden
Tabelle III aufgeführten Pyrimidinanalogen in solchen Mengen versetzt, daß deren Konzentration 3 g/Liter beträgt. Das Züchten
wird jeweils 3 Tage durchgeführt. Die in den Kulturbrühen
enthaltenen Mengen der Pyrimidinanalogen sind in Tabelle III zusammengestellt.
Pyrimidinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
5-Chlorcytosin 4,3
5-Hydroxycytosin 2,8
Beispiel 9
Das Züchten wird gemäß Beispiel 5 unter Verwendung von
Micrococcus sodonensis ATCC 19212 als Anzuchtstamm durchge- · führt, mit der Ausnahme, daß anstelle der im Beispiel 5 verwendeten
Glucose ein 5 Prozent η-Paraffine (C11 bis C1^) enthaitendes
Kulturmedium eingesetzt wird. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführten
Pyrimidinanalogen dem jeweiligen Kulturmedium in solchen Mengen zugesetzt, daß deren Konzentration 4 g/Liter be-
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trägt. Das Züchten wird jeweils 3 Tage durchgeführt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Pyrimidinanäloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
2-Thiocytosin 5,3
2-Thiothymin 4,7
Beispiel 10
Als Anzuchtstamm v/ird eine aus Brevibacterium ammoniagenes
ATCG 6872 durch Ultraviolett-Bestrahlung erhaltene Mutante (FERM-P Nr. 813, ATCC 21477) verwendet. Zur Herstellung einer
Anzuchtkultur wird diese Mutante in einem 2 Prozent Glucose, 1 Prozent.Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeex-
trakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium
24 Stunden bei 30 C gezüchtet.
Es wird ein Kulturmedium hergestellt, das in 1 Liter 130 g Glucose, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 10 g Dikaliumhydrogenphosphat,
10 g Magnesiumsulfat, 0,1'g Calciumchlorid, 10 mg ' Eisen(II)-sulfat, 1 mg Zinksulfat, 10 mg Mangansulfat, 5 mg
Vitamin B^, 10 mg Calciumpantothenat, 20 mg Cystin, 30 ug
Biotin, 10 g Fleischextrakt, 10 g Hefeextrakt, 2 g Ammoniumsulfat und 2 g getrennt sterilisierten Harnstoff enthält. Das
Kulturmedium v/ird auf p™ 7,8 eingestellt. 3 Liter dieses Mediums
werden in einen 5 Liter fassenden Glasfermenter gegeben und durch Erhitzen auf 1.200C während 30 Minuten sterilisiert. Das
sterilisierte Kulturmedium v/ird mit 300 ml der vorstehend hergestellten
Anzuchtkultur beimpft. Das Züchten wird bei 32°C durchgeführt, wobei der powert mit wäßriger Ammoniaklösung auf
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6,8 eingestellt wird. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens wird das Kulturmedium mit einer solchen Menge von 6-Methylaminopurin
versetzt, daß dessen Konzentration 5 g/Liter beträgt. 4 Tage nach Beginn des ZUchtens sind in der Kulturbrühe 8,5 g/
Liter 6-Methylarainopurinribosid enthalten.
1 Liter des durch Filtrieren der Kulturbrühe zur Entfernung der Zellen und der Niederschläge erhaltenen Kulturfiltrats wird
über eine mit Dowex 1x2 gefüllte Säule in der Chloridform gegeben,
wobei 6-Methylaminopurinribosid adsorbiert wird. Die Säule wird mit V/asser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure
eluiert. Die 6-Methylaminopurinribosid enthaltenden Fraktionen v/erden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert
und abgekühlt, v/obei 4,4 g roh'es 6-Methylaminopurinribosid in kristalliner Form erhalten werden. Das Rohprodukt wird aus
einem Wasser-Äthanol-Gemisch umkristallisiert. Sämtliche Daten, die z.B. bei der Elementaranalyse, der Bestimmung des Basen-
und Zuckeranteils und aus den Ultraviolett- und Infrarot-Absorptionsspektren erhalten v/erden und die bei der Papierchromatographie
erhaltenen R«-Werte zeigen, daß das erfindungsgemäß hergestellte Produkt identisch ist mit 6-Methylaminopurinribosid.
Das Züchten wird gemäß Beispiel 10 unter Verwendung von Brevibacterium aramoniagenes (ATCC 21477) als Anzuchtstamm
durchgeführt. Die jeweiligen Kulturmedien werden 24 Stunden nach Beginn des Züchtens mit den in der nachstehenden Tabelle V
aufgeführten Purinanalogen in solchen Mengen versetzt, daß de-
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ren Konzentration 2 g/Liter beträgt. Die in den jeweiligen Kulturbrühen enthaltenen Mengen der Riboside der Purinanalogen
sind in der Tabelle V zusammengestellt.
Purinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
8-Azaadenin 2,5
2,6-Diäminopurin 2,9 '
4-Hydroxypyrazolo-/3,4~d/-pyrimidin 3,7
4-Aminopyrazolo-/3,4-d7-pyrimidin 3,9
6-Chlorguanin ' 3,2
6-Mercaptoxanthin 2,1
8-Azaxanthin 3»6
2-Hethyladenin 2,8
8-Azahypoxanthin 2,9
ρ
N -Methylguanin · 3,4 ■
N -Methylguanin · 3,4 ■
N2,N2-Dimethylguanin 2,3
Als Anzuchtstamm wird Arthrobacter sp. Nr. 3489 (FERM-P Nr. 811, ATCC 21647) verwendet. Es wird ein Kulturmedium hergestellt,
das in 1 Liter 120 g Stärkehydrolysat (ausgedrückt als Glucose),
1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 10 g Maisquellwasser, 5 g Hefeextrakt
und 5 g Ammoniumchlorid enthält. Der p^-Wert des Kulturmediums
wird vor dem Sterilisieren mit wäßriger Ammoniaklösung auf 7,2 eingestellt. Das Züchten wird gemäß Beispiel 10 durchgeführt.
24 und 48 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die jeweiligen Kulturmedien mit solchen Mengen der in der nachstehenden Tabelle
VI aufgeführten Purinanalogen versetzt, daß deren Konzentration
2 g/Liter beträgt. Das Züchten wird jeweils 4 Tage durchgeführt,
wobei der p„-V'ert während des Züchtens mit wäßriger Ammoniaklö-
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sung auf 7,2 eingestellt wird. Die in den jeweiligen Kulturbrühen enthaltenen Mengen der Riboside der Purinanalogen sind in
der Tabelle VI zusammengestellt.
Purinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
8-Azaguanin ■ 4,9
6-Mercaptoguanin 4,3
2-Methylhypoxanthin 5,1
6-Mercaptopurin 5,5
6-Methylpurin 3,1
6-Methylmercaptopurin · h,3
Das Züchten wird gemäß Beispiel· 12 unter Verwendung von Corynebacterium sp. Nr. 3546 (FERM-P Nr. 812, ATCC 21648) als
Anzuchtstamm durchgeführt. 24 und 48 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die jeweiligen Kulturmedien mit den in der
nachstehenden Tabelle VIT aufgeführten Purinanalogen in solchen Mengen versetzt, daß deren Konzentration 2 g/Liter beträgt.
Das Züchten wird jeweils 4 Tage durchgeführt. Die in den jeweiligen Kulturbrühen enthaltenen Mengen der Purinanalogen sind
in der Tabelle VII zusammengestellt.
Purinanaloge Verbindung " Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
2-Fluoradenin 3,3
2-Chlorpurin 4,4
6-Hydroxyaminopurin 3,1
6-Methylmercaptopurin 2,6
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Beispiel 14
Das Züchten wird gemäß Beispiel 10 unter Verwendung von Micrococcus sodonensis ATCC 19212 als Anzuchtstamm durchgeführt
mit der Ausnahme, daß anstelle der in Beispiel 10 verwendeten Glucose ein 5 Prozent η-Paraffine (C^,. Ms C^) enthaltendes
Kulturmedium eingesetzt wird. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die jeweiligen Kulturmedien mit den in der
nachstehenden Tabelle VIII aufgeführten Purinanalogen in solchen Mengen versetzt, daß deren Konzentration 4 g/Liter beträgt.
Das Züchten wird jeweils 3 Tage durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
Purinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
2-Methoxypurin '4,2
2-Äthylhypoxanthin 4,7
N -Äcetyladenin ' 4,2
2-Mercaptohypoxanthin 3,6
Das Züchten wird gemäß Beispiel 12 unter Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 21477) als Anzuchtstamm
durchgeführt. 24 Stunden nach Beginn des Züchtens werden die jeweiligen Kulturmedien mit den in der nachstehenden Tabelle
IX aufgeführten Purinanalogen in solchen Mengen versetzt, daß deren Konzentration 3 g/Liter beträgt. Das Züchten wird jeweils
3 Tage durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.
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Purinanaloge Verbindung Ribosid in der Kulturbrühe,
g/Liter
8-Azaguanin 4,9
6-Mercaptoguanin 4,2
6-Mercaptopurin 4,7
6-Hydroxyaminopurin 4,2
6-Methylpurin 4,2
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Claims (5)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Ribosiden
heterocyclischer organischer Basen der Formeln I, II oder III
XH
HOHzc
O1H OH
(U
H Ψ
OH OH
(JD
OH OH (HI).
in denen P und Q gleich oder verschieden sind und eine Hydroxyl-, Mercapto- oder Aminogruppe, einen Alkylrest oder ein
Ilalogenatom bedeuten, R ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxyl- oder Aminogruppe oder ein Alkyl- oder Trihalogenmethylrest
ist, S und T gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxyl-, Amino-, Benzylamino-,
Hydroxylamino-, Mercapto-, Amid- oder Benzylgruppe oder einen Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkylmercapto-, Alkyl-
oder Alkoxyrest bedeuten und X und Y gleich oder verschieden sind und ein Stickstoffatom oder eine Hethingruppe bedeuten,
dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur
Produktion von Ribosiden heterocyclischer organischer Basen befähigten Mikroorganismus der Gattungen Brevibacteriumj,
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Arthrobacter, Corynebacterium oder Micrococcus in einem Nährmedium züchtet, das mit einer heterocyclischen organischen
Base der Formeln IV, V oder VI
Il
(V) : (VI)
in denen P, Q, R, S, T, X und Y die vorstehend angegebene Bedeutung
haben, versetzt wird, und das entsprechende, in der Kulturbrühe angereicherte Ribosid isoliert.
2. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 6-Azauracilribosid
gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen 6-Azauracilribosid produzierenden Mikroorganismus der Gattungen
Brevibacterium, Arthrobacter, Corynebacterium oder Micrococcus in einem Nährmedium züchtet, das mit 6-Azauracil versetzt
wird und das in der Kulturbrühe angereicherte 6-Azauracilribosid isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch Λ und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Züchtung in einem Nährmedium durchführt, das mit 1 bis 20 g/Liter der heterocyclischen organischen Base versetzt
wird.
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4. Verfahren nach Anspruch,1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Züchtung in einem Nährmedium durchführt, das einen Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit Brevibacterium ammoniagenes
ATCC 21477 ? Arthrobacter sp. Nr. 3489, ATCC.21647,
Corynebacteriuiü sp. Nr. 3546, ATCC 21648 oder Micrococcus
sodonensis ATCC 19212 durchführt. ' ■
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Legal Events
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |