DE1517826C - - Google Patents
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Description
Die. Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel-. lung von Inosinsäpre durch aerobes Züchten von
Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze
und Adenin enthält, bei hierfür üblichen pH-Werten und Temperaturen.
Inosinsäure oder Hypoxanthin-Ribosid-5'-phosphorsäure ist eine bekannte Verbindung. Inosinsäure
wurde bisher auf verschiedenen Wegen hergestellt, wie z.B. durch Hydrolyse von Inosintriphosphat.
Wurde sie durch Fermentation unter Verwendung von Adenin ί erfordernden Stämmen hergestellt, so
war es notwendig, die Fermentation durch Regelung - der.Adeninmenge unter der für das Wachstum des
verwendeten Stammes optimalen Menge durchzuführen. Daher ist durch die Regelung der verwendeten
Adeninmenge die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen gering, und folglich wird eine
lange Fermentationszeit benötigt.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Inosinsäure, das die bisherigen
Nachteile und Unzulänglichkeiten ausschaltet.
Ausgehend vom Stand der Technik zur biotechnischen Herstellung von Inosinsäure durch Züchten
von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffsubstanzen,
Mineralsalze und Adenin enthält, bei hierfür üblichen pH-Werten und Temperaturen, wird diese Aufgabe
erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 14995,
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15187, —ATCC
19183 oder Bacillus subtilis ATCC 15512 verwendet und dem Nährmedium wenigstens eine der Verbindungen
Guanin oder Hypoxanthin oder damit verwandte Verbindungen in einer Menge von IO bis
200 mg/1 zusetzt. ·
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung können als mit Guanin und Hypoxanthin verwandte Verbindungen
Guanosin, Inosin, Ribonucleinsäurehydrolysat, Derivate des Guanosins und Derivate des
Hypoxanthins eingesetzt werden. ,
ίο Durch diese Maßnahmen wird Inosinsäure in
hoherReinheit und guter Ausbeute erhalten.
In der nachfolgenden Beschreibung wird die Erfindung näher erläutert.
Als Ergebnis eingehender Untersuchungen würde gefunden, daß die bisherigen Beschränkungen bezüglich der Adeninmengen zu einem großen Ausmaß
Als Ergebnis eingehender Untersuchungen würde gefunden, daß die bisherigen Beschränkungen bezüglich der Adeninmengen zu einem großen Ausmaß
. durch die Zugabe einer geringen Menge Guanin oder .Hypoxanthin zu dem Nährmedium weitgehend
aufgehoben werden können.
Wie in Tabelle I gezeigt, wird in Nährmedien, die Adenin in Mengen über 50 mg/1 enthalten, das
Wachstum .der Mikroorganismen beträchtlich inhibiert.
Dagegen wird, wie in Tabelle I ebenfalls gezeigt,
- die Inhibierung des Wachstums * auf Grund der Anwesenheit von über 50 mg/1 Adenin durch, die
Gegenwart von 10 bis 200 mg/1 Guanin oder Hypoxanthin weitgehend aufgehoben. In diesem Fall wird
das normale Wachstum für die optimale Menge des bisher verwendeten Adenins erhalten. Tatsächlich
wird das Wachstum beschleunigt, und in kurzer Zeit kann eine Menge von über 10 mg/ml Bakterienzellen
erhalten werden.
Verwendete Stämme: Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19183
' -^S. Guanin oder | ·'■'' · ■■'.'· | Guanin | Guanin | Hypoxanthin | Hypoxanthin |
^tjypoxanthin | keine Zugabe | 50 mg/1 zugesetzt | 200 mg/1 zugesetzt | 50.mg/l zugesetzt | 200 mg/l zugesetzt |
. Adenin ^s. ■ | Wachstumsausmaß | Wachstumsausmaß | Wachstumsäiismaß | Wachstumsausmaß | Wachstumsausmaß |
(mg/1) >^ | (mg/ml) | (mg/ml) ■ | Img/mi) | (mg/ml) | (mg/ml) |
0 | 0,2 | 0,1' | 0,1 | 0,1 | |
10 | 5^8 | ■ 7,2 · ■ | 7,0 | 6,8 ·. | 7,0 ' |
20 | 6,5 | 8,0 | 8,5 | " 9,0 . | 9,5- |
50 | 4,8 | 9,3 · | ■ 10,0 | 10,2 | 11,0 |
100 | 01 | 12 0 | ' 13 0 | P 5 | ' 12 3 |
200 | \Jyl ... 0,05 |
15,0 | . · 15,5 | ■ - · * —,-* -"' . * 16,1 . |
.15,0 |
500 | ;: 0,1. ^. | ■>'4,0 : "Γ.'- | 16,5- .-Λ | -.-:; -9,8-':■/"■■.·;. | 7 16,0 > ..:.'■. 1 ■ . ' . -.' ■ .... ι · |
Zusammensetzung des Grundmediums:
5,0% Glucose, ,. . /
0,1% KH2PO4,
0,1% K2HPo4, :
0,1% MgSO4-7H2O,
0,01% CaCl2-2H2O,
30 γ/Ι Biotin,
10 y/ml Calciumpantothenat,
30 γ/Ι Biotin,
10 y/ml Calciumpantothenat,
5 }'/ml Vitamin B1,
50 y/ml L-Cystin,
50 y/ml L-Cystin,
1 mg/1 ZnSO4 -7 H, O,
1,0% (NH4J2SO4,
0,2% Harnstoff,
0,001% MnSO4 · 4H,O und
0,001% FeSO4-7H2O.
Das Medium Jiatte einen pH-Wert von 7.2. Die
Kultivierung wurde in Reagenzgläsern unter aerobem Schütteln bei 320C während 48 Stunden durchgeführt.
Gemäß der Erfindung kann die Fermentation in einem Nährmedium durchgeführt werden, welches
eine weit größere Menge Adenin als die üblicherweise verwendete Höchstmenge enthält, wobei' in kurzer
Zeit eine beträchtliche Inosinsäiiremenge gebildet
wird.
Das vorteilhafte Ergebnis der vorliegenden Erfindung wird auch unter Verwendung von Guanosin.
Guanosinderivaten, Inosin, Hypoxanthinderivaten.
Ribonucleinsäurehydrolysat oderSubstah/en, die diese
Stoffe enthalten, erreicht.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwendenden Züchtungsbedingungen sind .die in dieser
I 617
Technik üblichen. Sowohl ein synthetisches Nährmedium als ein natürliches Nährmedium ist geeignet,
solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Stammes enthält. Derartige
Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Stoffe, wie z. B: eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,
anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in entsprechenden
Mengen verbraucht werden. Als Kohlcnstoffquelie kommen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Ίο
Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse usw., oder irgendeine andere geeignete
Kohlenstoffquelle, wie ?.. B. Glycerin, Mannit, Sorbit, Glutaminsäure usw., in Betracht. Diese Substanzen
können entweder einzeln oder im Gemisch von zwei oder mehreren angewendet werden. Als Stickstoffquelle
können beispielsweise verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbiiv
düngen, wie beispielsweise Harnstoff, oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw.. oder natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit,
Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysate, lösliche Fischprodukte,
Reiskleieextrakt usw., verwendet werden. Diese Sub- 25~
stanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren angewendet
werden. Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, gehören
Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, CaI- ■
ciumchlorid usw. Wie üblich, können wachstumsbeschleunigende Mittel, wie z. B. Biotin oder geeignete
Vitamine, dem Medium zugesetzt werden.
Die aerobe Fermentation kann durch Schütteln oder Rühren unter Einrühren von Luft bei einer
Temperatur von etwa 25 bis 38' C und einen pH-Wert von etwa 5,5 bis 8.5 vorgenommen werden. Nach
etwa 2- bis 3tägiger Züchtung wurde festgestellt, daß sich eine große Menge von Inpsinsäure in der
Fermentationsllüssigkeit angesammelt hatte. Nach beendeter Fermentation kann die Inosinsäure aus
dem Fermentationsfiltral durch übliche Mittel, wie
z. B. einer Inonenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen,
Chromatographie od. dgl., abgetrennt werden. Nächstehend werden einige Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen· Verfahrens beschrieben. Falls nicht anders vermerkt, beziehen sich die %-Angaben
auf das Gewicht pro Liter Wasser.
Beispiel 1 ,
Es werden die in Tabelle II wiedergegebenen Adenin erfordernden Inosinsäure erzeugenden Mikroorganismen
verwendet. Diese Stämme werden unter aerobem Schütteln in entsprechenden 2 1 konischen
Glasbehältern, die 300 ml eines Nährmediums aus 4,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt und
0,25% Natriumchlorid enthielten, bei einem pH-Wert von 7,0 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Das erhaltene
Impfmedium wird in einen 5-1-Fermentationsbehälter eingeimpft, welcher 3 1 der folgenden Fermentationsmediumzusammensetzung
enthält: ~
10% Glucose,
1,0% KH2 PO4, - .
1,0% K2HPO4,
0,01% CaCl,-2H2O, - '
1 mg/1 ZnSO4-7 H2O,
20 mg/1 FeSO4-7H2O,
20· mg/1 L-Cystin,
30 7/I Biotin,
15 mg/1/i-Alanin,
20 mg/1 FeSO4-7H2O,
20· mg/1 L-Cystin,
30 7/I Biotin,
15 mg/1/i-Alanin,
1,0% Ehrlich-FIeischextrakt,
1,0% MgSO4-7H2O,
5 mg/1 Vitamin B1,
0,2% Harnstoff.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums betrug 7,2; die Konzentrationen des verwendeten Adenins,
Guanins u.dgl. sind in Tabelle II wiedergegeben.
Die Fermentation wird bei 30° C unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 600 U/min und Belüftung
in einem Ausmaß von 3 l/min durchgeführt. Der pH-Wert wird während der Fermentation auf 6,2
bis 8,0 mit Ammoniakwasser eingestellt.
Die Mengen an erzeugter Inosinsäure sind in Tabelle II wiedergegeben:
Adenin |
Guanin
■■ oder HypoMiinthin |
Fermentationszeit |
Menge an erzeugter
. Inosinsäure |
|
(mg/Il | (mgl) · | (Stunden) | ' (mg/ml) | |
Micrococcüs glutamicus | 110 | 2,0 | ||
ATCC 14995 .· \: | IU . ■ | 10 | 72 | 8,0 |
Ίί\ | — | 110 | 0,5 | |
JXl | 20 | 65 | 12,4 | |
CA | :— | 110 | 0,1 | |
JV | 20 bis 50 | 48 | 20,2 | |
KM) | — | 110 | Spuren | |
I w\J | 50 | 48 | 6,0 | |
Brevibacterium ammoniagenes | 11\ | — | 96 | 4,0 |
ATCC !5187 | IU | K) | 72 | 8,6 |
— | 96 | 3.0 | ||
H) | 20 | 72 | 16,5 | |
CJI | 96 | 1,0 | ||
50 1 | 20 bis 50 | 62 | 18,0 |
Adenin
(mg I) |
Fortsetzung : |
F-ermentalions/eit
(Stunden) |
Menge an erzeugter
I.nosinsäurc - . (mg/ml) |
|
■ .· :- :■' ■ -■ ..-■'■■ | ,00 :.'j 10 . • 20 ■ 50 . 100 . |
(iuanin
oder Hvpoxanthih (mg'l) |
96 . 43 ·■■-..:.- 100 90 100 .72 . KX) 65 KK) -.. 65 .,.,-.... |
• 0,5 12,4 ■.... 1.3: 1,8 0,5 2,0 0,1 ■ ;. . . 2,5 , · Spuren ι,ο ; |
Brcvibacterium ammoniagenes ATCC 15187 ·/...■ Bacillus subtilis ATCC 15512 |
50 bis 100 10 10, . . 20 bis 50 20 bis 100 |
|||
Wie aus Tabelle II hervorgeht, sind die optimalen Mengen an Adenin hinsichtlich der .Erzeugung an
Inosinsäürc durch die Zugabe von Guanin oder Hypoxanthin zu dem Nährmedium gesteigert. Dementsprechend
ist die Fermentationszeit verkürzt, wäh- _
rend die angesammelte Inosinsäuremenge erheblich gesteigert ist.
Fs wird eine'Impfkultur'in einem 21 konischen
Glasgefiiß. wie im Beispiel I beschrieben, unter Ver-Wendung
von Brevibaclcrium ammoniagenes ATCC 19183 hergestellt. Dann werden 6(H) ml dieser Impfkultur
in ein 30-I-Fermentationsgefaß eingeimpft, welches 18 1 eines Nährmediums, das die gleiche
Zusammensetzung wie das unter Tabelle 1 angegebene Grundmediuni aufweist und zusätzlich 150 mg I Adenin
und 50 mg 1 Guanin enthält. Die Züchtung wird dann unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von
300 U min und Belüftung in einem Ausmaß von 15 1 min bei einer Temperatur von 35 C während 4»
.20 Stunden'durchgeführt.
Das so erhaltene jmpfmedium wird in einem Verhältnis
von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium eingeimpft, das die gleiche Zusammensetzung,
wie im Beispiel I beschrieben, aufweist mit der Ausnahme, daß es 12",, Glucose enthält. Dieses
Medium enthält auch 50 mg I Adenin und 50 mg I Guanin. :
Die Fermentation' wird in einem 3(X)-1-Tank. der 150 1 des Fermentationsmediums enthält, bei 30 bis .su
35 C und einer Rührgcschwindigkeit von-2(H) Γ min
und Belüftung · in einem Ausmaß von 150 1min
durchgeführt. Nach 6Osüindiger Züchtung hallen
sich 22.0 mg ml Inosinsäürc in der Fermenlations-
.ariucsammelt. '5*
1501-des nach Abtrennung des Zellkörpcrs von
der Fermentationsflüssigkeit erhaltenen Filtrats wird auf einen pH-Wert von 1,4"mit Chlorwasserstoffsäure
eingestellt und durch eine lonenaustauschkolonne Diaion SK-I (Η-Form) gegeben. Danach wird durch
die Kolonne destilliertes Wasser geleitet, und die Anteile, welche zu Beginn des Waschvorgangs im
austretenden Strom Inosinsäurc enthalten, werden kombiniert und mit Natriumhydroxyd auf einen
pH-Wert von 7.2 eingestellt. Durch Konzentrierung unter vermindertem Druck und Kühlen werden
Kristalle von Natriuminosinat erhalten. Die Produktausbeute
beträgt 2.2 kg.
Claims (2)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von Inosinsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium.
das Kohlenstoff- und Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und Adenin enthält, bei üblichen
rfH-Wertch und Temperaturen, dadurch gekennzeichnet,
daß man .als Mikroorganismus Micrococcus glutamicus ATCCJ4995.
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Ι5Ϊ87Γ
ATCC 19183 oder Bacillus subtilis ATCC 15512
.verwendet und dem Nährmedium wenigstens
eine der Verbindungen Guanin, Hypoxanthin
oder damit verwandte Verbindungen in einer Menge von IO bis 2(K) mg 1 zusetzt. - . .'
2. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß man als verwandte Verbin-
. düngen Guanosin. Inosin. Ribonucleinsäurehydro-Iysat.
Derivate des Guanosins'und Derivate des Hypoxanthins zusetzt. ..-■--;->-
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