DE2005848C - Gewinnung von Zitronensäure und Isozitronensäure - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft die Verwendung von durch sulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat. Züchten des Mikroorganismus Candida zeylanoldes Ferner können auch In der Natur vorkommende, ATCC15585 unter hierfür üblichen Bedingungen ge· Stickstoff enthaltende Substanzen verwendet werden,

wonnenen Fermentationsflüssißkeiten zur Gewinnung ι. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt,

von Zitronensäure und Isozitronensaure. 5 Fischmehl, Pepton, Fleischbrühe, Caseinnydrolysat,

Zitronensäure und Isozitronensäure sind bekannte lösliche Fischbestandteile und Reiskleieextrakt. Diese Handelsprodukte. Es sind auch bereits verschiedene Substanzen können ebenfalls entweder allein oder in Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen be> Form von Gemischen aus zwei oder mehreren der Sub-

kannt. So ist beispielsweise aus »The Proceedings of stanzen eingesetzt werden,

the General Meeting of the Agricultural Chemical »ο Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium

Society of Japan«, S. 91 (1968), die Herstellung von zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magne- Zitronensäure und Isozitronensäure unter..Verwen- siumsulfat.Natriumphosphat.Kaliumdihydrogenpnos-

dung von Hefe bereits bekannt. Diese bekannten phat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder

Verfahren haben jedooh verschiedene Nachteile, die andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid,

durch die vorliegende Erfindung beseitigt werden 15 Zinksulfat, Kupfersulfat, Molybdate und Borate,

sollen. Darüber hinaus kann das Nährmedium auch weitere

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß große Nährstoffe enthalten. Erwähnt seien beispielsweise Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure in der Aminosäuren, z. B. Histidin, Tyrosin, Phenylalanin, Fermentationsflüssigkeit angereichert sind, die beim Threonin, Leucin und Cystin und/oder Vitamine, bei- ZUchten von Candida zeylanoides ATCC 15585 unter ap spielsweise Pyridoxal, p-Aminobenzoesäure, Thiamin,

hierfür üblichen Bedingungen in einem hierfür üb- Pantothensäure, Biotin und Nikotinsäure,

liehen Nährmedium erhalten wird Durch Verwendung Die Züchtung des Mikroorganismus Candida

einer solchen Fermentationsflüssigkeit können in in- zeylanoides ATCC 15585 wird unter aeroben Bedin-

dustriellem Maßstab unter geringen Kosten in hoher gungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes

Ausbeute Zitronensäure und Isozitrpnensäure ge- as Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften

wonnen werden. einer Submerskultur und zwar bei einer Temperatur

Zur Durchführung der Fermentation zur Gewinnung von beispielsweise etwa 20 bis 4O⁰C sowie bei einem

der erfindungsgemäß verwendeten Fermentationsflüs- pH-Wert von beispielsweise etwa 1,0 bis 9,0. Die

sigkeit eignet sich ein synthetisches oder natürliches bevorzugten Bedingungen sind eine Temperatur von

Nährmedium, vorausgesetzt, daß es die für das Wachs- 30 etwa 30⁰C und ein pH-Wert von etwa 6,0. Die Auf-

tum des Mikroorganismus Candida zeylanoides rechterhaitung des pH-Wertes kann durch Zusatz von

ATCC 15585 erforderlichen Nährstoffe enthält. Solche beispielsweise Calciumcarbonat, Natriumhydroxyd, Nährstoffe sind bekannt. Es handelt sich dabei bei- Calciumhydroxyd oder Ammoniak bewirkt werden,

spielsweise um eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff- Gewöhnlich sind in der durch übliche Züchtung

quelle, anorganische Verbindungen od. dgl., wobei 35 von Candida zeylanoides ATCC15585 erhaltenen

diese Nährstoffe von dem verwendeten Mikroorganis- Fermentationsflüssigkeit etwa äquivalente Mengen an

mus in entsprechenden Mengen verbraucht werden. Zitronensäure und Isozitronensaure enthalten, jedoch

Die Fermentation selbst wird in einem wäßrigen kann die Menge an Zitronensäure und Isozitronensäure Nährmedium durchgeführt, das einen Kohlenwasser- in der Fermentationsflüssigkeit von Candida zcylanoi-

stoff oder eine Mischung aus Kohlenwasserstoffen als 40 des AlCC 15585 infolge der Anwesenheit verschie-

Hauptkohtenstoffquelle enthält. Wahlweise kann ein dener organischer und anorganischer Verbindungen Kohlehydrat als Hauptkohlenstoffquelle verwendet oder Wirkstoffe in dem Nährmedium variieren,

werden. Wenn Kohlenwasserstoffe verwendet werden, Die Zitronensäure und die Isozitronensäure können

so können diese entweder flüssig, gasförmig oder fest aus der Fermentationsflüssigkeit mit üblichen Mitteln,

sein. 45 beispielsweise durch Ionenaustauscherbehandlung,

Beispiele für verwendbare Kohlenwasserstoffe sind durch Extraktion mit Lösungsmitteln, durch Aus-

geradkettige oder verzweigtkettige Paraffine (Alkane) fällen, durch Adsorption oder durch Chromatogra-

mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. n-Pentan, phie, abgetrennt werden.

n-Octan, n-Decau, n-Dodecan, n-Hexadecan, Iso- Die folgenden Beispiele geben eine üblich» Züchtung pentan oder Isoqctan, geradkettige oder verzweigt- 50 von Candida zeylanoides ATCC 15585 wieder. Gleichkettige Olefine, t. B. Penten-2, Hexen-1, Octen-1, zeitig ergeben sich aus den Beispielen die Gehalte an Octen-2 oder Mischungen davon und gemischte in solchen Fermentationsflüssigkeiten enthaltener Zi-Kohlenwasserstofije, z. B. Kerosin, Leichtöle, Schwer- tronensäure und Isozitronensäure. Die Prozentanöle, Paraffinöle, Oasöle und verschiedene Erdölroh- gaben stellen, wenn nicht anderes angegeben ist, materialien. SS Gewichtsprozent/Volumprozent dar.

Beispiele für geeignete Kohlehydrate sind Zucker . · , 1 und Zuckeralkohole, z. B. Glukose, Fructose, Maltose, Beispiel ι Rohrzucker, Melaissen, Stärke, Stärkehydrolysate und Candida zeylanoides ATCC 15585 wurde auf 20 ml Abfallmelassen. AWere geeignete Kohlenstoffquellen eines Nährmediums aufgeimpft, das 5°/₀ n-Paraffine sind z. B. Alkohole oder organische Säuren, beispiels- 60 (eine Mischung aus n-C₁₂-, n-C₁₃-, n-C_l4- und n-C_lsweise Glycerin, Mannit, Sorbit und Essigsäure. Diese Paraffinen), 0,5% Maisquellwasser, 0,5% Ammo Substanzen werden entweder allein oder in Form von niumnitrat, 0,05% Kaliumphosphat, 0,025% Magne-Gemischen aus zwei oder mehreren der Substanzen siumsulfat, 10 mg/1 Eisen(III)-sulfat, 4 mg/1 Manganverwendet, sulfat, 2 mg/1 Zinksulfat, 50y/l Kupfersulfat, 100 y/I

Als Stiekstoffquelle kommen verschiedene Arten 65 Ammorüummolybdat, 100 γ/Ι Borsäure und 3,0% von anorganischen oder organischen Salzen oder Ver- Calciumcarbonat enthielt; der pH-Wert des Nährbindungen in Frage, z. B. Harnstoff oder Ammonium- mediums, das in einem 250-ml-Kolben mit konischer salze, beisoielsweisft Ammoniumchlorid, Ammonium- Form enthalten war, betrug 6,0. Das Züchten erfolgte

Claims (1)

1. 0,25% Maisquellwasser 0,3% Ammoniumnitrat Kaliumdihydrogenphosphat 0,025% Magnesiumsulfat 10 mg/1 Eisen(IlI)-sulfat ' 4 mg/1 Mangansulfat 2 mg/1 Zinksulfat 5% Calciumcarbonat

   3 .4

   unter aerobem Schütteln bei WC mit 22(PUpM Nach Beendigung des Züchtens wurden jeweils

   während einer Zeitspanne von 2 Tagen. 35 mg/ml Isozitronensäure und Zitronensäure in dor

   Dae erhaltene Impfmedium wurde anschließend zu Fermentationen"Ussigkeit erhalten. Nach der im Bei»

   20 ml eines Produktionsmediums in einem 500-ml« spiel 1 beschriebenen Weise erhielt man 62 g Iso·

   Sakaguchi-Kolben gegeben. Dat, Medium besaß fol- λ zitronensäure und 60 g Zitronensäure in kristalliner

   gende Zusammensetzung: Form. *

   10% n-Parafnne (eine Mischung aus n-C,»·, Beispiel 3

   .2fe!. ".^{nd n}-^ci»-^Pwafflne") Das Züchten wurde in der gleichen Welse und unter

   ίο den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß Glukose an Stelle der n-Parafflnmischung in der Impfkultur verwendet wurde. Dabei wurde das gleiche Produktionsmedium wie im Beispiel 1 eingesetzt, ig Nach 4tägigem Züchten unter Schütteln der Kultur unter aeroben Bedingungen fand man 25 mg/ml Zitronensäure und 26 mg/ml Isozitronensäure in der er-Der pH-Wert dieses Mediums betrug 6,0. haltenen Fermentationsflüssigkeit. Unter Einhaltung

   Das Züchten wurde unter aerobem Schütteln bei der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurden 30⁰C unter Hin- und Herbewegen mit einer Geschwin- ao 200 mg Zitronensäurekristalle und 205 mg Isozitronendigkeit von 125mal pro Minute während einer Zeit- Säurekristalle erhalten, spanne von 4 Tagen durchgeführt. Dabei erhielt man „ . . . .

   30 mg/ml Zitronensäure und 28 mg/mj Isozitronen- B e ι s ρ ι e ι 4

   säure in der Fermentationsflüssigkeit. Das Züchten wurde in der gleichen Weise und unter

   Der überstehenden Lösung der Fermentations- 25 den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchflüssigkeit wurde Bariumhydroxyd zugesetzt. Das er- geführt, iedoch mit der Ausnahme, daß 0,001 % Phehaltene Bariumsalz wurde gesammelt, worauf Schwefel- nolrot dem Produktionsmedium zugesetzt wurden, säure zur Entfernung des Bariums zugesetzt wurde. Außerdem wurde l%iges Ammoniumacetat an Stelle Anschließend wurde die erhaltene überstehende Flüs- der η-Paraffine in dem Produktionsmedium verwendet, sigkeit getrocknet und mit Methanol umgesetzt, wobei 30 Der pH-Wert wurde während des Züchtens auf 7,0 ein Ätheradditionsprodukt von Bortrifluorid als Kata- eingestellt, und zwar durch Zugabe von 50⁰/„igem lysator verwendet wurde. Dabei wurde der Methyl- Ammoniumacetat.

   ester gebildet. Die Ester von Zitronensäure und Iso- Nach 4tägigem Züchten wurden 12 mg/ml Zitronenzitronensäure wurden durch Destillation fraktioniert, säuie und 10 mg/ml Isozitronensäure in der erhaltenen worauf jeder Teil verseift und neutralisiert wurde. An- 35 Fermentationsflüssigkeit festgestellt. Die Gesamtmenge schließend wurde Äthanol zugesetzt. an dem Produktionsmedium zugeführter Essigsäure,

   Dabei erhielt man 250 mg Isozitronensäure und einschließlich der während des Züchtens zugeführten 260 mg Zitronensäure in kristalliner Form. Menge, betrug 5% (als Essigsäure).

   Anschließend an die im Beispiel 1 beschriebene

   Beispiel 2 ₄₀ Abtrennungsmethode erhielt man 100mg Zitronen-

   31 eines Nährmediums der nachstehend angegebenen säure und 110 mg Isozitronensäure in Form von Zusammensetzung (pH 6,0) wurden in einem 5-1- Kristallen. Gärungsgefäß hergestellt und sterilisiert: Beispiel 5

   10% η-Paraffine (eine Mischung aus n-C_u-, _{45 Das} Züchten wurde in der gleichen Weise und unter

   n-C_l3-, n-C_u- und n-C,_s-Paraffinen) _{den g}i_ej_chen Bedingungen wie im Beispiel 2 durch-

   0,25% Maisquellwasser geführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Konzen-

   0,3% Ammoniumnitrat tration der n-Paraffinmischung in dem Produktions-

   0,05 % Kahumdihydrogenphosphat medium 15% betrug. Nach 24stündigem Züchten

   0,025% Magnesiumsulfat _{50 wur}den 2% Methanol dem Produktionsmedium zu-

   10 mg/ml Eisen(III)-sulfat gesetzt, worauf das Züchten in der gleichen Weise

   4 mg/1 Mangansulfat fortgesetzt wurde.

   2 mg/1 Zinksulfat Nach 4tägigem Züchten erhielt man 85 mg/ml Zi-

   Candida zeylanoides ATCC 15585 wurde in 2-1- tronensäure und 10 mg/ml Isozitronensäure in der Kolben unter aerobem Schütteln während einer Zeit- 55 Fermentationsflüssigkeit. Unter Einhaltung der im spanne von 2 Tagen in 300 ml einer Impf kultur ge- Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurden 100 g züchtet, welche die gleiche Zusammensetzung wie im Zitronensäurekristalle und 12 g Isozitronensäurekri-Beispiell besaß. Zwei Kolben mit der erhaltenen stalle erhalten. Impf kultur würden zu dem Produktionsmedium ge- Patentanspruch-

   geben, worauf die Fermentation bei 30⁰C unter 60 .

   Rühren (8QOUpM) durchgeführt wurde. Es wurde Verwendung von durch Züchten des Mikro-

   mit 11 Luft pro Liter Medium pro Minute belüftet. Organismus Candida zeylanoides ATCC 15585

   Das Züchten erfolgte während einer Zeitspanne von unter hierfür üblichen Bedingungen gewonnenen

   4 Tagen. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von

   NH₄OH während des Züchtens auf 6,0 eingestellt. 65 Zitronensäure und Isozitronensäure.