DE1517825C - Verfahren zur biotechnischen Her stellung von L Valin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von l-Valin durch Züchten von Mikroorganismen in n-Paraffinkohlenwasserstoff enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH- und Temperaturverhältnissen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Arthrobacter paraffineus ATCC 19559 oder Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 19561 einsetzt.

L-Valin, d. h. 2-Amino-3-methylbuttersäure, ist eine bekannte Aminosäure. Sie hat sich als für das Wachstum von Ratten wesentlich erwiesen und kommt insbesondere in faserartigen Broteinen vor. l-Valin wird medizinisch als Nahrungsmittel verwendet, wobei die empfohlene zu verabreichende Menge für Menschen 1,6 g pro Tag beträgt (vgl. Rose, Fed. Proa, Bd. 8, S. 546 [1949]).

Bisher wurde die Anreicherung von L-Valin durch' Nährmittel erfordernde Mutanten durch Verwendung eines Pantothensäure erfordernden Stammes von Escherichia coli (Journal of Bycteriology, Bd. 65, S. 388 bis 399 [1953]) sowie eines Isoleucin erfoidernden Stammes davon (vgl. Experienza, Bd. 6, S. 41 bis 50 [1950]) erzielt. Ferner wurde in jüngerer Zeit festgestellt, daß eine beträchtliche Menge an L-Valin dann angereichert werden kann, wenn ein Isoleucin erfordernder Stamrn von Micrococcus glutamicus (japanische Patentschrift 1692/62) eingesetzt wird. Jedoch wird zur Durchführung aller dieser Methoden zur Herstellung von L-Valin ein Kohlehydratmaterial als Ausgangskohlenstoffquelle verwendet.

In der USA.-Patentschrift 3 028 310 wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin beschrieben, das ebenfalls ein Kohlehydrat als Ausgangsmaterial verwendet.

Ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin, bei dessen Durchführung ein Kohlenwasserstoff als Rohmaterial verwendet wird, wird in »Agricultural and Biological Chemistry«, Bd. 27, S. 390 bis 395 [1963], beschrieben. Jedoch ist die bei der Durchführung dieses Verfahrens anfallende L-Valin-Menge sehr unbedeutend (38 mg/1), so daß sich dieses Verfahren nicht für eine Durchführung in technischem Maßstabe eignet.

Demgegenüber hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, L-Valin unter Verwendung billigerer Ausgangsmaterialien als Kohlehydrate in biotechnischem Maßstab herzustellen. Diese Aufgabe wird durch die eingangs geschilderte Verfahrensdurchführung gelöst.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als . n-Paraffinkohlenwasserstoffe η-Paraffine mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise solche mit 13 bis 18 Kohlenstoffatomen, oder Gemische davon, eingesetzt.

Geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Stärkehydrolysat, dunkle Melasse (blackstrap molasses) usw., können in dem Nährmedium zusammen mit dem Kohlenwasserstoff verwendet werden. .

Ein synthetisches Nährmedium oder ein natürliches Medium ist für die vorliegende Erfindung geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten speziellen Stammes enthält und gemäß der Erfindung einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören z. B. Substanzen wie Stickstoffquellen, anorganische Stoffe u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in der entsprechenden Menge verbraucht werden. Als Stickstoffquelle können veischiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff, oder Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojamehlhydrolysat, Kaseinhydrolysat, Fischmehl usw., verwendet werden. Auch können Gemische von zwei oder mehr dieser Substanzen eingesetzt werden.' Zu anorganischen Substanzen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, gehören notwendige anorganische Salze, wie z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Natriumchlorid, Eisensulfat, sowie andere, üblicherweise verwendete Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, Zink, Calcium u. dgl. Wenn ein rein synthetisiertes Nährmedium verwendet wird, ist es notwendig, Thiamin und Isoleucin, Threonin oder Momoserin, je nach dem speziell verwendeten Stamm, zuzusetzen. ■ ν

Die Fermentation wird unter üblichen aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobes Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur mit Einführung sterilisierter Luft bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40⁰C durchgeführt. Vorzugsweise wird, der pH-Wert des Nährmediums während der Kultivierung im Neutralbereich gehalten. Sobald die Kultivierung eingeleitet ist, tritt eine Neigung des pH-Wertes, unter 5,0 bis 8,5 abzusinken, ein. Daher wird dann vorzugsweise neutralisiert unter Zusatz von Calciumcarbonat, Ammoniakwasser, Natriumhydroxyd, Ammoniumcarbonat o. dgl. zum Kulturmedium. Die Kultivierung wird gewöhnlich 2 bis 5 Tage lang durchgeführt. Während dieses Zeitraumes sammelt sich eine beträchtliche Menge L-Valin in der Fermentationsflüssigkeit an.

Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen aus der Flüssigkeit entfernt und zur Abtrennung des L-Valin-Produktes aus der Fermentationsflüssigkeit werden übliche Mittel angewendet, z. B. Ionenaustauschharzbehandlung, wie im Beispiel 1 beschrieben. (

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Wenn nicht anders vermerkt, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

10 ml Anteile des Nährmediums werden in große Reagenzgläser gegeben. Das verwendete Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

0,1% KH₂PO₄,
0,1% Na₂HPO₄,
0,1% MgSO₄-7H₂O,
0,02% FeSO₄ -7H₂O,
0,002% MnSO₄-4H₂O,
1,5% NH₄NO₃,
0,2% Hefeextrakt,

5% ^emes Gemisches von η-Paraffinen mit 11 bis 18 Kohlenstoffatomen.

Der pH-Wert des Nährmediums beträgt etwa 7,0. Nach Sterilisierung werden in jedes Reagenzglas ge- " trennt 2% CaCO₃, das gesondert durch trockne Sterilisation hergestellt worden war, zugefügt. Dann wird eine Platinöse des Keimstammes, der durch Kultivierung von Arthrobacter paraffineus ATCC

19559 in einer Bouillon-Hefe-Agar-Schrägkultur bei 30⁰C während 24 Stunden hergestellt wurde, in die Reagenzgläser, die das vorgenannte Nährmedium enthielten, eingeimpft.

Die Kultivierung wird dann unter aeroben Bedingungen mit Vibration bei 28 ⁰C durchgeführt. Die Ergebnisse der während der Kultivierung durchgeführten Analyse sind in der Tabelle wiedergegeben.

Kultivierungszeit aage)	pH	Menge an erzeugtem ' L-Valin (mg/ml)
. ~ 3 4	5,7 5,4	6,8 8,8

Die Kultivierung wird 4 Tage bei 28° C fortgesetzt. Nach dieser Zeit werden die Mikroorganismenzellen von der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit entfernt, und man erhält ein Filtrat. 11 dieses Filtrats. (8,8 g/l L-Valin) wird auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und auf einem Ionenaustauschharz [Diaion SK-I (H-Typ)] absorbiert. Nach Waschen der Ionenaustauschharzkolonne mit Wasser wird eine von ln-Ammoniak* wasser eluierte, auf die Ninhydrinreaktion positive Fraktion gewonnen. Diese Fraktion wird bei einer Temperatur unter 4O⁰C bei vermindertem Druck konzentriert und mit Aktivkohle entfärbt. Danach werden nach Zugabe von Äthylalkohol 7,2 g Rohkristalle von L-Valin erhalten.

Bei spiel 2

Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 19561 wird als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wurde durch Schütteln in einem Boullonmedium bei 30° C während 24 Stunden kultiviert. Die erhaltene Impfkultur wird in einer Menge von 5 Volumprozent in 10-ml-Anteile des in großen Reagenzgläsern enthaltenen Nährmediums eingeimpft. Das verwendete Nährmedium ist das gleiche wie im Beispiel 1 beschrieben mit der Ausnahme, daß 5 Gewichtsprozent n-Tridecan an Stelle von 5 Gewichtsprozent eines Gemisches von η-Paraffinen verwendet wurde. Nach Sterilisierung werden 2 Gewichtsprozent von getrennt hergestellten CaCO₃ jedem Reagenzglas zugefügt, welches das Nährmedium vor der Impfung enthält.

Die Kultivierung wird unter aerobem Schütteln bei 28° C durchgeführt. Nach 4 Tagen Kultivierung hatten sich 7,5 mg/ml L-Valin in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

, Beispiel 3

Arthrobacter paraffineus ATCC 19559 wird als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wird unter Vibration in einem Bouillonmedium bei 3O⁰C während

ίο 24 Stunden kultiviert. Es wird das gleiche Nährmedium wie im Beispiel 1 beschrieben verwendet mit der Ausnahme, daß 3 Gewichtsprozent Kerosin an Stelle der beschriebenen 5 Gewichtsprozent eines Gemisches aus η-Paraffinen verwendet werden. 10-ml-Anteile des Nährmediums werden in große Reagenzgläser gegossen, und nach Sterilisierung werden 5 °/o der erhaltenen Impfkultur in jedes Reagenzglas eingeimpft. Die -Kultivierung wird —' wie im vorangehenden Beispiel — unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

ao Während der Kultivierung wird Ammoniakwasser zu dem Nährmedium zugesetzt, um den pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 zu halten. Nach 4tägiger Kultivierungszeit beträgt die in der Fermentationsflüssig- - keit angesammelte Menge an L-Valin 3,9 mg/ml.

Obgleich Kerosin speziell im Beispiel 3 angegeben ist, können selbstverständlich andere ähnliche Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Leichtöle, Schweröle, Paraffin-Öle u. dgl., verwendet werden, soweit sie n-Paraffinkohlenwasserstoffe mit einer in dem obengenannten Bereich liegenden Kohlenstoffanzahl enthalten.

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Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Valin durch Züchten von Mikroorganismen in n-Paraffinkohlenwasserstoff enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH- und Temperaturverhältnissen, dadurchgekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Arthrobacter paraffineus ATCC 19559 oder Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 19561 einsetzt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als n-Paraffinkohlenwasserstoffe η-Paraffine mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise solche mit 13 bis 18 Kohlenstoffatomen, oder Gemische davon, einsetzt.