DE1966534C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung vonjota-Serin. Ausscheidung aus: 1916421 - Google Patents

Description

Staram Corynebacterium hydrocarboclastus gen u. dgl., die von dem angewendeten Mikroorganis-

ATCC 21221 einsetzt. 15 mus in geeigneten Mengen gebraucht wurden. Als

Kohlenstoffquelie seien beispielsweise Kohlehydrate,

wie z. B. Glycose, Fructose, Maltose, Saccharose,

Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Mannose, Glycerin, Sorbit, Mannit u. dgl., oder irgendeine andere

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermen- ao geeignete Kohlenstoffquelle, wie z. B. Zuckeralkotativen Gewinnung von i.-Serin durch aerobes Züch- hole, organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure, ten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Brenztraubensäure, Fumarsäure oder Aminosäuren, Nährmedium bei einer Temperatur vor etwa 20 bis wie beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure 40° C und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,5 und u. dgl., erwähnt. Im Fall der Verwendung von Kohdurch anschließende Abtrennung des in der Kultur- as lenwasserstoffen können beispielsweise n-Paraffine, brühe angereicherten L-Serin mit hierfür üblichen Kerosin oder Erdölfraktionen, zu denen Leichtöle, Methoden. Schweröle, Paraffinöle u. dgl. gehören, in dem Nähr-L-Serin ist eine bekannte Aminosäure, die als medium als Kohlenstoffquelle oder in Kombination Arzneimittel und Kosmetikum verwendet wird. mit einer oder mehreren der obengenannten Kohlen-L-Serin ist auch eine wertvolle Substanz, die zur Her- 30 stoffquellen verwendet werden. Entweder eine einstellung anderer wertvoller Verbindungen, beispiels- zelne Kohlenstoffquelle oder ein Gemisch von zwei weise N-Methylserin, verwendet werden kann. oder mehr können angewendet werden.

Bisher wurde L-Serin dadurch hergestellt, daß man Gemäß der Erfindung enthält das Nährmedium DL-Serin durch eine synthetische Methode herstellte jedoch keine üL-Glycerinsäure. Folglich ist diese und dann das Produkt in die entsprechenden opti- 35 Substanz von den im Rahmen der Erfindung verschen Isomeren trennte. In jüngster Zeit wurde ein wendeten Kohlenstoffquellen ausgeschlossen.
Verfahren zur Herstellung von L-Serin unter An- Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anwendung von ηL-GIycerinsäure als ein Substrat organischer oder organischer Salze oder Verbindunbekannt (japanische veröffentlichte Patentschrift gen, z. B. Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder 17728/67). Jedoch ist bisher kein Verfahren zur Her- «o Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumchlorid, Amstellung beträchtlicher Mengen L-Serin aus unter moniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, geringem Kostenaufwand zugänglichen Kohlehydra- Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat u. dgl., ten, Kohlenwasserstoffen, anderen Kohienstoffquellen oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. und Stickstoffquellen ohne die Notwendigkeit der Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Anwendung kostspieliger Substanzen, wie beispiels- 45 Pepton, Fischmehl, oder verschiedene Abbausubstanweise Glycerinsäure als Ausgangsmaterial, bekannt. zen davon, Bouillon, Caseinhydrolvsate, lösliche Zwar ist aus der USA.-Patentschrift 3 222 258 ein Fischsubstanz, Reiskleieextrakt, entfettete Sojaboh-Verfahren bekannt, nach dem unter anderem auch nenrückstände oder Abbausubstanzen davon, Chry-L-Serin unter aeroben Bedingungen erhalten werden salishydrolysate u. dgl., verwendet werden. Diese Subkann, jedoch liegen die Ausbeuten an i.-Serin bei nur 5° stanzen können wiederum entweder einzeln oder in wenigen Milligramm pro Liter. Kombinationen von zwei oder mehr verwendet wer-

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe den.

zugrunde, ein in industriellem Maßstab wirtschaftlich, Zu den anorganischen Verbindungen, die zu dem zuverlässig und mit hohen Ausbeuten durchführbares Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Fermentationsverfahren zur fermentativen aeroben 55 Magnesiumsulfat, Natriumphosphot, Kaliumdihydro-Herstellung von i.-Serin zu schaffen. genphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen-Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der ein- sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumgangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch ge- chlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat löst, daß man als Mikroorganismus den isoleucin- u. dgl.

bedürftigen Stamm Brevibacterium ketoglutamicum 60 Da der verwendete Mikroorganismus noch andere ATCC 21222 oder den isoleucinbedürftigen Stamm Nährstoffe zu seinem Wachstum benötigt, sollen Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 natürlich entsprechende Mengen der zur Befriedigung einsetzt. der speziellen Bedürfnisse erforderlichen Nährstoffe Als Ergebnis vielfältiger Untersuchungen hinsieht- zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Diese Nährlich der Herstellung von L-Serin in industriellen Men- 65 stoffe sind bisweilen in den dem Medium als Stickgen bei geringen Kosten wurde festgestellt, daß be- stoffquelle zugesetzten natürlichen Substanzen entträchtliche Mengen L-Serin erzsugt und in einer halten und müssen nicht eigens zugesetzt werden. Ge-Kulturflüssigkeit angesammelt werden können, wenn gebenenfalls können diese Substanzen jedoch zu dem

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Medium als solche zugesetzt werden und enthalten 0,1% MgSO₄ χ 7 JiA

Wachstumsfaktoren, wie z.B. Aminosäuren, Vita- 2% CaCo,,

mine, wie beispielsweise Thiamin, Cobalamia u. dgl., 1 mg/1 Thi'amin,

oder Biotin. Die beiden im erfindungsgemäßen Ver- 0,5 °/o Caseinhydrolysate,

fahren einzusetzenden Stämme benötigen Isoleucin 5 1 ml/I der folgenden Lösung A.

zum Wachstum.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, Zusammensetzung der Losung A:

wie z. B. aerobes Schütteln der Kultur oder unter Be- NaJB₄O₇ χ 10 H₈O 88 mg/l

lüften und Rühren einer Subraerskultur bei einer (Nn₄J₈Mo₇O₂₄ χ 4 H₀O 37 mg/1

Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40° C und io FeCL₁XOH₂O Γ 970 mg/1

einem pH-Wert von beispielsweise etwa 5 bis 9,5 ZnSO₄χ7H₈O .. 8,8mg/1

durchgeführt. Selbstverständlich können die Tem- CuSO₄XSH₃O 20 mg/1

peratur und der pH-Wert auch außerhalb der be- MnCI₂ χ 4 H₂O 7,2 mg/1

schriebenen Grenzen variieren entsprechend den

Wachstumserfordernissen des speziellen verwendeten 15 Die Kultivierung wird dann unter aerobem Schüt-

Mikroorganismus. Um hohe Ausbeuten an L-Serin zu teln der Kultur in dem Fermentationsmedium bei

erhalten, ist es erwünscht, den pH-Wert des Kultur- 30' C über einen Zeitraum von 96 Stunden durchge-

mediums etwa iieim Neutralpunkt (7,0) während der führt. In der Kulturflüssigkeit wird dabei das L-Serin

Kultivierung zu halten. Nach etwa 1 bis 5 Tagen in cir.er Menge von 1,7 mg/ml gebildet.

Kultivierungszeit unter diesen Bedingungen haben 20 2 1 des nach der Entfernung der Mikroorganismen-

sich beträchtliche Mengen L-Serien gebildet und in zellen und der anderen unlöslichen Stoffe aus der

der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt. Kulturflüssigkeit erhaltenen Filtrats werden auf eine

Nach beendeter Kultivierung werden die Mikro- Kolonne mit einem stark sauren kationischen PoIyorganismenzellen und unerwünschte Ausfällungen styrolaustauscherharz aufgegeben, um das L-Serin von der Kulturflüssigkeit abgetrennt, und das L-Serin as zu adsorbieren. Die Kolonne wird mit Wasser gewird aus der Flüssigkeit durch übliche Mittel, wie bei- waschen und mit Ammoniakwasser eluiert. Die gespielsweise eine Ionenaustauscherharzbehandlung, sammelten L-Serinfraktionen werden eingeengt. Auf Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorp- diese Weise erhält man 2,3 g L-Serinkristalle.
tion, Chromatographie, Konzentrierung od. dgl., ge- . -19
wonnen. Eine besonders geeigrote Methode zur Ge- 30 Beispiel
winnung ist die lonenaus'.auscbharzbehandlung, die Die Kultivierung wird in der gleichen Weise und im folgenden Beispiel 1 beschrieben wird. unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1

Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Kulturme-

Prozentgehalte in den Beispielen und der gesamten dium verwendet wird, das 5 °/o Sorbit an Stelle des

Beschreibung auf das Gewicht pro Liter Wasser. 35 im Beispiel 1 angegebenen n-Alkangemisches als

. 1, ^e'^rie Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium

^öeisP^iel ' enthält. Die Menge des gebildeten L-Serins beträgt

Als Impfmikroorganismus wird der L-Serin bil- 1,2 mg/ml.

dende Stamm Brevibacterium ketoglutamicum BeisDiel 3

ATCC 21222 verwendet. Dieser Stamm leitet sich 40 ^V

von dem Stamm Brevibacterium ketoglutamicum Als Impf mikroorganismus wird der L-Serin bil-

ATCC 15588 ab und benötigt für sein Wachstum dende Stamm Corynebacterium hydrocsrboclastus

Isoleucin. ATCC 21221 verwendet. Dieser Stamm leitet sich

Dieser Stamm wird in einen konischen 250-ml- von dem Stamm Corynebacterium hydrocarboclastus

Kolben, der 20 ml eines sterilisierten Impfkulturme- 45 ATCC 15592 ab und benötigt für sein Wachstum

diums mit 2 %> Sorbit, 1 °/o Fleischextrakt, 1 °/o Pep- Isoleucin.

ton, 0,5 %> Hefeextrakt, 0,3 °/o NaCl und 50 mg/1 Die Kultivierung wird auf die gleiche Weise und

m-Diaminopimelinsäure enthält, eingeimpft. Die KuI- unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1

tivierung wird unter aerobem Schütteln bei 30° C durchgeführt. Die Menge des dabei gebildeten L-Se-

24 Stunden lang durchgeführt, wobei eine Impfkultur 50 rins in der Kulturflüssigkeit beträgt 1,9 mg/ml,

erhalten wird. _ . -14

7 ml der erhaltenen Impf kultur werden in einen ko- B e 1 s ρ 1 e I 4

nischen 250-ml-Kolben eingeimpft, der 20 ml eines Die Kultivierung wird in der gleichen Weise und

sterilisierten Fermentationsmediums (pH 7,4) der fol- unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1

genden Zusammensetzung enthält. 55 durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 5 °/o Sorbit an Stelle der im

5 °/o n-Alkangemisch (C₁₂ — C₁₄), Beispiel 1 als Kohlenstoffquelle in dem Fertnenta-

2°/o (NH₄)₂SO₄, tionsmedium verwendeten n-Alkanmischung verwen-

0,1 %> K₂HPO₄, det wird. Die Menge des in der erhaltenen Kultur-

0,1 °/o KH₂PO₄, 60 flüssigkeit gebildeten L-Serins beträgt 1,3 mg/ml.

Claims (1)

1 2

ό t t „_c„n,nh. ^{einer der} beWen obengenannten ATCOStSmme in

menmnsprucn. _{emm Nghrmediumt a(ts} Kohlehydrate, Kohlenwas-

Verfahren zur fermentativen Gewinnung von serstoffe oder andere Kohlenstoffquellen u. dgl. ent-

L-Serin durch aerobes Züchten eines Mikroorga- hält, und insbesondere ohne die Zugabe von in.-Gly-

nismus in einem bierfür üblichen Nährmedium 5 cerinsäure zu dem Medium kultiviert wird,

bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und Sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch

einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,5 und durch ein natürliches Nährmcdium ist zur Kultivierung der

anschließende Abtrennung des in der Kulturbrühe erfindungsgemäß verwendeten zwei Stämme geeig-

angereicberten L-Serin mit hierfür üblichen Me- net, sofern es die wesentlichen Nährstoffe zum

tboden, dadurch gekennzeichnet, daß io Wachstum des verwendeten Stamms aufweist Der-

man als Mikroorganismus den isoleucinbedürfti- artige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören

gen Stamm Brevibacterium ketoglutamicum Substanzen, wie beispielsweise eine Kohlenstoff-

ATCC 21222 oder den isoleucinbedürftigen quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindun-