DE1792495C

DE1792495C - Verfahren zur Herstellung von L Threonin

Info

Publication number: DE1792495C
Application number: DE19681792495
Authority: DE
Inventors: Katsumi Nasu Katsuya Hofu Akeyama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-09-12
Filing date: 1968-09-10
Publication date: 1973-04-19

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen von Escherichia coli in hierfür üblichen Nährmedien bei pH-Werten von 5 bis 8 und Temperaturen von 20 bis 4O⁰C, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Escherichia coli Escherichia coli ATCC 21148, Escherichia coli ATCC 21 272 oder Escherichia coli ATCC 21149 einsetzt und dem Nährmedium mindestens ein Antibiotikum zusetzt. Durch die Zugabe des Antibiotikums werden größere Mengen an L-Threonin in der Kulturflüssigkeit angereichert sowie die Umwandlung und der Verlust an L-Threonin verhindert.

L-Threonin ist eine essentielle Aminosäure für die Ernährung von Mensch und Tier. Es sind biotechnische und synthetische Herstellungsverfahren für Threonin bekannt. Die meisten der Synthese-Verfahren sind Verfahren zur Herstellung von DL-Threonin, was eine Abtrennung des L-Threonins erforderlich macht. Andere Verfahren beinhalten eine Abtrennung des gewünschten Produktes aus natürlichen Substanzen. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus haben diese Verfahren zahlreiche Nachteile und Mangel.

Aus den französischen Patentschriften 1427 303 und 1428 972 sind Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure auf mikrobiologischem Wege bekannt, bei denen dem Nährmedium Antibiotika zu- gesetzt werden.

Die bisher bekannten biotechnischen Verfahren zur Herstellung von L-Threonin sind Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Fermentation, die unter Verwendung von Homoserin als Hauptausgangs material (USA.-Patentschrift 3 099 604; »Amino Acid and Nucleic Acid«, Bd. 10, S. 68 [1964]; französische Patentschrift 1 484 846) sowie unter Verwendung einer nährstoffbedürftigen Mutante von Escherichia coli arbeiten; in den USA.-Patentschriften 2 937122 und 2 937121 wird der Einsatz der Mikroorganismenstämme Escherichia coli ATCC 13 071 und ATCC 13 070 vorgeschlagen. Schließlich wird in der französischen Patentschrift 1 486 045 ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Threonin vorgeschla gen, bei welchem ein Mikroorganismus der Gattung Azotobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Candida, Saccharomyces oder Streptomyces in einem !.-Asparaginsäure enthaltenden wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird. Diesen bekannten Fermentationsverfahren haften bedeutende Mängel an. Homoserin ist als Ausgangsmaterial kostspielig, bei Verwendung der in den USA.-Patentschriften vorgeschlagenen Stämme Escherichia coli ATCC 13 071 und 13 070 lassen sich unter den Bedingungen des er findungsgemäßen Beispiels 1 nur Spuren an L-Thre onin gewinnen.

Auch bei den anderen bekannten Verfahren sind die Ausbeuten unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Beispiels 1 gering.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein in einfacher Weise und wirksam in industriellem Maßstab bei niedrigen Kosten und hohen Produktausbeuten durchzuführendes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin zu ent wickeln.

Tabelle Mikroorganismenstainm

Verwendetes Medium

	Abgelaufene Züchtungsdauer	(Stunden)	96
		72	3,8
24	48	5,1	4,2
1.3	3.2	5,8	3,0
1.8	3,8	4,7
1.4	3,6

120

Escherichia coli ATCC 21272 Escherichia coli ATCC 21148 Escherichia coli ATCC 21149

Grundmedium

Anmerkung 1: Die Werte in der Tabelle geben die gebildeten Mengen an L-Threonin in g/l au. Anmerkung 2: Zusammensetzung pro Liter des Züchtungsmediums: Grundmedium: 7Sg Fructose 14 g (NHJ₁SO, 2 g KH₁PO₁ Ig MgSO₄ -7H₁O 20 g CCO,

100 mg Diaminopimelinsäure 100 mg L-Lysinhydrochlorid

Medium A: Zu dem Grundmedium wurden 100 mg Methionin und 200 mg Isoleucin pro Liter hinzugegeben. Medium B: Zu dem Grundmedium wurden 100 mg Methionin pro Liter hinzugegeben.

Spuren

1,2 Spuren

3 4

Es wurden Fermentationsverfahren unter Verwen- dem speziellen Typ des verwendeten Antibiotikums dung von L-Threonin-produzierenden Mutanten ge- variiert.' Es ist daher erwünscht, daß man die optimal nauer untersucht, und zwar im Falle der Stämme geeignete Menge im Hinblick auf den Typ des Anti-Escherichia coli ATCC 21148, — ATCC 21149 biotikums und mit Bezug auf den Zeitpunkt, zu dem und — ATCC 21 272 im Hinblick auf die für die BiI- 5 das Antibiotikum zu dem Medium hinzugesetzt wird, dung von L-Threonin optimalen Bedingungen. Als auswählt. Im Falle von Streptomycin, welches als ein Ergebnis wurde gefunden, daß die durch die drei geeignetes antibiotisch.es Zusatzmittel gemäß der ErStämme angereicherte Menge an L-Threonin nach findung angesehen wird, liegt der Bereich der wirkeiner bestimmten Züchtungsdauer ein Maximum er- samen Konzentration im allgemeinen bei etwa 10 bis reicht und daß sich die gebildete Menge an L-Threonin io 300 mg/Liter des Mediums. Allgemein kann gesagt danach bei einer Fortsetzung der Züchtung verringert. werden, daß etwa 10 bis 1000 mg des Antibiotikums Dies ist darauf zurückzuführen, daß der verwendete pro Liter des Mediums verwendet werden sollten. Es L-Threonin-produzierende Stamm bei fortschreitender konnte kein besonderer Unterschied zwischen der Züchtungsdauer nach dem Maximum eine Aktivität gleichzeitigen Zugabe der gesamten Menge an Antizur Umwandlung und damit zur Verminderung der 15 biotikum und der Zugabe des Antibiotikums in mehvorliegenden Menge an L-Threonin gewinnt. Es ist reren Anteilen während eines geeigneten Zeitraums klar, daß dieses Phänomen nicht nur auf einer Herab- festgestellt werden.

setzung der L-Threonin-Bildungsaktivität beruht. Diese Entweder ein synthetisches oder ein natürliches

Rückschlüsse sind aus den Werten der Tabelle 1 er- Nährmedium ist beim erfindungsgemäßen Verfahren äiehtlich. ao brauchbar, solange es die für das Wachstum des ver-

Aus den obigen Ergebnissen wurde von den Erfin- wendeten Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe dem gefolgert, daß die Schaffung eines Verfahrens zur enthält. Solche Nährstoffe sind in der Technik beselektiven Verhinderung des Auftretens oder Tätig- kannt und umfassen Substanzen wie eine Kohlenstoffwerdens des Umwandlungsmechanismus zusammen quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Vertonet dem Verlust von L-Threonin durch den L-Threonin- as düngen u. dgl. in geeigneten Mengen, die von dem bildenden Stamm selbst notwendig ist, um L-Threonin verwendeten Mikroorganismus ausgenutzt werden, vorteilhaft durch Fermentation herzustellen. Als Er- So können als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenhydrate, gebnis gelang es gemäß vorliegender Erfindung, die wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke-Bildung von L-Threonin über einen langen Zeitraum hydrolysate, Melassen, Sorbit, Mannit, Glycerin ohne Verlust an L-Threonin in der Kulturflüssigkeit 30 usw., oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, fortzusetzen, indem man mindestens ein Antibiotikum wie organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure zu dem Züchtungsmedium mit den genannten drei usw., verwendet werden. Diese Substanzen können Stämmen hinzugibt, bevor das L-Threonin in der KuI- entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder turflüssigkeit umgewandelt wird und verlorengeht. mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle

Antibiotika, die sich zur erfindungsgemäßen Ver- 35 können verschiedene Arten anorganischen oder orgawendung eignen, sind z.B. Streptomycin, Dihydro- nischen Stickstoffverbindungen verwendet werden, streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Oxy- wie ζ. B. Harnstoff, wäßriges Ammoniak oder Amtetracyclin, Chlortetracyclin, Kanamycin, Polymyxin B moniiunsalze, z.B. Ammoniumchlond, Ammonium- und Viomycin. Diese Aufzählung gibt jedoch lediglich sulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Am-Beispiele wieder, und die erfindungsgemäßen Wifkun- 40 moniumphosphat usw., oder natürliche stickstoffgen können auch mit anderen Antibiotika erzielt haltige Stoffe, wie Maisquellfiüssigkeit, Hefeextralct, werden. So können in der Praxis Salze oder Derivate Fleischextrakt, Pcpton, Fischmehl, Bouillon, Caseinderselben verwendet werden, solange die erfindungs- hydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reis gemäßen Ziele erreicht werden. Gemische geeigneter kleieextrakt usw. Auch diese Substanzen können einAntibiotika können ebenfalls verwendet werden. 45 zein oder als Kombination von zweien oder mehreren

Die Antibiotika können zu jedem Zeitpunkt zu dem verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die Zuchtungsmedium hinzugegeben werden, bevor das zu dem Medium hinzugegeben werden können, sind L-Threonin umgewandelt wird und verlorengeht. Wenn z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumeine zu große Menge an Antibiotikum während der dihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Vermehrung des Mikroorganismus zu einem früheren 5» Eisensulfat, Manganchloridv Calciumchlond, Natnum-Zeitpunkt der Züchtung hinzugesetzt wird, kann die chlorid, Zinksulfat usw. Außerdem müssen die für das Vermehrung des Mikroorganismus in dem zur Bildung Wachstum der Mikroorganismen essentielle Substanvott L-Threonin ausreichendem Maße in einigen Fällen zen zu dem Medium hinzugegeben werden Dazu gegehemmt werden. Der gewünschte Effekt wird daher hören außer den obengenannten Materialien Mone am besten erreicht, indem man das Antibiotikum zu 55 wie Aminosäuren, z. B. Diaminopimelinsäure, Metndem Medium hinzugibt, nachdem die Vermehrung des ionin, Isoleucin, Lysin u. dgl., Vitamine, Biotin, kom-Mikroorganismus während der Züchtungsdauer ein plexe Nährstoffe, wie z. B. Aminosäuren in horm von Gleichgewicht erreicht hat. Selbstverständlich variiert tierischen oder pflanzlichen Proteinhydrolysaten, nut der genaue Zeitpunkt der Zugabe etwas entsprechend Nucleinsäuren in Beziehung stenende Materialien dem Typ des verwendeten Mikroorganismus, der Zu- «« u. dgl.

sammensetzung des Kulturmediums und den spe- Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen wie

zielten Züchtungsbedingungen. Als Ergebnis von Ver- z. B. aerobem Schütteln oder Rühren und Belüften der suchen, bei denen die Zeit mit dem bis dahin vor- Kultur, bei einer Temperatur von z. B. etwa 20 bis handenen L-Threonin verglichen wurde, ergab sich, 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 durchdaß im allgemeinen das Antibiotikum etwa 8 bis «5 geführt. Diese Bedingungen sind ment festetehend, 72 Stunden nach Beginn der Züchtung hinzugefügt sondern variieren etwa* in Abhängigkeit von dem verwerfen sollte. Weiterhin wurde beobachtet, daß die wendeten Mikroorganismus, hinzuzufügende Menge an Antibiotikum erheblich mit Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhöht sich

die in der Kulturflüssigkeit angereicherte Menge an L-Threonin beträchtlich. 10 bis 15 g L-Threonin pro Liter können angereichert werden, im Vergleich zu einer maximal angereicherten Menge von etwa 3 bis 5 g pro Liter, wenn keine Antibiotika hinzugegeben werden. Es ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung die vorteilhafte Produktion von L-Threonin in industriellen Maßstab ermöglicht.

Nach Abschluß der Züchtung, die im allgemeinen etwa 2 bis 6 Tage dauert, kann das L-Threonin mit den üblichen Methoden gewonnen werden, z. B. durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie od. dgl.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

20

40 ml eines Mediums, enthaltend pro Liter 20 g Glucose. 10 g Pepton, 10 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 50 mg Diaminopimelinsäure, werden in einen Erlenmeyerkolben von 250 ml Inhalt eingebracht. Nach dem Sterilisieren wird Escherichia ATCC 21148 aj (eine nährstoffbedürftige Mutante, die als wesentliche Faktoren für ihr Wachstum Diaminopimelinsäure und Methionin benötigt) eingeimpft und bei 3O⁰C 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute gezüchtet, um eine Einsaatkultur zu erhalten.

Ein Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung pro Liter wird hergestellt:

75 g Fructose
14 g (NHJ₂SO₄
2 g KH₂PO₄
1 g MgSO₄ · 7 H₂O
20 g CaCO₃

100 mg Diaminopimelinsäure 100 mg DL-Methionin
100 mg L-Lysinhydrochlorid

40 ml des Fennentationsmediurns werden jeweils in einen Erlenmeyerkolben von 250 ml Inhalt eingebracht. Nach dem Sterilisieren werden 4 ml der Einsaatkulturfiüssigkeit eingeimpft, und die Züchtung wird unter aerobem Schütteln mit einer Geschwindigkeit von 220 Schüttelbewegungen pro Minute und bei 30⁰C 120 Stunden lang durchgeführt. Nach 30stündiger Züchtung werden verschiedene Antibiotika gemäß den Angaben der Tabelle 2 zu den jeweiligen Kolben hinzugefügt.

Die in der Kulturflüssigkeit nach Abschluß der Züchtung gebildeten Mengen an L-Threonin sind in Tabelle 2 angegeben, und zwar im Vergleich zu der Situation nach 72 Stunden- Züchtung und zu einem Vergleichsversuch, bei dem kein Antibiotikum zu dem Medium hinzugegeben worden war.

Tabelle Antibiotikum

Zugegebene Menge an Antibiotikum

Nach 72 Stunden

gebildete Menge

an L-Threonin

(g/l)

Nach 120 Stunden

gebildete Menge

an L-Threonin

(g/l)

Streptomycin (Sulfat)

Dihydrostreptomycin (Sulfat)

Chloramphenicol

Tetracyclin

Chlortetracyclin

Oxytetracyclrn

Kanamycin (Sulfat)

Polymyxin B

Viomycin (Sulfat)

Keine Zugabe

30
30
50
50
50
50
40
20
30

6,3
6,8
5,7
6,2
6,0
5,4
6,3
6,0
5,6
5,8

12,3

11,2

11,3

10,5

9,8

9,6

11/7

11,0

10,3

1,2

Beispiel 2
(Vergleichsversuche)

Zum Vergleich mit dem Fermentationsverfabren der USA.-Patentschriften 2 937 122 und 2 937 121 wurden die Mikroorganismenstämme Escherichia coli ATCC 13 071 und — ATCC 13 070 dieser Patentschriften in dem gleichen Medium und unter den gleichen Züchtungsbedingungen wie im obigen Beispiel 1 gezüchtet |nur mit der Ausnahme, daß 30 mg Streptomycin-(Sulfat) pro Liter zu dem Medium 30 Stunden nach Beginn der Züchtung als Antibiotikum zugesetzt wurden].

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Teststämme	L-Threonin-Ausbeute nach 120 Stunden von Beginn der Züchtung an
E. coli	ATCC 13 071 ....	5,8 mg/ml
E. coli	ATCC 13 070 ....	6,5 mg/ml
E. coli	ATCC 21 148 ....	12,3 mg/ml
Π. coli	ATCC 21 149 ....	12,6 mg/ml
L^;. coli	ATCC 21 272 ....	8,9 mg/ml

Diese Ergebnisse lassen erkennen, daß die L-Threonin-Ausbeuten bei Einsatz der erfindungsgemäß verwendeten Stämme beträchtlich höher liegen als die L-Threonin-Ausbeuten bei Einsatz der Stämme ATCC 13 071 und ATCC 13 070 aus den USA.-Patent-Schriften 2 937 122 und 2 937 121.

Bei dem Einsatz der Mikroorganismen der USA.-Patentschrift 3 099 604 und der französischen Patentschriften 1486 045 und 1484 846 gemäß dem vorstehenden Beispiel 1 wurden nur Spuren von L-Threonin erhalten.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß die hinzugegebene Menge an Streptomycin (Sulfat) und die Zeitpunkte der Zugabe variiert werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3 ^ao

Zeitpunkt der Zugabe (Zeit nach Beginn der Züchtung)	Menge der Zugabe (mg/1)	Nach 72 Stun den gebildete Menge an L-Threonin (g/l)	Nach 120 Stun den gebildete Menge an L-Threonin (g/l)
—	keine Zugabe	5,3	0,8
» f	40 80	5,9 6,0	8,3 7,2
« {	40 80	6,3 6,3	10,9 9,8
» I	40 80	6,0 5,6	11,8 12,3
40 ί	40 80	5,5 5,3	13,2 13,0
« {	40 80	4,8 5,0	13,2 11,8
60 j	40 80	5,3 5,7	7,2 9,3
» ί	40 80	5,6 5,6	9,8 5,6

35

45

Beispiel 4

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß die in dem Fermentationsmedium verwendete Kohlenstoffquelle Glucose ist und pro Liter 50 mg Streptomycin als antibiotisches Zugabemittel verwendet wird. Die in der erhaltenen Kulturflüssigkeit nach Abschluß der Züchtung gebildete Menge an L-Threonin beträgt 12,2 g/l.

Wenn man zu dem Medium kein Streptomycin hinzufügt, werden pro Liter nur 1,1 g L-Threonin erhalten.

Beispiel 5 ^

Ein Einsaatmedium wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 hergestellt, jedoch unter Verwendung von Escherichia coli ATCC 21272 (einer nährstoffbedüiftigen Mutante, welche als wesentliche Faktoren «5 für ihr Wachstum Diaminopimelinsäure, Methionin und Isoleucin benötigt).

Das verwendete Fermentationsmedium besitzt pro Liter folgende Zusammensetzung:

50 g Glycerin
Hg(NHO₂SO₁
2 g KH₂PO₄
1 g MgSO₄ · 7 H₂O
20 g CaCO₃

100 mg Diaminopimelinsäure
100 mg OL-Methionin
200 mg L-Isoleucin
100 mg L-Lysinhydrochlorid

Jeweils 40 ml des Fermentationsmediums werden in einem Erlenmeyerkolben von 250 ml Inhalt eingebracht. Nach dem Sterilisieren wird die Einsaatkultur eingeimpft und die Züchtung unter aerobem Schütteln der Kultur mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute bei 32⁰C durchgeführt. Nach 35 Stunden Züchtung werden pro Liter 50 mg Streptomycin (Sulfat) zu dem Medium hinzugegeben, und die Züchtung wird weitere 120 Stunden lang durchgeführt. Die in der Kulturflüssigkeit nach Abschluß der Züchtung angereicherte Menge an L-Threonin beträgt 8,3 g./l.

Zum Vergleich wird die Züchtung ohne Zugabe von Streptomycin zu dem Medium ausgeführt. Die nach 72 Stunden der Züchtung angereicherte Menge an L-Threonin beträgt 4,7 g/l. Nach 120 Stunden ist das i.-Threonin jedoch fast vollständig verlorengegangen.

Beispiele

Eine Einsaatkultur wird in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise mit Escherichia coli ATCC 21 149 (einer nährsioffbedürftigen Mutante, die zu ihrem Wachstum Diaminopimelinsäure benötigt) erhalten.

Ein wäßriges Nährmedium der folgenden Zusammensetzung pro Liter wird für die Fermentation verwendet :

75 g Fructose
Mg(NH₄J₂SO,
2 g KH₂PO₁
1 g MgSO. - 7 H-O
20 g CaCO₃

100 mg Diaminopimelinsäure
100 mg L-Lysinhydrochlorid

Jeweils 40 ml des Fermentationsmediums werden in einen Erlenmeyerkolben von 250 ml Inhalt eingebracht. Nach dem Sterilisieren wird die obige Einsaatkultur in das Medium eingeimpft Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln mit 220 Schüttelbewegungen pro Minute bei 30⁰C durchgeführt. Nach 40 Stunden Züchtung werden pro Liter 80 mg Streptomycin (Komplex) zu dem Medium hinzugesetzt, und die Züchtung wird weitere 120 Stunden lang durchgeführt Die in der erhaltenen Kulturflüssigkeit nach Abschluß der Züchtung gebildete Menge an L-Threonin beträgt 7,8 g/l.

Zum Vergleich wird die Züchtung ohne Zugabe von Streptomycin zu dem Medium ausgeführt. Nach 72 Stunden Züchtung sind pro Liter 4,3 g L-Threonin in der Flüssigkeit angereichert worden. Nach 120 Stunden Züchtung ist es jedoch fast vollständig verschwunden.

309 £167314

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen von Escherichia cob' in hierfür üblichen Nährmedien bei pH-Weiten von 5 bis 8 und Temperaturen von 20bis40⁰C, dadurch gekennzeichnet, daß man als Escherichia coli Escherichia coli ATCC 21148, Escherichia coü ATCC 21 272 oder Escherichia coli ATCC 21149 einsetzt und dem Nährmedium mindestens ein Antibiotikum zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Kanamycin, Polymyxin B oder Viomycin verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum innerhalb des Zeitraums von 8 bis 72 Stunden nach Beginn der Züchtung dem Nährmedium zusetzt.