DE1642717B1 - Verfahren zur Herstellung von L-Prolin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-ProlinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und
Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der
Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge.
Es ist bereits bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung einer Mutanten
von Escherichia coli aus Glutaminsäure hergestellt werden kann. Es ist ferner bekannt, daß sich zur
fermentativen Herstellung von L-Prolin auch Neurospora sitophila und verschiedene Hefen eignen.
Aus der französischen Patentschrift 1 427 534 ist es bereits bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem
Wege in einem ein Kohlenhydrat enthaltenden Nährmedium angereichert wird, wenn in diesem Brevibacterium
flavum ATCC 15 940 kultiviert wird. Aus der USA.-Patentschrift 3 222 258 ist schließlich bereits
ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung von Mikroorganismen
der Gattung Pseudomonas und Candida in einem üblichen, Biotin, Ammonium- und Chloridionen
in einer Konzentration von etwa 0,1 Mol/Liter enthaltenden Nährmedium bekannt.
Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Prolin sind jedoch wegen der damit erzielbaren
geringen Ausbeute für die großtechnische Herstellung dieser bekannten Aminsäure nicht geeignet.
Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin
anzugeben, mit dessen Hilfe die den bisher bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile beseitigt werden
können und das insbesondere zur großtechnischen Herstellung von L-Prolin geeignet und einfach durchführbar
ist.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man ganz bestimmte Mikro-Organismen
der Gattung Micrococcus glutamicus verwendet und in dem Nährmedium eine Mindestkonzentration
an Ammonium- und Chloridionen von jeweils 0,5 Mol pro Liter aufrechterhält.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von
Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien
mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden
Menge, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC
21157, 21158 oder 21159 eingesetzt wird und die
Ammonium- und Chloridionönkonzentration im Nährmedium jeweils mindestens 0,5 Mol pro Liter
beträgt.
Bezüglich der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium ist es zweckmäßig, die Kultivierung unter
solchen Bedingungen durchzuführen, bei denen die Biotinkonzentration auf einem Wert gehalten wird,
30. bei dem die Mikroorganismenzellen optimal wachsen.
Dabei hat sich gezeigt, daß die Konzentration an Ammoniumionen in dem Nährmedium möglichst hoch
gehalten werden muß. Die Bildung von L-Prolin wird begünstigt, wenn die Konzentration des Ammoniumsalzes
in dem Nährmedium auf einem Wert von mindestens etwa 4 Gewichtsprozent gehalten wird,
insbesondere dann, wenn als Ammoniumsalz Ammoniumchlorid verwendet wird. Ferner wurde gefunden,
daß durch die Anwesenheit von zusätzlichen Chloridionen die Bildung von L-Prolin in synergistischer
Weise begünstigt wird.
Die Abhängigkeit der L-Prolinbildung von der
Konzentration der Ammoniumionen und Chloridionen sowie der Konzentration an Biotin in dem
Nährmedium geht aus den folgenden Tabellen hervor:
35
40
0 | 1,23 | NaCl, g/dl (Cl" Mol/l) | 2,46 | 3,69 | 4,92 | 6,15 | 7,38 | |
(NHJ2SO4 in g/dl, | (0) | (0,187) | (0,374) | (0,561) | (0,748) | (0,935) | (1,122) | |
(NH/ in Mol/Liter) | ■ 3,2 | 4,8 | 6,3 | 10,4 | 12,2 | 15,3 | 13,2 | |
5,7 | 9,4 | 11,9 | . 15,6 | 17,4 | 19,0 | 14,8 | ||
1,26 (0,187) | 7,2 | 11,8 | 18,2 | 24,4 | 28,3 | 27,0 | 19,1 | |
2,52 (0,374) | 9,4 | 13,8 | 21,4 | 27,0 | 32,4 | 30,0 | 24,6 | |
3,78 (0,561) | 10,1 | 16,7 | 25,4 | 29,5 | 30,4 | 21,4 | 16,6 | |
5,04 (0,748) | 10,2 | 15,3 | 21,8 | 20,6 | 17,6 | 13,7 | 10,4 | |
6,30 (0,935) | ||||||||
7,46 (1,122) | ||||||||
Bemerkung 1) zu Tabelle I
Zusammensetzung des Nährmediums:
Glukose 18 g/dl
(NH4J2SO4 wie in Tabelle I angegeben
NaCl wie in Tabelle I angegeben
KH2PO4 0,10 g/dl
K2HPO4 0,10 g/dl
MgSO4 ■ 7H2O 0,05 g/dl
FeSO4 · 7H2O.
0,002 g/dl
MnSO4 · 4H2O 0,002 g/dl
MnSO4 · 4H2O 0,002 g/dl
ZnSO4-7H2O .'.
NiCl2 -6H2O
K2CrO4
Biotin
Thiaminhydrochlorid .
Fleischextrakt
Harnstoff
CaCO3
0,001 g/dl
0,001 g/dl
0,001 g/dl
100 -//I
2 mg/1
0,5 g/dl
0,5 g/dl
5,0 g/dl
0,001 g/dl
0,001 g/dl
100 -//I
2 mg/1
0,5 g/dl
0,5 g/dl
5,0 g/dl
Bemerkung 2) zu Tabelle I Züchtungsbedingungen
20 ml des Nährmediums werden in einen Sakaguchi-Kolben gegossen und sterilisiert. Der Stamm Micrococcus glutamicus ATCC 21 157
wird eingeimpft und unter aeroben Bedingungen unter Schütteln bei 28 bis 300C 96 Stunden lang kultiviert.
Bemerkung 3) zu Tabelle I Die Zahlenwerte in der Tabelle I zeigen die gebildete L-Prolinmenge in mg/ml.
Biotin- konzen- tration |
Menge an erzeug tem |
2,0 (0,374 | ) | Menge der' Bak terien |
Ammoniumchlorid, g/dl | Menge an erzeug tem |
Menge an er zeugter L-GIu- |
Menge der Bakte rien |
( | Menge an erzeug tem |
5,0 (1,121) | Menge der Bakte rien |
10,0 (1,870) | Menge an erzeug tem |
Menge an er zeugter L-GIu- |
Menge der Bakte rien |
|
L-Prolin | Menge an er zeugter L-GIu- |
zellen | 4,0 (0,748) | L-Prolin | tamin- | zellen | L-Prolin | Menge an er zeugter L-GIu- |
zellen | L-Prolin | tamin- | zellen | |||||
Zucker konzen tration |
tamin- | säure | tamin- | säure | |||||||||||||
rfi | mg/ml | säure | mg/dl | mg/ml | mg/ml | mg/dl | mg/ml | säure | mg/dl | mg/ml | mg/ml | mg/dl | |||||
5 | 2,6 | mg/ml | 13,0 | 5,1 | 20,5 | 10,1 | 8,9 | mg/ml | 10,0 | 3,2 | 0,3 | 6,2 | |||||
g/dl | 10 | 6,3 | 23,4 | 16,2 | 9,9 | 23,2 | 16,4 | 13,2 | 8,0 | 16,6 | 7,6 | 0,6 | 8,1 | ||||
15 | 15 | 8,1 | 30,2 | 29,2 | 14,4 | 20,2 | -21,8 | 18,1 | 7,5 | 18,4 | 13,2 | 1,2 | 10,2 | ||||
20 | 12,6 | 19,4 | 31,4 | 18,1 | 5,8 | 27,6 | 21,5 | 17,4 | 22,2 | 15,6 | 1,8 | 12,4 | |||||
30 | 12,5 | 3,6 | 32,2 | 18,8 | 4,6 | 31,2 | 26,5 | 7,4 | 25,8 | 17,8 | 1,5 | 14,8 | |||||
50 | 12,2 | 1,0 | 32,4 | 19,2 | 3,2 | 32,2 | 27,1 | 3,2 | 26,2 | 19,6 | 0,9 | 17,1 | |||||
100 | 12,2 | 0,9 | 32,8 | 19,5 | 2,6 | 32,8 | 27,2 | 2,8 | 26,4 | 21,2 | 0,3 | 18,6 | |||||
1000 | 12,1 | 0,9 | 31,8 | 19,0 | 2,4 | 31,4 | 27,3 | 2,1 | 26,2 | 23,5 | 0,1 | 19,2 | |||||
5 | 1,8 | 0,8 | 11,2 | 3,2 | 3,6 | 9,2 | 2,7 | 1,9 | 8,8 | 1,3 | 0,1 | 3,4 | |||||
10 | 7,1 | 15,3 | 16,2 | 8,8 | 9,2 | 13,6 | 9,1 | 1,8 | 11,8 | 3,6 | 0,3 | 7,2 | |||||
20 | 15 | 9,8 | 17,2 | 22,4 | 17,3 | 9,4 | 19,4 | 19,7 | 2,4 | 15,8 | 7,9 | 0,7 | 8,5 | ||||
20 | 15,8 | 19,4 | 29,2 | 22,6 | 15,4 | 21,2 | 26,5 | 5,0 | 17,8 | 13,2 | 1,2 | 9,1 | |||||
30 | 16,8 | 11,0 | 31,4 | 25,4 | 4,2 | 23,0 | 35,0 | 3,3 | 19,8 | 15,4 | 1,7 | 11,2 | |||||
50 | 17,1 | 2,8 | 32,0 | 26,2 | 3,8 | 25,0 | 36,4 | 3,9 | 21,2 | 17,6 | 1,4 | 14,1 | |||||
100 | 17,2 | 2,5 | 31,4 | 26,1 | 3,6 | 26,4 | 37,2 | 2,9 | 21,6 | 20,2 | 0,9 | 15,2 | |||||
1000 | 17,2 | 2,3 | 31,2 | 25,8 | 3,4 | 26,2 | 36,5 | 2,7 | 21,8 | 22,8 | 0,6 | 16,4 | |||||
2,1 | 2,5 | ||||||||||||||||
Bemerkung 1) zu Tabelle II
Zusammensetzung des Nährmediums:
Glukose wie in der Tabelle
NH4Cl wie in der Tabelle
K2HPO11 0,10 g/dl
KH,PO4 0,10 g/dl
MgSO4 · 7H2O 0,05 g/dl
FeSO4 · 7H2O 0,002 g/dl
MnSO4 · 4H2O 0,002 g/dl
ZnSO4 · 7H2O 0,001 g/dl
NiCl2 · 6H2O 0,001 g/dl
K2CrO4 0,001 g/dl
Biotin wie in der Tabelle
Thiaminhydrochlorid 2 mg/1
Fleischextrakt 0,5 g/dl
Harnstoff 0,5 g/dl
CaCO3 5,0 g/dl
Bemerkung 2) zu Tabelle II
Züchtungsbedingungen Wie in Tabelle I.
Bemerkung 3) zu Tabelle II
Die Mengen an Bakterienzellen wurden an Hand des Gewichtes der getrockneten Bakterienzellen ermittelt.
Die Mengen an Bakterienzellen wurden an Hand des Gewichtes der getrockneten Bakterienzellen ermittelt.
Die Beziehung zwischen der Ammoniumchloridkonzentration und der Biotinkonzentration geht aus
den Tabellen I und II hervor, wobei Ammoniumsulfat als Ammoniumionenquelle, Natriumchlorid als
Chloridionenquelle und Ammoniumchlorid als Quelle sowohl für Ammonium- als auch Chloridionen eingesetzt
wurden. Wie aus diesen Tabellen zu ersehen ist, steigt die Menge an gebildetem L-Prolin durch Erhöhung
der Ammoniumionenkonzentration in dem g0 Nährmedium an. Darüber hinaus wird die Bildung von
L-Prolin durch eine steigende Chloridionenkonzentration (Zugabe von Natriumchlorid) erheblich beschleunigt.
Beträgt die Konzentration an beiden Ionen 0,5 Mol pro Liter oder darüber, dann verstärkt sich
diese Neigung erheblich, wobei die Menge an gebildetem L-Prolin bei einer Konzentration von ungefähr
0,7 bis 1,2 Mol pro Liter ein Maximum erreicht.
Wie aus einem Vergleich der Tabellen I und II hervorgeht, kann die optimale Menge eine beträchtlich
höhere Konzentration bei der Zugabe von Ammoniumchlorid als Ammonium- und Chloridionenquelle
erreichen als dies der Fall ist, wenn zwei Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniumchlorid und Natriumchlorid,
zugesetzt werden. Die Menge an gebildetem L-Prolin kann auf diese Weise gesteigert werden.
Diese Erscheinung scheint auf die Tatsache zurückzuführen zu sein, daß im Falle von Ammoniumchlorid
der osmotische Druck in dem Medium nicht so stark erhöht wird, daß seine wachstumshemmende Wirkung
auf die Mikroorganismen gering ist, wobei die unerwünschte hemmende Wirkung anderer Ionen, wie
beispielsweise von Natrium- und Sulfationen, nicht eintritt. Ferner steht die Wirkung dieser beiden Ionen
auf die Erzeugung von L-Prolin in enger Beziehung
zu der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium. Die Bildung von L-Prolin zeigt dann ein Maximum,
wenn eine Biotinmenge in dem Nährmedium zugegen ist, die für das Wachstum der Bakterienzellen ausreicht
oder über dieser ausreichenden Menge liegt. ' Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmedium geeignet, sofern es
die für das Wachsen des eingesetzten Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe
sind bekannt. Zu ihnen gehören beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische
Verbindungen, wobei diese Nährstoffe von dem eingesetzten Mikroorganismus in entsprechenden
Mengen verbraucht werden.
Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise genannt: Kohlehydrate, wie z. B. Glukose, Fruktose, Maltose,
Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen, oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoffquellen,
wie beispielsweise Glycerin, Mannit, Sorbit, aliphatische organische Säuren, z.B. Gluconsäure,
Zitronensäure und Essigsäure. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen
aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle kommen verschiedene anorganische oder organische Salze oder Verbindungen in
Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder natürliche, Stickstoff enthaltende
Substanzen, beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe,
Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile oder Reiskleieextrakt. Diese Substanzen können
ebenfalls allein oder in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.
Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat,
Natriumphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat,
Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid oder andere Salze von Kalium, Magnesium, Eisen
und Mangan. Außerdem können verschiedene Nährstoffe, wie beispielsweise Vitamine, Aminosäuren oder
Nucleinsäuren, dem Nährmedium zugesetzt werden.
Die Chloridionen können in Form von beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid
zugefügt werden. Die Verwendung von Ammoniumchlorid, das beide Ionen enthält, ist sowohl
aus wirtschaftlichen Gründen als auch hinsichtlich des Wirkungsgrades zu empfehlen.
Die optimale Konzentration an Biotin, die bei dem erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren zur Erzeugung
von L-Prolin eingesetzt wird, schwankt etwas mit der Zusammensetzung des Nährmediums, den
Züchtungsbedingungen u.dgl. Folglich ändert sich die dem Nährmedium zuzusetzende* Biotinkonzentration
mit diesen Bedingungen. Im allgemeinen wird die Zugabe von etwa 30 bis 1000 γ/Ι bevorzugt. Im
Handel erhältliche Quellen für reines Biotin sowie Rohprodukte, die Biotin enthalten, sind einsetzbar.
Falls Biotin enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Melassen, in dem Medium verwendet werden,
kann ein Teil des Biotins oder die ganze erforderliche Biotinmenge in dieser Form zugeführt werden. Bekannte
Biotinersatzverbindungen können ebenfalls eingesetzt werden. Von derartigen verwendbaren Ersatzverbindungen
seien beispielsweise Biotinhomologe, wie z. B. Biocitin und d,l-Desthiobiotin, Substanzen
mit Pelargonsäuregruppen, wie beispielsweise 7-Keto-8-amino-pelargonsäuresalze und 7,8-Diketopelargonsäure,
höhere ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Linoleinsäure und ölsäure sowie nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie beispielsweise
Sorbitanmonooleat und Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, erwähnt. Substanzen, die als Äquivalente
zu Biotin angesehen werden, können ebenfalls gegebenenfalls verwendet werden. Werden diese Ersatzmittel
eingesetzt, dann richtet sich die zugesetzte Menge nach der Wirksamkeit des Ersatzmittels, die
im allgemeinen bekannt ist.
Die Züchtung oder Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch
aerobes Schütteln oder durch Belüften und Rühren, und zwar bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35° C,
vorzugsweise 28 bis 32° C, und bei einem pH von ungefähr 6,0 bis 7,0. Es ist am zweckmäßigsten, das pH
während der Züchtung auf den angegebenen Bereich einzustellen. Als Neutralisierungsmittel für diesen
Zweck seien Ammoniak, Harnstoff, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd und Calciumcarbonat erwähnt.
L-Prolin wird in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit gewöhnlich nach 2- bis 5tägigem Züchten als
Hauptprodukt angereichert.
Nach Beendigung der Fermentation kann das L-Prolin aus der Fermentationsflüssigkeit durch Behandlung
mit einem Ionenaustauscherharz abgetrennt werden. Beispielsweise wird das Fermentationsmedium filtriert, die Fermentationsflüssigkeit mittels
eines Kationenaustauscherharzes behandelt und von letzterem anschließend das L-Prolin eluiert. Nach der
Konzentrierung des Eluats unter vermindertem Druck wird Methanol zugesetzt, um in Methanol kaum
lösliche Aminosäuren durch Filtration abzutrennen. Anschließend wird in der methanolischen L-Prolinlösung
das Methanol durch Wasser ersetzt, worauf die Lösung durch ein Kationenaustauscherharz sowie
durch ein Anionenaustauscherharz zur Entfernung kleiner Mengen basischer und saurer Aminosäuren
geleitet wird. Aus dem konzentrierten mit Methanol versetzten Eluat können nach Filtration und Einengen
zur Trockne unter vermindertem Druck rohe Kristalle von L-Prolin erhalten werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die Prozentangaben sind Gewichtsprozent.
Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wird in 11 Wasser hergestellt:.
25 g/dl Glukose,
6 g/dl NH4CiI,
0,10 g/dl KH2PO4,
0,15 g/dl K2HPO4,
0,10g/dl MgSO4-7H2O,
0,002 g/dl FeSO4-7H2O,
0,002 g/dl MnSO4 · 4H2O,
0,001 g/dl ZnSO4-7H2O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid,
5,0g/dl-CaCO3,
0,5 g/dl Hefeextrakt,
0,5 g/dl Harnstoff,
80 γ/dl Biotin.
80 γ/dl Biotin.
20 ml des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gegossen
und 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert. Die Phos-
phate und der Harnstoff werden jeweils getrennt sterilisiert. Auf Teile des erhaltenen Nährmediums,
die in einzelnen Kolben enthalten sind, wird Micrococcus glutamicus ATCC 21158 aufgeimpft. Das
Züchten wird dann unter aerobem Schütteln 96 Stunden lang bei 300C durchgeführt.
Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten L-Prolins
beträgt im Durchschnitt 22,4 mg/ml. Die Menge an als Nebenprodukt anfallender Glutaminsäure beträgt
durchschnittlich 4,2 mg/ml.
Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium gesammelt und auf ein Volumen
von 11 gebracht. Anschließend wird das pH durch Zugabe von Schwefelsäure auf 2 eingestellt,
worauf unlösliche Substanzen abfiltriert werden. Das Filtrat wird durch ein Kationenaustauscherharz (SuI-fonsäuretyp)
geleitet, worauf nach der Adsorption eine Eluierung mit Ammoniakwasser durchgeführt
wird. 0,31 der L-Prolin-Abflußfraktion werden unter
vermindertem Druck bis auf ein Volumen von etwa 50 ml eingeengt. Anschließend wird kontinuierlich
Methanol zugesetzt, wobei gleichzeitig die Lösung konzentriert wird. Auf diese Weise wird das Wasser
durch Methanol ersetzt. Die Methanollösung wird zur Entfernung von Aminosäuren, die in Methanol
kaum löslich sind, filtriert. Das Methanol wird durch Wasser ersetzt und diese wäßrige Lösung durch eine
Kationenaustauscherharz-Kolonne sowie anschließend durch eine Anionenaustauscherharz-Kolonne
geleitet. Nach der Konzentrierung des Efluats wird das Wasser erneut zur Entfernung von unlöslichen
Substanzen durch Methanol ersetzt. Die erhaltene Methanollösung (etwa 100 ml) wird unter vermindertem
Druck zur Trockne eingedampft. Dabei fallen 16 g roher L-Prolin-Kristalle an.
In 11 Wasser wird folgendes Nährmedium hergestellt:
20 g/dl Glukose,
5 g/dl (NH4)2SO4,
5 g/dl NaCl,
0,10 g/dl KH2PO4,
0,10 g/dl K2HPO4,
0,05 g/dl MgSO4-7H2O,
0,002 g/dl MnSO4 · 4H2O,
0,001 g/dl ZnSO4 · 7H2O,
0,001 g/dl NiCl2 · 6H2O,
0,001 g/dl K2CrO4,
1 mg/ml Thiaminhydrochlorid,
4,0 g/dl CaCO3,
1,0 g/dl Hefeextrakt,
0,5 g/dl Harnstoff,
50 γ/Ι Biotin.
50 γ/Ι Biotin.
20-ml-Portionen des vorstehend beschriebenen
Nährmediums werden in konische 500-ml-Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert.
Die Phosphate und der Harnstoff werden getrennt sterilisiert. Jeder Kolben, welcher das Nährmedium
enthält, wird mit Micrococcus glutamicus ATCC 21157 beimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem
Schütteln 96 Stunden lang bei 28° C durchgeführt.
Die nach Beendigung des Züchtens im Fermentationsmedium angereicherte Menge an L-Prolin
beträgt durchschnittlich 24,8 mg/ml. Die Menge der
als Nebenprodukt anfallenden L-Glutaminsäure wird zu durchschnittlich 3,1 mg/ml ermittelt.
Nach Beendigung des Züchtens wird das Fermentationsmedium gesammelt und auf ein Volumen von
11 gebracht. Die Abtrennung des L-Prolins erfolgt in
der gleichen Weise wie im Beispiel 1. Auf diese Weise werden ungefähr 18 g roher L-Prolin-Kristalle
erhalten.
In 11 Wasser wird ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
25 g/dl Glukose,
5 g/dl NH4Cl,
0,10 g/dl KH2PO4,
0,15 g/dl K2HPO4,
0,05 g/dl MgSO4 -7H2O,
0,003 g/dl MnSO4 · 4H2O,
0,002 g/dl ZnSO4 · 7H2O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid,
4,0 g/dl CaCO3,
0,5 g/dl Hefeextrakt,
0,5 g/dl Harnstoff,
10OyA Biotin.
5 g/dl NH4Cl,
0,10 g/dl KH2PO4,
0,15 g/dl K2HPO4,
0,05 g/dl MgSO4 -7H2O,
0,003 g/dl MnSO4 · 4H2O,
0,002 g/dl ZnSO4 · 7H2O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid,
4,0 g/dl CaCO3,
0,5 g/dl Hefeextrakt,
0,5 g/dl Harnstoff,
10OyA Biotin.
31 des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in eine 5-1-Glas-Fermentierungsvorrichtung
gegeben und 15 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Die Phosphate sowie der Harnstoff werden jeweils
30. getrennt sterilisiert. Anschließend wird das Nährmedium
mit einer Impfbakterienflüssigkeit aus Micrococcus glutamicus ATCC 21159 beimpft. Das Züchten
wird anschließend unter Belüften und Rühren der Submerskultur bei einer Temperatur von 300C
durchgeführt, wobei die Belüftung mit 3 1 pro Minute erfolgt und mit einer Geschwindigkeit von 650 UpM
gerührt wird.
Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten L-Prolins
beträgt 30,4 mg/ml, während die Menge der als Nebenprodukt anfallenden L-Glutaminsäure zu
3,8 mg/ml ermittelt wird.
Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium in der im Beispiel 1 beschriebenen
Weise behandelt. Dabei werden 70 g roher L-Prolin-Kristalle erhalten.
Das Züchten wird nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, daß
die in der folgenden Tabelle III aufgeführten Substanzen an Stelle des im Beispiel 1 verwendeten Biotins
eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt.
Konzentration | Menge an er zeugtem L-Prolin |
Menge | |
Biotinersatz | an als Neben produkt erzeugter |
||
L-Gluta | |||
(mg/ml) | minsäure | ||
200 γ β | 18,8 | (mg/ml) | |
Biocitin | (2OyA) | (5,1) | 7,1 |
(17,6) | |||
209513/214
Fortsetzung
10
Konzentration | Menge an er |
Menge | |
zeugtem | an als Neben |
||
Biotinersatz | L-Prolin | produkt | |
erzeugter | |||
!,-Gluta | |||
200 γ/Ι | (mg/ml) | minsäure | |
(20 r/l) | 16,9 | (mg/ml) | |
d,l-Desthiobiotin | 2000 γ/Ι | (3,6) | 4,2 |
(200 7/l) | 14,8 | (14,4) | |
7,8-Diamino- | (1,9) | 4,6 | |
pelargonsäure | (15,6) | ||
Konzentration | Menge an er zeugtem |
Menge | |
Biotinersatz | L-Prolin | an als Neben produkt |
|
erzeugter | |||
L-Gluta- | |||
(mg/ml) | minsäure | ||
20 mg/ml | 20,8 | (mg/ml) | |
Polyoxyäthylen- | (2 mg/ml) | (7,9) | 2,0 |
sorbitanmono- oleat |
10 mg/ml | 17,9 | (25,1) |
Natriumlaurat | (1 mg/ml) | (3,2) | 2,1 |
10 mg/ml | 22,8 | (21,4) | |
Calciumoleat | (1 mg/ml) | (5,9) | 3,2 |
(23,7) | |||
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 21157, 21158 oder 21159 eingesetzt wird und die Ammonium- und Chloridionenkonzentration im Nährmedium jeweils mindestens 0,5 Mol/Liter beträgt.
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---|---|---|---|
JP218067 | 1967-01-13 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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---|---|---|---|
DE19681642717 Pending DE1642717B1 (de) | 1967-01-13 | 1968-01-04 | Verfahren zur Herstellung von L-Prolin |
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DE (1) | DE1642717B1 (de) |
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GB (1) | GB1189941A (de) |
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Citations (2)
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US3329577A (en) * | 1964-04-20 | 1967-07-04 | Ajinomoto Kk | Fermentative preparation of proline |
US3285827A (en) * | 1964-05-28 | 1966-11-15 | Commercial Solvents Corp | Process for producing glutamic acid |
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1968
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- 1968-01-08 GB GB0105/68A patent/GB1189941A/en not_active Expired
- 1968-01-09 FR FR1561238D patent/FR1561238A/fr not_active Expired
- 1968-01-10 IT IT50075/68A patent/IT943045B/it active
- 1968-06-14 US US736957A patent/US3650899A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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Also Published As
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IT943045B (it) | 1973-04-02 |
US3650899A (en) | 1972-03-21 |
GB1189941A (en) | 1970-04-29 |
FR1561238A (de) | 1969-03-28 |
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Legal Events
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