NL8402275A - Nieuw l-proline producerend microorganisme. - Google Patents

Description

i « 7 " t .

' - Nieuw L-proline producerend microorganisme -

Naar de productie van L-proline ( in Bet vervolg kortweg "proline” ] en andere aminozuren door fermentatie is veel onderzoek verricht. Microorganismen Behorende tot de genera Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium ® en andere genera behoeven een bepaalde hoeveelheid proline om te overleven en produceren hun eigen proline. Een dergelijke prolineproduktie is niet noodzakelijk afhankelijk van een gebrek aan proline in het medium , dat wil zeggen, sommige microorganismen kunnen altijd enig proline produceren. Niettemin wordt aange-10 nomen dat de microbiologische produktie van proline wordt geregeld, tenminste tot op zekere hoogte, door bepaalde terugkoppe-lingsmechanismen zodat de microorganismen gewoonlijk ophouden met het produceren van proline of minder proline produceren wanneer voldoende hoeveelheden beschikbaar zijn.

Wanneer een prolineanalogon aanwezig is, wordt dit in het algemeen door de microorganismen herkend en benut als proline waarmee het terugkoppelingsmechanisme om de produktie van proline te staken of te vertragenyin werking wordt gesteld.

Bij afwezigheid van proline uit de omgeving of zelf geproduceerd gaan de microorganismen dood. Bepaalde mutanten zijn ongevoelig voor of resistent tegen proline en prolineanaloga. Het terugkoppelingsmechanisme van deze mutanten wordt noch door proline noch door prolineanaloga in werking gesteld. Deze mutanten zul- 8402275 - 2 - len dus doorgaan met produceren van proline meer dan zij nodig hebben.

Resistentie tegen prolineanaloga als een middel om microorganismen met een overproduktie aan proline te selecteren, 5 is in een groot aantal octrooischriften en technische publikaties beschreven. Zo is bijvoorbeeld in de Japanse octrooipublicatie 55-148096 een werkwijze beschreven voor de produktie van proline door kweken van microorganismen behorende tót de genera Artrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium of Microhacterium, die resistent zijn tegen structurele prolineanaloga zoals 3,4-dehydroproline , hydroxyproline, azetidine-2-carbonzuur, prolinehydroxamaat en D-proline . Evenzo is in het Amerikaans octrooischrift 4.244.409 een werkwijze beschreven voor het produceren van proline onder gebruikmaking van mutanten behorende tot de genera Brevibacterium, Corynebacterium of Microbact erium die resistent zijn tegen DL-3,4-dehydroproline. Microorganismen met resistentie tegen prolineanaloga worden bijvoorbeeld verkregen door bekende proline of glutaminezuur producerende microorganismen in aanraking te brengen met een mutageen en mutanten die in aanwezigheid van het prolineanalogon proline produceren, te selecteren.

Gevonden is, dat uitzonderlijke microorganismen met resistentie tegen meer dan één prolineanalogon geschikt zijn voor de produktie van proline op technische schaal. In het bijzonder is een stam van Brevibacterium ammoniagenes gevonden die ^ beduidend meer proline produceer^ dan de niet-resistente ouder-stam of een intermediaire stam met resistentie tegen één enkel analogon. De nieuwe stam volgens de uitvinding is resistent tegen zowel L-azetIdine-2-carbonzuur (ACAl als 3,4-dehydro-DL- proline (DHPI. Het door deze stam geproduceerde proline kan gemakkelijk volgens standaardmethoden van de fermentatievloeistof worden afgescheiden.

De nieuwe stam bezit een veranderde genetische struc— ^ tuur waardoor hij resistent is tegen de twee prolineanaloga ACA

8402275

# A

- 3 - en. DIP. Daardoor produceert hij aanzienlijke hoeveelheden proline hij kweken onder aerohe omstandigheden.

De uitvinding is in het bijzonder belichaamd in een nieuwe stam afgeleid van Brevihacterium' ammoniagenes ATCC 5 13746.

Brevibacterium ammonagenes ATCC 13746 is een bekende glutaminezuurproducent , die geringe hoeveelheden proline (minder dan 1 mg/mll vormt. Door aan deze stam resistentie tegen meer dan één structureel prolinealanogon te verlenen, werd een mulo tante stam verkregen die beduidend meer proline produceert.

Bij de gevolgde selectieprocedure werd de stam ATCC 13746 geëxposeerd aan ACA waarna een spontane mutant met ACA-resistentie werd geselecteerd . Deze intermediaire ACA resistente mutant werd vervolgens geexposeerd aan DHP waarop een mutant met de 15 gewenste meervoudige resistentie tegen proliheanaloga ontstond.

De gehele selectieprocedure werd als volgt uitgevoerd.

Eén cultuur van ATCC 13746 op een schuine voedings-agar (Difco 1 werd gewassen met steriel gedeioniseerd water. Van de gevormde celsuspensie werd 0,2 ml verspreid over een voedings-20 agarplaat (Difco) die 10 mg/ml van het prolineanalogon ACA bevatte. De plaat werd 3 dagen bij 30°C geinkubeerd . Ten gevolge van de aanwezigheid van ACA in het cultuurmedium werd de groei van ATCC 13746 prototrofen onderdrukt en konden alleen ACA resistente kolonies opkomen. De grootste daarvan werd overge-25 bracht op een verse voedingsagarplaat (Difco) zonder ACA. Deze plaat werd ongeveer 3 dagen geinkubeerd totdat de ACA resistente kolonies waren opgekomen. Eén van deze ACA resistente klonen bleek bij kweken in Proline Médium C meer proline dan normaal te produceren. De samenstelling van Proline Medium C was als volgt: 30 8402275 - 4 - \> ^ r bestanddeel hoeveelheid/1 gedeioniseerd ___ water

Glucose 50,0 g NH Cl 5,0 g 5 %

Ureum 5,0 g ΥΞ.^90^ 0,5 g K2HP04 0,5 g

MgS04 7H2Ó 0,5 g

FeS04 7H20 0,02 g 10 MnS04 4H20 0,02 g

ZnS04 7h20 0,01 g

Biotine 100,0 ^,ug

Thiomine-HCl 1,0 mg 15

Het medium werd met natriumhydroxyde geneutraliseerd (pH ongeveer 6,8) waarna het 12 minuten bij 112°C werd geauto-klaveerd.

De ACA resistente kloon werd gekweekt in 50 ml 20 Proline Medium C in een 250 ml Erlenmeyerkolf gedurende 3 dagen bij 30°C en bij een schudsnelheid van 300 omw/min. Na afloop werd de cultuürvloeistof gecentrifugeerd bij 4000 omw/min. en gefiltreerd over een 0,22 micron millipoorfliter. De proline- titer werd bepaald volgens de Technicon Autoanalyzer XI methode 25 onder gebruikmaking van isatin als kleurreagens. D.aarbij werd 1% isatin in isopropanol 1 minuut bij 80°C verwarmd waarna de absorptie bij 590nm werd bepaald. De ACA resistente kloon bleek 8,5 mg/ml proline te hebben gevorm.

Deze intermediaire ACA resistente mutant werd vervol- 30 gens geent op een schuine voedingsagar (Difcol en 4 dagen bij o 30 C geinkubeerd. Na afloop werd de schuine agar gewassen met 5,0 ml steriel gedeioniseerd water. Van de verkregen celsuspensie werd 0,2 ml verspreid over een voedingsagarplaat (Difcol die 8402275 * <· , _________________________________ ____________________-5.-_________________________________,_____________ ....

2 mg/ml DHP bevatte. Deze plaat werd 3 dagen bij 3Q°C geinkubeerd. Eén van de opgekomen kolonies met resistentie tegen zowel ACA als DHP werd overgebracht naar een verse voedingsagarplaat (Difcol die noch ACA noch DHP bevatte. Deze sta® werd daarna ge-5 kweekt in Proline Medium C^qS met de volgende samenstelling:

Bestanddeel Hoeveelheid/1. gedeioniseerd water

Glucose I00r0 g 10 NH4CL 5,0 g

Ureum 5,0 g KH2P04 0,5 g K2HP04 0,5 g

MgS04 7E20 0,5 g 15 FeSO. 7H 0 0,02 g

Z

MnS04 4H20 0,02 g

ZnS04 7H20 0,01 g

Bacto-Soytone (Difcol 0,3 g

Biotin 100,0 ^ug 20 Thismine-HCl 1,0 mg

Het medium werd weer met natriumhydroxide geneutraliseerd (pH ongeveer 6,81 en 12 minuten bij 112°c geautoklaveerd .

Eén van de ACA en DHP resistente klonen werd 3 dagen 25 gekweekt in 50 ml -Proline Medium C^gS in een 250 ml Erlenmeyer-kolf. De prolinetiter werd bepaald met isatin als kleurreagens zoals boven beschreven. De door de kloon geproduceerde hoeveelheid proline bedroeg 19,6 mg/ml.

Een gelyofiliseerde cultuur van de nieuwe ACA en DHP 30 resistente stam van Brevibacterium ammoniagenes is gedeponeerd bij het ATCC onder no. 39101. Deze stam staat na openbaarmaking van de aanvrage vrijelijk ter beschikking.

Het kweken van ATCC 39101 voor de produktie van proline 8402275 ’ .........________________ ____________________-.6 - werd ook. langs andere weg uitgevoerd onder gebruikmaking van de volgende media:

Entmedium bestanddeel hoeveelheid , g 5 Glucose 5,0

NaCl 5,0

Gistextract 10,0

Pepton 10,0 jq De bestanddelen werden toegevoegd aan gedeioniseerd water tot een volume van 1 1 en gemengd. Na instellen van de pH met natriumhydroxyde op 7,0 werd het medium 15 minuten bij o 112 C geautoklaveerd.

Produktiemedium 11 jcj bestanddeel hoeveelheid ürea 5,0 ns4ci 5,0 k2hpo4 1,0

MgS04 7H20 0,5 2q Sojaisolaat (Sheffield Co.1 1,0

PeS04 7H20 1,0 2)

MnS04 H20 2,0 3)

ZnSO. 7H-0 1,0 4)

Biotine 1,0 5) 25 Thiamine-HCl 1,0 6) #

CaCO, 50,0 J 71 Glucose 1) bij het bepalen\an de totale hoeveelheid gedëoniseerd water dient de toevoeging van glucose in aanmerking te worden 30 genomen.

21.voorraadoplossing : 20,0 g/1 FeSO, 7E 0 4. 2

3) voorraadoplossing : 6,1 g/1 MnSO HO

8402275 - 7 -

4) voorraadoplossing : 10,0 g/1 ZnSO^ 7h^O

5) voorraadoplossing : 0,1 g/1 Motine 61 voorraadoplossing ; 1,0 g/1 thiaraine-HCl 7} voorraadoplossing : 70% glucose. Autoclaveer 15 min. bij 2 110 C en voeg 7,0 ml per kolf toe al vorens te enten

De bestanddelen 1 t/m 10 werden toegevoegd aan gede-ioniseerd water tot een volume van 1 1 en gemengd. Na instellen van de pH met zwavelzuur op 6,8 werd het CaCO^ toegevoegd waar-£q na het medium 15 min. bij 121°C werd geautoclaveerd.

Van het Entmedium werd 50 ml in een 250 ml schudkolf geent met Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 waarna 24 uren werd geincubeerd bij 31°c en een schudsnelheid van 300 omw./min. Ongeveer 5,0 ml van de logfasecultuur (O.D.g^g = 3,01 werd £5 ultrasoon behandeld om celklompjes los te trillen. De gedesag-gregeerde celsuspensie werd verdund met een steriele 0,9%-ige NaCl-oplossing in water en verspreid over voedingsagarplaten (Difcol cm enkelvoudige kolonies te verkrijgen. De platen werden 72 uren bij 30°C geinkubeerd.

2q Vervolgens werd een enkelvoudige kolonie van de platen afgenomen en geent in 50 ml Entmedium in een 250 ml schudkolf, en 16 uren geinkubeerd bij 31°C en 300 ome/min. De entcultuur verkeerde toen in de eerste logfase van groei (O.D.g4Q = 1,71. De entcultuur werd gebruikt om 50 ml Produktiemedium in 25 250 ml schudkolven te enten tot een begin O.D.g^g van 0,05. Aan elke kolf werd 50 ƒ11 25,0% pluronic 61 (BASF Wyandotte) als anti-schuimmiddel toegevoegd. De produktiekolven werden geinkubeerd bij 31°C en 300 omw./min. Na 48 uren bleek uit hogedruk-vloeistofchromatografische analyse aan een monster van de cul-30 tuurvloeistof dat zich 15,8 g/1 proline had gevormd.

De nieuwe stam volgens de uitvinding kan worden gebruikt voor het produceren van proline volgens elke gebruikelijke aerobe kweek-of fermentatiemethode. Het fermenteren wordt door 8402275 ^ Λ, - 8 - gaans uitgevoerd bij een temperatuur van 20-45°C en bij voorkeur van 28-35°C , en een pH 5-9. Om de pH van het medium in te stellen kunnen calciumcarbonaat en ammoniak worden gebruikt.

Als kweekmedium kan elk fermentatiemedium wor-2 den gebruikt dat een koolstofbron, stikstofbron, anorganische zouten en, desgewenst, andere meer ondergeschikte organische voedingsstoffen bevat. Als koolstofbron kunnen fermenteerbare suikers, proteinehydroly-saten en proteïnen worden gebruikt. Als stikstofbron komen ureum, ammo-niumzouten van organische zuren zoals ammoniumacetaat en ammoniumoxalaat, 10 en ammoniumzouten van anorganische zuren zoals ammoniumsulfaat , ammonium-nitraat en arnmoniumchloride in aanmerking. De hoeveelheid koolstof- en stikstofbronnen in het medium bedraagt in het algemeen 0,001 — 20 gew./ vol.% . Anorganische verbindingen zoals kaliumfósfaat of magnesiumsulfaat en/of vitaminen zoals thiamine kunnen worden toegevoegd.

15 Bïotine, een vitamine B-complex , is een onmisbaar nutrient voor het kweken van Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101.

De concentratie biotine in het cultuurmedium bedraagt in het algemeen ongeveer 50-500 g/1. Bij lagere concentraties dan ongeveer 50 g/1 kan het microorganisme tot produktie van glutaminezuur worden gedwongen, 20 wat een ongewenste verontreiniging is voor het beoogde proline.

Desgewenst kunnen andere organische voedingsstoffen aan het cultuurmedium worden toegevoegd.

Het nieuwe microorganisme volgens de uitvinding wordt als een hradytroof beschouwd, dat wil zeggen een langzame groeier die 25 meer de neiging heeft om te gedijen wanneer hij wordt gekweekt met complexe voedingsstoffen dan op een minimaal medium. Zo kunnen bijvoorbeeld organische voedingsstoffen zoals maisweekvloeistof, peptonen , proteinehydrolysaten of gistextracten, anorganische voedingsstoffen zoals kaliumfósfaat of magnesiumsulfaat, en/of vitaminen zoals thiamine 30.worden toegevoegd.

Een voorkeurscultuurmedium voor het nieuwe microorganisme volgens de uitvinding bevat organische voedingsstoffen. Een voor-keursorganische voedingsstof voor fermentatie in kolven is Bacto-Soytone 8402275 τ- ^ » - a -- (Difcol , een. enzymatisch. hydrolysaat van soyameel , in een concentratie van ongeveer 0,1 - 0,5 en bij voorkeur ongeveer 0,3 g/1 cultuurmedium. Inplaats daarvan kunnen' gist extracten, maisweek-vloeistoffen of peptonen uit andere bronnen worden gebruikt. Een 5 andere voorkeursnutrient is het vitaminefchiamine.

De fermentatie wordt in de regel in ongeveer 16-176 uren, bijvoorbeeld 72 uren, in kolven uitgevoerd waarbij zich proline in de fermentatievloeistof ophoopt. Cellen en andere vaste bestanddelen kunnen op gebruikelijke wijze uit de cultuurvloeistof 10 worden verwijderd, bijvoorbeeld door filtreren of centrifugeren.

Om het proline uit het filtraat of de bovenstaande vloeistof te winnen en/of te zuiveren, kunnen eveneens bekende methoden worden toegepast. Zo kan de gefiltreerde fermentatievloei— stof bijvoorbeeld worden behandeld met een ionenuitwisselaarhars.

15 Dit de daarbij verkregen oplossing kan het proline worden uitgekristalliseerd.

8402275

Claims (13)

1. L-prolineproducerend mlcroorganisme, met het kenmerk dat/ het mlcroorganisme resistent is tegen meer dan ëën structureel proline analogon en overproduktIe aan L-proline vertoont.

2. Mictroorganisme volgens conclusie 1 , met het 5 kenmerk dat,het mlcroorganisme resistent is tegen twee of meer van de proline analoga 3,4-dehydro-DL-proline, azetidine-2-carhonzuur, prolinehydroxamaat en D-proline.

3. Mlcroorganisme volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, het mlcroorganisme een stam is van Brevibacterium ammoniagenes met resistentie tegen 3,4-dehydrö-DL-proline en L-azetidine-2-carbonzuur.

4. Mlcroorganisme volgens conclusie 3 , met het kenmerk dat, het mlcroorganisme Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 is. jL5 5.Mlcroorganisme volgens conclusie 1, met het kenmerk ♦ dat, het mlcroorganisme een voedingsmedium behoeft dat koolstof- en stikstofbronnen bevat in een hoeveelheid van ongeveer 0,001- 20,0 gew./vol.%.

6. Mlcroorganisme volgens conclusie 5, met het kan-20. merk dat, het voedingsmedium hiotine bevat in een hoeveelheid van ongeveer 50-500 microgram per liter.

7. Mlcroorganisme volgens conclusie 5, met het kenmerk dat, het voedingsmedium tenminste één complex nutrient bevat, bestaande uit een pepton , proteinehydrolysaat, gistextract en/of 8402275 m 'C -- ψ _________.-π- ____________:__________________________________ ... maisweekvloeistof.

8. Werkwijze ter verkrijging van een L-producerend microorganisme, met het kenmerk dat/ aj een L-proline producerend microorganisme wordt ge-5 exposeerd aan een eerste proline analogon , bl de eerste proline analogon resistente kolonies die de stap al hebben overleefd, worden gekweekt, cl de eerste proline analogon resistente kolonies aan een tweede proline analogon worden geexposeerd , en 10 dl de eerste en tweede proline analoga resistente ko lonies die de stap cl hebben overleefd,worden gekweekt.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het Kenmerk dat, het eerste proline alanogon en tweede proline analogon worden gekozen uit 3,4-dehydro-DL-proIine , azetidine-2-carbonzuur, 15 prolinehydroxamaat en D-proline , waarbij het· tweede proline analogon verschilt van het eerste proline analogon. IQ. Werkwijze voor het bereiden van L-proline, met het kenmerk dat, al een stam van een L-proline producerend microorga-20 nisme wordt geselecteerd die resistent is tegen meer dan één structureel proline analogon, bl de stam wordt gekweekt of gefermenteerd in een kweekmedium dat een koolstofbron en stikstofbron bevat, en cl L-proline uit het cultuurmedium wordt gewonnen.

11. Werkwjize volgens conclusie 10 , met het kenmerk dat, de stam van het L-proline producerend microorganisme een stam is van Brevibacterium ammoniagenes met resistentie tegen twee verschillende proline analoga bestaande uit 3,4-dehydro-DL-proline, L-azetidine-2-carbonzuur, prolinehydroxamaat of D-30 proline.

12. Werkwijze volgens conclusie 10 ,met het kenmerk dat, het cultuurmedium tenminste één complex nutrient bevat bestaande uit een pepton, proteinehydrolysaat , gistextract en/of 8402275 a -12-. U> v maisweekvloeistof.

13. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk dat, de stam van het L-proline producerend microorganisme Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 is.

14. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101.

15. Werkwijzen en microorganismen zoals beschreven in 1 de beschrijving en voorbeelden. / 8402275