NL8300224A - Werkwijze voor de fermentatieve bereiding van l-leucine. - Google Patents

Description

1 .... " ^ ♦ ........... . Λ*

Werkwijze voor de fermentatieve bereiding van L-leucine.

De bereiding van L-leucine, L-valine en andere aminozuren door fermentatie is het onderwerp van veel speurwerk geweest. Talloze geslachten van microorganismen zijn gebruikt en ook diverse aminozuur-analogen. Het Amerikaanse 5 octrooischrift 3.865.690 leert ons de bereiding van L-leucine door het kweken van een stam Brevibacterium of Corynebacterium die tegen een leucine-antagonist resistent gemaakt was. Volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.970.519 kweekt men voor de bereiding van L-leucine stammen van dezelfde geslachten in aan-10 wezigheid van diverse aminozuren. Uit het Amerikaanse octrooischrift 3.893.888 is het bekend dat L-valine gemaakt kan worden door mutant-stammen van Brevibacterium die tegen ct-amino-β-hydroxyvaleriaanzuur resistent zijn. Het Amerikaanse octrooischrift 3.688.073 leert ons de bereiding van L-leucine met een 15 microörganisme van het geslacht Corynebacterium in aanwezigheid van een "promoter”voor...isoleucine, methionine, fenylalanine of valine, bijvoorbeeld azaleucine of a-amino-g-hydroxyvaleriaan-zuur. Azaleucine is als analoog bij de bereiding van L-leucine gebruikt, zie Wang c.s. in "Fermentation and Enzyme Technology", 20 (John Wiley and Bons, Ine., 1979] blz. 18-20. Volgens het

Amerikaanse octrooischrift 3.759.789 gebruikt men stammen van Arthrobacter alkanicus die tegen L-threonine resistent zijn.

Om de opbrengsten te verhogen kan men voorlopers van L-leu-cine en L-isoleucine toevoegen.

25 De volgende literatuur is van belang: 1. Araki, Kazumi, H. Ueda en S. Saigusa. Fermentatieve Production of L-Leucine with Auxotrophic Mutants of Corynebacterium glutamicum. Agr. Biol. Chem. 58, 3, (1974) 565-572.

30 2. Calvo, R.A. en J.M. Calvo. Lack of End-Product Inhibition and Repression on Leucine Synthesis in a Strain of Salmonella typhimurium. Science, 156 (1967) 1107-1109.

3. M. Kisumi, S. Komatsubara en I. Chibata. Leucine 8300224 2

Accumulations by Isoleucine Revert ants of Serratia marcescens Resistant to α-Aminobntyric Acid: Lack of Both Feedback Inhibition and Repression. J. Biochem., 73 (1973) , 107-115.

5 4-. T. Tsuchida, F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose en S. Okumura. Cultural Conditions for L-Leueine Production by Strain No. 218, a Mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chan. 39 (5) , (1975) 1149-1153.

5. T. Tsuchida en H, •'Momose. Genetic Changes of Regulatory 10 Mechanisms Occurred in Leucine and Saline Producing Mutants

Derived· from Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 39(11), (1975) 2193-2198.

6. T. Tsuchida, F. Yoshinaga, K. Kubota, H. Momose and S. Okumura. Production of L-Leucine by a Mutant of 15 Brevibacterium lactofermentum 2256. Agr. Biol. Chem. 38(10) (1974) 19097-1911.

7. M. Freundlich en J.M. Trela. (1969). Control of isoleucine, valine and leucine biosynthesis. J. of Bacteriology, 101-106.

20 8. Y. Izumi, Y. Asano, Y. Tani en K. Ogata. (1977).

Formation of valine and leucine by analog-resistant mutants of an obligate methylötroph, Methylomonas aminofaciens.

J. Ferment. Techno1. 55, 452-458.

9. M. Kisumi, S. Komatsubara en I. Chibata. (1977).

25 Patchway for isoleucine formation from pyruvate by leucine

Biosynthetic enzymes in leucine-accumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens. J. Biochem; 82, 95-103.

10. M. Kisumi, J. Kato, S. Komatsubara, I. Chibata. (1973). Production of isoleucine, valine and leucine by regulatory 30 mutants of Serratia -marcescens·. "Genetics of Industrial

Microorganisms - Bacteria".

11. A. Rogerson en M. Freundlich. (1969). Control of isoleucine, valine and leucine biosynthesis. VIII. Mechanism of growth inhibition By leucine- in relaxed and stringent strains of

35 Escherichia coli K-12. Biochimica et Biophyscia Acta, BRA

26302.

Er zijn ook -meerdere artikel verschenen over de algemene biosynthese van L-leucine en ook yan andere aminozuren, te weten: 40 12. A. Szentirmai en I. Horvath. (1976). Regulation of branched- chain amino acid Biosynthesis. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 23, 137-149..

13. H.E, Umbarger (1974). The elements involved in the multivalent regulation of the isoleucine and valine biosynthetic 45 enzymes of the EnteroBacteriaceaea. Proceedings of the 1st.

Intersectional Congress of IAMS, Tokio.

8300224 * — 3 14. H.E. Umbarger. Genetic and physiological regulation of the isoleucine, valine and leucine biosynthetic enzymes of the Enterobacteriaceae. From "Genetics of Industrial Microorganisms." (1973).

5 15. H.E. Umbarger, Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation,

Ann. Rev. Biochem., 47 (1978), 533-606, 563.

Deze uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van L-leucine waarbij men een mutant stam van Brevibacterium thiogenitalis die tegen een L-leucine-analoog 10 resistent is onder aerobe omstandigheden kweekt.

Wilde stammen van Brevibacterium thiogenitalis (bijvoorbeeld ATCC 39240) die men voor de mutatie uitzoekt, worden gekenmerkt door een overproduktie van glutamine-zuur. De biosyntheseweg langs welke microorganismen L-leucine 15 maken is in het algemeen bekend. Zie bijvoorbeeld Umbarger "Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation" in Ann. Rev.

Biochem. 47 (1978) 563-565. Zoals hierin gezegd wordt de bio-synthese geacht langs de volgende produkten te gaan: pyruvaat, a-acetolactaat, α,ίΤ-dihydroxyisovaleraat, a-ketoisovaleraat, 20 α-isopropylmalaat, fj-isopropylmalaat, α-ketoisocaproaat en L-leucine.

.. Bepaalde analogen van in de natuur voorkomende aminozuren zijn geschikt voor het isoleren, van mutant-stammen volgens deze uitvinding. Deze analogen zijn gif-25 tig voor de stammen zonder overproduktie van L-leucine. Onder deze analogen vallen a-amino-g-hydroxyvaleriaanzuur, methallyl-glycine en 8-hydroxyleucine.

De tegen leucine-analogen resistente mutant kan verkregen worden door een wilde stam van Brevi-3Q bacterium thiogenitalis met ultraviolet te bestralen of door de wilde stam met een mutageen te behandelen, bijv. met ethyl-methaansulfonaat, N-methyl-Nf-nitro-N-nitrosoguanidine, enz.

Daarna kan de stam in aanwezigheid van het analoog gekweekt worden zodat men koloniën kan isoleren die te veel L-leucine 35 maken. Bijvoorbeeld kan de stam 2 tot 7 dagen bij 30°C gekweekt worden op agar-platen met de volgende samenstelling: gelatine-hydrolysaat-pepton 5,0 g/1, rundervleesextract 3,0 g/1, agar 8300224 S' * . . 4 ...

15 g/1, natrium-zout van a-amino-f3-hydroxyvaleriaanzuur 25 g/1.

Een levenskrachtige kweek van een L-leucine vormende mutant van Brevibacterium thiogenitalis die tegen a-amino-0-hydro'xyvaleriaanzuur (het produkt van het hier-5 na komende voorbeeld II) is gedeponeerd bij de American Type

Culture Collection, 123.01 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, onder no. ATCC 39104.

Een fermentatie met de geïsoleerde mutant-stammen van Brevibacterium thiogenitalis kan uitgevoerd 10 worden door schuddend kweken of door submerse fermentatie onder aërobe omstandigheden. De fermentatie gebeurt bij 25 tot 40°C en een pH tussen 5 en 8 (bij voorkeur tussen 6,5 en 7,5). Cal-ciumcarbonaat en ammoniak kunnen gebruikt worden voor het bijregelen van de pH". Het fermentatiemedium bevat bronnen van kool-15 stof, stikstof en. andere elementen. Voor fermentatie geschikte koolstofbronnen zijn suikers, eiwit-hydrolysaten en eiwitten. Voorbeelden van geschikte stikstofbronnen zijn ureum, ammonium-zouten van organische ...zuren (bijv. ammoniumacetaat en ammonium-oxalaat) en ammonium-zouten van anorganische zuren (bijv.

20 ammoniumsulf aat, ammoniumnitraat en ammoniumchloride). De con centraties aan koolstof- en stikstofbronnen in het medium liggen tussen 0,001 en 20 gew.%. Ook kunnen organische voedingsstoffen (bijv. maisweefcwater, pepton, gistextract, sojaboon-extract] en/of anorganische elementen (bijv. kaliumfosfaat en 25 magnesiumsulfaat), vitaminen zoals biothine en thiamine en aminozuren zoals valine aan het medium toegevoegd worden. De fermentatie gebeurt in 16 tot 176 uur en L-leucine hoopt zich in de vloeistof op.

Nadat de fermentatie voltooid is, 30 d.i. wanneer 0,1 tot 6 gew.% L-leucine in de kweek aanwezig is, worden cellen en andere vaste bestanddelen op gebruikelijke wijze zoals door filtreren of centrifugeren uit de kweekvloeistof verwijderd. Bekende methoden kunnen toegepast worden voor het winnen en/of zuiveren van het L-leucine uit het filtraat of de 35 bovenstaande vloeistof. Bijvoorbeeld wordt de gefiltreerde kweekvloeistof met een sterke kationenwisselaar behandeld, 8300224 * 5 .

** ------ -f* wordt dit hars met een verdunde alkalische oplossing zoals ammonia uitgespoeld, wordt het L-leucine bevattende eluaat geconcentreerd, wordt een alkanol zoals methanol of ethanol aan de geconcentreerde oplossing toegevoegd, en wordt het neerslag uit 5 een waterigealkanol zoals waterig methanol of ethanol herkris- talliseerd zodat men zuivere kristallen van L-leucine krijgt.

De uitvinding wordt nader toegelicht door de volgende, niet beperkende voorbeelden. Hierin staat "Difco" voor produkten aangeduid en/of beschreven in "Difco 10 Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbio-logical and Clinical Laboratory Procedures" 9 uitgave, (Difco Laboratories Incorporated, Detroit, Mich., 1953).

Voorbeeld I

Een twee dagen bij 30°C in een agarbuis 15 op voedingsagar van Difco gekweekte ent van Brevibacterium thiogenitalis (ATCC no. 19240) werd met 0,1 M natriumfosfaat-buffer met pH * 7,0 afgespoeld. In een steriele buis werd aan deze celsuspensie ethylmethaansulfonaat (een mutageen) tot een concentratie van 0,08 M toegevoegd. Om het mutageen te. laten 20 inwerken liet men dit mengsel 18 uur op 30°C staan.

Na dit incuberen werd de celsuspensie gecentrifugeerd, werd de bovenstaande vloeistof afgeschonken en werden de cellen in verse buffer gesuspendeerd. Na twee keer wassen om een eventueel restant mutageen te verwijderen werden 25 de cellen uitgeplaat op een agar-plaat met een gradient van 25 g/1 α-amino-g-hydroxyvaleriaanzuur, met aan de hoge kant van de gradiënt een concentratie van 25 g/1.

Resistente mutanten die nabij het hoge einde van de gradiënt verschenen werden op verse agar-30 platen overgebracht. Na 24 uur incubatie op 30°C werden de iso-laten geënt in 1 ml buizen met isoleucine-medium 1.

Isoleucine-Medium 1 per liter Dl* ^0

Glucose 100 g 35 KH2P04 3 g

MgS04.7H20 0,4 g 8300224 6

FeS04.7H20 0,01 g

MnS04.H20 0,0075 g (NH4)2S04 50 g

Biotine 100 jxg 5 Thiamine-HCl 1 -mg

Bacto-soyton (Difco) 0,63 g

CaCO^ 50 g x Dl = gedeïoniseerd 10 ass enzymatisch hydrolysaat van sojameel "Difco", blz.264.

De pH was voor het auto daveren (15 minuten op 112°C). met NaOR op 7+2 ingesteld.

o

De buizen werden 4 dagen op 30 C uit-15 gebroed, onder schudden op 300 rpm. De concentratie aan L-leu-cine in het medium werd op de hierna te beschrijven wijze biologisch bepaald met Pediocoecus cerevisiae (ATCC 80421. Bij een als 19240-31 aangeduide resistente isolaat vond men 2,6 g/1 L-leucine.

20 Principe van de biologische aminozuur-bepaling.

Pediocoecus cerevisiae heeft voor zijn groei alle aminozuren in hun L-vorm nodig. Het is daardoor mo-gelijk de hoeveelheid van een bepaald aminozuur in een kweek-vloeistof te bepalen door op een agar-plaat die alle noodzake-25 lijke nutriënten behalve het te bepalen aminozuur bevat

Pediocoecus gelijkmatig uit te strijken. Als nu een steriel schijfje filtreerpapier, gedrenkt met een door Millipore gefiltreerde kweekvloeistöf, op het oppervlak van het medium geplaatst wordt kan men na incubatie de groeizone rondom het 30 schijfje meten en de uitkomst vergelijken met een ijklijn. De ijklijn stelt men op door Pediocoecus te kweken op platen in aanwezigheid van schijfjes filtreerpapier die bekende hoeveelheden van het te bepalen aminozuur bevatten.

Procedure bij de bepaling van leucine.

35 Men kweekt Pediocoecus cerevisiae o ATCC 8042 ca 44 uur bij 37 C in 4 x 10 ml "Micro Inoculum Broth" 8300224 u 7 _ van Difco. De cellen worden driemaal met gesteriliseerd gedeioni-seerd water uitgewassen en dan samen in 12 ml gesteriliseerd gedeïoniseerd water gesuspendeerd. Platen voor de leucine-bepa-ling worden aangemaakt door 2,6 g "Leucine Assay Medium" en 5 1,5 g agar van goede kwaliteit in 100 ml gedeïoniseerd water op te lossen. Op deze platen wordt 0,3 ml celsuspensie gelijkmatig uitgestreken. "Micro Inoculum Broth" en "Leucine Assay Medium" zijn in de handel verkrijgbaar en in het genoemde Difco Handboek beschreven, resp. op blz. 213 en 230-231.

10 Nadat men overmaat vocht uit de platen heeft laten verdampen worden er steriele, absorberende schijfjes van 6 mm (deze zijn in de handel_verkrijgbaar) welke met bekende hoeveelheden L-leucine gedrenkt zijn, opgebracht, zodat men een ijklijn verkrijgt, en op andere platen brengt men zulke schijf- 15 jes met daarin een bekende hoeveelheid kweekvloeistof.

De platen worden 24 uur bij 37°C ge-incubeerd, en daarna meet men de doorsnede van de groeizones in mm. Met behulp van de ijklijn vindt men het te bepalen gehalte aan L-leucine.

20 Doordat deze bepaling microbiologisch is is de uitkomst hiervan semi-kwantitatief.

Voorbeeld II

Opgemerkt werd dat isolaat 19240-31 een gemengde populatie was met op voedingsagar grote en kleine 25 koloniën. Bij 3 dagen schuddend kweken bij 30°C op isoleucine-medium 1 (300 slagen per minuut) bleek dat de grote koloniën meer valine dan leucine en isoleucine vormden, terwijl bij de kleine koloniën het omgekeerde gold. Biologische bepalingen werden met Pediococcus cerevisiae uitgevoerd. Een als 19240-31-1

30 aangeduid isolaat vormde 0,5 g/1 leucine. Een als 19240-31-K

aangeduid isolaat vormde 1,5 g/1 leucine en werd vervolgens bij de American Type Colture Collection gedeponeerd onder no. ATCC 39104.

Voorbeeld III

35 Om de invloed van de begin-pH van het kweekmedium, en van de grootte van de porties en van de incubatie- 8300224 - 8 - Λ* tijd na te gaan werd isoleucine-medium I aangemaakt en werd de pïï in diverse onderporties daarvan met NaGH op diverse waarden ingesteld (te weten 5,8 tot 8,2 voor.het autoclaveren.

Isolaat 19240-31-K werd gedurende di~ 5 verse tijden (3 tot 5 dagen) gekweekt in 500 ml Erlenmeyer-kolven zonder denken die 100 ml medium bevatten en in 250 ml Erlenmeyers met of zonder deuken die 50 ml medium beyatten.

Na 4 dagen schuddend kweken bij 30°C in een 250 ml Erlenmeyer met deuken in een medium waarvan de pE 30 voor het steriliseren op 7,9 ingesteld was, had isolaat 19240-31-K volgens de biologische bepaling met Pedioeoccus 3,2 g/1 L-leucine gevormd.

15 8300224

Claims (6)

1. Werkwijze voor het bereiden van L-leucine waarbij men onder aerobe omstandigheden een micro- 5 organisme kweekt , en men uit de kweekvloeistof het L-leucine afscheidt, met het kenmerk, dat men een mutant-stam van Brevi-bacterium thiogenitalis gebruikt die tegen een analoog van L-leucine resistent is.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, 10 met het kenmerk, dat de mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC 39104 is.

3. Werkwijze volgens conclusie J of 2, met het kenmerk, dat men 16 tot 176 uur kweekt bij een temperatuur tussen 20° en 45°C.

4. Werkwijze volgens een der voorafgaan de conclusies, met het kenmerk, dat men kweekt in een medium waarvan de pH tussen 5 en 8 ligt.

5. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat het leucine-analoog 20 a-amino-g-hydroxyvaleriaanzuur, methallylglycine of g-hydroxy-leucine is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het analoog a-amino-g-hydroxyvaleriaanzuur is. 25 8300224