FR2528867A1 - Procede de preparation de l-leucine par fermentation - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION DE L-LEUCINE. SELON L'INVENTION, ON MET EN CULTURE, EN CONDITIONS AEROBIES, UNE SOUCHE MUTANTE DE BREVIBACTERIUM THIOGENITALIS RESISTANT A UN ANALOGUE DE LA L-LEUCINE, POUR DONNER UN BOUILLON DE FERMENTATION ET ON RECUPERE LA L-LEUCINE ACCUMULEE DANS LEDIT BOUILLON DE FERMENTATION. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA PRODUCTION D'AMINOACIDES.

Description

La production de L-leucine, de L-valine et autres aminoacides, par

fermentation, a été l'objet d'une

recherche considérable De nombreux genres de micro-

organismes ont été employés avec divers analogues d'aminoacides Le brevet US 3 865 690 enseigne la produc- tion de L-leucine par mise en culture d'une souche de Brevibacterium ou de Corynebacterium rendue résistante à un antagoniste de leucine Le brevet US N 3 970 519 met en culture des souches du même genre en présence de divers aminoacides pour produire la L-leucine On sait, du brevet US 3 893 888, que la L-valine peut être produite de souches mutantes de Brevibacterium résistant à l'acide C<amino-)3-hydroxy valérique (AHV) Le brevet US 3 688 073 enseigne la préparation de L-leucine en utilisant un micro-organisme du genre Corynebacterium en présence d'un "promoteur" pour l'isoleucine, la méthionine, la

phénylalanine ou la valine, comme l'azaleucine ou AHV.

L'azaleucine a été utilisée comme analogue pour la production de Lleucine Voir Wang et autres "Fermentation and Enzyme Technology", John Wiley and Sons, Inc 1979, pages 18-20 Le brevet US N 3 759 789 utilise des cultures d'Arthrobacter alkanicus quisont résistantes à la Lthréonine Des précurseurs de L-leucine et de L-isoleucine

peuvent être ajoutés pour augmenter les rendements.

La littérature qui suit est en rapport: 1 Araki, Kazumi, H Ueda and S Saigusa Fermentative Production of L-Leucine with Auxotrophic Mutants of Corynebacterium glutamicum Agr Biol Chem.

38 ( 3), 565-572 ( 1974).

2 Calvo, R A, and J M Calvo Lack of End-Product Inhibition and Repression on Leucine Synthesis in a strain of Salmonella typhimurium Science, 156,

1107-1109 ( 1967).

3 Kisumi, M, S Komatsubara and I Chibata Leucine Accumulations by Isoleucine Revertants of Serratia marcescens Resistant to O(-Aminobutyric Acid:

Lack of Both Feedback Inhibition and Repression.

J Biochem; 73, 107-115 ( 1973).

4 Tsuchida, T, F Yoshinaga, K Kubota, H Momose and S Okumura Cultural Conditions for L-Leucine Production by Strain N 218, a Mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256 Agr Biol.

Chem 39 ( 5), 1149-1153 ( 1975).

Tsuchida, T, and H Momose Genetic Changes of Regulatory Mechanisms Occurred in Leucine and Valine Producting Mutants Derived from

Brevibacterium lactofermentum 2256 Agr Biol.

Chem 39 ( 11), 2193-2198 ( 1975).

6 Tsuchida, T, F Yoshinaga, K Kubota, H Momose and S Okumura Production of L-Leucine by a Mutant

of Brevibacterium lactofermentum 2256 Agr Biol.

Chem 38 ( 10), 19097-1911 ( 1974).

7 Freundlich, M and J M Trela ( 1969) Control

of isoleucine, valine, and leucine biosynthesis.

J of Bacteriology, 101-106.

8 Izumi, Y, Y Asano, Y Tani and K, Ogata ( 1977).

Formation of valine and leucine by analog-resistant mutants of an obligate methylotroph, Methylomonas

aminofaciens J Ferment Technol, 55, 452-458.

9 Kisumi, M, S Komatsubara and I Chibata ( 1977).

Pathway for isoleucine formation from pyruvate by leucine biosynthetic enzymes in leucine-accumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens J.

Biochem, 82, 95-103.

Kisumi, M, J Kato, S Komatsubara, I Chibata.

( 1973) Production of isoleucine, valine and leucine

by regulatory mutants of Serratia marcescens.

"Genetics of Industrial Microorganisms Bacteria" 11 Rogerson, A, and M Freundlich ( 1969) Control

of isoleucine, valine and leucine biosynthesis.

VIII Mechanism of growth inhibition by leucine in relaxed and stringent strains of Escherichia

coli K-12 Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.

252886;'

Plusieurs articles généraux concernant les voies de biosynthèse pour la production de L-leucine ainsi que d'autres aminoacides ont également été publiés Voir: 12 Szentirmai, A and I Horvath ( 1976) Regulation of branched-chain amino acid biosynthesis Acta

Microbiol Acad Sci Hun, 23, 137-149.

13 Umbarger, H E ( 1974) The elements involved in the multivalent regulation of the isoleucine and

valine biosynthetic enzymes of the Enterobacteriaceoe.

Proceedings of the 1st Intersectional Congress of

IAMS, 1, Tokyo.

14 Umbarger, H E ( 1973) Genetic and physiological regulation of the isoleucine, valine and leucine

biosynthetic enzymes of the Enterobacteriaceae.

De "Genetics of Industrial Microorganisms " Umbarger, H E ( 1978) Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation Ann Rev Biochem, 47,

533-606, 563.

La présente invention concerne un procédé de préparation de L-leucine qui consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, une souche mutante de Brevibacterium thiogenitalis résistant à un analogue de L-leucine. Les souches sauvages de Brevibacterium thiogenitalis

(comme ATCC 19240) choisies pour la mutation sont caracté-

risées par une surproduction de l'acide glutamique La voie de biosynthèse par laquelle les micro-organismes produisent la L-leucine est généralement connue On peut voir par exemple Umbarger, "Amino Acid Biosynthesis

and Its Regulation," Ann Rev Biochem 1978 47:563-565.

Comme cela est indiqué dans cette référence, on pense que la synthèse passe par les stades qui suivent: pyruvate; o( -acétolactate; o(,/dihydroxy isovalérate; o -cétosiovalérate; o< -isopropylmalate; /3 isopropylmalate;

O (-cétoisocaproate; L-leucine.

Certains analogues des aminoacides naturels sont appropriés à l'isolement des souches mutantes de l'invention

Ces analogues sont toxiques aux souches qui ne surprodui-

sent pas la L-leucine De tels analogues comprennent l'acide o-amino hydroxyvalérique, la méthallylglycine;

et la P -hydroxyleucine.

Le mutant résistant analogue à la leucine peut être obtenu par irradiation aux ultraviolets d'une souche du type sauvage de Brevibacterium thiogenitalis ou en traitant la souche sauvage avec un mutagène comme le

méthanesulfonate d'éthyle, la N-méthyl-N 1-nitro-N-nitroso-

guanidine et autres Ensuite, la souche peut être mise en culture en présence de l'analogue pour isoler les colonies qui surproduisent la Lleucine Par exemple, la souche peut être mise en culture à 30 C pendant 2 à i 7 jours sur des plaques d'agar de la composition qui suit: peptone d'hydrolysat de gélatine, 5,0 g/l; extraits de boeuf, 3,0 g/l; agar, 15 g/l; sel de sodium de l'acide

" -amino-( -hydroxyvalérique, 25 g/l.

Une culture viable d'une souche mutante productrice de L-leucine de Brevibacterium thiogenitalis résistant à l'acide c< -amino-/ hydroxyvalérique (produit de l'exemple 2 ci-dessous) a été déposée au American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland

20852, sous le N ATCC 39104.

La fermentation des souches mutantes isolées de Brevibacterium thiogenitalis peut être accomplie en agitant la culture ou la fermentation submergée en conditions aérobies La fermentation est effectuée à 25 à C et à p H de 5 à 8 (de préférence 6,5 à 7,5) On peut employer du carbonate de calcium et de l'ammoniac pour l'ajustement du p H du milieu Le milieu de fermentation contient une source de carbone, une source d'azote et d'autres éléments Les sources appropriées de carbone pour la fermentation comprennent les sucres fermentables, les hydrolysats de protéine et les protéines Les exemples de sources appropriées d'azote sont l'urée, lessel d'ammonium d'acides organiques (comme l'acétate d'ammonium et l'oxalate d'ammonium) et les sels d'ammonium d'acides inorganiques (comme le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium) Les quantités des sources de carbone et d'azote dans le milieu sont de 0,001 à %enpoids/volume De même, des aliments organiques (comme la liqueur de trempage de mais, la peptone, des extraits de levure, des extraits de soja) et/ou des éléments inorganiques (comme le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, des vitamines comme la biotine et la thiamine, et des aminoacides comme la valine) peuvent être ajoutés au milieu La fermentation est accomplie en 16 à 176 heures et la L-leucine s'accumule

dans le bouillon de fermentation.

Quand la fermentation est terminée, c'est-à-dire qu'il y a accumulation de 0,1 à 6 % en poids/volume de L-leucine dans le bouillon, les cellules et autres composants solides de la culture sont retirés du bouillon de fermentation par des processus conventionnels comme une filtration ou une centrifugation Des processus connus peuvent être employés dans la récupération et/ou la purification de la L-leucine du filtrat ou de la solution

qui surnage Par exemple, le bouillon filtré de fermenta-

tion est traité avec une résine échangeuse de cations forte Alors, la résine est éluée avec une solution alcaline diluée comme de l'ammoniac aqueux Les éluats

contenant de la L-leucine sont combinés et concentrés.

On ajoute, à la solution concentrée, un alcanol comme du méthanol ou de l'éthanol Les cristaux précipités peuvent être recristallisés dans l'alcanol aqueux comme du méthanol aqueux ou de l'éthanol aqueux pour donner des

cristaux purs de L-leucine.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter "Difco" indique Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, Neuvième Edition, Difco Laboratories Incorporated, Detroit, Michigan, Etats Unis d'Amérique

( 1953).

EXEMPLE 1

Une gélose inclinée nutritive (Difco) de Brevibacterium thiogenitalis culture ATCC 19240, ayant grandi pendant 2 jours à 30 C, a été lavée avec un tampon de phosphate de sodium à 0,1 M, p H 7,0 La suspension résultante de cellules a été décantée dans un tube stérile o l'on avait ajouté un mutagène, du méthanesulfonate d'éthyle (EMS) en une quantité suffisante pour produire une concentration à 0,08 M Les cellules traitées à EMS ont alors été incubées pendant 18 heures à 30 C pour

laisser le mutagène avoir son effet.

Après incubation, la suspension des cellules a été centrifugée, le produit surnageant a été décanté et les cellules ont été remises en suspension dans un tampon

frais.

Après deux lavages pour retirer tout mutagène résiduel, les cellules ont été plaquées sur une plaque de gradient d'agar nutritif contenant 25 g/l d'acide ( -amino-/3-hydroxyvalérique (AHV) à l'extrémité haute

du gradient.

Les mutants résistants apparaissant à l'extrémité haute de la plaque ont été transférés à des plaques d'agar nutritif frais Après incubation à 30 C pendant 24 heures, les produits isolés ont été inoculés dans des tubes de

I ml d'Isoleucine Medium 1.

Isoleucine Medium 1 par litre DI /H 20 Glucose 100 g 3 g KH 2 PO 4 3 g Mg 504 7 H 20 0,4 g Fe 504 7 H 20 0,01 g Mn SO 4H 20 0,0075 G (NH 4)2504 50 g Biotine 100 ú g Thiamine H Cl 1 mg Bacto-soytonea/(Difco) 0,63 g Ca C 03 50 g 1/DI = désionisé 2/ Hydrolysat enzymatique de farine de soja "Difco",

page 264.

Le p H a été ajusté à 7,2 avec Na OH avant passage à l'autoclave à 112 C pendant 15 minutes. Les tubes ont été incubés pendant 4 jours à 30 C, 300 t/mn Une biodétermination en utilisant Pediococcus cerevisiae (ATCC 8042) a été accomplie comme on le décrira

ci-après pour déterminer la quantité de L-leucine présente.

Un isolat résistant désigné par 19240-31 a été déterminé

à 2,6 g/l de L-leucine.

PRINCIPE

Pediococcus cerevisiae nécessite tous les amino-

acides, sous leur forme L, pour sa croissance Il est par conséquent possible de déterminer la quantité d'un aminoacide particulier présent dans un bouillon de fermentation en étendant une couche de Pediococcus sur un milieu d'agar contenant tous les aliments nécessaires à l'exception de l'aminoacide à déterminer Quand un disque stérile de filtration, imbibé d'un bouillon de fermentation filtré par Millipore est placé à la surface du milieu, la zone de croissance de Pediococcus autour du disque peut être mesurée et comparée à une courbe standard La courbeest préparée par croissance de Pediococcus en présence de

disques de filtration contenant des quantités connues de -

l'aminoacide à déterminer.

PROCESSUS (POUR LA DETERMINATION

DE LA LEUCINE)

On fait croître Pediococcus cerevisiae ATCC 8042 pendant environ 44 heures à 37 C dans 4 x 10 ml de bouillon Micro Inoculum (Difco) Les cellules sont lavées trois fois avec H 20 D I stérile puis combinées et remises en suspension dans 12 ml de H 20 D I stérile Des plaques de milieu ou medium de détermination de leucine (Difco) préparées par mélange de 2,6 g du milieu de détermination de leucine et 1,5 g d'Agar Noble à 100 ml de H 20 D I. sont couvertes d'une couche de la suspension des cellules ( 0,3 ml) (Note le bouillon Micro Inoculum est un milieu de culture commercialisé contenant de la peptone, de l'extrait de levure, du dextrose, KH 2 PO 4, et un complexe de monooléate de sorbitan Il est décrit à la page 213, "Difco" Le milieu de détermination de leucine est de même commercialisé et est décrit aux pages 230-231, "Difco"). Après avoir laissé l'excès d'humidité s'évaporer des plaques, des disques absorbants stériles de 6,35 mm (commercialisés) sont imbibés de quantités connues de L-leucine pour la construction d'une courbe standard, et

de bouillons filtrés de fermentation à déterminer.

Les plaques sont incubées pendant 24 heures à 370 C et ensuite on mesure le diamètre des zones de croissance et on enregistre en millimètres Une courbe standard est préparée à laquelle les inconnues peuvent être comparées

pour une détermination de la production de L-leucine.

Ce processus, du fait qu'il repose sur un indica-

teur microbiologique, donne une mesure qualitative plutôt

que strictement quantitative de la production d'aminoacide.

EXEMPLE 2

On a découvert que l'isolat 19240-31 était une population mélangée de grandes et petites colonies sur un agar nutritif Lors d'une croissance dans le milieu d'isoleucine ou Isoleucine Medium NI 1 pendant 3 jours à 30 C, 300 t/mn, on a déterminé que les grandes colonies produisaient plus de valine que de leucine et d'isoleucine,

tandis que l'inverse était vrai pour les petites colonies.

Une biodétermination a été accomplie en utilisant Pediococcus cerevisiae Un isolat désigné par 19240-31-I a produit 0,5 g/l de leucine Un isolat désigné par 19240-31-K a produit 1,5 g/l de leucine et il a été subséquemment déposé à l'ATCC avec le NO d'accès

ATCC 39104.

EXEMPLE 3

Pour déterminer l'effet du p H initial des milieux de croissance ainsi que celui de la dimension du ballon 2528 b 67 et du temps d'incubation, on a préparé l'Isoleucine Medium I, et diverses portions du milieu ont été ajustées avec Na OH à une plage de niveauxde p H (comme 5,8 à 8,2

avant passage à l'autoclave).

On a fait croître l'isolat 19240-31-K pendant diverses longueurs de temps (comme 3 à 5 jours) dans des ballons de Erlenmeyer non empreints de 500 ml contenant ml du milieu et des ballons de Erlenmeyer empreints

et non empreints de 250 ml contenant 50 ml du milieu.

Lors d'une croissance pendant 4 jours à 300 C, 300 t/mn dans un ballon de Erlenmeyer empreint de 250 ml, contenant les milieux ajustés à p H 7,9 avant passage à l'autoclave, l'isolat 19240-31-K avait un titre de 3,2 g/l de L-leucine en déterminant par la biodétermination

de Pediococcus.

e

R E V E N D I C AT I O N S

1. Procédé de préparation de L-leucine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, une souche mutante de Brevibacterium thiogenitalis résistant à un analogue de L-leucine, pour donner un bouillon de fermentation et à récupérer la

L-leucine accumulée dudit bouillon de fermentation.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium thiogenitalis

ATCC 39104.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée à une température

de 20 à 45 C pendant 16 à 176 heures.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H des milieux de fermentation pendant la

culture est de 5 à 8.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Brevibacterium thiogenitalis ATCC 39104 et la fermentation est effectuée à une température de 25 à 40 C pendant 16 à 176 heures à un

p H de 5 à 9.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'analogue est l'acide o( -amino-/ -hydroxy-

valérique, de la méthallylglycine, et de la

J -hydroxyleucine.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce que l'analogue est l'acide o< -amino hydroxy-

valérique.