FR2511035A1 - Procede de production de l-lysine par fermentation - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PRODUCTION DE L-LYSINE PAR FERMENTATION. PROCEDE DE PRODUCTION DE L-LYSINE PAR CULTURE DE MICRO-ORGANISME OBTENUE PAR FUSION DE PROTOPLASTES ET DONT LA CULTURE PERMET D'OBTENIR LA L-LYSINE ET MICRO-ORGANISME OBTENU PAR FUSION DE PROTOPLASTES. CES MICRO-ORGANISMES SONT OBTENUS PAR FUSION DE PROTOPLASTES ENTRE DEUX SOUCHES IDENTIQUES OU DIFFERENTES APPARTENANT AU GENRE CORYNEBACTERIUM OU BREVIBACTERIUM ET PLUS PARTICULIEREMENT AUX ESPECES CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM OU BREVIBACTERIUM LACTOFERMENTUM. CES SOUCHES OBTENUES PAR FUSION DE PROTOPLASTES PERMETTENT D'OBTENIR LA L-LYSINE AVEC UN BON RENDEMENT ET EN OUTRE ELLES SONT RESISTANTES A AU MOINS DEUX ANTIBIOTIQUES.

Description

Procédé de production de L-lysine par fermentation.

L'invention a pour objet de nouveaux micro-organismes

pouvant produire la L-lysine ainsi qu'un procédé pour la pro-

duction de L-lysine par fermentation utilisant lesdits micro- organismes Plus particulièrement, l'invention concerne des micro-organismes appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et étant capables d'accumuler des quantités importantes de L-lysine et ayant une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques L'invention a également pour objet des micro-organismes appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et étant capable d'accumuler des quantités importantes de L-lysine et ayant une résistance à au moins un c Omposé analogue à la purine ou à la pyrimidine L'invention a également pour objet un organisme obtenu par la technologie de la fusion des protoplastes entre des souches parents appartenant au même genre ou à des genres différents de Corynebacterium ou de Brevibacterium et étant capables d'accumuler des quantités importantes de L-lysine L'invention a encore pour objet des micro-organismes obtenus par fusion de protoplastes et ayant l'aptitude d'accumuler la L-lysine en une quantité importante

et ayant une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques.

L'invention a encore pour objet les micro-organismes obtenus par fusion de protoplastes ayant à la fois une résistance à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine et étant capable d'accumuler la L- lysine en une quantité considérable L'invention vise également un procédé de production de L-lysine par fermentation qui comprend la culture desdits micro-organismes dans un milieu nutritif, l'accumulation d'une quantité considérable de L-lysine dans la liqueur de culture résultante et la récupération de la

L-lysine de cette liqueur.

L'invention vise un procédé pour la production de L-lysine qui est très demandé comme nourriture pour animaux, comme additifs à la nourriture des animaux, comme matière de départ pour médicaments et pour autres usages, à un faible

coût correspondant à une production industrielle.

On connaissait jusqu'à présent comme procédé pour la

production de la L-lys ine par fermentation, des procédés uti-

lisant des souches nécessitant pour leur nourriture des composés variés, des souches sensibles à différents produits chimiques ou différentes souches résistantes aux produits chimiques, appartenant au genre Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Nocardia, Saccharomyces, Escherichia, Klebsiella, Streptomyces, Alkaligenes, Microbacterium, Acromobacter et Serratia, et des procédés utilisant des mutants

ayant une combinaison des propriétés des micro-organismes ci-

dessus décrits.

Comme résultat de différentes études faites pour obtenir des souches ayant une productivité augmentée en L-lysine, les inventeurs ont découvert qu'une souche capable de produire la L-lysine et appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium ayant une résistance à deux ou plus de deux antibiotiques ou à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine possédait une aptitude remarquable pour la production de L-lysine. En outre, les inventeurs ont découvert qu'une souche capable de produire la L-lysine avec des rendements élevés peut être obtenue en utilisant la technologie de la fusion

des cellules employant des protoplastes pour obtenir la recom-

binaison des souches Ce procédé permet d'obtenir effectivement des mutants doubles capables de produire la L-lysine à des rendements élevés et ce procédé est efficace pour obtenir des mutants possédant les avantages des souches parents bien choisies On a découvert que lors de la production de la

L-lysine par fermentation, on peut augmenter de façon remar-

quable la productivité en L-lysine, en utilisant un mutant ayant une résistance à deux ouplus de deux antibiotiques, un mutant ayant une résistance à au moins un composé analogue à la purine

ou à la pyrimidine ou une souche obtenue par fusion de proto-

plastes L'invention sera décrite plus en détail ci-après.

Comme micro-organisme selon l'invention, on illustre des

souches produisant la L-lysine obtenuespar fusion de proto-

plastes entre des souches parents ayant des propriétés dif-

férentes et des souches produisant la L-lysine obtenues par la technologie de la fusion de protoplastes ou par mutation conventionnelle induisant une mutation spontanée ou produite, ayant une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques ou une résistance à un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine. Comme souches selon l'invention ayant l'aptitude de produire la L-lysine et une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques, on peut utiliser une souche capable de produire la Llysine et appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium qui possède une résistance à deux ou plus de deux antibiotiques ou une souche ayant une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques et qui appartient au genre Corynebacterium et Brevibacterium et qui a l'aptitude de

produire la L-lysine.

Comme souches selon la présente invention ayant à la fois l'aptitude à produire la L-lysine et une résistance à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine, on peut utiliser une souche appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et ayant une aptitude pour produire la L-lysine et qui a une résistance à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine ou une souche appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et ayant une résistance à au moins un compose analogue à la purine ou à la pyrimidine et qui possède l'aptitude de produire la L-lysine. Comme souches appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et ayant une aptitude à la production de la L-lysine, on peut citer les souches capables de produire la L- lysine et ayant une exigence ou une combinaison d'exigences nutritives (par exemple homoserine, methionine, threonine, histidine, proline, alanine, leucine, isoleucine, valine, serine, acide glutamique, acide panténiquei amide de l'acide nicotinique, acide acétique, adénine, hypoxanthine, inositol et leu rscombinaisons), une résistance à divers composés analogues à des acides aminés (par exemple des composés analogues aux suivants: lysine, threonine, methionine, leucine, isoleucine, valine, acide aspartique, tryptophane, histidine et leurscombinaisons) et une résistance à d'autres produits chimiques (par exemple sulfamides,antibiotiques, du type penicilline, divers acides

organiques, quinones, quinolines et leurs combinaisons, etc).

Par conséquent, on peut utiliser selon l'invention une souche pouvant être obtenue en communiquant à une souche telle que mentionnée ci-dessus capable de produire la L-lysine, les propriétés de résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques ou une résistance à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine En outre, on peut également utiliser, selon l'invention, une souche capable de produire la L-lysine obtenue en communiquant à une souche appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium et résistant à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine ou à deux ou plus de deux

antibiotiques et ayant différentes exigences pour leur nour-

riture, une résistance à différents composés analogues aux acides aminés ou une résistance à d'autres produits chimiques comme mentionné ci-dessus En outre, la souche à utiliser selon l'invention peut posséder d'autres propriétés que celles ci-dessus mentionnées, contribuant à la productivité en L-lysine. Comme résistance à deux ou plus de deux antibiotiques, on peut mentionner une résistance à deux ou plus de deux antibiotiques tels que les penicellines, les cephalosporines, la streptomycine, la dihydrostreptomycine, le rifampicine, le chloramphénicol, les tetracyclines, la spiramycine, l'erythromycine, la kanamycine, la kasugamycine, la mitomycine

C, l'actinomycine D, la polymixine, la colistine, la linco-

mycine, la gentamicine, la sagamicine, la fortimicine, l'olean-

domycine, et les composés analogues.

Comme résistance à un composé analogue à la purine, on peut citer par exemple une résistance aux composés suivants: 6-mercaptoguanine, 8azaguanine, 2-fluoro-adénine, tubercidine,

6-méthylpurine, 8-azaxanthine, 8-azaadénine, 8-mercaptoguano-

sine, 6-mercaptoguanosine, 2-aminopurine, 2-amino-6-mercapto-

purine, decoyinine, psicofuranine, etc Comme résistance à

un composé analogue à la pyrimidine, on peut citer une résis-

tance aux composés suivants: 5-bromouracile, 6-azauracile, -fluorouracile, 5-bromo-2-deoxyuridine, 2-thiouracile, 6-méthyl-2-thiouracile, amicetine, etc.

Comme mutants utiles pour la mise en oeuvre de l'in-

vention, on peut citer les mutants dérivés de souches parentes appartenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium connues comme des souches produisant l'acide glutamique, telles que Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavumn ATCC 14067, etc.

Comme exemple spécifique d'une souche ayant une résis-

tance à deux ou à plus de deux antibiotiques, qui est utilisable comme micro-organisme selon l'invention, on peut citer Corynebacterium glutamicum H-3127 (appelé ci-après H-3127) (FERM BP-153) et Brevibacterium lactofermentum H-3125 (appelé ci-après H-3125) (FERM BP- 151) Comme exemple spécifique de souche ayant une résistance à un composé analogue à la purine, on peut citer Corynebacterium _lutamicum H-3107 (appelé ci-après H-3107) (FERM BP-144), Brevibacterium lactofermentum H- 3114 (appelé ci-après H-3114) (FERM BP-146), et comme exemples spécifiques d'une souche ayant une résistance à un composé analogue à la pyrimidine, on peut citer la Corynebacterium glutamicum H-3106 (appelé ci- après H-3106) (FERM BP-143) et Brevibacterium lactofermentum H-3113 (appelé ci-après H-3113)

(FERM BP-145).

Comme exemples spécifiques d'une souche ayant une aptitude à produire la L-lysine, obtenue par la technologie de la fusion de protoplastes, on peut citer une souche à fusion de protoplastes H-3057 (appelé ci-après H- 3057) (FERM BP-148) entre Corynebacterium glutamicum 1-3122 (appelé ci- après H-3122) (FERM BP-150) et Brevibacterium lactofermentum H-3126 (appelé ci-après H-3126) (FERM BP-152), et une souche à fusion de protoplastes H-3055) (appelé ci-après H-3055) (FERM BP-147) entre H-3122 et Corynebacterium glutamicum H-3119 (appelé ci-après H-3119) (FERM BP- 149) En outre, on peut mentionner la souche H-3149 résistante à la 6azauracile (appelé ci-après

H-3149) (FERM BP-158) dérivé de H-3055.

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On décrit ci-après un exemple pour obtenir une souche

à fusion de protoplastes selon l'invention.

On forme des protoplastes à partir de cellules de culture comme indiqué ci-après On inoccule une souche dans un milieu nutrifif NB contenant 20 g de poudre de bouillon et 5 g d'extrait de levure dans un litre d'eau pure dont le p H a été ajusté à 7,2 et on cultive avec agitation L'absorbance ou

densité optique (OD) à 660 nm est mesurée au moyen d'un turbi-

domètre et au stade initial (OD = 0,1 à 0,2) de la phase de croissance logarithmique, on ajoute de la penicilline G à la liqueur de culture pour obtenir une concentration finale de 0,1 à 0,8 p/ml On continue la culture et lorsque OD atteint 0,3 à 0,5, on recueille les cellules et on les lave avec un milieu SSM (contenant 10 g de glucose, 4 g de NH 4 C 1, 2 g d'urée, 1 g d'extrait de levure, 1 g de KH 2 P 04, 3 g de K 2 HPO 4, 0,4 g de Mg C 12 6 H 20, 10 mg de Fe SO 4 7 H 20, 0,2 mg de Mn SO 4 4-6 H 20,

0,9 mg de Zn SO 4 7 H 20, 0,4 mg de Cu SO 4 5 H 20, 0,09 mg de Na 2 B 407.

1 OH 20, 0,04 mg de (NH 4)6 Mo 7024 4 H 20, 30,pg de biotine et 1 mg de chlorhydrate de thiamine dans 1 litre d'eau pure dont le p H a été ajusté à 7,2 Lorsqu'on cultive unrsouche exigeant un acide aminé, on ajoute en outre au milieu SSM 50 pg/ml de l'acide aminé nécessaire Ensiite, on met les cellules en suspension dans un milieu PFM (contenant 0,4 M de sucrose et 0,01 M de Mg C 12 6 H 20 dans une solution SSM diluée au double et dont le p H g C 2 2 est ajusté à 7,0-8,5) On ajoute à la suspension de cellule dela Lysozyme ( 0,2 à 2 mg/ml) pour maintenir à 30-37 C pendant 16 heures La formation de protoplastes est confirmée sous microscope optique Les protoplastes de deux souches à fusionner ainsi préparés sont comptés sous microscope optique et on mélange les suspensions dans un rapport des protoplastes 1:1 On sépare les protoplastes du mélange par centrifugation et après lavage des protoplastes séparés, avec un milieu PFM, on met à nouveau les protoplastes en suspension dans 0,1 ml de milieu PFM On ajoute à la suspension 2,5 ml d'un milieu PFM contenant 40 % de polyéthylèneglycol (PEG) 4000, et on agite lentement pendant 5 minutes Lorsqu'on utilise une source résistante à la streptomycine et une souche résistante à la rifampicine, on étale 0,3 ml de la solution sur une plaque agar

RCG contenant 100 pg/ml de streptomycine et 0,05 pg/ml de rifam-

picine, (contenant 5 9 de glucose, 5 g d'acide casamino, 2,5 g d'extrait de levure, 3,5 g de K 2 HPO 4, 1,5 g de KH 2 PO 4, 0,41 g de Mg C 12 6 H Cl, 10 mg de Fe 504 7 H 20, 2 mg de Mn SO 4 4-6 H 20, 0,9 mg de Zn SO 4 7 H 20, 0,4 mg de Cu SO 4 5 H 20, 0,09 mg de Na 2 B 4 007 10 H 20,

0,04 mg de (NH 4)6 Mo 7024 4 H 20, 30 pg de biotine, 2 mg de chlorhy-

drate de thiamine, 135 g de succinate de sodium et 14 g d'agar dans 1 litre d'eau pure ajouté au p H de 7,4) Après la culture à 30 C pendant 12 jours, on obtient des colonies d'une souche

ayant une résistance à la fois à la streptomycine et à la rifam-

picine. On peut utiliser n'importe quel milieu synthétique ou naturel comme milieu pour l'invention à condition qu'il contienne

de façon appropriée une source de carbone, des matières inorga-

niques et autres produits nutritifs nécessaires assimilables par

la source utilisée.

Comme source de carbone, on peut citer divers hydrates de carbone tels que glucose, fructose, sorbitol, glycerol, sucrose, amidon, amidon hydrolysé, mélasse, jus de fruits, etc,

des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide fuma-

rique, l'acide lactique, etc, des alcools tels que l'éthanol,

le méthanol,etc.

Comme source d'azote, on peut utiliser l'ammoniac, des sels d'ammonium organiques et minéraux tels que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc, l'urée, les amines, d' autres composés contenant de l'azote et la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la liqueur de macération de mais, l'hydrolysat de caséine, l'hydrolysat acide de farine de soja, diverses cellules microbiennes, des cellules microbiennes digérées, etc. Comme matières inorganiques, on peut citer le phosphate diacide de potassium, le phosphate acide dipotassique, le phosphate de magnésium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate manganeux, le sulfate de

cuivre,le carbonate de calcium, etc Lorsqu'on utilise un micro-

3 organisme selon l'invention qui nécessite des aliments spécifiques pour sa croissance, on ajoute au milieu une quantité appropriée de ces aliments Dans certains cas, ces aliments nutritifs sont ajoutés comme composants de substance

naturelle illustrées comme source d'azote.

En outre, la productivité en L-lysine par le micro-

organisme peut dans certains cas être augmentée en ajoutant divers additifs tels que par exemple divers antibiotiques, l'acide "aminobutyrique, la cystéine, la leucine, la liqueur de fermentation de leucine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, etc. La culture est mise en oeuvre dans des conditions aérobies, par exemple sous forme de culture agitée, sous forme de culture agitée immergée, etc La température de culture est généralement de 20 à 40 C Le p H du milieu est compris entre 3 et 9 et il est de préférence maintenu autour de la neutralité, cependant la culture peut être mise en oeuvre dans des conditions

autres tant que le micro-organisme utilisé peut se multiplier.

Le p H du milieu est ajusté avec du carbonate de calcium, avec une solution acide ou alcaline,avec de l Vammoniaque, avec un agent tampon, etc -Habituellement,après 1 à 6 jours de culture, la L-lysine est formée et s'accumule dans la liqueur de culture

résultante.

Apres la fin de la culture, on élimine de la liqueur de culture les précipités tels que cellules, et on peut récupérer la L-lysine de la liqueur de culture en utilisant des mt Ihodes conventionneles,tels que traitement avec une résine échangeuse d'ions, concentration, adsorption, relargage, en combinant

éventuellement ces traitements.

L'invention sera mieux illustrée à l'aide des exemples représentatifs, non limitatifs ci-après:

Exemple 1

(Préparation de H-3127 et de H-3125) On étale sur une plaque de bouillon d'agar du Corynebacterium glutamicum FERM P-3634 (NRRL-B-8183) (appelé ciaprès P-3634) nécessitant de l'homosérine et de la leucine, résistant à la thialysine et à la sulfaméthazine,et ayant été cultivé pendant la nuit dans un bouillon; la plaque d'agar contenant 200 kg/ml de dihydrostreptomycine Apres avoir maintenu le milieu à 30 C pendant 2 à 10 jours, on sélectionne des colonies en formation, une souche mutante spontanée et on met les cellles mutantes en suspension dans une solution tampon de 0,1 N tris-maléate, ayant un p H de 6,0, à une concentration de 10 ocellules /ml On ajoute-à la suspension de la N-méthyl-N'-nitro-N'nitrosoguanidine pour obtenir une concentration finale de 0,2 mg/ml Après avoir laissé la suspension au repos pendant 30 minutes, à la température ambiante, on étale la suspension sur une plaque de bouillon d'agar contenant une unité/ml de penicilline G H 11-3127 est obtenu sous forme de mutant sélectionné parmi les colonies en croissance H-3127 se différencie nettement de la souche parent P-3634 par le fait que le premie: possède une résistance à la fois à la dihydrostreptomycine et à la penicilline G, comme indiqué sur le tableau i Aussi, unesouche résistante à la dihydrostreptomycine obtenue -à partir de Brevibacterium lactofermentum H-3056 (FERD BP-154) (appelé ci-après H-3056)

ayant une aptitude à produire de la lysine (ayant une résis-

tance à la thialysine et exigeant la leucine et ayant une exigence partielle pour l'homoserine) est soumise à la même mutation spontanée que celle décrite ci-dessus H-3125 est obtenu sous forme d'une souche mutante sélectionnée parmi les colonies en croissance sur une plaque de bouillon d'agar

contenant 501 g/ml de rifampicine H-3125 est nettement dif-

férencié de la souche parent H-3056 par le fait que la première a une résistance à la fois à la dihydrostreptomycine

et à la rifampicine comme indiqué sur le tableau 1.

Tableau 1

P-3634 H-3127 H-3056 H-3125

Penicilline G 0,5 p/ml ++ 1,0 'ti + Dihydrostre 100 lg/ml ++ ++ ptomycine 200 " ++ ++ Rifampicine 25 " ++

" ++

Sans addition ++ ++ ++ ++ (++: croissance suffisante; +: croissance dans une certaine mesure; : pas de croissance)

Exemple 2

(Préparation de H-3107, H-3106, H-3289, H-3290, H-3114, H-3113 et H-3291) On met en suspension des cellules de P-3634 dans une solution tampon de 0, 1 N tris-maléate (p H 6,0) à une concen- tration de 10 de cellules/ml On ajoute à la suspension de la

N-méthyl-N'-nitro-N'-nitrosoguanidine pour obtenir une concen-

tration finale de 0,2 mg/ml Après avoir laissé la suspension au repos pendant 30 minutes à la température ambiante, on étale la suspension sur une plaque agar horizontale d'un milieu minimal de composition suivante contenant 0,4 mg/ml de 6-mercaptoguanosine ou sur une plaque agar horizontale d'un milieu minimal de composition similaire contenant 0,4 mg/ml de 6-azauracile, et ensuite,on choisit les mutants parmi les colonies en croissance Les deux souches H-3107 et H-3106 se différencient nettement de la souche parent P-3634 par le fait que les deux possèdent une résistance, respectivement, à la 6-mercaptoguanosine et à la 6azauracile, comme indiqué sur le

tableau 2.

Les souches H-3289 et H-3290 sont choisies comme

mutants ayant une résistance à la 5-bromouracile et à la 6-

méthylpurine, respectivement, et les souches H-3114, H-3113 et H-3291 sont choisies comme mutants ayant une résistance à la 6-mercaptoguanosine, 6-azauracile et 5-bromouracile à

partir de Brevibacterium lactofermentum H-3056 (appelé ci-

après H-3056) (FERM BP-154) (ayant une résistance à la thialysine et une exigence pour la leucine et une exigence partielle pour l'homosérine)dans le même traitement de mutation

que décrit ci-dessus Les souches H-3289 et H-3290 sont net-

tement distinctes de la souche parent P-3634, et les souches H-3114, H3113 et H-3291 sont nettement distinctes de la souche

parent H-3056, comme indiqué sur le tableau 2.

Tableau 2

(++: croissance suffisante; +: croissance dans une

certaine mesure;: pas de croissance.

Sans addidition 6-Mercaptoguanosine lig/ml

500 "

6-Azauracile ig/ml 6-Methylpurine ig/ml

400 "

-Bromouracile 1000 pg/ml

2000 N

p 3

H H E H HH H-

3107 3106 3289 3290 3056 3114 3113

++ ++ ++ ++

+ ++ + H-

++ ++ ++ ++ ++

++ _

_ -+ S

_ _ ++

+ ++ + + La composition de la plaque d'agar horizontale i minimal est la suivante: gl de glucose, 4 g/l de chlorure d'ammonium, 1 g/l de KH 2 PO 4, 3 g/l de K 2 HPO 4, 0,4 g/1 de Mg SO 4 7 H 20, 0,01 g/l de Fe SO 4 7 H 20, 0,01 g/1 de Mn 504 4 H 20, 2 g/l

d'urée, 50 pg/l de biotine et 20 g/l d'agar p H: 7,2.

milieu

Exemple 3

(Préparation de H-3057) On prépare H-3122 ayant une aptitude à produire la L-lysine (réclamant de la leucine et partiellement L-homosérine et ayant une résistance à la thialysine, sulfaméthazine et rifampicine) dérivée de P-3634 et H-3126 (ayant une résistance à la thialysine et streptomycine) dérivée de Brevibacterium j lactofermentum FERM P-1837 (ATCC 21888) ayant une aptitude à

produire la L-leucine; et on met en oeuvre la fusion de proto-

plastes de la même façon que décrite ci-dessus, pour obtenir des souches à fusion de protoplastes ayant une résistance aux deux antibiotiques rifampicine et streptomycine En ce qui concerne la souche parent H-312 Z et N 3126, la fréquence d'apparition des souches mutant spontanément ayant une résistance aux

deux antibiotiques rifampicine et streptomycine sont respecti-

vement 1,3 x 108 et 6,5 x 10-9, tandis que la fréquence par -7 technologie de fusion-de protoplastes est 1,1 x 10 Par conséquent, la fusion de protoplastes dote les souches parents avec une double résistance au moins 10 fois plus que par mutation spontanée -Ainsi, il est confirmé que les souches ayant

une résistance-aux deux antibiotiques rifampicine et strepto-

mycine apparaissent avec une haute fréquence par la technologie

de la fusion de protoplastes.

Diverses propriétés de H-3057, choisie comme exemple caractéristique de souche par fusion de protoplastes figurent sur le tableau 3 comparativement avec les souches parents Il résulte de ce tableau que H3057 possède les mêmes propriétés que H-3126 en ce qui concerne la sensibilité à la sulfaméthazine et la résistance à la streptomycine, et possède les mêmes propriétés que H-3122 en ce qui concerne l'exigence pour la leucine, la sensibilité à la 2-thiénylalanine, la résistance à la rifampicine, l'aptitude à réduire NO 3 et la productivité de L-lysine Une telle souche H-3057 ne peut pas être obtenue comme résultat de mutation spontanée par un seul traitement et par conséquent H-3057 est une souche caractéristique obtenue par

fusion de protoplastes.

Tableau 3

3 O_ _

Sulfa Rédrduc-

S-Lys métha 2 TA Leu STM RIF uction Prot zine de N 03tivité zine H-3122 R R S Nécessaire S R ++ L-Lys H-3126 R S R Nonénces R S + L-Leu H-3057R S S Nécessaire R R L-Lys H-3057 R S S Ncsar LL R ++ L-Lys R: résistant S: sensible S-Lys: S-( 2-aminométhyl)-cystéine; (thialysine) 2 TA: 2thiénylalanine Leu: leucine STM: streptomycine RIF: rifampicine

Exemple 4

(Préparation de H-3055) H-3122 et H-3119 (nécessitant partiellement de l'homosérine, ne nécessitant pas de leucine et résistant à la

thialysine, à la 2-thiénylalanine, à l'acidec<-amino P-hydroxy-

butyrique et à la streptomycine) dériva de Corynebacterium alytamicum ATCC 21543 sont soumis au traitement de fusion de protoplastescomme décrit,pour obtenir une souche ayant une

résistance aux deux antibiotiques streptomycine et rifampicine.

La productivité en L-lysine et différentes propriétés de cette souche sont examinées La fréquence d'apparition de souches ayant acquisune résistance à la fois à la streptomycine et rifamrpicine comme résultat de la mutation spontanée de H-3122 et H-3119 sont 1,0 x 10-8 et 2,0 x 10-8 respectivement Par ailleurs, la

fréquence d'apparition par la fusion de protoplast E décrite ci-

dessus de souches acquérant la double résistance est de 4 x 10-7 ce qui est de 20 à 40 fois la fréquence par mutation spontanée Ainsi, il est confirmé que les souches ayant une résistance aux deux antibiotiques rifampicine et streptomycine apparaissent avec une fréquence élevée Comme souche ayant une productivité remarquablement améliorée en L-lysine, on cite par exemple le H-3055 Différentes propriétés de cette souche H-3055 figurent au tableau 4 comparées avec les propriétés des

souches parentes.

H-3055 a la mre non exigence de leucine et la même sensi-

bilité à la sulfaméthazine et à la streptomycine que H-3119, et a la même sensibilité à la 2-thiénylalanine et la même résistance à la rifampicine que H-3122 En ce qui concerne la croissance et la productivité de Llysine, H-3055 a une

productivité améliorée par rapport à celle des souches parents.

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Tableau 4

Sulfa Croissance Produc-

S-Lys Leu metha 2 TA STM RIF avec tivit zi'ne sans avecien Leu L en Lys H3122 R eces R S S R ++ 36 % saire H-3119 R îon S R R S + + 25 éces- 1 aire

H-3055 R S S R R ++ +++ 38

R: résistant S: sensible *: rendement ba optimales) ( pour H-3122) sé sur sucrose (sous conditions 0,5 g/l de L-leucine est ajouté

Exemple 5

(Préparation de H-3149) On met en suspension des cellules de H-3055 dans une

solution tampon 0,1 N de tris-maleate (p H 6,0) en une concen-

tration de 108 cellules/ml On ajoute à la suspension de la

N-méthyl-N'-nitro-N'-nitrosoguanidine pour obtenir une concen-

tration finale de 2 mg/ml Après avoir laissé au repos la suspension pendant 30 minutes à la température ambiante, on étale la suspension sur une plaque de bouillon d'agar contenant 1 mg/ml de 6-azauracile Après avoir maintenu cette plaque à C pendant 2 à 10 jours, on obtient H-3149 sous forme de

souches mutante\s choisies parmi les colonies qui se multiplient.

Le tableau 5 indique la sensibilité de H-3055 et de H-3149 par

rapport à 6-azauracile.

Tableau 5

H-3055 H-3149

Sans additicn ++ ++ 6-Azauracile 0 5 mg/ml ++

1.0 " +

3.0 (++: croissance suffisante; +: croissance dans une certaine mesure;: pas de croissance)

Exemple 6

H-3057 est utilisé comme souche d'ensemencement.

Cette souche est inoculée dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20ml de milieu de semence (p H 7,2) comprenant 40 g de glucose, 3 g/l d'urée, 1,5 g/1 de KH 2 PO 4, 0,5 g/l de K 2 HPO 4, 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 50/g/1 de biotine, 20 g/1 de peptone et 5 g/l d'extrait de levure et on cultive à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 2 ml de cette culture de semence dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml de milieu de fermentation (p H 7,2) comprenant 100 g/1 de mélasse de tafia (sous forme de glucose), 20 g/l d'hydrolysat acide de soja (exprimé sous forme de soja); 5 g/l de sulfate d'ammonium, 1 g/l de L-leucine, 3 g/1 d'urée, 0,5 g/1 de Mg SO 4 7 H 20, 0,7 g/l de KH 2 PO 4 et 30 g/l de Ca CO 3, et on cultive

avec agitation de 220 tours/minute à 30 C pendant 3 jours.

Comme résultat, on constate la formation de 39,5 g/1 de L-lysine (sous forme de monochlorhydrate),et on le recueille dans la liqueur de culture Des quantités de L-lysine obtenues lorsque les souches parentes H-3122 et H-3126 sont cultivées en même temps dans les mêmes conditions à titre de témoin,

sont 36 g/l et 0,5 g/l respectivement.

Après la fin de la culture, on centrifuge 1 litre de la liqueur de culture de H-3107 La liqueur surnageante résultante est passée à travers une colonne de Diaion SK-1 B (forme H+, marque déposée d'une résine échangeuse d'ions fortement acide fabriquée par Mitsubishi Chemical Industries, Ltd) pour y adsorber la L-lysine Apres lavage de la colonne avec de l'eau, on élue la L-lysine avec une solution ammoniacale aqueuse diluée pour recueillir et concentrer les fractions contenant la L-lysine Apres avoir ajusté le p H de ce concentré à 2 à l'aide d'acide chlorhydrique, on refroidit le concentré tout en ajoutant de l'éthanol pour obtenir la cristallisation

de L-lysine On obtient 31 g de cristaux de L-lysine.

Exemple 7

H-3055 est utilisé comme souche d'ensemencement.

On inocule cette souche dans le même milieu d'ensemen-

cement que celui utilisé dans l'exemple 6, et on cultive à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 2 ml de la culture d'ensemencement dans un Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml de milieu de fermentation '(p H 7,2) comprenant 100 g/l de mélasse de tafia (sous forme de glucose), 40 g/l de sulfate d'ammonium, 0,5 g/l de KH 2 P 04, 0,5 g/l de Mg SO 4 et 30 g/l de Ca C 03, et on cultive avec agitation ( 220 tours/minute) à 32 C pendant 3 jours Comme résultat, 41 g/l de L-lysine est accumulé dans la liqueur de culture Les quantités de L-lysine obtenues lorsqu'on cultive les souches H-3122 et H-3119 en même temps

et dans les mêmes conditions à titre de témoin, sont respec-

tivement de 2,5 g/l et de 24 g/l La productivité en L-lysine de H-3122 est très faible car le milieu de culture ne contient

pas de L-leucine réclamé par la souche.

Exemple 8

H-3127 et H-3125 sont utilisés comme souchesd'ensemen-

cement Chacune de ces souches est inoculée dans le milieu d'ensemencement utilisé dans l'exemple 6, et on cultive à 30 C pendant 24 heures On inocule ensuite 2 ml de chaque souche de culture dans le même milieu de fermentation qu'utilisé dans l'exemple 5 et on cultive avec agitation ( 220 tours/minute) à 30 C pendant 3 jours Comme résultat, L-lysine est accumulé dans la liqueur de culture en des quantités figurant sur le tableau 6 Des quantités de L-lysine obtenues lorsqu'on cultive les souches P-3634 et H-3056 en même temps et dans les mêmes conditions à titre de témoin figurent également sur le tableau 6.

Tableau 6

________ Quantité de L-lysine (g/g)

P-3634 * 36

H-3127 39

H-3056 31

H-3125 36

Exemple 9

H-3055, H-3127, H-3125 et H-3057 sont utilisés comme souches d'ensemencement Chacune de ces souches est inoculée dans le même milieu d'ensemencement que celui utilisé dans l'exemple 6 et on cultive à 100 C pendant 24 heures On place ensuite 2 ml de chaque culture de semence dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml de milieu de fermentation (p H 7,2) comprenant 100 g/l de glucose, 20 g/l de chlorure d'ammonium, 20 g/l de liqueur de macération de mais, 200 pg/1 de biotine, 1 g/l de KH 2 PO 4, 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 0,2 mg/1 de chlorhydrate de thiamine, 10 mg/1 de Fe SO 4 7 H 20, 10 mg/1 de Mn SO 4 4 H 20, 3 g/l d'urée et 20 g/1 de Ca CO 3, et on cultive

avec agitation à 30 C pendant 3 jours Les quantités de L-

lysine ainsi accumulées figurent sur le tableau 7 ensemble avec les quantités de L-lysine accumulées en cultivant les souches parentes P-3634, H-3122, H-3126 et H-3119, en même

temps et dans les mêmes conditions à titre de témoin Addition-

nellement, pour les souches nécessitant le L-leucine, 0,5 g/1

de L-leucine est ajouté au milieu.

Tableau 7

Quantité de L-lysine (g/Z)

H-312536 5

E-3127 40 O

H-3055 41 0

H-3057 39 0

P-3634 36 5

H-3122 37 O

H-3119 29 0

H-3126 0 5 -

Exemple 10

H-3055 est utilisé comme souche d'ensemencement La souche est inoculée dans un flacon d'Erlenmeyer de 300 ml contenant 30 ml du même milieu d'ensemencement que celui utilisé dans l'exemple 6, et on cultive avec agitation ( 220 tours/minute) à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 100 ml de la culture d'ensemencement dans un récipient de 2 litres contenant 0,8 1 de milieu de fermentation comprenant 30 g/l de glucose, 3 g/l d'acétate d'ammonium, lg/l de KH 2 PO 4; 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 10 mg/l de Fe 504 7 H 20, 10 mg/l de Mn SO 4, 200 pg/1 de biotine, 200 fg/1 de chlorhydrate de thiamine et 2 g/1 d'hydrolysat acide d'aliment de soja (sous forme d'aliment de soja) et on cultive avec aération et agitation, le taux d'aération étant de 1 1/minute, et la vitesse d'agitation de 800 tours/minute, à 35 C pendant 55 heures tout en ajustant le p H de la liqueur de fermentation à 6,8 avec un mélange d'acide acétique et d'acétate d'ammonium (rapport acide acétique: acétate d'ammonium = 6: 1; concentration de l'acide acétique

dans le mélange: 60 %) Comme résultat, on constate l'accumu-

lation de 39 g/l de L-lysine dans la liqueur de culture.

Lorsqu'on cultive les souches parentes H-3122 et H-3119 en même temps et dans les mêmes conditions, à titre de témoin,

les quantités de L-lysine sont de 35 g/l et de 27 g/l, res-

pectivement.

Exemple 11

H-3107 est utilisé comme souche d'ensemencement.

La souche d'ensemencement est inoculée dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml de milieu d'ensemencement (p H 7,2) comprenant 40 g/l de glucose, 3 g/l d'urée, 1,5 g/1 de KH 2 P 04, 0,5 g/l de K 2 HP 04, 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 50 pg/1 de biotine, 20 g/l de peptone et 5 g/l d'extrait de levure et on cultive à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 2 ml de la culture de semence résultante dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml d'un milieu de fermentation (p H 7,2) comprenant 90 g/l de mélasse de tafia (sous forme de glucose), 20 g/1 d'hydrolysat acide d'aliment de soja (sous forme d'aliment de soja), 5 g/1 de sulfate d'ammonium, 3 g/1 d'urée, 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 0,7 g/l de K 2 HPO 4 et 30 g/1

de Ca CO 3, et on cultive avec agitation à 30 C pendant 3 jours.

Comme résultat, on obtient 38 g/1 de L-lysine dans la liqueur de culture Les quantités de L-lysine obtenu lorsqu'on cultive la souche parente P3634 dans les mêmes conditions, à titre de

témoin, est de 34 g/l.

Après la fin de la culture, on centrifuge 1 litre de la liqueur de culture de H-3107 On ajuste la liqueur surnageant; résultante à p H 1,5 avec de l'acide sulfurique, on fait passer à travers une colonne de Diaion SK-1 B (forme H, résine échangeuse d'ions fortement acide, fabriquée par Mitsubishi Chemical Industrie, Ltd) pour y adsorber la L- lysine Après lavage de la colonne avec de l'eau, on élue la L-lysine avec une

solution aqueuse diluée d'ammvniaque pour recueillir et concen-

trer les fractions contenant la L-lysine Après avoir ajusté le p H du concentré à 2 avec de l'acide chlorhydrique, on refroidit le concentré tout en y ajoutant de l'éthanol pour cristalliser la L-lysine On obtient ainsi 30,4 g de cristaux

de L-lysine.

Exemple 12

Les souches figurant au tableau 8 sont respectivement inoculées dans le même milieu d'ensemencement que dans l'exemple 11 et cultivées à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 2 ml de chacune des liqueurs de culture d'ensemencement résultant dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant 20 ml de milieu de fermentation (p H 7,2) comprenant 90 g/1 de glucose, g/l d'hydrolysat acide d'aliment de soja (sous forme d'aliment de soja), 5 g/1 de sulfate d'ammonium, 3 g/1 d'urée, 0,5 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 1 g/1 de KH 2 P 04, 50/ug/l de biotine, ug/ml de chlorhydrate de thiamine, 10 mg/1 de Fe SO 4 7 H 20, mg/1 de Mn SO 4 4 H 20 et 20 g/1 de Ca CO 3, et on cultive avec agitation à 30 C pendant 3 jours Les quantités de L-lysine accumulées dans les liqueurs de culture figurent sur le tableau 8.

Tableau 8

Souche L-Lysine Corynebacterium glutamicum P-3634 33 0 g/L

H-3106 36 0 "

H-3289 35 O

H-3290 34 5 "

Brevibacterium lactofermentum H-3056 31 0 g/2

H-3114 35 0 "

*H-3113 34 0 "

H-3291 34 0 "

Exemple 13

H-3106 est utilisé comme source d'ensemencement.

On inocule la source d'ensemencement dans un flacon Erlenmeyer de 2 litres contenant 300 ml du même milieu de semence que dans l'exemple 11 et on cultive avec agitation à 30 C pendant 24 heures On place ensuite 1 litre de la culture de semence résultante dans un récipient à fermentation de 30 litres contenant 10 litres de milieu de fermentation comprenant 100 g/l de mélasse de tafia (sous forme de glucose), 0,3 g/l de Mg SO 4 7 H 20, 0,7 g/l de KH 2 PO 4; 3 g/1 d'urée, 18 g/l d'hydrolysat acide d'aliment de soja (sous forme d'aliment de soja) et 1, 4 % (v/v) de liqueur de fermentation de leucine préparée en avance comme indiqué ci-après et on cultive avec aération à un taux de 10 1/minute et avec agitation à la vitesse de 400 tours/minute à 30 C pendant 48 heurestout en ajustant le p H de la liqueur de culture & 6,8 avec de l'ammoniac aqueux à 22 % Comme résultat, on accumule 43 g/l de L-lysine dans la liqueur de culture La quantité de L-lysine recueillie lorsqu'on cultive la souche parente P-3634 dans les mêmes conditions, à titre de témoin, est de

37 g/l.

La liqueur de fermentation de leucine utilisée dans

le milieu de fermentation est préparée comme suit.

Corynebacterium glutamicum ATCC 21885 ayant une apti-

tude à produire la leucine est inoculé dans un récipient de

fermentation de 5 litres contenant 3 litres de milieu d'ense-

mencement (p H 7,2) comprenant 50 g/1 de glucose,10 g/1 de peptone, 10 g/l d'extrait de leve, 5 g/Il de liqueur de macération de mais, 2,5 g/il de Na Cl, 3 g/1 d'urée et 50 pg/1 de biotine, et on cultive avec aération de 3 litres/minute et agitation à 600 tours/minute à 30 C pendant 17 heures On place ensuite 1 litre

de la culture de semence résultante dans un récipient de fermen-

tation de 30 litres contenant 10 litres d'un milieu de fermen-

tation (p H 6,8)comprenant 5 g/l d'acétate d'ammonium, 2 g/l de KH 2 PO 4, 0,5 g/1 de Mg SO 4 7 H 20, 0,1 g/1 de Fe 504 7 H 20, 0,01 g/l de Mn SO 4 4 H 20, 501 g/l de biotine et l O Opg/l de chlorhydrate de thiamine et on cultive avec aération au taux de 10 1/minute et avec une agitation de 400 tours/minute, à C pendant 60 heures Au cours de la culture, on ajuste le p H de la liqueur de culture à 6,8 en utilisant une solution mixte contenant 7 % d'acétate d'ammonium et 38 % d'acide acétique, sous forme d'addition continue On obtient ainsi une liqueur de fermentation de leucine contenant 15,3 g/l de leucine qui fait partiede la composition dudit milieu de fermentation pour la L-lysine.

Exemple 14

H-3149 est utilisé comme souche d'ensemencement.

On inocule cette souche dansle même milieu d'ensemen-

cement que celui utilisé dans l'exemple 6, et on cultive à 30 C pendant 24 heures On inocule ensuite 2 ml de la culture d'ensemencement dans un flacon Erlenmeyer de 300 ml contenant ml de milieu de fermentation (p H 7, 2) comprenant 100 g/l de mélasse de tafia (sous forme de glucose),40 g/1 de sulfate d'ammonium, 0,5 g/l de KH 2 PO 4, 0,5 g/1 de Mg SO 4 et 30 g/l de Ca CO 3, et on cultive à 32 C pendant 3 jours en agitant à 220 tours/minute On obtient 43 g/l de L-lysine accumulée dans la liqueur de culture La quantité de L-lysine obtenue lorsqu'on cultive la souche parente H-3055, en mêmetemps

et dans les mêmes conditions, à titre de témoin, est de 41 g/l.

Claims (27)

REVENDICATIONS

1 Procédé de production de L-lysine comprenant la cultured'un microorganisme obtenu par fusion de protoplastes et ayant une aptitude à produire la L-lysine, dans un milieu nutritif,la production et l'accumulation de la L-lysine dans la liqueur

de culture résultante et la récupération de la L-lysine.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme appartient au genre

Corynebacterium ou Brevibacterium.

3 Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé

par le fait que ledit micro-organisme est obtenu par fusion de protoplastes entre les mêmes souches ou des souches différentes appartenant au genre Corynebacterium glutamicum ou

Brevibacterium lactofermentum.

4 Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé

par le fait que ledit micro-organisme a une résistance à deux

ou à plus de deux antibiotiques.

Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé

par le fait que ledit micro-organisme a une résistance à deux ou à plus de deux antibiotiques et est également résistant

à un composé analogue à la pyrimidine.

6 Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis dans le groupe formé par les antibiotiques du type aminoglucoside, antibiotiques du type p -lactame, antibiotiques du type macrolide

et antibiotiques du type rifamycine.

7 Procédé selon les revendications 4 ou 5, caractérisé

par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis dans le groupe formé par la penicilline G, la cephalosporine C, la streptomycine, la dihydrostreptomycine, la rifampicine, le

chloramphénicol, le tetracycline, le spiramycine, l'erythromy-

cine, le kanamycine, le kasugamycine, le mitomycine C, l'acti-

nomycine D, le polymixine, le colistine, le lincomycine,

le gentamicine, le sagamicine, le fortimicine et l'oléandomycine.

8 Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le composé analogue à la pyrimidine est choisi dans le groupe fomné par le 5bromouracile, le 6-azauracile, le -fluorouracile, la 5-bromo-2déoxyuridine, le 2-thiouracile,

le 6-méthyl-2-thiouracile et l'amicétine.

9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est une souche à fusion de protoplastes H-3057 (FERM BP148) obtenue par fusion de protoplastes entre Corynebacterium glutamicum H-3122 (FERM BP-150) et Brevibacterium lactofermentum H-3126 (FERM BP-152) une souche à fusion de protoplastes H-3055 obtenue par fusion de protoplastes entre Corynebacterium glutamicum H-3122 (FERM BP-150) et Corynebacterium glutamicum H-3119 (FERM BP-149) ou H-3149 (FERM BP-158) dérivé de la souche à fusion de

protoplastes H-3055.

Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la culture est réalisée à 20-40 C pendant 1 à 6 jours. 11 Procédé de production de L-lysine comprenant la

culture d'un micro-organisme appartenant au genre Coryne-

bacterium ou Brevibacterium et ayant à la fois l'aptitude de produire la L-lysine et une résistance à 2 ou plus de 2 antibiotiques, dans un milieu nutritif, la formation et l'accumulation de la L-lysine dans la liqueur de culture

résultante et la récupération de la L-lysine.

12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis dans le groupe

formé par les antibiotiques du type aminoglucoside, les anti-

biotiques du type P-lactame, les antibiotiques du type macrolide

et les antibiotiques du type rifamycine.

13 Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis dans le groupe formé par penicilline G, cephalosporine C, streptomycine,

dihydrostreptomycine, rifampicine, chloramphénicol, tetra-

cycline, spiramycine, erythromycine, kanamycine, kasugamycine,

mitomycine C, actinomycine D, polymixine, colistine, linco-

mycine, gentamicine, sagamicine, fortimicine et oléandomycine.

14 Procédé de production de L-lysine par fermentation, comprenant la culture d'un micro-organisme appartenant au genre

Corynebacterium ou Brevibacterium et ayant à la fois une apti-

tude à produire la L-lysine et une résistance à au moins un composé analogue à la purine ou à la pyrimidine, dans un milieu nutritif, la formation à l'accumulation de la L-lysine dans la liqueur de culture résultante et la récupération de la L-lysine

de cette liqueur de culture.

Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le composé analogue à la purine est choisi dans le groupe formé par les composés suivants: 6-mercaptoguanine, 8-azaguanine, 2-fluoroadénine, tubercidine, 6-méthylpurine,

8-azaxanthine, 8-azaadénine, 8-mercaptoguanosine, 6-mercapto-

guanosine, 2-aminopurine, 2-amiro-6-mercaptopurine, decoyinine

et psicofuranine.

16 Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le composé analogue à la pyrimidine est choisi dans

le groupe formé par 5-bromouracile, 6-azauracile, 5-fluorou-

racile, 5-bromo-2-déoxyuridine, 2-Lhiouracile, 6-méthyl-2 -

thiouracile et amicétine.

17 Procédé selon les revendications 11 ou 14, carac-

térisé par le fait que ledit micro-organisme appartient à l'espèce Corynebacterium alutamicum ou Brevibacterium lactofermentum. 18 Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ledit microorganisme est Corynebacterium glutamicum H-3127 (FERM BP-153) ou Brevibacterium lactofermentuni

H-3125 (FERM BP-151).

19 Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est Corynebacterium qlutamicum 11-3107 (FERM BP-144), Corynebacterium glutamicum H-3106 (FERM BP-143), Corynebacteriuin glutamicum H-3290 (FERM BP-156), Corynebacteri Um 9 lutamicum H-3289 (FERM BP-157), Brevibacterium lactofermentum H-3114 (FE Pfl BP-146), Brevibacterium lactofermentum H-3113 (FERM BP-145) ou

Brevibacterium lactofermentum H-3291 (FERM BP-155).

20 Procédé selon les revendications 11 ou 14, carac-

térisé par le fait que la culture est effectuée de 20 à 400 C

pendant 1 à 6 jours.

Z 511035

21 Micro-organisme ayant une aptitude à produire la

L-lysine, obtenu par la technologie de fusion de protoplastes.

22 Micro-organisme selon la revendication 21, ap-

partenant au genre Corynebacterium ou Brevibacterium.

23 Micro-organisme selon la revendication 21, carac- térisé par le fait qu'il est obtenu par fusion de protoplastes entre des souches identiques ou différentes appartenant à l'espèce Corynebacterium glutamicum ou Brevibacterium lactofermentum.

24 Micro-organisme selon la revendication 21, carac-

térisé par le fait qu'il a une résistance à deux ou plus de

deux antibiotiques.

Micro-organisme selon la revendication 21, carac-

térisé par le fait qu'il a une résistance à deux ou plus de deux antibiotiques et une résistance à un composé analogue à

la pyrimidine.

26 Micro-organisme selon les revendications 24 ou 25,

caractérisé par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis

dans le groupe formé par les antibiotiques du type amino-

glucoside, les antibiotiques du type P-lactame, les antibiotiques

du type macrolide et les antibiotiques du type rifamycine.

27 Micro-organisme selon les revendications 24 ou 25,

caractérisé par le fait que lesdits antibiotiques sont choisis dans le groupe formé par penicilline G, cephalosporine C,

streptomycine, dihydrostreptomycine, rifampicine, chloram-

phénicol, tetracycline, spiramycine, erythromycine, kanamycine, kasugamycine, mitomycine C, actinomycine D, polymixine, colistine, lincomycine, gentamicine, sagamicine, fortimicine

et oléandomycine.

28 Micro-organisme selon la revendication 25, carac-

térisé par le fait que le composé analogue à la pyrimidine est choisi dansle groupe formé par les composés suivants: -bromouracile, 6azauracile, 5-fluorouracile, 5-bromo-2- déoxyuridine, 2-thiouracile, 6méthyl-2-thiouracile et

amicétine.

29 Micro-organisme selon la revendication 21, carac-

térisé par le fait qu'il s'agit de la souche à fusion de protoplastes H3057 (FERM BP-148) obtenuepar fusion de protoplastes entre Corynebacterium glutamicum H-3122 (FERM BP-150) et Brevibacterium lactofermentumni H-3126 (FERM BP-152), une souche à fusion de protoplastes H-3055 (FERM BP-147) obtenuepar fusion de protoplastes entre Corynebacterium glutamicum H-3122 (FERM BP-150) et Corynebacterium glutamicum Hl-3119 (FERM BP-149) ou H-3149 (FERM BP-158) dérivé de la souche à fusion de

protoplastes H-3055.

Culture biologiquement pure de micro-organisme Corynebacterium glutamicum H-3107 (FERM BP-144), lequel

micro-organisme lorsqu'on le cultive produit la L-lysine.

31 Une culture biologiquement pure du micro-organisme

Corynebacterium glutamicum H-3106 (FERM BP-143), lequel micro-

organisme lorsqu'il est cultivé, produit la L-lysine.

32 Culture biologiquement pure de micro-organisme

Corynebacterium glutamicum H-3290 (FERM BP-156), lequel micro-

organisme lorsqu'on le cultive produit la L-lysine.

33 Culture biologiquement pure de micro-organisme Brevibacterium lactofermentum H-3114 (FERM BP-146), lequel

micro-organisme lorsqu'on le cultive, produit la L-lysine.

34 Une culture biologiquement pure du micro-organisme Brevibacterium lactofermentum H-3113 (FERM BP-145), lequel

micro-organisme lorsqu'on le cultive produit la L-lysine.

Une culture biologiquement pure du micro-organisme Brevibacterium lactofermentum H-3291 (FERM BP-155), lequel

micro-organisme lorsqu'on le cultive, produit la L-lysine.