JP2000125893A - Ｌ―アミノ酸の発酵生産のための方法 - Google Patents
Ｌ―アミノ酸の発酵生産のための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高浸透圧の細胞の影響が抑制された、Ｌ−ア
ミノ酸の発酵生産のための方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸の発酵生産のための方法に
おいて、コリネ型微生物を使用し、かつ発酵初期にＬ−
プロリンを、公知のＣおよびＮ源を含有する発酵液体培
地に添加することによって解決された。
ミノ酸の発酵生産のための方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸の発酵生産のための方法に
おいて、コリネ型微生物を使用し、かつ発酵初期にＬ−
プロリンを、公知のＣおよびＮ源を含有する発酵液体培
地に添加することによって解決された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−プロリンが浸
透保護剤として発酵液体培地に加えられている、コリネ
型微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産のための方法
に関する。
透保護剤として発酵液体培地に加えられている、コリネ
型微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産のための方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】浸透圧下で、多くの微生物がその細胞質
中にカリウムイオンまたはいわゆるオスモライト（有機
化合物）を凝集することは公知である。これは、内部浸
透圧への抵抗を導き、細胞の脱水作用を防ぐ。これに関
連して、グリシンベタインの添加が、特に浸透圧の抑制
された培養液中で細胞の成長速度に作用することは、公
知である。これは、糖消費速度の上昇およびＬ−リシン
（Y.Kawahara, Y.Yoshihara, S.Ikeda, H.Yoshii, Y.Hi
rose, Ｌ−リシンの発酵におけるグリシンベタインの刺
激効果 (1990)34 (1), pp 87-90 Microbiology Biotech
nology に記載）生産の増加を導く。
中にカリウムイオンまたはいわゆるオスモライト（有機
化合物）を凝集することは公知である。これは、内部浸
透圧への抵抗を導き、細胞の脱水作用を防ぐ。これに関
連して、グリシンベタインの添加が、特に浸透圧の抑制
された培養液中で細胞の成長速度に作用することは、公
知である。これは、糖消費速度の上昇およびＬ−リシン
（Y.Kawahara, Y.Yoshihara, S.Ikeda, H.Yoshii, Y.Hi
rose, Ｌ−リシンの発酵におけるグリシンベタインの刺
激効果 (1990)34 (1), pp 87-90 Microbiology Biotech
nology に記載）生産の増加を導く。
【０００３】ブレビバクテリウムラクトフェルメンタン
（Brevibacterium lactofermentum）のプロリン栄養要
求性突然変異体の場合は、プロリンが浸透調節の一部を
担うことが見いだされた。
（Brevibacterium lactofermentum）のプロリン栄養要
求性突然変異体の場合は、プロリンが浸透調節の一部を
担うことが見いだされた。
【０００４】これら菌株の浸透許容量は、野生型菌株に
対して低いことが証明されている。これに関して、ピロ
リン−５−カルボキシレート還元酵素活性は、細胞が浸
透圧下で成長した場合に比べて、３倍増加したことが見
いだされた（Y.kawahara, T.Ohsumi, Y.Yoshihara, S.I
keda, ブレビバクテリウムラクトフェルメンタンの浸透
調節中のプロリン、（1989）、53、（9）pp 2475-247
9、Agricultural and Biological Chemistry ）。
対して低いことが証明されている。これに関して、ピロ
リン−５−カルボキシレート還元酵素活性は、細胞が浸
透圧下で成長した場合に比べて、３倍増加したことが見
いだされた（Y.kawahara, T.Ohsumi, Y.Yoshihara, S.I
keda, ブレビバクテリウムラクトフェルメンタンの浸透
調節中のプロリン、（1989）、53、（9）pp 2475-247
9、Agricultural and Biological Chemistry ）。
【０００５】アミノ酸の生産は、引用文献中に見受けら
れない。
れない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高浸
透圧の細胞の影響を抑制した、Ｌ−アミノ酸の発酵生産
のための方法を提供することである。
透圧の細胞の影響を抑制した、Ｌ−アミノ酸の発酵生産
のための方法を提供することである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産お
よび排出するコリネ型微生物がそれらのための培養液中
で培養され、さらに従来の成分であるＬ−プロリンが、
好ましくは発酵の最初に添加されることに特徴づけられ
ている、Ｌ−アミノ酸の発酵生産の方法を提供する。特
に、量または形質によって明らかにされた成分から成
る、いわゆる最小限の培養液および限定された培養液中
に適応可能である。しかしながら、内容物として加水分
解産物または抽出物を含む複合培養液の場合には、さら
なるＬ−プロリンの添加も、結果として改善された収量
が得られる。
よび排出するコリネ型微生物がそれらのための培養液中
で培養され、さらに従来の成分であるＬ−プロリンが、
好ましくは発酵の最初に添加されることに特徴づけられ
ている、Ｌ−アミノ酸の発酵生産の方法を提供する。特
に、量または形質によって明らかにされた成分から成
る、いわゆる最小限の培養液および限定された培養液中
に適応可能である。しかしながら、内容物として加水分
解産物または抽出物を含む複合培養液の場合には、さら
なるＬ−プロリンの添加も、結果として改善された収量
が得られる。
【０００８】この場合、Ｌ−プロリンは、ＣまたはＮ源
として微生物の代謝中において役立たない。しかしなが
ら、その添加は、アミノ酸生産体の改善された成長およ
びアミノ酸収量の増加を導く。
として微生物の代謝中において役立たない。しかしなが
ら、その添加は、アミノ酸生産体の改善された成長およ
びアミノ酸収量の増加を導く。
【０００９】コリネ型微生物、特にコリネバクテリウム
グルタミカン（Corynebacterium glutamicum）種は、ア
ミノ酸生産体として久しく公知であった。Ｌ−リシン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリンの生産
に適した、好ましい菌株が用いられる。また、Ｌ−グル
タミン酸もこの方法で生産されてもよい。
グルタミカン（Corynebacterium glutamicum）種は、ア
ミノ酸生産体として久しく公知であった。Ｌ−リシン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリンの生産
に適した、好ましい菌株が用いられる。また、Ｌ−グル
タミン酸もこの方法で生産されてもよい。
【００１０】発酵は一般に２５℃〜５０℃、好ましくは
３０℃〜４０℃の温度で実施される。その間、ｐＨは６
〜８、好ましくは７〜７．５であり、かつアンモニウム
濃度は、好ましくは０．５〜８ｇ／ｌである。
３０℃〜４０℃の温度で実施される。その間、ｐＨは６
〜８、好ましくは７〜７．５であり、かつアンモニウム
濃度は、好ましくは０．５〜８ｇ／ｌである。
【００１１】Ｌ−プロリンを、０．０１〜１０ｇ／ｌ、
好ましくは０．１〜２．５ｇ／ｌの量で発酵液体培地に
加える。
好ましくは０．１〜２．５ｇ／ｌの量で発酵液体培地に
加える。
【００１２】適したコリネバクテリウム属の菌株、特に
コリネバクテリウムグルタミカン種は、例えばグルタミ
ン酸を生産する知られた野生型菌株であり： コリネバクテリウム グルタミカン ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミカン（ Corynebac
terium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィラン（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ ブレビバクテリウム フラバム（brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン（brevibac
terium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ディバリカタン（brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ さらにこれから作られた変異体または菌株、Ｌ−リシン
を生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８
および ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ あるいは、Ｌ−トレオニンを生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ５８
３５ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ４１６４
および ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ４１８０ または、Ｌ−イソロイシンを生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ７５
６ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ７５９お
よび ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ４１９２ あるいは、Ｌ−バリンを生産する菌株は、例えば、 ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ５１２お
よび ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ１８４５である。
コリネバクテリウムグルタミカン種は、例えばグルタミ
ン酸を生産する知られた野生型菌株であり： コリネバクテリウム グルタミカン ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミカン（ Corynebac
terium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィラン（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ ブレビバクテリウム フラバム（brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン（brevibac
terium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ディバリカタン（brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ さらにこれから作られた変異体または菌株、Ｌ−リシン
を生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８
および ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ あるいは、Ｌ−トレオニンを生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ５８
３５ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ４１６４
および ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ４１８０ または、Ｌ−イソロイシンを生産する菌株は、例えば、 コリネバクテリウム グルタミカン ＦＥＲＭ−Ｐ７５
６ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ７５９お
よび ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ４１９２ あるいは、Ｌ−バリンを生産する菌株は、例えば、 ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ５１２お
よび ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタン ＦＥＲＭ
−Ｐ１８４５である。
【００１３】発酵に用いた培養液は、本発明で記載され
たＬ−アミノ酸生産のための、公知の基本的な培養液
か、あるいは通常、Ｌ−アミノ酸生産に用いられ、かつ
Ｌ−アミノ酸を生産するバクテリアに適した培養液であ
る。
たＬ−アミノ酸生産のための、公知の基本的な培養液
か、あるいは通常、Ｌ−アミノ酸生産に用いられ、かつ
Ｌ−アミノ酸を生産するバクテリアに適した培養液であ
る。
【００１４】使用された炭素の主要源は、一般に公知で
あるように、糖例えば、グルコース、サッカロース、フ
ラクトース、マルトース、糖蜜、さらにデンプンおよび
デンプン加水分解産物、セルロースおよび糖化されたセ
ルロース、ラクトース、脂肪酸例えば、アセチル酸、プ
ロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール
酸、有機酸例えば、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、
フマル酸、リンゴ酸、アルコール例えば、エチルアルコ
ール、ブチルアルコール、前記化合物の独立した成分ま
たは混合物である。加えて、選択されたＬ−アミノ酸の
生合成経路からの前駆体ならびに生合成経路それ自体が
用いられてもよい。
あるように、糖例えば、グルコース、サッカロース、フ
ラクトース、マルトース、糖蜜、さらにデンプンおよび
デンプン加水分解産物、セルロースおよび糖化されたセ
ルロース、ラクトース、脂肪酸例えば、アセチル酸、プ
ロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール
酸、有機酸例えば、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸、
フマル酸、リンゴ酸、アルコール例えば、エチルアルコ
ール、ブチルアルコール、前記化合物の独立した成分ま
たは混合物である。加えて、選択されたＬ−アミノ酸の
生合成経路からの前駆体ならびに生合成経路それ自体が
用いられてもよい。
【００１５】使用されるリン源は、一般にリン酸、二水
素リン酸カリウムまたはリン酸水素二カリウム、あるい
は相当するナトリウムを含有する塩である。
素リン酸カリウムまたはリン酸水素二カリウム、あるい
は相当するナトリウムを含有する塩である。
【００１６】使用される窒素源は、一般的に公知である
ように、アンモニウム塩、例えば硫化アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、尿素、液体アンモニウム、アンモニウム水である。
使用される窒素の複合有機源は、カザミノ酸、トウモロ
コシ浸漬水剤、大豆ミール加水分解産物、イーストエク
ストラクト、バイオマス加水分解産物およびタンパク質
加水分解産物である。
ように、アンモニウム塩、例えば硫化アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、尿素、液体アンモニウム、アンモニウム水である。
使用される窒素の複合有機源は、カザミノ酸、トウモロ
コシ浸漬水剤、大豆ミール加水分解産物、イーストエク
ストラクト、バイオマス加水分解産物およびタンパク質
加水分解産物である。
【００１７】使用されてもよい無機塩は、リン酸塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩、銅塩および、場合によ
っては他の微量元素[sic]である。さらに場合によって
は、ビタミン例えば、ビオチン、チアミンなどを使用し
てもよい。
グネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩、銅塩および、場合によ
っては他の微量元素[sic]である。さらに場合によって
は、ビタミン例えば、ビオチン、チアミンなどを使用し
てもよい。
【００１８】本発明による培養条件は、公知のアミノ酸
発酵と同様である。ところが、発酵液体培地の成分は、
Ｌ−アミノ酸または使用された菌株に大変依存してお
り、培養温度は２５℃〜５０℃であり、好ましくは３０
℃〜４５℃である。ｐＨ値に関しては、ｐＨ値が中性の
範囲にある場合には、良好な結果が得られる。タンパク
質加水分解産物が、窒素複合源として使用されるところ
では、その中で存在してもよいプロリン内容量は、使用
された付加的なプロリンの量が有利に重視される。加水
分解産物から生じるプロリンの量は、これら産物の自然
成分によって制限され、その結果、本発明による方法の
工程中でのプロリン量のさらなる添加は、有利であるこ
とを証明する。
発酵と同様である。ところが、発酵液体培地の成分は、
Ｌ−アミノ酸または使用された菌株に大変依存してお
り、培養温度は２５℃〜５０℃であり、好ましくは３０
℃〜４５℃である。ｐＨ値に関しては、ｐＨ値が中性の
範囲にある場合には、良好な結果が得られる。タンパク
質加水分解産物が、窒素複合源として使用されるところ
では、その中で存在してもよいプロリン内容量は、使用
された付加的なプロリンの量が有利に重視される。加水
分解産物から生じるプロリンの量は、これら産物の自然
成分によって制限され、その結果、本発明による方法の
工程中でのプロリン量のさらなる添加は、有利であるこ
とを証明する。
【００１９】
【実施例】本発明は、例によって以下、詳細に説明され
る。
る。
【００２０】この目的のために、アミノ酸を生産する菌
株の試験を実施し、その中で請求された方法が優れてい
ることを明らかにした： ａ）Ｌ−リシン生産菌株コルネバクテリウムグルタミカ
ン ＤＳＭ５７１５（ヨーロッパ特許出願公告第０４３
５１３２号明細書）および、 ｂ）Ｌ−トレオニンおよびＬ−イソロイシン生産菌株ブ
レビバクテリウム フラバム ＤＳＭ５３９９（ヨーロ
ッパ特許出願公告０３８５９４０号明細書）。
株の試験を実施し、その中で請求された方法が優れてい
ることを明らかにした： ａ）Ｌ−リシン生産菌株コルネバクテリウムグルタミカ
ン ＤＳＭ５７１５（ヨーロッパ特許出願公告第０４３
５１３２号明細書）および、 ｂ）Ｌ−トレオニンおよびＬ−イソロイシン生産菌株ブ
レビバクテリウム フラバム ＤＳＭ５３９９（ヨーロ
ッパ特許出願公告０３８５９４０号明細書）。
【００２１】例１ Ｌ−リシンの発酵生産 ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌおよびイー
ストエクストラクト１０ｇ／ｌを含有する培養液を、水
酸化ナトリウムでｐＨ７．４に調整し、加熱滅菌の後、
その培養液１ｌに対して５０％のグルコース溶液４０ｍ
ｌを加えた。培養液４７ｍｌをコリネバクテリウムグル
タミカンＤＳＭ５７１５と共に、注射針で、栄養媒体と
して４８時間培養された、脳、心臓浸出物を有する寒天
平板上に植え付け、インファーズＡＧ社（the firm Inf
ors AG、ボットミンゲン、スイス）のＲＣ−１−ＴＫ培
養器中で、２０時間に亘り３３℃で、１５０ｒｐｍで振
盪した。その後、細胞を滅菌済生理食塩水で洗浄した。
細胞を、ベックマン遠心分離器Ｊ６Ｂ中で４０００ｒｐ
ｍで２０分に亘る遠心によって分離した。
ストエクストラクト１０ｇ／ｌを含有する培養液を、水
酸化ナトリウムでｐＨ７．４に調整し、加熱滅菌の後、
その培養液１ｌに対して５０％のグルコース溶液４０ｍ
ｌを加えた。培養液４７ｍｌをコリネバクテリウムグル
タミカンＤＳＭ５７１５と共に、注射針で、栄養媒体と
して４８時間培養された、脳、心臓浸出物を有する寒天
平板上に植え付け、インファーズＡＧ社（the firm Inf
ors AG、ボットミンゲン、スイス）のＲＣ−１−ＴＫ培
養器中で、２０時間に亘り３３℃で、１５０ｒｐｍで振
盪した。その後、細胞を滅菌済生理食塩水で洗浄した。
細胞を、ベックマン遠心分離器Ｊ６Ｂ中で４０００ｒｐ
ｍで２０分に亘る遠心によって分離した。
【００２２】振盪フラスコ中の主要培養では、１ｌのビ
ーカー中に（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ ０．２５ｇおよびＬ−ロイシン０．３ｇを計量
導入し、蒸留水７５０ｍｌをそれに加えた。極微量の塩
の溶液は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ、ＭｎＳＯ
４・Ｈ２０ １．０ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１
ｇ、ＣｕＳＯ４ ０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２
０ ０．００２ｇを含み、それらは蒸留水１００ｍｌに
溶解され、塩の溶解性を増大するために、数滴のＨＣｌ
で、わずかに酸性化した。さらに、蒸留水１００ｍｌ中
にビオチン０．０２ｇの溶液１ｍｌを加えた。次いで、
ＮａＣｌを５ｇ／ｌの濃度で加えた。この培養液を、４
５ｍｌずつに分配し、５００ｍｌの三角フラスコ中に入
れ、かつ０．１〜１０ｇ／ｌの異なるプロリン濃度に調
製した。１２１℃で、２０分に亘るオートクレーブでの
加熱滅菌後、別に滅菌された５０％グルコース溶液１２
ｍｌおよび滅菌されたＣａＣｏ３１．２ｇをそれぞれの
フラスコに加えた。その後、滅菌条件下で洗浄された培
養液中の細胞へ植え付けを行った。洗浄した細胞の光学
的密度（測定に用いた波長：５３５ｎｍ）は、１８．
５；この懸濁液７．７ｍｌを培養液５７ｍｌの植え付け
に用いた。
ーカー中に（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ ０．２５ｇおよびＬ−ロイシン０．３ｇを計量
導入し、蒸留水７５０ｍｌをそれに加えた。極微量の塩
の溶液は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ、ＭｎＳＯ
４・Ｈ２０ １．０ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１
ｇ、ＣｕＳＯ４ ０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２
０ ０．００２ｇを含み、それらは蒸留水１００ｍｌに
溶解され、塩の溶解性を増大するために、数滴のＨＣｌ
で、わずかに酸性化した。さらに、蒸留水１００ｍｌ中
にビオチン０．０２ｇの溶液１ｍｌを加えた。次いで、
ＮａＣｌを５ｇ／ｌの濃度で加えた。この培養液を、４
５ｍｌずつに分配し、５００ｍｌの三角フラスコ中に入
れ、かつ０．１〜１０ｇ／ｌの異なるプロリン濃度に調
製した。１２１℃で、２０分に亘るオートクレーブでの
加熱滅菌後、別に滅菌された５０％グルコース溶液１２
ｍｌおよび滅菌されたＣａＣｏ３１．２ｇをそれぞれの
フラスコに加えた。その後、滅菌条件下で洗浄された培
養液中の細胞へ植え付けを行った。洗浄した細胞の光学
的密度（測定に用いた波長：５３５ｎｍ）は、１８．
５；この懸濁液７．７ｍｌを培養液５７ｍｌの植え付け
に用いた。
【００２３】培養を、インフォーマーＡＧ社（ボットミ
ンガン、スイス）のＲＣ−１−ＴＫ培養器で、７２時間
以上に亘り３３℃で、かつ１５０ｒｐｍで実施した。こ
れに続けて、光学的密度（ＯＤ）（Ｄｒ．ラング社（th
e firm Dr.Lange）の光度計ＬＰ２Ｗ、ベルリン、ドイ
ツ）および培養懸濁液中に形成されるＬ−アミノ酸の濃
度を測定した。アミノ酸をイオン交換クロマトグラフィ
ーおよびエッペンドルフ バイオトロニク社（the firm
Eppendrolf, BioTronik ハンブルグ、ドイツ）のアミ
ノ酸アナライザーを用いた、ニンヒドリン検出でのポス
トカラム反応によって分析した。試験結果は表１に示
す。
ンガン、スイス）のＲＣ−１−ＴＫ培養器で、７２時間
以上に亘り３３℃で、かつ１５０ｒｐｍで実施した。こ
れに続けて、光学的密度（ＯＤ）（Ｄｒ．ラング社（th
e firm Dr.Lange）の光度計ＬＰ２Ｗ、ベルリン、ドイ
ツ）および培養懸濁液中に形成されるＬ−アミノ酸の濃
度を測定した。アミノ酸をイオン交換クロマトグラフィ
ーおよびエッペンドルフ バイオトロニク社（the firm
Eppendrolf, BioTronik ハンブルグ、ドイツ）のアミ
ノ酸アナライザーを用いた、ニンヒドリン検出でのポス
トカラム反応によって分析した。試験結果は表１に示
す。
【００２４】
【表１】
【００２５】例２ Ｌ−トレオニンの発酵生産 サッカロース１００ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １２
ｇ／ｌ、大豆ミール加水分解産物１００ｍｌ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５．０ｇ
／ｌおよび極微量の塩の溶液１ｍｌを含有する培養液
を、ｐＨ７．０に調整し、かつオートクレーブにかけ
た。ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ １．０ｇ，ＭｎＳＯ４／Ｈ
２Ｏ １．０ｇ、ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、Ｃ
ｕＳＯ４ ０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
０．００２ｇから成る極微量の塩の溶液を、脱イオン水
１００ｍｌおよび数滴の１Ｎ ＨＣｌ溶液で作った。
ｇ／ｌ、大豆ミール加水分解産物１００ｍｌ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５．０ｇ
／ｌおよび極微量の塩の溶液１ｍｌを含有する培養液
を、ｐＨ７．０に調整し、かつオートクレーブにかけ
た。ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ １．０ｇ，ＭｎＳＯ４／Ｈ
２Ｏ １．０ｇ、ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、Ｃ
ｕＳＯ４ ０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
０．００２ｇから成る極微量の塩の溶液を、脱イオン水
１００ｍｌおよび数滴の１Ｎ ＨＣｌ溶液で作った。
【００２６】０．２ｍｇ／ｌビオチンおよびチアミン保
存溶液をそれぞれ１ｍｌずつを、濾過滅菌し、培養液に
加えた。ＣａＣＯ３ １０．０ｇ／ｌを振盪フラスコと
共に滅菌した。培養液中に、大豆ミール加水分解産物の
導入により得られたプロリン濃度は、０．３４ｇ／ｌで
あった。プロリン保存溶液から得られた、明記されたプ
ロリン濃度は、濾過滅菌の後に培養液に加えられた。
存溶液をそれぞれ１ｍｌずつを、濾過滅菌し、培養液に
加えた。ＣａＣＯ３ １０．０ｇ／ｌを振盪フラスコと
共に滅菌した。培養液中に、大豆ミール加水分解産物の
導入により得られたプロリン濃度は、０．３４ｇ／ｌで
あった。プロリン保存溶液から得られた、明記されたプ
ロリン濃度は、濾過滅菌の後に培養液に加えられた。
【００２７】ＤＳＭ５３９９と共に７２時間に亘り培養
された、栄養媒体として脳、心臓浸出物を有する寒天平
板を、滅菌済生理食塩水１０ｍｌ中に懸濁した。培養液
１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコ中に入れ、はがさ
れた細胞の懸濁液１００μｌに植え付けた。培養は、７
２時間に亘り３０℃で、３００ｒｐｍでおこなった。こ
れに続けて、実施例１に明記されているように、ＯＤを
６６０ｎｍの波長で決定し、トレオニン濃度を測定し
た。試験結果を表２に示す。
された、栄養媒体として脳、心臓浸出物を有する寒天平
板を、滅菌済生理食塩水１０ｍｌ中に懸濁した。培養液
１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコ中に入れ、はがさ
れた細胞の懸濁液１００μｌに植え付けた。培養は、７
２時間に亘り３０℃で、３００ｒｐｍでおこなった。こ
れに続けて、実施例１に明記されているように、ＯＤを
６６０ｎｍの波長で決定し、トレオニン濃度を測定し
た。試験結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】例３ Ｌ−イソロイシンの発酵生産 サッカロース１００ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １２
ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ
４ ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ ５．０ｇ／ｌおよび極微量の塩の溶液
を含有する、培養液１ｍｌをｐＨ７．０に調整し、オー
トクレーブをかけた。極微量の塩の溶液は、ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０
ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、ＣｕＳＯ４
０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００２ｇか
ら成り、蒸留水１００ｍｌと数滴の１Ｎ ＨＣｌで作ら
れた。
ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ
４ ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ
／ｌ、ＮａＣｌ ５．０ｇ／ｌおよび極微量の塩の溶液
を含有する、培養液１ｍｌをｐＨ７．０に調整し、オー
トクレーブをかけた。極微量の塩の溶液は、ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０
ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、ＣｕＳＯ４
０．０２ｇおよびＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００２ｇか
ら成り、蒸留水１００ｍｌと数滴の１Ｎ ＨＣｌで作ら
れた。
【００３０】濾過によって滅菌された０．２ｍｇ／ｌの
ビオチンおよびチアミンの保存溶液それぞれ１ｍｌを、
培養液に加えた。ＣａＣＯ３１０．０ｇ／ｌを、振盪フ
ラスコと一緒に滅菌した。濾過滅菌の後、プロリン保存
溶液から得られた適切な濃度のプロリンを、培養液に加
えた。
ビオチンおよびチアミンの保存溶液それぞれ１ｍｌを、
培養液に加えた。ＣａＣＯ３１０．０ｇ／ｌを、振盪フ
ラスコと一緒に滅菌した。濾過滅菌の後、プロリン保存
溶液から得られた適切な濃度のプロリンを、培養液に加
えた。
【００３１】ＤＳＭ５３９９と共に７２時間に亘り培養
された、栄養媒体として脳、心臓浸漬物を有する寒天平
板を、滅菌済生理食塩水１０ｍｌ中で懸濁した。培養液
１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコ内に入れ、取り出
された細胞懸濁液１００μｌを植え付けた。培養は、７
２時間以上に亘り３０℃で、３００ｒｐｍで行った。こ
れに続けて、例１に明記されたように、ＯＤを６６０ｎ
ｍの波長で決定し、イソロイシン濃度を測定した。試験
結果は表３に示す。
された、栄養媒体として脳、心臓浸漬物を有する寒天平
板を、滅菌済生理食塩水１０ｍｌ中で懸濁した。培養液
１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコ内に入れ、取り出
された細胞懸濁液１００μｌを植え付けた。培養は、７
２時間以上に亘り３０℃で、３００ｒｐｍで行った。こ
れに続けて、例１に明記されたように、ＯＤを６６０ｎ
ｍの波長で決定し、イソロイシン濃度を測定した。試験
結果は表３に示す。
【００３２】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 ハイディ ペーター ドイツ連邦共和国 ライヒリンゲン ノイ シュトラーセ 12 (72)発明者 ズザンネ モールバッハ ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ マイゼン ヴェーク 13 (72)発明者 イローナ ヴァルガー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト バー ラッハシュトラーセ ７ (72)発明者 ラインハルト クレーマー ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ブルクシ ュトラーセ ９ (72)発明者 ヴァルター プフェファーレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (7)
- 【請求項１】 Ｌ−アミノ酸を生産および排出するコリ
ネ型微生物の培養による、Ｌ−アミノ酸の発酵生産のた
めの方法において、好ましくは発酵初期にＬ−プロリン
を、公知のＣおよびＮ源を含有する発酵液体培地に添加
することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の発酵生産のため
の方法。 - 【請求項２】 Ｌ−プロリンを発酵液体培地に対して、
０．０１〜１０ｇ／ｌの量で加えることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 Ｌ−プロリンを発酵液体培地に対して、
０．１〜２．５ｇ／ｌの量で加えることを特徴とする、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 最小限の培養液中および／または限定さ
れた培養液中で、発酵を実施することを特徴とする、請
求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 加水分解産物を含む培養液中で、発酵を
実施することを特徴とする、請求項１から３までのいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ト
レオニンまたはＬ−バリンを生産することを特徴とす
る、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 コリネバクテリウム（Corynebacteriu
m）属の微生物を使用することを特徴とする、請求項１
から６までのいずれか１項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE19849625A DE19849625A1 (de) | 1998-10-28 | 1998-10-28 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP11303952A Pending JP2000125893A (ja) | 1998-10-28 | 1999-10-26 | Ｌ―アミノ酸の発酵生産のための方法 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022515496A (ja) * | 2018-12-26 | 2022-02-18 | デサン・コーポレイション | Ｌ－アミノ酸を生産する大腸菌変異株またはコリネバクテリウムグルタミカム変異株、およびそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法 |
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|---|---|---|---|---|
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| KR100442768B1 (ko) * | 2001-05-21 | 2004-08-04 | 주식회사 한국표지화합물연구소 | 방사성동위원소 표지화합물로서 ｌ-발린의 제조방법 |
| CN101235401B (zh) * | 2007-02-02 | 2011-06-08 | 上海祥韦思化学品有限公司 | 发酵制备l-氨基酸的方法 |
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- 1998-10-28 DE DE19849625A patent/DE19849625A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-10-20 EP EP99120741A patent/EP0997532A3/de not_active Withdrawn
- 1999-10-25 ID IDP990978D patent/ID24138A/id unknown
- 1999-10-26 JP JP11303952A patent/JP2000125893A/ja active Pending
- 1999-10-27 AU AU57068/99A patent/AU5706899A/en not_active Abandoned
- 1999-10-27 KR KR1019990046815A patent/KR20000029349A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-10-27 US US09/428,048 patent/US20010049128A1/en not_active Abandoned
- 1999-10-27 SK SK1477-99A patent/SK147799A3/sk unknown
- 1999-10-27 CA CA002287532A patent/CA2287532A1/en not_active Abandoned
- 1999-10-27 HU HU9903899A patent/HUP9903899A2/hu unknown
- 1999-10-27 BR BR9904948-1A patent/BR9904948A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-10-27 ZA ZA9906751A patent/ZA996751B/xx unknown
- 1999-10-28 CN CN99122093A patent/CN1257930A/zh active Pending
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| JP2022515496A (ja) * | 2018-12-26 | 2022-02-18 | デサン・コーポレイション | Ｌ－アミノ酸を生産する大腸菌変異株またはコリネバクテリウムグルタミカム変異株、およびそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法 |
| JP7304953B2 (ja) | 2018-12-26 | 2023-07-07 | デサン・コーポレイション | Ｌ－アミノ酸を生産する大腸菌変異株またはコリネバクテリウムグルタミカム変異株、およびそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法 |
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