SK147799A3

SK147799A3 - Process for the fermentative production of l-amino acids

Info

Publication number: SK147799A3
Application number: SK1477-99A
Authority: SK
Inventors: Ulrich Becker; Heidi Peter; Susanne Morbach; Ilona Walger; Reinhard Kramer; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2000-11-07
Also published as: CA2287532A1; HUP9903899A2; DE19849625A1; JP2000125893A; US20010049128A1; KR20000029349A; HU9903899D0; AU5706899A; ZA996751B; ID24138A; BR9904948A; CN1257930A; EP0997532A3; EP0997532A2

Description

Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu fermentačnej výroby L-aminokyselín pomocou koryneformných baktérií, pri ktorom sa k fermentačnému roztoku pridáva L-prolín ako osmoprotektívna látka.

Doterajší stav techniky

Je známe, že väčšina mikroorganizmov za osmotického stresu koncentruje vo svojej cytoplazme draselné ióny alebo takzvané osmolyty (organické zlúčeniny). Toto vedie k vnútornej osmotickej odporovej sile, ktorá zabraňuje dehydratácii buniek. V tejto súvislosti je známe, že pomocou prídavku betaínu glycínu sa stimuluje miera rastu buniek najmä v médiách s inhibičným osmotickým tlakom. To vedie k zvýšeniu miery spotreby cukru a nárastu produkcie L-lyzínu (Y. Kawahara, Y. Yoshihara, S. Ikeda, H. Yoshii, Y. Hirose, Stimulátory effectt of glycine betaine on L-lysine fermentation (1990), 34 (1), str. 87-90, Applied Microbiology Biotechnology).

Pri prolín-auxotrofných mutantoch Brevibacterium. lactofermentum sa zistilo, že prolín hrá určitú úlohu pri osmoregulácii.

Osmotická tolerancia týchto kmeňov sa javila nižšia ako pri divých kmeňoch. V tejto súvislosti sa aktivita pyrolín5-karboxylátreduktázy ukazuje ako zvýšená o trojnásobok, keď bunky rástli za osmotického tlaku (Y. Kawahara, T. Ohsumi,

Y. Yoshihara, S. Ikeda, Proline in the Osmoregulation of

Brevibacterium lactofermentum, (1989), 53, (9), str. 24752479, Agricultural and Biological Chemistry). Výroba aminokyselín sa nedá z tohto citátu prebrať.

Úloha vynálezu spočíva v poskytnutí spôsobu fermentačnej výroby L-aminokyselin, pri ktorom sa tlmia účinky hyperosmotického tlaku na bunky.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, ktorý sa vyznačuje tým, že koryneformné mikroorganizmy produkujúce a vylučujúce L-aminokyseliny sa kultivujú v médiu, ku ktorému sa pridáva okrem zvyčajných zložiek L-prolín, prednostne na začiatku fermentácie. Toto platí najmä pre takzvané minimálne médiá, poprípade definované médiá, ktoré sa skladajú zo zložiek identifikovaných z hladiska kvantity a druhu. Ale aj pri komplexne zložených médiách, ktoré medzi iným obsahujú hydrolyzáty alebo extrakty, vedie prímes L-prolínu k zlepšeným výťažkom.

L-Prolín pritom neslúži ako zdroj uhlíka alebo dusíka v metabolizme mikroorganizmov. Prímes však spôsobuje zlepšený rast producentov aminokyselín a zvýšenie výťažku aminokyselín.

Koryneformné baktérie, najmä druh Corynebacterium glutamicum, sú už dlho známe ako producenti aminokyselín. Prednostne sa využívajú kmene vhodné na výrobu L-lyzínu, L-izoleucínu, L-treonínu alebo L-valínu. Takto sa môže vyrábať aj kyselina L-glutámová.

Fermentácia sa uskutočňuje všeobecne pri teplotách 25 až 50 °C, najmä 30 až 45 °C, zatiaľ čo hodnota pH je v rozmedzí 6 až 8, najmä 7 až 7,5 a koncentrácia amoniových iónov je prednostne 0,5 až 8 g/1.

K fermentačnému roztoku sa pridáva L-prolín v množstve 0,01 až 10 g/1, prednostne 0,1 až 2,5 g/1.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum sú napríklad známe kmene divého typu produkujúce kyselinu glutámovú:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Corynebacterium

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 acetoacidophilum ATCC13870

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a

Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vyrobené mutanty, poprípade kmene, ako napríklad kmene produkujúce L-lyzín:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708 a

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 alebo ako napríklad kmene produkujúce L-treonín:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 5835

Brevibacterium flavum FERM-P 4164 a

Brevi ba c téri um lactofermentum FERM-P 4180 alebo ako napríklad kmene produkujúce L-izoleucín:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 756

Brevibacterium flavum FERM-P 759 a

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4192 alebo ako napríklad kmene produkujúce L-valín:

Brevibacterium flavum FERM-P 512 a

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845.

Na fermentáciu sa používajú známe základné médiá na produkciu L-aminokyselín, ako sa uvádzajú v predloženom vynáleze, alebo bežné médiá na produkciu L-aminokyselín, ktoré sú vhodné pre baktérie produkujúce L-aminokyseliny.

Ako hlavné zdroje uhlíka sa používajú známym spôsobom cukry, ako je glukóza, sacharóza, fruktóza, maltóza, melasy, ale aj škrob a hydrolyzáty škrobu, celulóza a scukornená celulóza, mastné kyseliny, ako je kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; organické kyseliny, ako je kyselina pyrohroznová, kyselina citrónová, kyselina jantárová, kyselina fumarová, kyselina jablčná; alkoholy, ako je etanol, butanol; jednotlivé zložky alebo zmesi uvedených zlúčenín. Dodatočne sa môžu používať prekurzory z biosyntézy zvolených L-aminokyselín a tieto samotné.

Ako zdroje fosforu slúžia všeobecne kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan sodný alebo príslušné soli obsahujúce sodík.

Ako zdroje dusíka sa používajú, ako je všeobecne známe, amónne soli, ako je síran amónny, chlorid amónny, dusičnan amónny, octan amónny, močovina, kvapalný amoniak alebo amoniaková voda. Ako komplexné organické zdroje dusíka sa používajú casaminokyseliny, máčacia voda, hydrolyzát sójovej múky, kvasnicový extrakt, hydrolyzáty biomasy, ako aj proteínové hydrolyzáty.

Ako anorganické soli sa môžu používať fosforečnany, horečnaté soli, vápenaté soli, draselné soli, sodné soli, soli železa, soli mangánu, zinočnaté soli, soli medi a iných stopových prvkov, ak je to potrebné. Ďalej sa môžu používať, ak je to potrebné, vitamíny, ako je biotín, tiamín atď.

Podmienky kutivácie podía predloženého vynálezu sú také isté ako pri známych fermentáciách aminokyselín. Zatial čo zloženia fermentačných roztokov sa menia v závislosti od Laminokyseliny alebo použitého kmeňa, kultivačná teplota je 25 až 50 °C, najmä 30 až 45 °C. Čo sa týka hodnoty pH, dobré výsledky sa dosahujú, ak hodnota pH zostáva v neutrálnej oblasti. Pri použití proteínového hydrolyzátu ako komplexného zdroja dusíka sa výhodne prihliada pri stanovení dodatočne použitého prolínu na obsah prolínu poprípade v ňom obsiahnutého. Množstvo prolínu, ktoré pochádza z hydrolyzátu, je obmedzené prirodzeným zložením týchto produktov, takže prídavok ďalších množstiev prolínu v rámci spôsobu podľa vynálezu sa ukazuje ako prospešný.

Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia. Na tento účel sa uskutočnili pokusy s kmeňmi produkujúcimi aminokyseliny, v ktorých sa demonštruje prevaha nárokovaného spôsobu:

a) kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5715, (EP-B- 0435 132) produkujúci L-lyzín a

b) kmeň Brevibacterium flavum DSM5399 (EP-B- 0385 940) produkujúci L-treonín a L-izoleucín.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Fermentačná výroba L-lyzínu

Kultivačné médium, ktoré obsahuje 2,5 g/1 NaCl, 10 g/1 peptónu a 10 g/1 kvasnicového extraktu, sa nastavilo na pH

7,4 pomocou hydroxidu sodného a po tepelnej sterilizácii sa zmiešalo so 40 ml 50o roztoku glukózy na liter. Diely média s objemom 47 ml sa inokulovali sterom očiek z agarovej platne inkubovanéj 48 hodín s mozgovo-srdcovým agarom ako živnou pôdou s Corynebacterium glutamicum DSM5715 a pretrepávali 20 hodín pri 33 °C a pri 150 ot./min v inkubátore RC-l-TK od firmy Infors AG (Bottmingen, Švajčiarsko). Potom sa bunky premyli sterilným fyziologickým roztokom chloridu sodného.

Separácia buniek sa uskutočňovala 20 min pri 4000 ot./min v centrifúge Beckmann J 6B.

Na hlavnú kultiváciu v bankách na pretrepávanie sa odvážilo v kadičke s objemom 1 1 40 g (NHJ_SO₄, 0,5 g KH;PO₄,

0,5 g KjHPO₄, 0,25 g MgSO₄.7HjO a 0,3 g leucinu a pridalo sa 750 ml destilovanej vody. Okrem toho sa pridal 1 ml roztoku soli stopových prvkov. Roztok soli stopových prvkov obsahoval 1,0 g FeSO₄.7H_O, 1,0 g ΜηδΟ·.Η.Ο, 0,1 g ZnSO,. 7H.O, 0,02 g CuSO₄ a 0, 002 g NiCl_.6HO, ktorý sa kvôli lepšej rozpustnosti soli mierne okyslil niekoľkými kvapkami HC1, sa rozpustil v 100 ml destilovanej vody. Dodatočne sa pridal 1 ml roztoku biotinu obsahujúceho 0,02 g biotinu na 100 ml destilovanej vody. Potom sa pridal NaCl v koncentrácii 5 g/1.

Toto kultivačné médium sa rozdelilo na diely s objemom 45 ml do Erlenmeyerových baniek s objemom 500 ml a nastavilo na rozdielne koncentrácie prolinu od 0,1 do 10 g/1. Po tepelnej sterilizácii v autokláve pri 121 °C počas 20 minút sa do každej banky pridalo 12 ml oddelene sterilizovaného 50, roztoku glukózy a 1,2 g sterilizovaného CaCCl·. Nato sa naočkova li bunkami kultivačného média premytými za sterilných podmienok. Optická hustota (meracia vlnová dĺžka: 535 nm) premytých buniek bola 18,5; 7,7 ml tejto suspenzie sa použilo na naočkovanie 57 ml kultivačného média.

Kultivácia sa uskutočňovala 72 hodin pri 33 °C a 150 ot./min v inkubátore RC-l-TK od firmy Infors AC (Bottmingen, Švajčiarsko). V nadväznosti na to sa v kultivačnej suspenzii stanovila optická hustota (OH) (fotometer LP2W od firmy Dr. Lange; Berlín, Nemecko) a koncentrácia vytvorenej L-aminokyseliny. Aminokyseliny sa stanovili pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a dodatočnou reakciou na kolóne pomocou ninhydrínovej detekcie. V tabulke 1 je znázornený výsledok pokusu.

TABUĽKA 1

Prolín [g/1] ...........o .....

0, 5

OH 535 nm '“~24'T6............

30, 5

Lyzín [g/1] .............23,6

29, 4

Príklad 2

Fermentačná výroba L-treonínu

Kultivačné médium, ktoré obsahovalo 100 g/1 sacharózy, g/1 (NH₄)_;SO₄, 100 ml/1 hydrolyzátu sójovej múky, 0,5 g/1 K_;HPO₄, 0,5 g/1 KH_:PO₄, 0,25 g/1 MgSO₄.7H_O, 5,0 g/1 NaCl a 1 ml roztoku solí stopových prvkov, sa nastavilo na pH 7,0 a autoklávovalo. Roztok solí stopových prvkov obsahoval 1,0 g FeSO₄.7H_O, 1,0 g MnSO₄.HO, 0,1 g ZnSO₄.7H_O, 0,02 g CuSO₄,

0, 002 g NiCl;.6H_:O, ktorý sa doplnil na 100 ml demineralizovanou vodou a niekoľkými kvapkami IN roztoku HCl.

Ku kultivačnému médiu sa pridal 1 ml sterilné filtrovaného zásobného roztoku biotínu, poprípade tiamínu s koncentráciou 0,2 mg/1. Spoločne sa sterilizovalo 10,0 g CaCO., v pretrepávaných bankách. Koncentrácia prolínu v kultivačnom médiu, ktorý vznikol zo vsádzky hydrolyzátu sójovej múky, bola 0,34 g/1. Uvedená koncentrácia prolínu sterilné filtrovaného zo zásobného roztoku sa pridala do média.

Agarová platňa s mozgovo-srdcovým agarom ako živnou pôdou, inkubovaná 72 hodín s DSM5399, sa premyla 10 ml sterilného fyziologického roztoku NaCl. Erlenmeyerove banky na pretrepávanie s objemom 100 ml sa naplnili 10 ml kultivačného média a inokulovali 100 μΐ premytej suspenzie buniek. Kultivácia sa uskutočňovala 72 hodín pri 30 °C a 300 ot./min. Nato sa merali optické hustoty pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm a koncentrácia treonínu, ako sa uvádza v príklade 1. V tabuľke 2 je znázornený výsledok pokusu.

TABUĽKA 2

Prolín [g/1]	OH 660 nm	Treonín [g/1]
0, 34	51,2	0, 63
0, 66	52, 6	1,29

Príklad 3

Fermentačná výroba L-izoleucínu

Kultivačné médium, ktoré obsahuje 100 g/1 sacharózy, 12 g/1 (NHJ.SO4, 0,5 g/1 K2HPO4, 0,5 g/1 KH₂PO₄, 0,25 g/1 MgSO₄.7H₂O, 5,0 g/1 NaCl a 1 ml roztoku solí stopových prvkov, sa nastavilo na pH 7,0 a podrobilo spracovaniu v autokláve. Roztok solí stopových prvkov, ktorý obsahoval 1,0 g FeSO₄.7H₂O, 1,0 g MnSO₄.H₂O, 0,1 g ZnSO₄.7H₂O, 0,02 g CuSO₄ a 0, 002 g NiClj.6H₂0, sa doplnil na 100 ml demineralizovanou vodou a niekoľkmý kvapkami IN roztoku HC1.

Ku kultivačnému médiu sa pridal vždy 1 ml sterilné filtrovaného zásobného roztoku biotínu, poprípade tiamínu s koncentráciou 0,2 mg/1. Spoločne sa sterilizovalo 10,0 g CaCO< v pretrepávaných bankách. Zo zásobného roztoku prolínu sa pridávala príslušná koncentrácia sterilné filtrovaného prolínu do kultivačného média.

I

Agarová platňa s mozgovo-srdcovým agarom ako živnou pôdou, inkubovaná 72 hodín s DSM5399, sa premyla 10 ml sterilného fyziologického roztoku NaCl. Erlenmeyerove banky na pretrepávanie s objemom 100 ml sa naplnili 10 ml kultivačného média a inokulovali 100 μΐ premytej suspenzie buniek. Kultivácia sa uskutočňovala 72 hodín pri 30 °C a 300 ot./min. Nato sa merali optické hustoty pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm a koncentrácia izoleucínu, ako sa uvádza v príklade 1. V tabuľke 3 je znázornený výsledok pokusu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín kultiváciou koryneformných mikroorganizmov produkujúcich a vylučujúcich tieto aminokyseliny, vyznačujúci sa tým, žéV^k fermentačnému roztoku obsahujúcemu známe zdroje uhlíka a dusíka pridáva L-prolín, prednostne na začiatku fermentácie.
2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že L-prolín sa pridáva v množstve 0,01 až 10 g/1 vzhľadom na fermentačný roztok.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že L-prolín sa pridáva v množstve 0,1 až 2,5 g/1 vzhľadom na fermentačný roztok.
4. Spôsob podľa nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že fermentácia sa uskutočňuje v minimálnom médiu a/alebo v definovanom médiu.
5. Spôsob podľa nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že fermentácia sa uskutočňuje v médiu obsahujúcom hydrolyzát.
6. Spôsob podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa t ý m , že sa vyrába L-lyzín, L-izoleucín, L-treonín alebo L-valín.
7. Spôsob podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium.