KR20000029349A

KR20000029349A - Ｌ-아미노산의 발효적 제조방법

Info

Publication number: KR20000029349A
Application number: KR1019990046815A
Authority: KR
Inventors: 벡커울리히; 페터하이디; 모르바흐주잔네; 발거일로나; 크래머라인하르트; 페페를레발터
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2000-05-25
Also published as: DE19849625A1; AU5706899A; ID24138A; US20010049128A1; BR9904948A; HUP9903899A2; JP2000125893A; EP0997532A2; EP0997532A3; SK147799A3; HU9903899D0; ZA996751B; CA2287532A1; CN1257930A

Abstract

본 발명은 코리네형(coryneform) 세균을 사용하는 L-아미노산의 발효적 제조방법에 관한 것이며, 이때, 과삼투 응력의 세포에 대한 영향을 억제하기 위해서 L-프롤린을 삼투방지 물질로서 발효 브로쓰에 가한다.

Description

Ｌ-아미노산의 발효적 제조방법{Process for the fermentative production of L-amino acids}

본 발명은 코리네형(coryneform) 세균을 사용하는 L-아미노산의 발효적 제조방법에 관한 것이며, 이때, L-프롤린을 삼투방지 물질로서 발효 브로쓰에 가한다.

삼투 응력하에 대부분의 미생물은 칼륨 이온 또는 소위 삼투분해물(osmolyte; 유기 화합물)을 세포질에 농축시키는 것으로 공지되어 있다. 이로 인해 내부 삼투 저항이 발생하여 세포의 탈수를 막는다. 이와 관련하여, 글라이신 베타인을 첨가함으로써, 특히 배지에서 삼투 응력을 억제하면서 세포의 성장 속도를 향상시키는 것이 공지되어 있다. 이로 인해 당 소모 속도가 상승되고 L-라이신의 생성이 증가된다[참조: Y. Kawahara, Y. Yoshihara, S. Ikeda, H. Yoshii, Y. Hirose, Stimulatory effect of glycine betaine on L-lysine fermentation (1990), 34 (1), pp 87-90, Applied Microbiology Biotechnology].

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 프롤린-영양요구성 돌연변이체의 경우에 있어서, 프롤린이 삼투조절 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.

이들 균주의 삼투 내성은 야생 균주보다 낮은 것으로 증명되었다. 이와 관련하여, 피롤린-5-카복실레이트 리덕타제의 활성은 세포가 삼투 응력하에 성장하는 경우, 3배 증가되는 것으로 밝혀졌다[참조: Y. Kawahara, T. Ohsumi, Y. Yoshihara, S. Ikeda, Proline in the Osmoregulation of Brevibacterium lactofermentum, (1989), 53, (9), pp 2475-2479, Agricultural and Biological Chemistry]. 인용 문헌에는 아미노산의 제조방법에 관해서는 밝혀져 있지 않다.

본 발명의 목적은 과삼투 응력의 세포에 대한 영향이 억제되는, L-아미노산의 발효적 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하고 배출하는 코리네형 미생물을 통상적인 성분 이외에 L-프롤린을, 특히 발효 시작시 첨가한 배지에서 배양함을 특징으로 하는 L-아미노산의 발효적 제조방법을 제공한다. 이는 특히 양과 형태에 의해 확인된 성분으로 이루어진 소위 최소 배지 및 규정 배지에 적용할 수 있다. 그러나, 또한 L-프롤린을 가함으로써 복합 배지의 경우에 가수분해물 또는 추출물을 포함하는 내용물의 수율을 향상시키기도 한다.

이때, L-프롤린은 미생물의 대사에 C 또는 N의 공급원으로서 작용하지 않는다. 그러나, 이의 첨가로 아미노산 생산자의 성장을 향상시키고 L-아미노산의 수율이 증가되게 된다.

코리네형 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)종은 오랫동안 아미노산 생산자로서 알려져 왔다. 바람직하게는 L-라이신, L-이소로이신, L-트레오닌 또는 L-발린의 제조에 적합한 균주를 사용한다. L-글루탐산도 이러한 방법으로 제조할 수 있다.

발효는 일반적으로 25 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 45℃의 온도에서 6 내지 8의 pH, 바람직하게는 7 내지 7.5의 pH하에 및 바람직하게는 0.5 내지 8g/l의 암모늄 농도에서 수행한다.

L-프롤린은 0.01 내지 10g/l, 바람직하게는 0.1 내지 2.5g/l의 양으로 발효 브로쓰에 가한다.

코리네박테리움속의 적합한 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰종은, 예를 들면, 글루탐산을 생산하는 공지된 야생 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020; 및

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712와 같은 L-라이신 생산 균주 또는,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 5835

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 4164 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 4180과 같은 L-트레오닌 생산 균주 또는,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 756

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 759 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 4192와 같은 L-이소로이신 생산 균주 또는,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 512 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1845와 같은 L-발린 생산 균주로부터 생성된 돌연변이체 또는 균주이다.

발효에 사용되는 배지는 본 발명에서 언급하는 공지된 L-아미노산 제조용 기본 배지이거나, 통상적으로 L-아미노산의 제조에 사용되고 L-아미노산을 생산하는 세균에 적합한 배지이다.

사용된 탄소의 주 공급원은, 일반적으로 공지된 바와 같이, 글루코즈, 사카로즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 또한 전분 및 전분 가수분해물, 셀룰로즈 및 당화 셀룰로즈 및 락토즈와 같은 당류; 아세트산, 프로피온산, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산류; 피루브산, 시트르산, 석신산, 푸마르산 및 말산과 같은 유기산류; 에틸 알콜 및 부틸 알콜과 같은 알콜류; 앞에서 언급한 화합물의 개개의 성분 또는 혼합물이다. 또한, 선택된 L-아미노산의 생합성 경로로부터의 전구체 및 L-아미노산 그 자체를 사용할 수 있다.

사용된 인의 공급원은 일반적으로 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 함유 염이다.

사용된 질소의 공급원은, 일반적으로 공지된 바와 같이, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 암모늄 아세테이트, 요소, 액상 암모늄 또는 암모니아수와 같은 암모늄염이다. 사용된 질소의 복합 유기 공급원은 카사미노산, 옥수수 침지액, 콩가루 가수분해물, 효모 추출물, 생물자원 가수분해물 및 단백질 가수분해물이다.

사용될 수 있는 무기염은, 경우에 따라, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염, 나트륨염, 철염, 망간염, 아연염, 구리염 및 기타 미량 원소이다. 또한, 경우에 따라, 비오틴, 티아민 등과 같은 비타민을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 배양 조건은 공지된 아미노산 발효에서와 같다. 단, L-아미노산 또는 사용되는 균주에 따라 발효 브로쓰의 조성은 변형되며, 배양 온도는 25 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 45℃이다. pH값에 있어서, pH값이 중성 범위일 때 양호한 결과가 수득된다. 단백질 가수분해물이 질소의 복합 공급원으로서 사용되는 경우, 이에 존재할 수 있는 프롤린의 함량을 추가로 사용되는 프롤린의 계산시 고려하는 것이 유리하다. 가수분해물로부터 발생하는 프롤린의 양은 이러한 생성물의 본래의 조성에 의해 제한되기 때문에 본 발명에 따르는 방법의 구성 내에서 추가량의 프롤린을 첨가하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.

실시예

본 발명은 아래 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 이를 위하여, 아미노산 생산 균주를 사용하는 시험을 수행하며, 청구된 방법의 우수성은 a) L-라이신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715(참조: EP-B 제0 435 132호) 및 b) L-트레오닌- 및 L-이소로이신 생산 균주 브레비박테리움 플라붐 DSM5399(참조: EP-B 제0 385 940호)로 증명된다.

실시예 1

L-라이신의 발효적 제조

2.5g/l NaCl, 10g/l 펩톤 및 10g/l 효모 추출물을 함유하는 배양 배지를 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.4로 조정하고, 가열 멸균 후, 리터당 50% 글루코즈 용액 40ml를 여기에 가한다. 48시간 동안 항온처리된 영양 배지로서 뇌-심근 한천을 함유하는 한천 평판에 니들을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715와 함께 배지 47ml를 접종하고, RC-1-TK 항온처리기[제조원: Infors AG(Bottmingen, Switzerland]에서 150rpm으로 20시간 동안 33℃에서 진탕시킨다. 이어서, 세포를 멸균 생리 식염수로 세척한다. 세포를 벡크만(Beckmann) 원심분리기 J 6B에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리에 의해 분리한다.

진탕 플라스크에서의 주 배양을 위하여, (NH₄)₂SO₄40g, KH₂PO₄0.5g, K₂HPO₄0.5g, MgSO₄·7H₂O 0.25g 및 L-로이신 0.3g을 1ℓ들이 비이커에 칭량해 넣고 여기에 증류수 750ml를 가한다. 또한 미량 염 용액 1ml를 가한다. 미량 염 용액은 염의 용해도를 증가시키기 위해서 HCl 몇 방울로 산성화시킨 증류수 100ml에 용해된 FeSO₄·7H₂O 1.0g, MnSO₄·H₂O 1.0g, ZnSO₄·7H₂O 0.1g, CuSO₄0.02g 및 NiCl₂·6H₂O 0.002g을 함유한다. 또한, 증류수 100ml당 비오틴 0.02g의 용액 1ml를 가한다. 이어서, NaCl을 5g/l의 농도로 가한다. 이 배양 배지를 45ml씩으로 나누고, 이를 500ml들이 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 넣고 0.1 내지 10g/l의 상이한 프롤린 농도로 조정한다. 오토클레이브 중에서 121℃에서 20분 동안 가열 멸균한 후, 별도로 멸균된 50% 글루코즈 용액 12ml와 멸균된 CaCO₃1.2g을 각각의 플라스크에 가한다. 이어서, 멸균 조건하에 세척한 배양 배지의 세포를 접종한다. 세척된 세포의 광학 밀도(측정에 사용된 파장: 535nm)는 18.5이며, 이 현탁액 7.7ml를 배양 배지 57ml를 접종하는데 사용한다.

RC-1-TK 항온처리기[제조원: Infors AG(Bottmingen, Switzerland)]에서 33℃에서 150rpm으로 72시간에 걸쳐 배양한다. 이어서, 광학 밀도(OD)[광도계 LP2W(제조원: Dr. Lange, Berlin, Germany)] 및 배양 현탁액에 생성된 L-아미노산의 농도를 측정한다. 아미노산은 이온교환 크로마토그래피 및 아미노산 분석기[제조원: Eppendorf BioTronik(Hamburg, Germany)]를 사용하여 닌하이드린 검출법을 사용하는 후-컬럼 반응(post-column reaction)에 의해 분석한다. 시험 결과는 표 1에 나타내었다.

프롤린[g/l]	OD 535nm	라이신[g/l]
0	24.6	23.6
0.5	30.5	29.4

실시예 2

L-트레오닌의 발효적 제조

100g/l 사카로즈, 12g/l (NH₄)₂SO₄, 100ml/l 콩가루 가수분해물, 0.5g/l K₂HPO₄, 0.5g/l KH₂PO₄, 0.25g/l MgSO₄·7H₂O, 5.0g/l NaCl 및 미량 염 용액 1ml를 함유하는 배양 배지를 pH 7.0으로 조정하고 오토클레이빙시킨다. 미량 염 용액은 FeSO₄·7H₂O 1.0g, MnSO₄·H₂O 1.0g, ZnSO₄·7H₂O 0.1g, CuSO₄0.02g 및 NiCl₂·6H₂O 0.002g을 함유하고, 탈염수 및 1N HCl 용액 몇 방울로 100ml가 되게 한다.

여과 멸균시킨, 0.2mg/l 비오틴 및 티아민 스톡 용액 각 1ml씩을 배양 배지에 가한다. 10.0g/l CaCO₃를 진탕 플라스크와 함께 멸균시킨다. 배양 배지에 있어서, 콩가루 가수분해물을 혼입함으로써 생성된 프롤린 농도는 0.34g/l이다. 프롤린 스톡 용액으로부터 수득된 프롤린의 규정 농도를 여과 멸균시킨 후 배지에 가한다.

DSM5399와 함께 72시간 동안 항온처리시킨, 영양 배지로서 뇌-심근 한천을 함유하는 한천 평판을 멸균 생리 식염수 10ml에 현탁시킨다. 배양 배지 10ml씩을 100ml들이 엘렌마이어 진탕 플라스크에 넣고 회수된 세포 현탁액 100㎕를 접종한다. 30℃ 및 300rpm으로 72시간에 걸쳐 배양한다. 이에 이어서, 실시예 1에 규정된 바와 같이, OD를 660nm의 파장에서 측정하고, 트레오닌 농도를 측정한다. 시험 결과는 표 2에 나타내었다.

프롤린[g/l]	OD 660nm	트레오닌[g/l]
0.34	51.2	0.63
0.66	52.6	1.29

실시예 3

L-이소로이신의 발효적 제조

100g/l 사카로즈, 12g/l (NH₄)₂SO₄, 0.5g/l K₂HPO₄, 0.5g/l KH₂PO₄, 0.25g/l MgSO₄·7H₂O, 5.0g/l NaCl 및 미량 염 용액 1ml를 함유하는 배양 배지를 pH 7.0으로 조정하고 오토클레이빙시킨다. 미량 염 용액은 FeSO₄·7H₂O 1.0g, MnSO₄·H₂O 1.0g, ZnSO₄·7H₂O 0.1g, CuSO₄0.02g 및 NiCl₂·6H₂O 0.002g을 함유하고, 탈염수 및 1N HCl 용액 몇 방울로 100ml가 되게 한다.

여과 멸균시킨, 0.2mg/l 비오틴 및 티아민 스톡 용액 각 1ml씩을 배양 배지에 가한다. 10.0g/l CaCO₃를 진탕 플라스크와 함께 멸균시킨다. 프롤린 스톡 용액으로부터 수득된 프롤린의 적당한 농도를 여과 멸균시킨 후 배양 배지에 가한다.

DSM5399와 함께 72시간 동안 항온처리시킨, 영양 배지로서 뇌-심근 한천을 함유하는 한천 평판을 멸균 생리 식염수 10ml에 현탁시킨다. 배양 배지 10ml씩을 100ml들이 엘렌마이어 진탕 플라스크에 넣고 회수된 세포 현탁액 100㎕를 접종한다. 30℃ 및 300rpm으로 72시간에 걸쳐 배양한다. 이에 이어서, 실시예 1에 규정된 바와 같이, OD를 660nm의 파장에서 측정하고, 이소로이신 농도를 측정한다. 시험 결과는 표 3에 나타내었다.

프롤린[g/l]	OD 660nm	L-이소로이신[g/l]
0	51.2	0.18
0.1	52.0	0.39

본 발명은 과삼투 응력의 세포에 대한 영향이 억제되는 L-아미노산의 발효적 제조방법을 제공한다.

Claims

바람직하게는 발효 시작시, L-프롤린을 공지된 C 및 N 공급원을 함유하는 발효 브로쓰에 첨가함을 특징으로 하여, L-아미노산을 생산하고 배출하는 코리네형(coryneform) 미생물을 배양시킴으로써 L-아미노산을 발효적으로 제조하는 방법.
제1항에 있어서, L-프롤린이, 발효 브로쓰를 기준으로 하여, 0.01 내지 10g/l의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, L-프롤린이, 발효 브로쓰를 기준으로 하여, 0.1 내지 2.5g/l의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 발효가 최소 배지 및/또는 규정 배지에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 발효가 가수분해물을 함유하는 배지에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, L-라이신, L-이소로이신, L-트레오닌 또는 L-발린이 제조됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물이 사용됨을 특징으로 하는 방법.