CN1257930A - L－氨基酸的发酵生产方法 - Google Patents

L－氨基酸的发酵生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1257930A
CN1257930A CN99122093A CN99122093A CN1257930A CN 1257930 A CN1257930 A CN 1257930A CN 99122093 A CN99122093 A CN 99122093A CN 99122093 A CN99122093 A CN 99122093A CN 1257930 A CN1257930 A CN 1257930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
proline
pro
amino acid
substratum
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99122093A
Other languages
English (en)
Inventor
乌尔里希·贝克尔
海丁·波得
苏珊·莫尔巴赫
伊洛娜·瓦尔格
赖因哈德·克雷默
瓦尔特·普费弗勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Publication of CN1257930A publication Critical patent/CN1257930A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及使用棒状杆菌发酵生产L－氨基酸的方法,其中向发酵液中加入L－脯氨酸作为渗透保护物质以抑制高渗透压力对细胞的效应。

Description

L-氨基酸的发酵生产方法
本发明涉及使用棒状杆菌发酵生产L-氨基酸的方法，其中向发酵液中加入L-脯氨酸作为渗透保护物质。
已知在渗透压力下，大多数微生物在其细胞质中浓缩钾离子或所谓的渗压剂(有机化合物)，这导致内部渗透阻力，从而防止细胞脱水。在这一方面，已知加入甜菜碱能刺激细胞的生长速率，尤其是在具有抑制渗透压的培养基中。这会导致糖消耗速率的增加，以及L-赖氨酸的产量增加(Y.Kawahara，Y.Yoshihara，S.Ikeda，H.Yoshii，Y.Hirose，甜菜碱对L-赖氨酸发酵的刺激效应，(1990)，34(1)，pp87-90，应用微生物学生物工程)。
在乳发酵短杆菌的脯氨酸营养缺陷型突变体中，已发现脯氨酸在渗透调节中起一定作用。
已证明这些菌株的渗透耐受性比其野生型菌株低，在这一方面，发现当细胞在渗透压力下生长时，吡咯啉-5-羧酸还原酶的活性提高3倍(Y.Kawahara，T.Ohsumi，Y.Yoshihara，S.Ikeda，脯氨酸在乳发酵短杆菌的渗透调节中，(1989)，53(9)，pp2475-2479，农业及生物化学)。
在上述文献中未涉及氨基酸的生产。
本发明的一个目的在于提供一种用于发酵生产L-氨基酸的方法，其中高渗透压对细胞的效应被抑制。
本发明提供了一种用于发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于将产生和分泌L-氨基酸的棒状杆菌在一种培养基中培养，其中该培养基除了常规组分外，还添加有L-脯氨酸，优选地是在发酵开始时加入L-脯氨酸。其特别适用于由规定量和类型的组分组成的所谓的最小培养基和确定成分培养基。但是在包括水解物或提取物的复合培养基中加入L-脯氨酸也能提高产量。
此处L-脯氨酸并不作为微生物代谢中的C源或N源，但是其添加能促进氨基酸生产菌的生长并增加L-氨基酸的产量。
棒状杆菌特别是谷氨酸棒状杆菌很久以来就已知是一种氨基酸生产菌种。优选地使用适于生产L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸或L-缬氨酸的菌株。L-谷氨酸也可以如此方式生产。
发酵通常在25-50℃、优选地30-45℃进行，同时pH为6-8，优选地pH为7-7.5，铵浓度优选地为0.5-8g/l。
L-脯氨酸以0.01-10g/l、优选地0.1-2.5g/l的量加入到发酵液中。
棒状杆菌属特别是谷氨酸棒状杆菌的合适菌株是例如已知的生产谷氨酸的野生型菌株：
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，
醋谷棒状杆菌ATCC15806，
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870，
黄色短杆菌ATCC14067，
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020及由其产生的突变体和菌株，如生产L-赖氨酸的菌株
谷氨酸棒状杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708和
乳发酵短杆菌FERM-P 1712或如生产L-苏氨酸的菌株
谷氨酸棒状杆菌FERM-P 5835
黄色短杆菌FERM-P 4164和
乳发酵短杆菌FERM-P 4180或如生产L-异亮氨酸的菌株
谷氨酸棒状杆菌FERM-P 756
黄色短杆菌FERM-P 759和
乳发酵短杆菌FERM-P 4192或如生产L-缬氨酸的菌株
黄色短杆菌FERM-P 512和
乳发酵短杆菌FERM-P 1845。
用于发酵的培养基是用于生产本发明中所提到的L-氨基酸的已知基本培养基，或者常规用于生产L-氨基酸并且适用于生产L-氨基酸的细菌的培养基。
如通常已知的，所用的主要碳源是糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和淀粉水解物、纤维素和糖化纤维素、乳糖；脂肪酸，如乙酸、丙酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；有机酸，如丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、马来酸；醇类，如乙醇、丁醇；上述化合物的单个组分或化合物。另外，来自所选的L-氨基酸的生物合成途径的前体或L-氨基酸本身也可以使用。
所用磷源通常是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。
所用的氮源是通常已知的铵盐，如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵、尿素、液态氨或氨水。所用的复合有机氮源是酪蛋白氨基酸、玉米浸渍液、豆粉水解物、酵母提取物、生物量水解物和蛋白水解物。
可以使用的无机盐是磷酸盐、镁盐、钙盐、钾盐、钠盐、铁盐、锰盐、锌盐、铜盐，及其它微量元素，如果需要。另外，如果需要，可以使用维生素如生物素、硫胺等。
本发明的培养条件与已知的氨基酸发酵培养条件相同。尽管发酵液的组成根据L-氨基酸或所用菌株而变化，但是培养温度为25-50C，优选30-45℃。关于pH值，当pH值处于中性范围时能获得良好的结果。当使用蛋白水解物作为复合氮源时，其中所含的脯氨酸含量有利地是计算进补加的脯氨酸量中。由水解物来源的脯氨酸的量由这些产物的天然组成限制，从而在本发明方法框架内加入另外的脯氨酸证明是有利的。
实施例
本发明以下经实施例更详细地描述。
为此，用下列氨基酸生产菌株进行试验，在试验中证明了本发明方法的优越性：
L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌DSM5715，(EP-B 0 435132)和
L-苏氨酸及L-异亮氨酸生产菌株黄色短杆菌DSM5399，(EP-B 0 385 940)
实施例1 L-赖氨酸的发酵生产
用氢氧化钠将含2.5g/lNaCl、10g/l蛋白胨和10g/l酵母膏的培养基的pH调节为pH7.4，热灭菌后，每升培养基中加入40ml 50％葡萄糖溶液。用接种针挑取在脑心浸液琼脂板上培养48小时的谷氨酸棒状杆菌DSM5715接种到47ml所述培养基中，在购自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培养箱中于33℃以150rpm振荡培养20小时。然后用无菌生理盐水洗细胞，在Beckman离心机J 6B中以4000rpm离心20分钟分离细胞。
为了在摇瓶中进行主培养，在1升烧杯中称入40g(NH4)2SO4，0.5gKH2PO4，0.5g K2HPO4，0.25g MgSO4·7H2O和0.3g L-亮氨酸，并向其中加入750ml蒸馏水。还加入1ml微量元素盐溶液，该微量元素盐溶液含有溶解于100ml蒸馏水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O，该溶液用几滴HCl稍加酸化以增加盐的溶解。另外，还加入1ml 0.02g生物素在100ml蒸馏水中的溶液。随后加入NaCl至浓度为5g/l。将这-培养基分成45ml的等份，置于500ml Erlenmeyer烧瓶中，并调节脯氨酸至0.1-10g/l的各种浓度。在121℃热灭菌20分钟后，向每个烧瓶中加入单独灭菌的12ml 50％葡萄糖溶液和1.2g无菌CaCO3。然后用前述已在无菌状态下洗涤的培养基中的细胞接种，洗涤的细胞的光密度为18.5(测定用波长535nm)，用7.7ml这种悬液接种57ml培养基。
在购自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培养箱中于33℃以150rpm振荡培养72小时，随后测定光密度(OD)(购自Dr.Lange，德国柏林的分光光度计LP2W)及培养悬液中的L-氨基酸的浓度。用购自Eppendorf BioTronik(德国汉堡)的氨基酸分析仪经离子交换层析及利用茚三铜的柱层析后反应分析氨基酸。测试结果见表1。
           表1脯氨酸(g/l)    OD 535nm    赖氨酸(g/l)0                24.6       23.60.5              30.5       29.4实施例2 L-苏氨酸的发酵生产
将含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、100ml/l大豆粉水解物、0.5gKH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素盐溶液的培养基的pH调节为7.0并高压灭菌。该微量元素盐溶液由溶解于100ml去离子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及几滴1N HCl组成。
将各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺储存液(已过滤除菌)加入到培养基中。将10.0g/l CaCO3与摇瓶一起灭菌。培养基中由引入豆粉水解物产生的脯氨酸浓度为0.34g/l。向过滤除菌的培养基中加入来自脯氨酸储存溶液的规定浓度的脯氨酸。
将在脑心浸液琼脂板上培养72小时的DSM5399悬浮于10ml无菌生理盐水中，将10ml培养基等份置于100ml Erlenmeyer摇瓶中并接种100μl上述细胞悬液。于30℃以300rpm振荡培养72小时，之后如实施例1所述，测定波长660nm的OD及苏氨酸的浓度。测试结果见表2。
              表2脯氨酸(g/l)    OD 660nm    苏氨酸(g/l)0.34            51.2         0.630.66            52.6         1.29
实施例3 L-异亮氨酸的发酵生产
将含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素盐溶液的培养基的pH调节为7.0并高压灭菌。该微量元素盐溶液由溶解于100ml去离子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02gCuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及几滴1N HCl组成。
将各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺储存液(已过滤除菌)加入到培养基中。将10.0g/l CaCO3与摇瓶一起灭菌。培养基中由引入豆粉水解物产生的脯氨酸浓度为0.34g/l。向过滤除菌的培养基中加入来自脯氨酸储存溶液的规定浓度的脯氨酸。
将在脑心浸液琼脂板上培养72小时的DSM5399悬浮于10ml无菌生理盐水中，将10ml培养基等份置于100ml Erlenmeyer摇瓶中并接种100μl上述细胞悬液。于30℃以300rpm振荡培养72小时，之后如实施例1所述，测定波长660nm的OD及异亮氨酸的浓度。测试结果见表3。
              表2脯氨酸(g/l)    OD 660nm    异亮氨酸(g/l)0                51.2           0.180.1              52.0           0.36

Claims (7)

1、通过培养产生并分泌L-氨基酸的棒状杆菌而发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：
优选地在发酵开始时向含有已知碳源和氮源的发酵液中加入L-脯氨酸。
2、权利要求1的方法，其特征在于：
基于发酵液，L-脯氨酸的加入量为0.01-10g/l。
3、权利要求2的方法，其特征在于：
基于发酵液，L-脯氨酸的加入量为0.1-2.5g/l。
4、权利要求1-3的方法，其特征在于：
发酵是在最小培养基和/或确定成分培养基中进行。
5、权利要求1-3的方法，其特征在于：
发酵是在含有水解物的培养基中进行。
6、权利要求1-5的方法，其特征在于：
生产出L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸或L-缬氨酸。
7、权利要求1-6的方法，其特征在于：
使用棒状杆菌属的微生物。
CN99122093A 1998-10-28 1999-10-28 L－氨基酸的发酵生产方法 Pending CN1257930A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19849625.7 1998-10-28
DE19849625A DE19849625A1 (de) 1998-10-28 1998-10-28 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1257930A true CN1257930A (zh) 2000-06-28

Family

ID=7885876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99122093A Pending CN1257930A (zh) 1998-10-28 1999-10-28 L－氨基酸的发酵生产方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20010049128A1 (zh)
EP (1) EP0997532A3 (zh)
JP (1) JP2000125893A (zh)
KR (1) KR20000029349A (zh)
CN (1) CN1257930A (zh)
AU (1) AU5706899A (zh)
BR (1) BR9904948A (zh)
CA (1) CA2287532A1 (zh)
DE (1) DE19849625A1 (zh)
HU (1) HUP9903899A2 (zh)
ID (1) ID24138A (zh)
SK (1) SK147799A3 (zh)
ZA (1) ZA996751B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235401B (zh) * 2007-02-02 2011-06-08 上海祥韦思化学品有限公司 发酵制备l-氨基酸的方法
CN109609564A (zh) * 2018-12-30 2019-04-12 新疆阜丰生物科技有限公司 一种提高l-亮氨酸发酵产量的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10046934A1 (de) * 2000-09-21 2002-04-18 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
KR100442768B1 (ko) * 2001-05-21 2004-08-04 주식회사 한국표지화합물연구소 방사성동위원소 표지화합물로서 ｌ-발린의 제조방법
JP7304953B2 (ja) * 2018-12-26 2023-07-07 デサン・コーポレイション Ｌ－アミノ酸を生産する大腸菌変異株またはコリネバクテリウムグルタミカム変異株、およびそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5151584A (en) * 1974-10-26 1976-05-07 Ajinomoto Kk Eruurijinno seizoho
KR0149721B1 (ko) * 1994-06-29 1998-10-15 김정덕 이방성 도전 접착제를 사용한 집적회로 실장 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235401B (zh) * 2007-02-02 2011-06-08 上海祥韦思化学品有限公司 发酵制备l-氨基酸的方法
CN109609564A (zh) * 2018-12-30 2019-04-12 新疆阜丰生物科技有限公司 一种提高l-亮氨酸发酵产量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ID24138A (id) 2000-07-06
JP2000125893A (ja) 2000-05-09
CA2287532A1 (en) 2000-04-28
US20010049128A1 (en) 2001-12-06
DE19849625A1 (de) 2000-05-04
EP0997532A3 (de) 2002-10-02
HUP9903899A2 (hu) 2003-02-28
ZA996751B (en) 2000-05-15
AU5706899A (en) 2000-05-04
EP0997532A2 (de) 2000-05-03
HU9903899D0 (en) 1999-12-28
SK147799A3 (en) 2000-11-07
KR20000029349A (ko) 2000-05-25
BR9904948A (pt) 2000-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215545B (hu) Eljárás L-treonin előállítására
CN102174449A (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用
EP0051637A1 (en) Liquid culturing of sporulating, ectomycorrhizal fungi
KR950005133B1 (ko) L-발린의 제조방법
CN112322673B (zh) 一种谷氨酸的发酵方法
CN1257930A (zh) L－氨基酸的发酵生产方法
US3580810A (en) Fermentative production of l-threonine
CN1067725C (zh) 一种利用微生物发酵生产α、ω－长链二元酸的方法
JPH0491794A (ja) 発酵法によるｌ―リジンの製造法
Belly et al. Effect of amino acids on the growth of Acetobacter suboxydans
CN107760734A (zh) 一种提高苏氨酸产量的方法及其应用
KR100752928B1 (ko) Ｌ-라이신 발효 공정
KR920005749B1 (ko) 신균주 코리네박테리움 글루타미쿰 mwex-46 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조방법
KR910008636B1 (ko) L-아르기닌의 제조방법
KR100389580B1 (ko) Ｌ-트레오닌 생산 변이주 및 그를 이용한 ｌ-트레오닌생산방법
US5118619A (en) Method for the fermentative production of L-isoleucine from D,L-α-hydroxybutyrate
JP2574786B2 (ja) Ｌ−スレオニンの製造法
SUGISAKI STUDIES ON L-VALINE FERMENTATION PART II. CERTAIN FACTORS AFFECTING THE PRODUCTION OF L-VALINE BY AEROBACTER
HU215248B (hu) Eljárás L-lizin előállítására
JP3118175B2 (ja) ５−アミノレブリン酸生産菌及びその選抜方法
KR920002894B1 (ko) 신규 세포융합주 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조방법
JPS59169497A (ja) Ｌ−リジンの製造法
KR830001445B1 (ko) 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법
CN115386529A (zh) 提高谷氨酸发酵菌体量和产酸效率的方法
CN1597921A (zh) 用于发酵法制备转氨酶的培养基

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
CI01 Publication of corrected invention patent application

Correction item: Second inventors

Correct: Haddin Peter

False: Haddin Bode

Number: 26

Page: 50

Volume: 16

CI02 Correction of invention patent application

Correction item: Second inventors

Correct: Haddin Peter

False: Haddin Bode

Number: 26

Page: The title page

Volume: 16

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: SECOND INVENTOR; FROM: GARY DEMONT SARGENT TO: HEIDING POHDE

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: SECOND INVENTOR; FROM: GARY DEMONT SARGENT TO: HEIDING POHDE

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication