HU215545B - Eljárás L-treonin előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány szerinti eljárás sőrán egy, az Escherichia nemzetségheztartőzó vad törzsből származó és műtagenezis alkalmazásával L-fenilalanin- vagy L-leűcin-rezisztenciával ellátőtt és L-tre nin-termelőképességgel rendelkező törzset valamilyen alkalmas táptalajbanaddig tenyésztenek, amíg L-treőnin termelődik és felhalmőzódik atenyészetben, majd az L-treőnint kinyerik a tenyészetből. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás L-treonin előállítására fermentációval. Az L-treonin nemcsak gyógyszerként használatos, mint aminosav-készítmény, hanem állati takarmányok kiegészítőjeként is alkalmazzák.

Különböző eljárások ismeretesek az L-treoninnak az Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok segítségével, fermentációs eljárással történő előállítására. Ilyen például egy borrelidin szenzitív mikroorganizmust alkalmazó eljárás (6752/76 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés), egy növekedéséhez diamino-pimelinsavat és metionint igénylő olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus treonin-bioszintézis rendszere rezisztens a treonin visszacsatolásos gátlására (10037/81 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés), egy a rifampicin, lizin, metionin, aszparaginsav és homoszerin közül legalább egyikükre rezisztens vagy csökkent L-treonin-lebontóképességű mikroorganizmust alkalmazó eljárás (273487/88 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés és az 5,017,483 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), az L-szerin vagy metionin közül legalább egyikre rezisztens mikroorganizmust alkalmazó eljárás (259088/91 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés, 445 830 számú európai közrebocsátási irat), és a többi.

Az ismert eljárások azonban nem kielégítőek az Ltreonin termelékenységének hatásossága szempontjából. A találmány célkitűzése ezért az volt, hogy L-treonin termelésére magasabb kitermelést biztosító és alacsonyabb költséggel kivitelezhető eljárást biztosítsunk.

A találmány olyan eljárást biztosít L-treonin termelésére, amely szerint egy, az Escherichia nemzetséghez tartozó, és az L-fenilalanin és az L-leucin közül legalább egyikre rezisztens, L-treonint termelő mikroorganizmust addig tenyésztünk egy táptalajban, amíg Ltreonin termelődik és felhalmozódik a tenyészetben, és onnan kinyerjük az L-treonint.

A találmány szerint bármely mikroorganizmus használható, amennyiben az Escherichia nemzetséghez tartozik, az L-fenilalanin és az L-leucin közül legalább egyikre rezisztens és képes L-treonin termelésére.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmus úgy nyerhető, hogy az Escherichia nemzetséghez tartozó és L-treonint termelő mikroorganizmusokat szokásos mutagenezisnek, például N-metil-N’-nitroN-nitrozo-guanidinnel végzett kezelésnek és röntgenbesugárzásnak vetjük alá, a kapott mikroorganizmusokat L-fenilalanint vagy L-leucint tartalmazó minimál táptalajon szélesztjük, és a minimál táptalajon kinövő telepeket felszedjük. A kívánt mutáns törzs szelektálása hatásosan végezhető L-lizint, vagy valamilyen sóját, például L-lizin-hidrokloridot 1-10 g/1 mennyiségben tartalmazó minimál táptalaj alkalmazásával. A találmány szerinti eljárásban használt megfelelő mikroorganizmus valamilyen vad törzsből származó, az Escherichia nemzetséghez tartozó, és az L-fenilalanin és az L-leucin közül legalább egyikkel szemben rezisztens mikroorganizmusnak az L-treonin-termelőképesség fokozása céljából, tápanyag auxotrófiával, treonin metabolizmus antagonista rezisztenciával stb. való felruházásával is nyerhető. Az alkalmas mikroorganizmusokra példaként az Escherichia coli H-8309 és H-8311 törzsek említhetők.

Az előnyös törzsek előállításának egy specifikus példáját az alábbiakban írjuk le:

Egy diamino-pimelinsav nem-auxotróf törzset, az Escherichia coli Η-7700-at, egy metionint igénylő, aamino-fi-hidroxi-valeriánsavval szemben rezisztens, csökkent L-treonin-lebontóképességű, rifampicinnel szemben rezisztens, lizinnel szemben rezisztens, metioninnal szemben rezisztens, homoszerinnel szemben rezisztens és aszparaginnal szemben rezisztens, diaminopimelinsav auxotróf törzsből, az Escherichia coli Η-4581-ből (FERM BP—1411) nyerjük. Az Escherichia coli Η-7700-at utána L-szerin- és etionin-rezisztenciával ellátva, az Escherichia coli Η-7729-et (FERM BP-2792) kapjuk. Az Escherichia coli Η-7729-et Nmetil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel végzett szokásos mutációs kezelésnek (0,2 mg/ml; 30 °C, 30 perc) vetjük alá, és utána 10 g/1 L-fenilalanint és 3 g/1 L-lizinhidrokloridot tartalmazó minimál táptalajon [5 g/1 glükóz, 2 g/1 ammónium-klorid, 2 g/1 kálium-dihidrogénfoszfát, 0,1 g/1 magnézium-szulfát-víz (1/7), 20 mg/ml vas(II)-szulfát-víz (1/7), 50 mg/ml DL-metionin, 2% agar, pH 7,2] szélesztjük. A 30 °C-on 2-6 napig végzett tenyésztés után a kinőtt nagy telepeket mint L-fenilalaninnal szemben rezisztenciával rendelkező törzset leszedjük, és L-treonin-termelési vizsgálatnak vetjük alá, hogy a szülőtörzsnél jobb termelőképességgel rendelkező törzseket szelektáljunk. Az így szelektált törzsek között van az Escherichia coli H-8311.

Az L-leucinnal szembeni rezisztenciával rendelkező Escherichia coli Η-8309-et a H-8311 törzs előállításához hasonló módon kapjuk, azzal az eltéréssel, hogy a H-7729 törzs helyett a H-7700 törzset használjuk szülőtörzsként, és az előbb említett minimál táptalaj Lfenilalanin helyett 6 g/1 L-leucint tartalmaz.

Az így kapott H-8311 és H-8309 törzseket 1991. augusztus 21-én a Fermentációs Kutató Intézetnél (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan) a Budapesti Egyezménynek megfelelően letétbe helyeztük a FERM BP-3520, illetve FERM BP-3519 letéti számon.

Megvizsgáltuk a H-8311 és HG-8309 törzsek Lfenilalaninnal és L-leucinnal szembeni rezisztenciáját a megfelelő szülőtörzs rezisztenciájához viszonyítva. A rezisztenciafokozatot a növekedési fokozat alapján értékeltük. A mutáns törzsek és a szülőtörzsek mindegyikét teljes táptalajon (10 g/1 tripton, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 nátrium-klorid, 2% agar, pH 7,5) 24 óra hosszat tenyésztjük ferde agaron. A kinőtt törzseket steril vízben szuszpendáljuk. A kapott szuszpenziót az 1. táblázatban megadott különböző mennyiségű L-fenilalanint és Lleucint tartalmazó minimál táptalajon [5 g/1 glükóz, 2 g/1 ammónium-klorid, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 0,1 g/1 magnézium-szulfát-víz (1/7), 20 mg/1 vas(II)szulfát-víz (1/7), 50 mg/1 DL-metionin, 2 g/1 L-lizinhidroklorid, 2% agar, pH 7,2] szélesztjük, és 30 °C-on 72 óra hosszat tenyésztjük. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

HU 215 545 Β

1. táblázat

Mennyiség (g/1)	Törzs
H-7729	H-8311	H-7700	H-8309
PheO	+	+	+	+
1	±	+	±	+
10	-	+	-	±
Leu 0	+	+		+
1	±	+	±	+
6	-	+	-	+

+ : megfelelő növekedés ±: mérsékelt növekedés

-: nincs növekedés.

A találmány szerinti mikroorganizmusokat alkalmazó L-treonin-előállítási eljárásban a baktériumok tenyésztésénél alkalmazott bármely szokásos eljárás használható. Ami a táptalajt illeti, bármely szintetikus vagy természetes táptalaj használható, amennyiben a felhasznált törzsek által igényelt megfelelő szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen alkotórészeket és egyéb szerves tápanyagokat tartalmazza.

Szénforrásként szénhidrátok, például glükóz, fruktóz, laktóz, melaszok, cellulózhidrolizátumok, nyerscukor vagy keményítő hidrolizátumai, továbbá szerves savak, például piroszőlősav, ecetsav, fumársav, almasav vagy tejsav használhatók. A mikroorganizmus asszimilálóképességétől függően glicerin, alkoholok, például etanol is használhatók.

Nitrogénforrásként ammónia, szervetlen vagy szerves savak ammóniumsói, például ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónium-acetát vagy ammóniumfoszfát, aminok és egyéb nitrogéntartalmú vegyületek, például pepton, húskivonat, szójapogácsa-hidrolizátum, vagy különböző tenyésztett sejtek és emésztett termékeik is használhatók.

Szervetlen alkotórészekként kálium-dihidrogénfoszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(II)-szulfát, mangán(II)-szulfát, réz(II)-szulfát vagy kalcium-karbonát használhatók.

A tenyésztést aerob körülmények között, például rázatott tenyészetben, kevert merített tenyészetben, 20 °Ctól 40 °C-ig, előnyösen 25 °C-tól 38 °C-ig terjedő hőmérséklet-tartományban végezzük. A táptalaj pH-ja 5től 9-ig teijedő tartományba esik, és előnyösen közel semlegesen tartjuk. A pH-t kalcium-karbonáttal, szervetlen vagy szerves savakkal, lúgos oldatokkal, ammóniával vagy valamilyen pH-puffer ágenssel állítjuk be.

Általában 2-7 napig végzett tenyésztés után Ltreonin halmozódik fel a tenyészetben.

A tenyésztés befejezése után a kiválásokat, például sejteket eltávolítjuk a tenyészetből, célszerűen centrifugálással. Az L-treonin ioncserés kezelés, koncentrálás vagy kisózás kombinálásával kinyerhető a tenyészetből.

A találmányt a következő példával szemléltetjük:

1. példa

L-Treonin-termelési kísérlet

L-Treonin-termelési kísérletet végzünk az előbbiekben említett mutáns törzsek tenyésztésével. Escherichia coli Η-8311-et és szülőtörzsét az Escherichia coli Η-7729-et, valamint Escherichia coli Η-8309-et és szülőtörzsét az Escherichia coli Η-7700-at rázatás közben, 30 °C-on 16 óra hosszat tenyésztjük 7,4 pH-jú, 20 g/1 glükózt, 10 g/1 peptont, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2,5 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó oltótáptalajban. A kapott oltótenyészet 100 ml-ét átoltjuk egy 2 literes üvegfermentorba töltött 1 liternyi, alább megadott összetételű fermentációs táptalajra, és 30 °C-on, 800 fordulat/perc keverés és 1 liter/perc levegőztetés mellett, 80 óra hosszat végezzük a tenyésztést. A tenyésztés alatt pH-szabályzást és nitrogén-utánpótlást végzünk vizes ammóniaoldattal; a pH-t körülbelül 6,5 ±0,2 értéken tartjuk, és megfelelő időközönként glükózt adagolunk. A tenyésztés befejezése után a felhalmozódott L-treonin mennyiségét nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával kvantitatíve meghatározzuk. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

A fermentációs táptalaj összetétele:

g/1 glükóz, 12 g/1 ammónium-szulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 0,1 g/1 magnézium-szulfát-víz (1/7), 5 g/1 kukoricalekvár, 0,3 g/1 DL-metionin (pH=7,4).

A H-8311 törzs tenyésztésével kapott 1 liternyi Ltreonin-tartalmú tenyészetből a sejteket és egyéb szenynyezéseket 10 percig, percenkénti 3000 fordulattal végzett centrifugálással eltávolítjuk. Az így kapott felülúszót átengedjük egy DIAION SKIB erősen savas kationcserélő gyantával (H⁺-ciklus; a Mitsubishi Kaséi Corporation, Japán gyártmánya) töltött oszlopon; az Ltreonin megkötődik az oszlopon. Az oszlopot vízzel mossuk, és 0,5 M vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk az L-treonint. Az L-treonint tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk, majd etanolt adunk a töményített oldathoz. Az elegyet lehűtjük. Az elegyből hűtés közben kristályosán kiválik az L-treonin. 39,5 g kristályos L-treonint kapunk, amelynek tisztasága 98% vagy magasabb.

2. táblázat

Törzs	L-Treonin (g/1)
H-7700	3,4
H-8309	10,4
H-7729	37,2
H-8311	48,7

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (3)

1. Eljárás L-treonin termelésére, azzal jellemezve, hogy egy, az Escherichia nemzetséghez tartozó és az L-fenilalanin és az L-leucin közül legalább egyikkel szemben rezisztens, L-treonint termelő mikroorganizmust addig tenyésztünk egy táptalajban, amíg termelő3

HU 215 545 Β dik L-treonin és felhalmozódik a tenyészetben, és kinyerjük a tenyészetből az L-treonint.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli fajhoz tartozó mikroorganizmust tenyésztünk. 5

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli FERM ΒΡ-3519-et vagy Escherichia coli FERM ΒΡ-3520-at tenyésztünk.