JPH0564593A - 発酵法によるl−スレオニンの製造法 - Google Patents

発酵法によるl−スレオニンの製造法

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JPH0564593A JP3224259A JP22425991A JPH0564593A JP H0564593 A JPH0564593 A JP H0564593A JP 3224259 A JP3224259 A JP 3224259A JP 22425991 A JP22425991 A JP 22425991A JP H0564593 A JPH0564593 A JP H0564593A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】アミノ酸製剤や飼料添加物として有用なL−ス
レオニンを、より収率よく安価に製造する方法を提供す
る。 【構成】エッシェリヒア属に属し、L−フェニルアラニ
ンおよび/またはL−ロイシンに耐性を有し、かつL−
スレオニン生産能を有する微生物を用いることにより、
L−スレオニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるL−スレオ
ニンの製造法に関する。L−スレオニンは、アミノ酸製
剤などの医薬品として有用であるだけでなく、飼料添加
用としても利用できるアミノ酸である。
【0002】
【従来の技術】発酵法によるL−スレオニンの製造法に
おいて、エシェリヒア属に属する微生物を用いる方法と
して、ボレリジン感受性を示す微生物を用いる方法(特
公昭51-6752)、ジアミノピメリン酸とメチオニンの要求
性を示し、かつスレオニンの生合成系がスレオニンのフ
ィードバック阻害に対して抵抗性を示す微生物を用いる
方法 (特公昭56-10037) 、リファンピシン、リジン、メ
チオニン、アスパラギン酸およびホモセリンの少なくと
も一種に耐性を有するか、またはL−スレオニンの分解
能の低下した微生物を用いる方法(特開昭63-273487)な
どが知られている。また本出願人はL−セリンおよび/
またはエチオニンに耐性を有する微生物を用いる方法
(特願平2-59669)について出願している。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミ
ノ酸製剤や飼料添加物として有用なL−スレオニンを、
より収率良く安価に製造する方法を提供することにあ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、エシェ
リヒア属に属し、L−フェニルアラニンおよび/または
L−ロイシンに耐性を有し、かつL−スレオニン生産能
を有する微生物を培地に培養し、培養物中にL−スレオ
ニンを生成蓄積させ、該培養物よりL−スレオニンを採
取することを特徴とする発酵法によるL−スレオニンの
製造法を提供することができる。
【0005】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する微生物としては、エシェリヒア属に属し、L−
フェニルアラニンおよび/またはL−ロイシンに耐性を
有し、かつL−スレオニン生産能を有する微生物であれ
ば、いずれも用いることができる。本発明で用いられる
変異株は、エシェリヒア属に属するL−スレオニン生産
能を有する微生物を、通常の変異手段により変異させ、
L−フェニルアラニンおよび/またはL−ロイシン耐性
を付与することにより取得できる。該耐性を付与させる
際、L−リジンまたはその塩たとえば塩酸塩の存在下で
おこなうと、より効率よく、該耐性を付与することがで
きる。また野生株から誘導したL−フェニルアラニンお
よび/またはL−ロイシン耐性変異株に栄養要求性やス
レオニン代謝拮抗物質耐性などのL−スレオニン生産性
を向上させる変異を付与することによっても本発明で用
いられる微生物を得ることができる。好適な例としては
エシェリヒア・コリ( Escherichia coli) H−8309お
よびH−8311をあげることができる。
【0006】以下に具体的な菌株の取得方法を示す。エ
シェリヒア・コリH−4581株(FERM BP-1411 : ジアミノ
ピメリン酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸耐性、L−スレオニン分解能低下、
リファンピシン耐性、リジン耐性、メチオニン耐性、ホ
モセリン耐性、アスパラギン酸耐性)より誘導したジア
ミノピメリン酸非要求株H−7700株からさらに誘導した
L−セリンおよびエチオニン耐性株H−7729株(FERM BP
-2792)に、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジンによる常法の変異処理(0.2mg/ml、30℃、
30分間)を施した後、L−フェニルアラニン(10g
/l)とL−リジン塩酸塩(3g/l)を含む最少培地
(グルコース5g/l、NH4 Cl 2g/l 、KH2 PO4 2g
/l 、MgSO4 ・7H2 O 0.1g/l 、FeSO4 ・7H2 O 20mg
/l 、DL- メチオニン 50 mg/l 、寒天 2% 、pH7.2)に
塗布した。30℃で2〜6日間培養し、生育してくる大き
なコロニーを釣菌分離し、スレオニン生産試験をおこな
った。親株よりL−スレオニン生産能が向上した菌株を
L−フェニルアラニン耐性株としてH−8311と命名し
た。
【0007】また、親株をH−7700株とし、L−ロイシ
ン(6g/l)とL−リジン塩酸塩(3g/l)を含む
上記最少培地を用いる以外はH−8311株の取得方法と同
様の方法をおこない、L−ロイシン耐性株H−8309を取
得した。これらの菌株は、平成3年8月21日付で、ブ
ダペスト条約に基づいて工業技術院微生物工業技術研究
所にそれぞれ微工研条寄第3520号(FERM BP-352
0 )、微工研条寄第3519号(FERM BP-3519) と
して寄託されている。
【0008】このようにして得られた変異株のL−フェ
ニルアラニンおよびL−ロイシンに対する耐性度をそれ
ぞれ親株と比較した。耐性度は、第1表に示した量のL
−フェニルアラニンとL−ロイシンを含む最少培地(グ
ルコース5g/l、NH4 Cl 2g/l 、KH2 PO4 2g/l
、MgSO4 ・7H2 O 0.1g/l 、FeSO4 ・7H2 O20mg/l
、DL- メチオニン 50 mg/l 、L-リジン塩酸塩 2g/l
、寒天 2% 、pH7.2)に、天然培地 (トリプトン 10 g
/l 、酵母エキス 5g/l 、NaCl 10 g/l 、pH7.5)ス
ラント上で24時間培養した菌体を殺菌水に懸濁して塗布
し、30℃、72時間培養後の生育の度合いで示した
(第1表)。
【0009】
【表1】
【0010】本発明の微生物によるL−スレオニンの生
産は、通常の細菌の培養法にて実施可能である。使用培
地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株
の必要とする栄養素を程良く含有するものならば、合成
培地または天然培地いずれも使用可能である。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖
蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水
分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、
リンゴ酸、乳酸などの有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によってグリセリン、エタノールなどのアル
コールなども用いられる。
【0011】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸ア
ンモニウムなどの各種無機塩類や有機酸のアンモニウム
塩、アミン類、その他の窒素化合物、ならびにペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消
化物などが用いられる。
【0012】無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸
第二カリウム、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、
炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、深部振盪培
養または通気攪拌培養などの好気的条件下にて行う。培
養温度は20〜40℃で、好ましくは25〜38℃の範
囲である。培地のpHはpH5〜9の範囲で、好ましく
は中性付記に保持する。培地のpH調整は炭酸カルシウ
ム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニ
ア、pH緩衝液などによって行う。通常2〜7日間の培
養により、培養液中にL−スレオニンが生成蓄積する。
【0013】培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からL−スレオニンを回収す
ることができる。以下に本発明の実施例を示す。
【0014】
【実施例】
実施例1 L−スレオニンの生産試験 前記で得られた変異株を用いL−スレオニンの発酵生産
試験を行った。エシェリヒア・コリH−7700、エシェリ
ヒア・コリH−7729、エシェリヒア・コリH−8309およ
びエシェリヒア・コリH−8311を、グルコース20g/
l、ペプトン10g/l、酵母エキス10g/lおよびN
aCl 2.5g/lの組成からなる種培地(pH7.4)に
て、それぞれ30℃、16時間振盪培養した。得られた
種培養液100 mlを、下記発酵培地1リットルを含む2リ
ットル容小型発酵槽に植菌し、30℃、攪拌数800rp
m 、通気量1 l/min にて培養した。培養中のpH調整
および窒素源の供給はアンモニア水にて行い、pHは6.
5±0.2に維持した。グルコースを適宜供給しつつ、7
0時間培養を行った。その際のL−スレオニン生成量を
高速液体クロマトグラフィー法により定量した。結果を
第2表に示す。発酵培地の組成:グルコース40g/l、
(NH 4 ) 2 SO4 12g/l、KH2 PO4 2g/l 、MgSO4
7H2 O 0.1g/l 、コーンスチープリカー 5g/l 、DL
- メチオニン 0.3g/l 、(pH7.4) H−8311株を用いて得たL−スレオニン含有培養液1リ
ットルを、それぞれ遠心分離(3,000rpm、10min)にか
け、菌体その他の不純物を除去した。得られた上澄液を
強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンSKIB(H
+ 型) のカラムに通し、L−スレオニンを吸着させ、水
洗後0.5規定のアンモニア水で溶出して、L−スレオニ
ン画分を集めた。集めた画分を濃縮し、エタノールを加
えて冷却下で保存することにより、純度98%以上のL
−スレオニン結晶が39.5gを得られた
【0015】
【表2】
【0016】
【発明の効果】本発明により、収率良くL−スレオニン
を得ることができる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 エシェリヒア属に属し、L−フェニルア
    ラニンおよび/またはL−ロイシンに耐性を有し、かつ
    L−スレオニン生産能を有する微生物を培地に培養し、
    培養物中にL−スレオニンを生成蓄積させ、該培養物よ
    りL−スレオニンを採取することを特徴とするL−スレ
    オニンの製造法。
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