CN102471790B

CN102471790B - 产生l-氨基酸的方法

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Publication number: CN102471790B
Application number: CN201080033906.3A
Authority: CN
Inventors: 铃木茂雄
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2030-07-28
Also published as: US8771981B2; US20140363857A1; US20120202255A1; JPWO2011013707A1; WO2011013707A1; BRPI1014661B1; CN102471790A; BRPI1014661A2; EP2460883A4; EP2460883A1

Abstract

一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括：制备微型藻类的处理产物，其通过在培养基中培养微型藻类，并在中温处理其培养物来用具有产生L-氨基酸能力的细菌促进L-氨基酸的产生和蓄积；在包含所述微型藻类的处理产物的培养基中培养细菌以在培养物中产生并蓄积L-氨基酸；和从培养物收集L-氨基酸。

Description

产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及用于使用微生物产生L-氨基酸的方法。L-氨基酸用于多种领域，如用于调味料、食品添加剂、饲料添加剂、化学品和药物。

背景技术

L-氨基酸，如L-苏氨酸和L-赖氨酸，在工业上是通过使用氨基酸生产细菌如具有产生这些L-氨基酸的能力的埃希氏菌(Escherichia)发酵产生的。作为此类氨基酸生产细菌，使用从自然界分离的细菌菌株，这些细菌菌株的人工突变体，其中L-氨基酸生物合成酶通过基因重组而增强的这些细菌菌株的重组体等。用于产生L-苏氨酸的方法的实例包括，例如专利文献1至4中所述的方法。用于产生L-赖氨酸的方法的实例包括，例如专利文献5至8中所述的方法。

在通过发酵法进行的L-氨基酸工业生产中，将糖类，即葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜(blackstrap molasses)、淀粉水解物等用作碳源。作为L-氨基酸的发酵产生方法中使用的碳源，经常使用的是来源于高等植物如玉米和木薯(cassava)的淀粉的糖化产物。这些具有低的水分含量和高的淀粉含量，因此在产业上容易从其获得淀粉。相反，微型藻类中包含的淀粉尽管具有以单位干重计与玉米或木薯相当的含量，但单位培养液的藻干重量不到1％。分离藻体、将其脱水、破坏细胞、提取淀粉和纯化淀粉的方法是复杂而困难的。尽管专利文献9、10和非专利文献1描述了使用微型藻类淀粉的乙醇发酵，但其并未显示乙醇发酵的结果。此外，目前为止未报道任何将微型藻类淀粉糖化后用于氨基酸产生的实例。

已知大肠杆菌(Escherichia coli)，一种代表性的氨基酸生产细菌，可使用甘油作为唯一的碳源生长(非专利文献2)，且可使用具有12个或更多个碳原子的长链脂肪酸作为唯一碳源生长(非专利文献3)。因此，在非专利文献4中描述了大肠杆菌可同化作为油脂水解产物的长链脂肪酸和甘油，但大肠杆菌不具有脂肪酶活性，因此其无法直接同化油脂。此外，亦已知长链脂肪酸的溶解度一般极低，而非专利文献5中描述了这样的测量结果：尽管月桂酸的溶解度为0.1g/L以上，但油酸的溶解度为0.0003g/L以下，而棕榈酸的溶解度为0.00000003g/L以下。因此，高度水溶性的甘油和脂肪酸难以同时同化，且迄今为止并无对基于利用油脂水解物(其为长链脂肪酸和甘油的混合物)作为碳源的直接发酵产生L-氨基酸的报道。

通常用于产生食用油脂的油料作物大豆的种子及油棕(Elaeis guineensis)的果实包含约20％的油脂。与此相对的是，据非专利文献6报道，已知微型藻类中存在产生脂肪或油者，且单位面积的油脂产率远超过油料作物。然而，正如淀粉的情况一样，分离藻、使其脱水、破碎细胞、提取油脂和纯化油脂的方法是复杂而困难的。因此，迄今为止亦无通过利用来自藻类的油脂作为碳源直接发酵产生L-氨基酸的报道。

此外，尽管已知用于提取来源于小球藻(chlorella)的有机物质的方法(专利文献11、12和13)，认为其破坏优选通过高温反应进行。而且，迄今为止并无关于利用通过前述方法获得的处理产物作为碳源直接发酵而产生L-氨基酸的报道。此外，亦已知核酸相关化合物可通过小球藻的自溶而增加(专利文献14)，但迄今为止并无关于利用该处理产物作为碳源直接发酵而产生L-氨基酸的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开平5-304969

专利文献2：国际公开WO98/04715

专利文献3：特开平05-227977

专利文献4：美国专利申请公开2002/0110876

专利文献5：特开平10-165180

专利文献6：特开平11-192088

专利文献7：特开2000-253879

专利文献8：特开2001-057896

专利文献9：美国专利申请公开2006/135308

专利文献10：美国专利申请公开2007/0202582

专利文献11：特开平9-75094

专利文献12：国际公开WO2006/095964

专利文献13：美国专利申请公开2007/0202582

专利文献14：特开昭62-278977

非专利文献

非专利文献1：Matsumoto，M.等，2003，Appl.Biochem.Biotechnol.，105-108：247-254

非专利文献2：Lin，E.C.C.，1996，pp.307-342，In F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.

非专利文献3：Clark，D.P.和Cronan Jr.，J.E.，1996，pp.343-357，In F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.

非专利文献4：Brenner，D.J.和Farmer III J.J.Family I.，2005，pp.587-669，In：D.J.Brenner，N.R.Krieg and J.T.Staley，Editors，Bergey′s Manual of SystematicBacteriology，Volume Two：The Proteobacteria Part B：The Gammaproteobacteria，Springer，New York

非专利文献5：Vorum，H.等，1992，Biochimica et Biophysica Acta，1126：135-142

非专利文献6：Chisti Y.，2007，Biotechnol.Adv.，25：294-306

发明内容

发明要解决的问题

本发明的一个目标是提供更有效的产生L-氨基酸的方法，特别是提供通过使用来源于微型藻类的碳源，与传统上通过主要使用来源于高等植物的糖类作为碳源进行的使用微生物发酵产生L-氨基酸的方法相比，以更低成本产生L-氨基酸的方法。

解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题进行了大量研究，结果发现，可利用通过使藻类培养物在中温反应，无需添加或仅添加少量脂肪酶或淀粉酶即可获得有机物质的藻类培养物处理产物作为碳源，有效地产生L-氨基酸。基于该发现而完成了本发明。

(1)一种产生L-氨基酸的方法，包括

(a)通过在培养基中培养微型藻类并在中温处理该培养物，制备可促进具有L-氨基酸产生能力的细菌的L-氨基酸产生和蓄积的该微型藻类的处理产物，

(b)在包含该微型藻类的处理产物的培养基中培养细菌以在培养物中产生并蓄积L-氨基酸，和

(c)从培养物收集L-氨基酸。

(2).上述的方法，其中在中温处理的温度为40℃或更高。

(3).上述的方法，其中在中温处理的温度为70℃或更低。

(4).上述的方法，其中所述处理产物是通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀，并包含脂肪酸。

(5).上述的方法，其中所述处理产物是通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的上清，并包含葡萄糖或甘油。

(6).上述的方法，其中所述处理产物是通过对在中温进行了处理的产物用碱或有机溶剂处理以提取脂肪酸而获得的提取物。

(7).上述的方法，其中对通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀物用碱或有机溶剂进行处理。

(8).上述的方法，其中用碱的处理是在10.5或更高的pH进行。

(9).上述的方法，其中用碱的处理是在60℃或更高温度进行。

(10).上述的方法，其中用有机溶剂的处理是用甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、氯仿、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲醚、乙醚或己烷进行的。

(11).上述的方法，其中在中温进行处理的过程中降低温度。

(12).上述的方法，其中所述微型藻类是属于绿藻门(Chlorophyta)或不等鞭毛门(Heterokontophyta)的藻类。

(13).上述的方法，其中所述微型藻类是属于绿藻纲(Chlorophyceae)、四胞藻纲(Trebouxiophyceae)或硅藻纲(Bacillariophyceae)的藻类。

(14).上述的方法，其中所述微型藻类是属于绿藻纲的藻类。

(15).上述的方法，其中所述细菌是属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌。

(16).上述的方法，其中所述属于肠杆菌科的细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。

发明效果

通过使用本发明，可有效地产生L-氨基酸。

附图说明

图1显示通过在中温处理Chorella kessleri所获得的脂肪酸的量。

图2显示通过在中温处理微球藻属种(Nannochloris sp.)所获得的脂肪酸的量。

图3显示在中温处理藻期间观察到的脂肪酸产生率的经时变化。

图4显示对用于提取脂肪酸的碱处理的pH条件的考察。

图5显示对用于提取脂肪酸的碱处理的温度条件的考察。

图6显示对用于提取脂肪酸的碱处理的时间的考察。

图7显示对在中温下两步处理藻的第一步处理的温度条件的考察。

图8显示对在中温下两步处理藻的第一步处理的时间和第二步处理的时间的考察。

图9显示对在用于提取脂肪酸的有机溶剂处理中所用的溶剂的考察。

具体实施方式

在下文中会对本发明进行详细解释。

<1>用于本发明的微型藻类及其培养方法

用于本发明的微型藻类，可使用任何藻类。然而，优选在藻体中蓄积淀粉和/或油脂的微型藻类。

藻类(algae)指进行产氧型光合成的生物中，除主要在陆上生活的苔癣植物(Bryophyta)、蕨类植物(Pteridophyta)、种子植物(Spermatophyta)以外的全部生物。藻类包括多种单细胞生物和多细胞生物，如是原核生物的蓝细菌(蓝藻)(cyanobacteria)以及是真核生物的分类灰藻门(Glaucophyta)、红藻门(红藻)(Rhodophyta)、绿藻门(Chlorophyta)、隐藻门(隐藻)(Cryptophyta)、定鞭藻门(定鞭藻)(Haptophyta)、不等长鞭毛门(Heterokontophyta)、甲藻门(甲藻)(Dinophyta)、裸藻门(Euglenophyta)或Chlorarachniophyta的那些。微型藻类是指是上述藻类中除了是多细胞生物的海藻类以外的具有微观结构的藻类(Biodiversity Series(3)Diversity and Pedigree of Algae，edited by Mitsuo Chihara，Shokabo Publishing Co.，Ltd.(1999))。

许多植物包括藻类产生淀粉作为储藏多糖(Ball，S.G.和Morell，M.K.2003.Annual Review of Plant Biology，54：207-233)。已知多种蓄积淀粉的藻类，典型藻类包括属于绿藻门的葱绿藻纲(Prasinophyceae)、绿藻纲(Chlorophyceae)、四胞藻纲(Trebouxiophyceae)、石莼纲(Ulvophyceae)、轮藻纲(Charophyceae)等。其中，属于绿藻纲(Chlorophyceae)以及四胞藻纲的藻类得到了充分的研究。属于绿藻纲的藻类的实例包括衣藻属(Chlamydomonas)；而属于四胞藻纲的藻类的实例包括小球藻属(Chlorella)。具体地，属于衣藻属的藻类的实例包括莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Ball，S.G.1998.TheMolecular Biology of Chloroplasts and Mitochondria in Chlamydomonas，pp.549-567.Rochaix J.-D.，Goldschmidt-Clermont M.，and Merchant S.(Eds)，Kluwer Academic Publishers)；而属于小球藻属的藻类的实例包括Chlorellakessleri(旧称Chlorella vulgaris)(Izumo，A.et al.2007.Plant Science 172：1138-1147)。更具体地，莱茵衣藻的实例包括莱茵衣藻CC125株，而Chlorellakessleri的实例包括Chlorella kessleri 11h株。这些藻株例如分别保藏在德克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas at Austin，The CultureCollection of Algae(UTEX)，1 University Station A6700，Austin，TX 78712-0183，USA)，受理号为UTEX 2244和UTEX 263，并可以从UTEX获得。Chlorellakessleri 11h株先保藏在东京大学分子细胞生物学研究所IAM培养物保藏中心，保藏号C-531，然后转移至独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施(NIES)。此外，该株还保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC、P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，1，United States of America)，受理号ATCC11468，可由ATCC提供。

还已知有的微型藻类蓄积油脂作为储藏物质(Chisti，Y.2007.BiotechnolAdv.25：294-306)。作为这样的藻类，熟知的有属于绿藻门、不等长鞭毛门的那些。属于绿藻门的藻类的实例包括属于绿藻纲(Chlorophyceae)的藻类，而属于绿藻纲的藻类包括富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)(Tornabene，T.G.等1983.Enzyme and Microb.Technol.5：435-440)、微球藻属种(Nannochlorissp.)(Takagi，M.等，2000.Appl.Microbiol.Biotechnol.54：112-117)等。不等长鞭毛门分类成黄金色藻纲(Chrysophyceae)、硅鞭藻纲(Dictyochophyceae)、Pelagophyceae、针胞藻纲(Rhaphidophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、黄绿藻纲(Xanthophyceae)、大眼藻纲(Eustigmatophyceae)。作为常用的属于硅藻纲的藻类的实例包括假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)(Tonon，T等2002.Phytochemistry 61：15-24)。富油新绿藻的具体实例包括富油新绿藻UTEX 1185株，微球藻属种的具体实例包括微球藻属种UTEX LB 1999株，而假微型海链藻的具体实例包括假微型海链藻UTEX LB FD2株。这些菌株可以从德克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas at Austin，The Culture Collection of Algae(UTEX)，1University Station A6700，Austin，TX 78712-0183，USA)获得。

有许多关于微型藻类的培养的认识，且对于小球藻属、螺旋藻属(Spirulina，Arthrospira)或者杜氏盐藻(Dunaliella salina)等，已经进行了大规模工业培养(Spolaore，P.等2006.J.Biosci.Bioeng.101：87-96)。对于莱茵衣藻，例如，可使用0.3×HSM培养基(Oyama，Y.等2006.Planta 224：646-654)，而对于Chlorella kessleri，可以使用0.2×Gamborg培养基(Izumo，A.等2007.PlantScience 172：1138-1147)等。富油新绿藻、微球藻属种可以使用修饰的NORO培养基(Yamaberi，K.等1998.J.Mar.Biotechnol.6：44-48；Takagi，M.等2000.Appl.Microbiol.Biotechnol.54：112-117)或Bold′s Basal Medium(Tornabene，T.G.等1983.Enzyme and Microb.Technol.5：435-440；Archibald，P.A.and Bold，H.C.1970.Phytomorphology 20：383-389)来进行培养。作为属于硅藻纲的藻类的假微型海链藻，可优选地使用F/2培养基(Lie，C.-P.和Lin，L.-P.2001.Bot.Bull.Acad.Sin.42：207-214)等。此外，对于微型藻类的培养，还可以使用光生物反应器(WO2003/094598号小册子)。

培养中大多是通过添加基于主培养的体积1-50％的前培养液来进行的。初始pH优选为约中性，即7-9，且培养中大多不进行pH调整。然而，视需要也可进行pH调整。培养温度优选为25-35℃，特别是一般经常使用28℃附近的温度。然而，培养温度只要是适合于所使用的藻类的温度。培养液中大多通入空气，作为通气率，经常使用的是单位培养液体积的每分钟的通气量为0.1-2vvm(volume per volume per minute，体积每体积每分钟)。而且，为了促进生长，也会通入CO₂，且优选以通气率的约0.5-5％通入。最佳光照射强度也取决于微型藻类的种类而异，但经常采用1,000-10,000lux左右的光照射强度。对于光源，通常在室内使用白色荧光灯，但光源并不限于此。也可以在室外利用太阳光来进行培养。视需要，还可以以适当强度搅拌或循环培养液。此外，已知当氮源枯竭时，藻类在藻体内蓄积油脂(Thompson GA Jr.1996.Biochim.Biophys.Acta 1302：17-45)，也可以对于主培养亦可使用限制了氮源浓度的培养基。

本发明中，微型藻类的培养物包括：包含藻体的培养液和从培养液回收的藻体。

可以通过常规的离心分离、过滤或者使用絮凝剂(flocculant)的重力沉降(Grima，E.M.et al.2003.Biotechnol.Advances 20：491-515)从培养液收集藻体。

在本发明中，特别是，当使用包含于处理产物中的脂肪酸作为碳源时，在中温的处理之前，微型藻类优选是通过离心等浓缩的。藻体的浓缩包括去除溶液成分以获得酶单位体积溶液的微型藻类干重量浓度为25g/L或更高，优选250g/L或更高(包括从培养基通过离心等分离藻体，并将藻体以所需浓度悬于液体)，并使用从培养基沉淀和分离的藻体。

<2>用于处理微型藻类的方法和微型藻类的处理产物

在本发明中，微型藻类的培养是在中温进行的，且将微型藻类的处理产物用作L-氨基酸发酵的营养源。

在本发明中，微型藻类的处理产物意指通过在中温处理微型藻类的培养物而获得的反应混合物。因此，在本说明书中，术语“在中温处理”和“在中温反应”具有相同含意。处理产物包括通过对在中温处理的反应混合物进一步进行提取或分级和/或其他处理而获得的产物，其包含来源于微型藻类细胞的有机物质的混合物，也包含可促进具有产生L-氨基酸能力的细菌促进L-氨基酸的产生和蓄积的成分。

“促进L-氨基酸的生产和蓄积”意指处理产物中所包含的有机物质在细菌增殖和L-氨基酸生产中，作为构成细胞成分和L-氨基酸的碳的供给源实质性地做出贡献，而任何能够以此方式做出贡献的处理产物，均包含在本发明的“促进L-氨基酸生产和蓄积量的处理产物”之中。

处理产物是否促进L-氨基酸的生产和蓄积，可以通过在除了有无处理产物之外相同的条件下培养该细菌，并比较培养物中的L-氨基酸的产生和蓄积量来确认。

所述L-氨基酸蓄积可为与未添加处理产物而观察到的L-氨基酸蓄积相比有所提高的任何量，优选与未添加培养产物的培养相比，L-氨基酸蓄积提高10％以上，优选20％以上，更优选30％以上。

由于添加处理产物，微生物的生长率提高、培养基中的微生物菌体量增加，也包括在本发明的“促进L-氨基酸的产生和蓄积”中，且与未添加的培养物相比，生长率和细胞量优选增加10％以上，更优选20％以上，仍更优选30％以上。

此外，当处理产物包含碳源时，只要其能够在细菌生长及L-氨基酸生产中作为构成菌体成分和L-氨基酸的碳的供给源做出实质性贡献，就包括在本发明的促进L-氨基酸的产生和蓄积的处理产物中。因此，虽然任何与未添加处理产物的情形相比增加L-氨基酸产生和蓄积量的处理产物均包括在本发明的处理产物之中，但优选相比于以与包含于处理产物中的碳源相同的量添加包含纯化物质的碳源的情形，提高L-氨基酸产生和蓄积量的处理产物。

此外，与使用包含纯化物质的碳源相比，缩短了纯化碳源的处理步骤，也可以说促进了L-氨基酸的产生和蓄积。在此情况下，处理步骤的时间优选缩短10％以上，更优选20％以上，仍更优选30％以上。

在本发明中，中温意指足以增加处理产物中脂肪酸、甘油或葡萄糖的量的温度，且处理可在相同温度连续进行，或可在处理过程中降低温度进行。作为在处理过程中降低温度的实例，可先在中温进行处理作为第一步中温处理，然后在低于该温度的恒定温度进行处理作为第二步中温处理。这里，在中温的连续处理或第一步中温处理的温度下限通常在40℃以上，优选在45℃以上，更优选在50℃以上，温度上限通常在70℃以下，优选65℃以下，更优选60℃以下。第二步中温处理的温度下限通常在30℃以上，优选在35℃以上，更优选40℃以上，而温度上限通常在55℃以下，优选在50℃以下，更优选在45℃以下。

在本发明中，尽管可对通过上述培养方法获得的藻类培养物直接进行在中温的反应，但也可如上所述将其浓缩然后使用。例如，可将培养物离心，然后将沉淀的藻体用于反应。

而且，在中温进行反应之前，反应pH可调整为弱酸性pH，或可将藻体冻结一次。

上述弱酸性pH优选为3.0至7.0，更优选4.0至6.0。

用于冻结的温度通常意指-80至0℃的温度，且优选允许在-20℃或更低温度，更优选-50℃或更低温度反应1小时或更长。

在本发明中，对于在中温进行的连续处理，反应优选进行至少1小时或更长，更优选5小时或更长。上述在中温进行的反应通常进行48小时或更短，更优选24小时或更短。对于第一步中温处理，反应优选进行至少1分钟或更长，优选10分钟或更长，更优选20分钟或更长。所述第一步中温处理通常优选进行120分钟或更短，更优选60分钟或更短。所述第二步中温处理最短反应时间优选进行至少1小时或更长，更优选4小时或更长，且通常最长反应时间优选20小时或更短，更优选15小时或更短。

当在中温进行处理之后进行碱处理或有机溶剂处理时，包括将在中温处理之后的溶液体积不变进行处理或稀释处理，以及将沉淀出的沉淀从上清分离后进行处理。通常，优选地，在每单位体积溶液的沉淀浓度为250g/L或更低，优选125g/L或更低的浓度进行处理。在碱处理的情况下，优选以125g/L或更低的浓度进行处理，在有机溶剂处理的情况下，优选将沉淀从上清分离。

在本发明中，在中温处理之后进行的碱处理的pH，通常意指pH为pH 10.5或更高，pH 14或更低，优选pH 11.5或更高，更优选pH 12.5或更低。

在本发明中，该碱处理的温度通常意指60℃或更高，优选80℃或更高，更优选90℃或更高。优选该碱处理的温度在120℃或更低。

在本发明中，该碱处理的时间，优选处理至少10分钟或更长，优选30分钟或更长，更优选60分钟或更长。优选该碱处理的时间为150分钟或更短。

在本发明中，在中温进行的处理之后的有机溶剂处理，可将处理产物干燥之后用有机溶剂抽提，亦可不经干燥进行抽提。此处的有机溶剂可为甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、氯仿、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲醚、乙醚、己烷等。

在中温进行的处理之后，优选将反应液通过离心分离为沉淀和上清。而且在中温进行的处理之后，亦可将处理产物直接用作L-氨基酸发酵的培养基成分。

沉淀包含许多脂肪酸，优选为了将脂肪酸用水胶束化而进行碱处理。此外，优选为了使得碳源高效地同化，对沉淀进行乳化处理。乳化处理的实例包括添加乳化增强剂、搅拌、匀浆和超声波处理等。认为通过乳化处理，细菌对脂肪酸的同化变得容易，L-氨基酸的发酵变得更加有效。只要是使得具有L-氨基酸生产能力的细菌更加容易地同化脂肪酸的处理，任何乳化处理均可。例如，可考虑添加乳化增强剂或表面活性剂作为乳化方法。在此，乳化增强剂的实例包括磷脂或甾醇。而且，作为表面活性剂的实例，非离子表面活性剂有聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨坦单油酸酯(Tween 80)，烷基葡糖苷如正辛基β-D-葡糖苷，蔗糖脂肪酸酯如蔗糖硬脂酸酯，聚甘油脂肪酸酯如聚甘油硬脂酸酯等。两性离子型表面活性剂有烷基甜菜碱N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱等。除了这些以外，可以利用生物学领域一般使用的表面活性剂如Triton X-100、聚氧乙烯(20)鲸蜡醚(Brij-58)和壬基酚乙氧化物(Tergitol NP-40)等。

此外，为了促进难溶性物质如脂肪酸的乳化或均一化而进行的操作也是有效的。该操作只要是促进脂肪酸和甘油的混合物的乳化或均一化的操作，无论何种操作均可。具体实例包括搅拌处理、匀浆器处理、均匀搅拌器(homomixer)处理、超声波处理、高压处理、高温处理等，更优选搅拌、匀浆器处理、超声波处理及其组合。

特别优选上述乳化增强剂进行的处理与搅拌处理、匀浆器处理和/或超声波处理的组合，且期望这样的处理在脂肪酸更稳定的条件下进行。碱性条件优选pH 9或更高，更优选pH 11或更高。

当沉淀物中包含微型藻类产生的油脂时，亦可将其水解物作为碳源添加至培养基。亦可对通过乙醇、甲醇和氯仿的混合物以及丙酮等溶剂抽提的有机物的混合溶液进行水解。这些溶液可照原样使用，亦可通过冻干和蒸发等处理来浓缩。该溶液包含氨基酸等可用作有机氮源的成分，金属等对具有氨基酸生产能力的细菌的生长有效的成分亦可用作碳源之外的培养基成分。

油脂为脂肪酸和甘油的酯，亦称为甘油三酯。微型藻类产生的油脂，优选的是，通过水解产生的脂肪酸种类能够被本发明的方法中使用的细菌作为碳源同化，其含量越高越好。具有L-氨基酸生产能力的细菌能够同化的长链脂肪酸种类的实例包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等。此外，一般而言生物除了油脂之外，还包含通过水解释放脂肪酸的脂质，亦可将通过脂质的水解产生的脂肪酸作为碳源。脂质的实例包括单纯脂质如蜡或神经酰胺，和复合脂质包括磷脂和糖脂等。

为了进一步水解油脂，亦可将沉淀与脂肪酶反应。脂肪酶为将油脂水解为脂肪酸和甘油的酶，亦称为三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酯脂肪酶。

脂肪酶见于多种生物，只要是催化上述反应的脂肪酶，无论使用来自何种的脂肪酶均可。近年来，进行了种种使用脂肪酶从油脂和醇类生产属于脂肪酸酯的生物柴油燃料的尝试。

作为来自微生物的代表性脂肪酶，已知许多来自芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的脂肪酶(Jaeger，K.E.，和Eggert，T.2002.Curr.Opin.Biotechnol.13：390-397)。

举例而言，编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的LipA(GenBankAccession No.M74010)的基因核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：1和2。

编码来自荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)的LipA(GenBankAccession No.X70354)的基因核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：3和4。

编码来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的LipA(GenBankAccession No.D50587)的基因核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：5和6。

编码来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的脂肪酶(GenBankAccession No.M12715)的基因核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：7和8。

此外，来自酵母南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶(GenBankAccession No.Z30645)亦为常用的脂肪酶的一种(Breivik，H.，Haraldsson，G.G.and Kristinsson，B.1997.J.Am.Oil Chem.Soc.74：1425-1429)。编码该脂肪酶的基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：9和10。

此外，对于酵母皱落假丝酵母(柱状假丝酵母)(Candida rugosa，Candidacylindracea)，已知有五种以上的由不同基因编码的脂肪酶的存在(Alberghina，L.和Lotti，M.1997.Methods Enzymol.284：246-260)。作为主要的脂肪酶，已知LIP1和LIP2，编码LIP1的lip1(GenBank Accession No.X64703)的基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：11和12。编码LIP2的lip2(GenBank Accession No.X64703)的基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：13和14。而且，对于柱状假丝酵母等假丝酵母属(Candida)，已知在通用密码子中编码亮氨酸的CTG密码子编码丝氨酸(Kawaguchi，Y.等1989.Nature 341：164-166；Ohama，T.等1993.Nucleic Acids Res.21：4039-4045)。对于SEQ ID NO：11至14，尽管为了方便起见将CTG对应的氨基酸记载为Leu，实际上则为Ser。

此外，亦可使用来源于隐球菌属(Cryptococcus)的脂肪酶，例如由Cryptococcus sp.S-2产生的脂肪酶，以及与其一级结构类似的脂肪酶(特开2004-73123号)。作为编码来自隐球菌属的脂肪酶的基因，已知Cryptococcussp.S-2(FERM P-15155)的脂肪酶基因CS2基因(特开2004-73123号公报)。该CS2基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：18，而由该CS2基因编码的脂肪酶的前体的氨基酸序列示于SEQ ID NO：19。对于SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，预测-34～-1位为信号肽，而1～205位相当于成熟蛋白质。Cryptococcussp.S-2于1995年9月5日以FERM P-15155的登录号保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(地址305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，并于2008年4月25日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并被赋予保藏号FERM BP-10961。

上述脂肪酶可以使用从上述微生物的细胞或培养物制备的，亦可使用编码各脂肪酶的基因，利用基因工程技术，通过在其它宿主微生物中表达来制备。当将皱褶假丝酵母(柱状假丝酵母)等CTG密码子编码丝氨酸的酵母来源的基因在其它宿主中进行表达时，有必要将CTG变更为编码丝氨酸的其它通用密码子(Schmidt-Dannert，C.1999.Bioorg.Med.Chem.7：2123-2130)。

作为脂肪酶的序列方面的特征的实例包括，在活性中心Ser周围具有称为脂肪酶盒(lipase box)的GXSXG基序，以及脂肪酶、酯酶、丝氨酸蛋白酶中均可见的称为催化三联体(catalytic traid)的Ser、Asp、His这3个残基的保守性。例如，在SEQ ID NO：2所示的枯草芽孢杆菌来源的LipA的氨基酸序列中，脂肪酶盒相当于第106位～110位，催化三联体相当于第108位的Ser、第164位的Asp以及第187位的His这3个残基。

此外，为了降低酶的成本，亦可使用通过修饰酶而提高了其活性和稳定性的脂肪酶。实例包括通过噬菌体展示(Phage Display)法修饰的枯草芽孢杆菌脂肪酶A(Droge等，ChemBioChem，2006，7：149-157.)、通过DNA改组而改善活性和稳定性的修饰体(Suen等，Protein Eng.Design&Selection，2004，17：133-140)、通过CALB法修饰的南极假丝酵母脂肪酶B(Zhang等，ProteinEng.，2003，16：599-605)、通过CAST法修饰的铜绿假单胞菌脂肪酶(Reets等，Angew.Chem.Int.Ed.，2005，44：4192-4196.)等。

在本发明中，对于在中温反应所得的处理产物离心分离后得到的沉淀中所含的油脂进行分解，则分解为脂肪酸和甘油。因此可将该甘油作为氨基酸发酵的碳源。

此外，在本发明中，亦可将在中温反应所得的处理产物离心分离后所得的上清液作为处理产物使用。通过本发明的中温处理，离心分离所得的上清液中包含淀粉分解所得的片段和葡萄糖，还包含油脂分解所得的甘油。因此，该葡萄糖和甘油可作为碳源使用。

此外，在本发明中，将在中温反应所得的处理产物离心分离所得的上清包含淀粉的断裂产物。因此，可使用通过将上清的淀粉断裂产物通过淀粉葡糖苷酶等糖化，而导致葡萄糖量进一步提高的处理产物。

淀粉是一类高分子多糖，包括直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉由葡萄糖通过α-1，4-糖苷键连接而直链连接而成，而支链淀粉在分枝上具有α-1，4-糖苷键和α-1，6-糖苷键二者的直链。淀粉酶是水解淀粉等的糖苷键的酶的总称。根据作用部位的不同，大体分为α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1)，β-淀粉酶(β-amylase EC3.2.1.2)以及葡糖淀粉酶(glucoamylase EC3.2.1.3)或淀粉葡糖苷酶(淀粉-1，6-糖苷酶)(EC：3.2.1.33)。α-淀粉酶为随机切割淀粉或糖原等的α-1，4-糖苷键的内切型酶。β-淀粉酶为从淀粉的非还原性末端以麦芽糖单元将α-1，4糖苷键逐次分解的外切型酶。葡糖淀粉酶或淀粉葡糖苷酶为从淀粉的非还原性末端以葡萄糖单元将将α-1，4糖苷键逐次分解的外切型酶，亦分解包含于支链淀粉中的α-1，6键。葡糖淀粉酶或淀粉葡糖苷酶由于可从淀粉直接生成葡萄糖，故广泛用于淀粉的产生，在本发明中亦为优选的酶。

来自谷物的淀粉糖化反应在产业中实施的例子有很多(Robertson，G.H.等2006.J.Agric.Food Chem.54：353-365)。与这样的实例同样，可从藻体通过酶反应获得糖化产物。当将包含经破碎的藻体的溶液用酶处理时，作为预处理，优选使用煮沸、超声波处理、碱处理等的组合(Izumo，A.等2007.Plant Science172：1138-1147)。

酶反应的条件可根据使用的酶的性质而适当地设定。例如，对于淀粉葡糖苷酶(Sigma Aldrich A-9228)，优选酶浓度2～20U/mL，温度40～60℃，pH 4～6。而且，对于pH的调整，可使用在L-氨基酸的产生中使用的细菌能够同化的有机酸作为缓冲液，且可将淀粉的糖化产物与该有机酸一同使用作为碳源。例如，可将酶反应产物直接添加至培养基中。

<4>本发明中使用的细菌

在本发明中，使用具有L-氨基酸生产能力的细菌。对于细菌没有特殊限制，只要其能够高效地从由微型藻类生产的有机物、特别是淀粉的糖化物或者油脂的水解物生产L-氨基酸即可，可以列举例如埃希氏菌属、泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属(Enterobacter)等属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，以及属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)的称为棒状杆菌型细菌等，但不限于此。

可以对本发明中的L-氨基酸生产菌进行修饰，使得油脂水解物或脂肪酸的同化能力提高。这样的修饰的实例包括，例如，编码在肠杆菌科细菌群中发现的转录因子FadR(该因子调节脂肪酸代谢且具有DNA结合能力)的基因的缺失(DiRusso，C.C.等1992.J.Biol.Chem.267：8685-8691；DiRusso，C.C.等1993.Mol.Microbiol.7：311-322)。具体地，大肠杆菌的fadR基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号1,234,161～1,234,880，该基因编码以GenBank登录号AAC74271登录的蛋白质。大肠杆菌fadR基因序列示于SEQ ID NO：16。

为了提高油脂水解物或脂肪酸同化能力，可进一步增强选自下组的一种或2种以上的基因的表达：fadA、fadB、fadI、fadJ、fadL、fadE和fadD。

本发明中的“fadL基因”意指编码见于肠杆菌科细菌群，具有摄入长链脂肪酸能力的外膜转运蛋白的基因(Kumar，G.B.和Black，P.N.1993.J.Biol.Chem.268：15469-15476；Stenberg，F.等2005.J.Biol.Chem.280：34409-34419)。作为编码FadL的基因的具体实例包括作为大肠杆菌的fadL基因的大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号2459322～2460668位置处的基因。

本发明中的“fadD基因”意指编码见于肠杆菌科细菌群，在催化从长链脂肪酸生成脂肪酰CoA的脂肪酰CoA合成酶活性的同时通过内膜将其摄入的酶的基因(Dirusso，C.C.和Black，P.N.2004.J.Biol.Chem.279：49563-49566；Schmelter，T.等2004.J.Biol.Chem.279：24163-24170)。编码FadD的基因的具体实例包括作为大肠杆菌的fadD基因的大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号1887770～1886085(互补链)位置处的基因。

本发明中的“fadE基因”意指编码见于肠杆菌科细菌群，具有催化脂肪酸CoA氧化的酰基CoA脱氢酶活性的酶的基因(O′Brien，W.J.和Frerman，F.E.1977.J.Bacteriol.132：532-540；Campbell，J.W.和Cronan，J.E.2002.J.Bacteriol.184：3759-3764)。

编码FadE的基因的具体实例包括作为大肠杆菌的fadE基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号243303～240859(互补链)，具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的基因。该基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：8。

本发明中的“fadB基因”意指编码见于肠杆菌科细菌群，为脂肪酸氧化复合物(fatty acid oxidation complex)的α组分，催化烯醇基CoA水解酶、3-羟酰CoA脱氢酶、3-羟酰CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰CoA异构酶等四种活性的酶的基因(Pramanik，A.等1979.J.Bacteriol.137：469-473；Yang，S.Y.and Schulz，H.1983.J.Biol.Chem.258：9780-9785)。编码FadB的基因的具体实例包括作为大肠杆菌的fadB基因的大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号4028994～4026805(互补链)位置处的基因。

本发明中的“fadA基因”意指编码见于肠杆菌科细菌群，为脂肪酸氧化复合物(fatty acid oxidation complex)的β组分，催化3-酮酰基CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)活性的酶的基因(Pramanik，A.等1979.J.Bacteriol.137：469-473)。编码FadA的基因的具体实例包括作为大肠杆菌的fadA基因的大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号4026795～4025632(互补链)位置处的基因。

已知见于肠杆菌科细菌群的脂肪酸氧化复合物为由FadB和FadA形成的复合物，作为基因，亦形成fadBA操纵子(Yang，S.Y.等1990.J.Biol.Chem.265：10424-10429)。因此，作为fadBA操纵子，可对操纵子整体进行扩增。

此外，油脂水解物或脂肪酸的同化能力可通过cyo操纵子(cyoABCDE)的增强而达成。本发明中的“cyoABCDE”是编码作为见于肠杆菌科细菌群的末端氧化酶之一的细胞色素bo氧化酶复合物(cytochrome bo terminal oxidasecomplex)的各亚基的基因群，cyoB意指编码亚基I的基因，cyoA意指编码亚基II的基因，cyoC意指编码亚基III的基因，cyoC意指编码亚基IV的基因，而cyoE意指编码催化血红素O合酶(heme O synthase)活性的酶的基因(Gennis，R.B.and Stewart，V.1996.p.217-261.In F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C；Chepuri等1990.J.Biol.Chem.265：11185-11192)。

编码cyoA的基因的实例具体包括作为大肠杆菌cyoA基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号450834～449887(互补链)位置处的基因。编码cyoB的基因的实例具体包括作为大肠杆菌cyoB基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号449865～447874(互补链)位置处的基因。编码cyoC的基因的实例具体包括作为大肠杆菌cyoC基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号447884～447270(互补链)位置处的基因。编码cyoD的基因的实例具体包括作为大肠杆菌cyoD基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号447270～446941(互补链)位置处的基因。编码cyoE的基因的实例具体包括作为大肠杆菌cyoE基因的位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录号U00096)的碱基编号446929～446039(互补链)位置处的基因。

此外，本发明的细菌可为经修饰使得丙酮酸合酶或丙酮酸：NADP+氧化还原酶活性增强的菌株(参见WO2009/031565)。

本发明中的“丙酮酸合酶”意指在电子供体如铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白存在下可逆地催化下述从乙酰CoA和CO₂生成丙酮酸的反应的酶(EC1.2.7.1)。丙酮酸合酶亦可略称为PS，也有被命名为丙酮酸氧化还原酶、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸氧化还原酶的情况。作为电子供体，可使用铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白。

还原型铁氧还蛋白+乙酰CoA+CO₂→氧化型铁氧还蛋白+丙酮酸+CoA

丙酮酸合酶活性的增强的确认，可通过制备来自增强前的微生物与增强后的微生物的粗酶溶液，并比较其丙酮酸合酶活性来达成。丙酮酸合酶活性可通过例如Yoon等的方法(Yoon，K.S.等1997.Arch.Microbiol.167：275-279)来测定。例如，可通过下述方法测定，即向包含作为电子受体的氧化型甲基紫精(methylviologen)和CoA和粗酶液的反应液中添加丙酮酸，用分光光度法测量由于丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型甲基紫精的量。1单位(U)的酶活性定义为相当于每分钟1μmol的甲基紫精的还原量。在亲本株具有丙酮酸合酶活性的情况下，与亲本株相比，期望酶活性优选提高至1.5倍或更高，更优选2倍或更高，更优选3倍或更高。而当亲本株不具有丙酮酸合酶活性时，期望可通过导入丙酮酸合酶基因，生成丙酮酸合酶，优选酶活性增强至能够测定的程度，优选0.001U/mg(菌体蛋白)或更高，更优选0.005U/mg或更高，更优选0.01U/mg或更高。丙酮酸合酶具有对氧的敏感性，一般而言活性表达和测定常常是困难的(Buckel，W.and Golding，B.T.2006.Ann.Rev.ofMicrobiol.60：27-49)。因此，当测定酶活性时，优选使反应容器中氧浓度减少而进行酶反应。

编码丙酮酸合酶的基因可利用绿硫菌(Chlorobium tepidum)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)等具有还原性TCA循环的细菌的丙酮酸合酶基因。此外，亦可利用包括大肠杆菌的属于肠杆菌科细菌群的细菌来源的丙酮酸合酶基因。此外，编码丙酮酸合酶的基因，可利用海藻甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、Methanocaldococcus jannaschii、Methanothermobacter thermautotrophicus等自养型甲烷生产古菌(autotrophicmethanogens)的丙酮酸合酶基因。

本发明中的“丙酮酸：NADP+氧化还原酶”意指在电子供体例如NADPH或NADH存在下可逆地催化下述从乙酰CoA和CO₂生成丙酮酸的反应的酶(EC 1.2.1.15)。丙酮酸：NADP+氧化还原酶亦略称为PNO，亦有被命名为丙酮酸脱氢酶的情况。然而，本发明中称“丙酮酸脱氢酶活性”时，如下所述，为催化将丙酮酸氧化脱碳酸，生成乙酰CoA的反应的活性，催化该反应的丙酮酸脱氢酶(PDH)与丙酮酸：NADP+氧化还原酶是不同的酶。丙酮酸：NADP+氧化还原酶可使用NADPH或NADH作为电子供体。

NADPH+乙酰CoA+CO₂→NADP++丙酮酸+CoA

丙酮酸：NADP+氧化还原酶的活性增强的确认是通过制备来自增强前的微生物和增强后的微生物的粗酶液，比较其丙酮酸：NADP+氧化还原酶活性来达成的。丙酮酸：NADP+氧化还原酶活性例如可通过Inui等的方法(Inui，H.等1987.J.Biol.Chem.262：9130-9135)来测定。例如，可通过下述方法测定：向包含作为电子受体的氧化型甲基紫精和CoA和粗酶液的反应液添加丙酮酸，通过分光光度法测定由于丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型甲基紫精的量。1单位(U)酶活性定义为相当于酶分钟将1μmol甲基紫精还原的量。在亲本株具有丙酮酸：NADP+氧化还原酶活性的情况下，与亲本株相比，期望酶活性优选提高至1.5倍或更高，更优选2倍或更高，更优选3倍或更高。而当亲本株不具有丙酮酸：NADP+氧化还原酶活性时，期望可通过导入丙酮酸合酶基因，生成丙酮酸：NADP+氧化还原酶，优选酶活性增强至能够测定的程度，优选0.001U/mg(细胞蛋白)或更高，更优选0.005U/mg或更高，更优选0.01U/mg或更高。丙酮酸：NADP+氧化还原酶具有对氧的敏感性，一般而言活性表达和测定常常是困难的(Inui，H.等1987.J.Biol.Chem.262：9130-9135；Rotte，C.等2001.Mol.Biol.Evol.18：710-720)。

编码丙酮酸：NADP+氧化还原酶的基因包括既是光合成真核微生物也被分类为原生动物的纤细裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸：NADP+氧化还原酶基因(Nakazawa，M.等2000.FEBS Lett.479：155-156)，原生动物微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的丙酮酸：NADP+氧化还原酶基因(Rotte，C.等2001.Mol.Biol.Evol.18：710-720)，除此之外已知在硅藻Tharassiosira pseudonana中亦存在同源的基因(Ctrnacta，V.等2006.J.Eukaryot.Microbiol.53：225-231)。

具体而言，可利用纤细裸藻的丙酮酸：NADP+氧化还原酶基因(GenBank登录号AB021127)。

本发明的微生物可为经过修饰的微生物，其与亲本株例如野生株或非突变株相比，经修饰而使得丙酮酸合酶活性所必需的将电子供体的氧化型循环为还原型的活性增强，由此使得丙酮酸合酶的活性增加。将电子供体的氧化型循环为还原型的活性的实例包括铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性。此外，亦可为这样的微生物，其除了增加电子供体的循环活性之外，还进行了使得丙酮酸合酶的活性增加的修饰，而使得丙酮酸合酶活性增加。而且，上述亲本株可为原本具有编码电子供体的循环活性的基因的株，亦可为原本不具有电子供体的循环活性，通过导入编码该活性的基因而赋予活性，而提高L-氨基酸生产能力的株。

“铁氧还蛋白NADP+还原酶”意指可逆地催化下述反应的酶(EC1.18.1.2)。

还原型铁氧还蛋白+NADP+→氧化型铁氧还蛋白+NADPH+H+

该反应是可逆反应，且可在NADPH和氧化型铁氧还蛋白的存在下，产生还原型铁氧还蛋白。铁氧还蛋白可由黄素氧还蛋白代替，命名为黄素氧还蛋白-NADP+还原酶者亦具有同样的功能。已确认黄素氧还蛋白NADP+还原酶在自微生物至高等生物中广泛存在(参见Carrillo，N.and Ceccarelli，E.A.2003.Eur.J.Biochem.270：1900-1915；Ceccarelli，E.A.等2004.Biochim.Biophys.Acta.1698：155-165)，其亦命名为黄素氧还蛋白-NADP+氧化还原酶或NADPH-黄素氧还蛋白还原酶。

黄素氧还蛋白-NADP+还原酶活性增强的确认，可通过制备来自修饰前的微生物和修饰后的微生物的粗酶液，比较其黄素氧还蛋白-NADP+还原酶的活性来达成。黄素氧还蛋白NADP+还原酶的活性例如可通过Blaschkowski等的方法(Blaschkowski，H.P.等1982.Eur.J.Biochem.123：563-569)来测定。举例而言，使用黄素氧还蛋白作为底物，可通过分光光度法测定来测定减少的NADPH的量。1单位(U)的酶活性定义为相当于每分钟将1μmol的NADPH氧化的量。当亲本株具有黄素氧还蛋白-NADP+还原酶活性时，亲本株的活性充分高，则无必要增强，但期望与亲本株相比，酶活性优选提高至1.5倍或更高，更优选2倍或更高，更优选3倍或更高。

编码铁氧还蛋白NADP+还原酶的基因见于多种生物种，只要是具有目的的L-氨基酸生产株中的活性即可使用。对于大肠杆菌，fpr基因被鉴定为黄素氧还蛋白-NADP+还原酶(Bianchi，V.等1993.J.Bacteriol.175：1590-1595)。此外，已知恶臭假单胞菌(Psuedomonas putida)中假单胞氧还蛋白还原酶(Putidaredoxin reductase)基因和假单胞氧还蛋白(Putidaredoxin)基因作为操纵子存在(Koga，H.等1989.J.Biochem.(Tokyo)106：831-836)。

大肠杆菌黄素氧还蛋白-NADP+还原酶的实例包括大肠杆菌K-12株的基因组序列(GenBank登录号U00096)的碱基编号4111749～4112495(互补链)位置处的fpr基因。此外，在谷氨酸棒杆菌基因组序列(GenBank登录号BA00036)的碱基编号2526234～2527211中发现了铁氧还蛋白NADP+还原酶(GenBank登录号BAB99777)。

丙酮酸合酶活性需要铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白作为电子供体存在。因此，亦可为经过提高铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力的修饰，而使得丙酮酸合酶的活性提高的经修饰微生物。

此外，除了使得丙酮酸合酶或黄素氧还蛋白-NADP+还原酶及丙酮酸合酶增强的修饰之外，可以进行使得铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力提高的修饰。

在本发明中，“铁氧还蛋白”指与包含非血红素铁原子(Fe)和硫原子，称作4Fe-4S、3Fe-4S或2Fe-2S簇的铁硫簇的蛋白质，其作为单电子传递物起作用。“黄素氧还蛋白”指具有包含FMN(黄素单核苷酸)作为辅基的单电子或双电子传递物的功能的蛋白质。对于铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白，记载于McLean等的文献(McLean，K.J.等2005.Biochem.Soc.Trans.33：796-801)。

此外，就修饰所用的亲本株而言，其可原本固有地具有编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因，也可以本来不具有铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白基因，而通过导入铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因而赋予活性，提高L-氨基酸的生产能力。

此外，与亲本株例如野生株或非突变株相比，铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的产生能力提高的确认，可通过SDS或双向电泳或使用抗体的Western印迹来检测出(Sambrook，J.等1989.Molecular Cloning A LaboratoryManual/Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。对于生产量，只要与野生株或非突变株相比有所提高即可，但期望例如与野生型、非突变株相比提高至1.5倍或更高，优选2倍或更高，更优选3倍或更高。

铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白的活性可通过加入到适当的氧化还原反应体系中来测定。例如，Boyer等揭示了将产生的铁氧还蛋白通过铁氧还蛋白-NADP+还原酶还原，对所产生的还原型铁氧还蛋白还原细胞色素C的还原反应定量的方法(Boyer，M.E.等2006.Biotechnol.Bioeng.94：128-138)。此外，黄素氧还蛋白的活性可使用黄素氧还蛋白-NADP+还原酶以相同方法测定。

编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因分布广泛，只要其编码的铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白能够被丙酮酸合酶和电子供体再生系统利用，即可使用。例如，在大肠杆菌中，存在fdx基因作为编码具有2Fe-2S簇的铁氧还蛋白的基因(Ta，D.T.和Vickery，L.E.1992.J.Biol.Chem.267：11120-11125)，预期yfhL基因是具有4Fe-FS簇的铁氧还蛋白基因。此外，作为黄素氧还蛋白基因，已知fldA基因(Osborne，C.等1991.J.Bacteriol.173：1729-1737)和fldB基因(Gaudu，P.和Weiss，B.2000.J.Bacteriol.182：1788-1793)的存在。在谷氨酸棒杆菌的基因组序列(GenBank登录号BA00036)中，在碱基编号562643～562963中发现了多个铁氧还蛋白基因fdx(GenBank登录号BAB97942)，而在碱基编号1148953～1149270中发现了fer(GenBank登录号BAB98495)。此外，在绿硫菌中存在多种铁氧还蛋白基因，已鉴定铁氧还蛋白I和铁氧还蛋白II为作为丙酮酸合酶的电子受体的4Fe-4S型的铁氧还蛋白基因(Yoon，K.S.等2001.J.Biol.Chem.276：44027-44036)。亦可使用嗜热氢杆菌等具有还原性TCA循环的细菌来源的铁氧还蛋白基因或黄素氧还蛋白基因。

大肠杆菌的铁氧还蛋白基因的具体实例包括大肠杆菌K-12株的基因组序列(GenBank登录号U00096)的碱基编号2654770～2655105(互补链)位置处的fdx基因，以及碱基编号2697685～2697945位置处的yfhL基因。

本发明中的L-氨基酸生产菌中与甘油代谢相关的基因可以被修饰。

作为与甘油代谢相关的基因，为了提高甘油同化性能，可以弱化glpR基因(EP1715056)的表达，或者强化glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa以及talC基因等甘油代谢基因(EP1715055A)的表达。

特别是，为了提高甘油同化性能，优选组合强化甘油脱氢酶基因(gldA)与PEP依赖型二羟基丙酮激酶基因(dhaKLM)基因或者ATP依赖型二羟基丙酮激酶基因(dak)。而且，还可以进一步强化果糖-6-磷酸醛缩酶(fsaB)的表达(WO2008/102861)。

此外，在甘油激酶(glpK)方面，优选使用解除了果糖-1，6-磷酸反馈抑制的脱敏型glpK基因(WO2008/081959，WO2008/107277)。

肠杆菌科中包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森菌属等属的细菌。特别优选通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgiyyid＝91347)中采用的分类方法分类在肠杆菌科中的细菌。

对于可在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌没有特殊限制，包括例如Neidhardt等的著作(Neidhardt，F.C.Ed.1996.Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp.2477-2483.Table 1.AmericanSociety for Microbiology Press，Washington，D.C.)中表述的系统。具体实例包括原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址P.O.Box 1549Manassas，VA 20108，United States of America)通过分售获得。即，对各菌株赋予了对应的登录号，可以利用该登录号通过分售获得。对应于各菌株的登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。这一点对于以下的附有ATCC号的菌株而言也是一样的。

所谓属于泛菌属的细菌，是指该细菌通过微生物学专家知晓的分类被分类在泛菌属。成团肠杆菌的某些种，最近基于16S rRNA碱基序列分析等被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌((Pantoea stewartu))等(Int.J.Syst.Bacteriol.1993.43：162-173)。在本发明中，属于泛菌属的细菌也包含这样重新分类在泛菌属的细菌。

作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体地，可以列举下述菌株。

Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)

Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)

此外，这些菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中被描述为成团肠杆菌。但是现在，如上所述，这些菌株通过16S rRNA的碱基序列解析等被重新分类为Pantoea ananatis。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。具体地，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书示例的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举成团肠杆菌ATCC12287株。

作为欧文氏菌属细菌，可以列举解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。具体地，可以列举下述菌株。

解淀粉欧文氏菌ATCC15580株

胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713株

植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)

植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)

在本发明中，“棒状杆菌型细菌”还包括：传统上被分类为短杆菌属，而现在被分类为棒杆菌属的细菌(Liebl，W.et al.1991.Int.J.Syst.Bacteriol.，41：255-260)，以及与棒杆菌属亲缘关系非常近的短杆菌属细菌。作为这样的棒状杆菌型细菌的例子，可以列举以下细菌。

嗜乙酰乙酸棒杆菌

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoammogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)

白色棒杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体地，可以示例出诸如下述的菌株。

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)ATCC21511

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC19240

产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC6871、ATCC6872

白色棒杆菌(Brevibacterium album)ATCC15111

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)ATCC15112

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354

在本发明中，具有氨基酸生产能力的细菌，是指具有在培养基中进行培养时生产L-氨基酸并将L-氨基酸分泌至培养基中的能力的细菌。此外，优选地，是指能够在培养基中蓄积优选0.5g/L以上、更优选1.0g/L以上的量的目的L-氨基酸的细菌。L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。特别优选L-苏氨酸、L-赖氨酸以及L-谷氨酸。

以下，针对赋予如上所述的细菌以L-氨基酸生产能力的方法、或者增强如上所述的细菌的L-氨基酸生产能力的方法进行说明。

为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等L-氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变体、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株，创建L-氨基酸生物合成系统统酶表达增强的重组菌株等等(参见《氨基酸发酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日首次出版，第77-100页)。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。

具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；从所得的突变菌株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。

此外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过利用基因重组增强酶活性来进行。在酶活性的增强方面，可以例举对细菌进行修饰而增强参与L-氨基酸生物合成的酶的编码基因的表达的方法。作为增强基因的表达的方法，可以这样来实现：将包含基因的DNA片段导入适当的质粒，例如至少包含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体，而得到扩增质粒，导入这样的扩增质粒；或者，通过接合、基因转移等使所述基因在染色体上多拷贝化；抑或在所述基因的启动子区域导入突变(参照国际公开小册子WO95/34672号)。

当向上述扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达所述基因的启动子可以是能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的任何启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适宜地选择在棒状杆菌型细菌中强力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表达量的调节。诸如上述的增强酶基因表达的方法，记载于国际公开第00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等。

以下，针对赋予细菌L-氨基酸生产能力的方法、以及被赋予了L-氨基酸生产能力的细菌进行示例。

L-苏氨酸生产菌

作为优选的具有L-苏氨酸生产能力的微生物，可以列举增强了L-苏氨酸生物合成系统酶中的1种或2种以上活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、thr操纵子编码的天冬氨酸激酶I(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号内为该基因的简记符号(下同)。所述酶中，特别优选天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶以及苏氨酸合酶。L-苏氨酸生物合成系统基因可以导入苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，可以列举例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH6株(特开2001-346578号)等。

L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成系统酶进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现该修饰(参照Lynn，S.P.et al.1987.J.Mol.Biol.194：59-69；国际公开第02/26993号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。

苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，可用非天然(non-native)启动子将其取代(参考国际公开第98/04715号小册子)。或者，可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物(repressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，也可以选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株。

对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而表达量提高。除了通过使用质粒的扩增来增加拷贝数，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组上转入苏氨酸操纵子来增加拷贝数。

理想的是，除了L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。

此外，增强赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是理想的。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Livshits，V.A.等2003.Res.Microbiol.154：123-135)、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。

作为L-苏氨酸生产菌和用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举：大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利第5,175,107号、美国专利第5,705,371号)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美国专利第5,631,157号)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利第5,939,307号)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利第5,474,918号)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利第5,376,538号)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，1978.Genetika(俄语)，14：947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(欧洲专利申请公开第1149911号)等属于埃希氏杆菌属的菌株，但不限于此。

TDH-6菌株缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且其ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation)。该菌株的rhtA基因也有赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性的突变。B-3996菌株携带pVIC40质粒，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-Union ScientificCenter of Antibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Nagatinskaya Street 3-A，117105Moscow，Russia)，保藏号为RIA 1867。该菌株也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM)，(1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号为B-3996。

还可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株。B-5318菌株是非异亮氨酸营养缺陷型的，其中温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子取代了pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日国际保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号为VKPM B-5318。

编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号337～2,799，该基因编码以GenBank登录号AAC73113登录的蛋白质。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号2,801～3,733，该基因编码以GenBank登录号AAC73114登录的蛋白质。编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号3,734～5,020，该基因编码以GenBank登录号AAC73115登录的蛋白质。这3个基因在编码前导肽的thrL基因的下游以由thrLABC构成的苏氨酸操纵子的形式编码。为了增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子上除去影响转录的弱化子区域是有效的(国际公开第2005/049808号、国际公开第2003/097839号)。

编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，加上thrB和thrC基因，可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得，该质粒存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996菌株中，pVIC40质粒在美国专利No.5,705,371中有详述。

rhtA基因是作为赋予高丝氨酸以及苏氨酸抗性的基因(rht：resistant tothreonine/homoserine，苏氨酸/高丝氨酸抗性)而获得的，其位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号848,433～849,320(互补链)，该基因编码以GenBank登录号AAC73900登录的蛋白质。此外，已经证明提高rthA的表达的rhtA23突变是相对于ATG起始密码子为-1位的位置上的G→A取代(Livshits，V.A.等2003.Res Microbiol.154：123-135、欧洲专利申请公开第1013765号)。

大肠杆菌的asd基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号3,571,798～3,572,901(互补链)，该基因编码以GenBank登录号AAC76458登录的蛋白质。可以通过使用基于基因碱基序列制作的引物的PCR来获得(White，T.J.等1989.Trends Genet.5：185-189.参照)。其它微生物的asd基因也可以以同样的方式获得。

此外，大肠杆菌的aspC基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号983,742～984,932(互补链)，该基因编码以GenBank登录号AAC74014登录的蛋白质，可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因也可以以同样的方式获得。

L-赖氨酸生产菌

以下，以L-赖氨酸生产菌及其构建方法为例进行说明。

作为具有L-赖氨酸生产能力的菌株，可以例举L-赖氨酸类似物抗性株或代谢调控突变株。作为L-赖氨酸类似物的例子，可以列举氧化赖氨酸、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下也简记为“AEC”)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等，但不限于此。对于所述赖氨酸类似物具有抗性的突变株，可以通过对属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌实施常规的人工突变处理来获得。作为L-赖氨酸生产菌，具体可以列举大肠杆菌AJ11442株(FERMBP-1543、NRRL B-12185；参照特开昭56-18596号公报和美国专利第4346170号说明书)、大肠杆菌VL611株(特开2000-189180号公报)等。此外，作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌，也可以使用WC196株(参照国际公开第96/17930号小册子)。

此外，通过提高L-赖氨酸生物合成系统的酶活性也可以构建L-赖氨酸生产菌。所述酶活性的提高可以通过提高编码酶的基因在细胞内的拷贝数、或对表达调节序列进行修饰来实现。

用于增强基因表达的修饰可以通过例如利用基因重组技术提高细胞中基因的拷贝数来进行。例如，可以将包含gapA基因的DNA片段与在宿主细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体相连接，来制作重组DNA，然后再将其导入细菌进行转化。

提高基因的拷贝数还可以通过使如上所述的基因在细菌的基因组DNA上以多拷贝存在来实现。为了在细菌基因组DNA上多拷贝地导入基因，可以利用染色体DNA上多拷贝存在的序列作为靶标来进行同源重组。作为染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA或存在于转移因子的端部的反向重复序列。此外，可以在存在于基因组上的gapA基因的旁侧随机连接各种基因，也可以把多个这样的基因来导入到基因组上的不必要的基因中。所述基因导入可以使用温度敏感型载体，或者使用整合(integration)载体来实现。

或者，也可以如特开平2-109985号公报所述那样，将基因加载在转座子上，使其发生转移，从而将基因多拷贝地导入基因组DNA上。基因转移到基因组上这一事实的确认，可以通过以基因的一部分作为探针进行Southern杂交来确认。

而且，除了上述的基因拷贝数扩增以外，基因表达的增强还可以通过下述方法实现：采用国际公开00/18935号小册子记载的方法，将基因组DNA上或质粒上的基因的各自的启动子等表达调节序列替换为更强力的启动子等表达调节序列，使各基因的-35、-10区域向共有序列接近，对提高基因表达的调节子进行扩增，或者对降低基因表达的调节子进行缺失或弱化。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、10启动子等是已知的强力启动子。此外，还可以在gapA基因的启动子区域、SD区域导入碱基取代等，将其修饰得更强。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子在Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.1995.1：105-128)等中有记载。而且，已知对核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列中，特别是对起始密码子紧邻上游的序列中的数个核苷酸的取代，对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对这些序列进行修饰。基因的启动子等表达调节区域也可以使用启动子搜索载体、GENETYX等基因解析软件来确定。通过所述启动子取代或修饰，基因的表达得到强化。表达调节序列的取代可以采用例如使用温度敏感型质粒的方法、Red驱动整合法(WO2005/010175)等。

作为编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因，可以列举：二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱碳酸酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(以上、国际公开第96/40934号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭60-87788号公报)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-102028号公报)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(特开2003-135066号公报)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(国际公开第00/61723号小册子)等二氨基庚二酸途径的酶的基因，或者高乌头酸水合酶基因(特开2000-157276号公报)等氨基己二酸途径的酶等的基因。此外，亲本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo)(EP 1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716)、编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Valle F.等1983.Gene23：199-209)或它们的任意组合的基因表达水平可以增加。而且，括号内为所述基因的简记符号。

已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶受L-赖氨酸的反馈抑制，大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，在使用dapA基因和lysC基因时，优选这些基因是不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型基因。

作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，可以列举编码具有第118位的组氨酸残基被取代成酪氨酸残基的序列的蛋白质的DNA。此外，作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA，可以列举编码具有第352位的苏氨酸残基被取代为异亮氨酸残基、第323位的甘氨酸残基被取代为天冬酰胺残基、第318位的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸的序列的AKIII的DNA(关于这些突变体，可参见美国专利第5661012号和第6040160号说明书)。突变型DNA可以通过利用PCR等的定点突变方法获得。

而且，作为包含编码突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的突变型dapA和编码突变型天冬氨酸激酶的突变型lysC的质粒，已知有广宿主域质粒RSFD80、pCAB1、pCABD2(美国专利第6040160号说明书)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109株(美国专利第6040160号说明书)命名为AJ12396，该株于1993年10月28日保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏号FERM P-13936；并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERMBP-4859。RSFD80可采用公知方法从AJ12396株获取。

在L-赖氨酸生产中，作为这样的酶，有高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶等，该酶的活性降低或缺损的菌株记载于国际公开第WO95/23864号、第WO96/17930号小册子、第WO2005/010175号小册子等。

为了使赖氨酸脱羧酶活性降低或缺损，优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达。降低这两个基因的表达可以按照WO2006/078039号小册子所述的方法来进行。

作为降低或者缺损所述酶活性的方法，可以采用常规的突变处理法或基因重组技术，在基因组上的上述酶的基因中导入使得细胞中该酶的活性降低或缺损的突变。这样的突变的导入可以如下地实现：例如，通过基因重组缺损基因组上的编码酶的基因，或者对启动子、shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰，等等。此外，还可以这样完成：向基因组上的编码酶的区域导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一～二个碱基的移码突变，或者使基因的一部分或整个区域缺失(Wang，J.P.等2006.J.Agric.Food Chem.54：9405-9410；Winkler，W.C.2005.Curr.Opin.Chem.Biol.9：594-602；Qiu，Z.and Goodman，M.F.1997.J.Biol.Chem.272：8611-8617；Wente，S.R.and Schachman，H.K.1991.J.Biol.Chem.266：20833-20839)。此外，酶活性的降低或缺损还可以这样实现：构建编码突变酶的基因，其中编码区域整体或部分缺失，通过同源重组等用该基因取代基因组上的正常基因，或者将转座子、IS因子导入到该基因中。

例如，为了通过基因重组导入使得上述酶的活性降低或缺损的突变，可以采用诸如以下的方法。对目的基因的部分序列进行修饰，制备不产生正常发挥功能的酶的突变型基因，用含该基因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌，通过突变型基因与基因组上的基因之间发生重组，可以将基因组上的目的基因替换成突变型。如上所述的利用同源重组的基因取代包括：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，和Wanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645)、组合使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.2002.Bacteriol.184：5200-5203)的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(美国专利第6303383号、特开平05-007491号公报)。此外，基于如上述的利用了同源重组的基因取代的位点特异性突变导入还可以利用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。

作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2(WO2006/078039)。该菌株是通过在WC196株中破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因、并导入包含赖氨酸生物合成系统基因的质粒pCABD2(美国专利第6,040,160号)而构建的菌株。WC196株是由大肠杆菌K-12来源的W3110株出发，用突变型lysC基因替换W3110株染色体上的野生型lysC基因，而后赋予AEC抗性而选育得到的菌株(美国专利第5,827,698号)，所述突变型lysC基因编码第352位的苏氨酸被替换成异亮氨酸，从而解除了L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶III(美国专利第5,661,012号)。WC196株被命名为大肠杆菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-14690；并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-5252(美国专利第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC本身也是优选的L-赖氨酸生产菌。WC196ΔcadAΔldcC被命名为AJ110692，并于2008年10月7日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM BP-11027。

pCABD2包含：编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型lysC基因、编码大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、以及编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源的二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(国际公开第WO95/16042、WO01/53459号小册子)。

增强如上所述的L-赖氨酸生物合成相关酶的基因表达的方法、降低酶活性的方法对于其它编码L-氨基酸生物合成酶的基因也可同样适用。

作为具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以列举：AEC抗性突变株(乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11082(NRRL B-11470)株等：参照特公昭56-1914号公报、特公昭56-1915号公报、特公昭57-14157号公报、特公昭57-14158号公报、特公昭57-30474号公报、特公昭58-10075号公报、特公昭59-4993号公报、特公昭61-35840号公报、特公昭62-24074号公报、特公昭62-36673号公报、特公平5-11958号公报、特公平7-112437号公报、特公平7-112438号公报)；生长需要L-高丝氨酸等氨基酸的突变株(参照特公昭48-28078号公报、特公昭56-6499号公报)；显示AEC抗性、且需要L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变株(参照美国专利第3708395号以及第3825472号说明书)；显示DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药、醌类、N-月桂酰亮氨酸抗性的L-赖氨酸生产突变株；显示草酰乙酸脱碳酸酶(脱羧酶)或呼吸体系酶抑制剂抗性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭50-53588号公报、特开昭50-31093号公报、特开昭52-102498号公报、特开昭53-9394号公报、特开昭53-86089号公报、特开昭55-9783号公报、特开昭55-9759号公报、特开昭56-32995号公报、特开昭56-39778号公报、特公昭53-43591号公报、特公昭53-1833号公报)；需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9784号公报、特开昭56-8692号公报)；对氟代丙酮酸或34℃以上的温度显示敏感性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9783号公报、特开昭53-86090号公报)；对乙二醇显示抗性、且生产L-赖氨酸的短杆菌属或棒杆菌属的生产突变株(美国专利第4411997号说明书)等。

L-半胱氨酸生产菌

L-半胱氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)，具有过表达编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110(美国专利5,972,663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(特开平11-155571号)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(国际公开第0127307号)，等等。

L-亮氨酸生产菌

L-亮氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过国际公开第96/06926号中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。

用于本发明的细菌可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达来加以改进。这些基因的实例可优选例举以编码解除了L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因(美国专利第6,403,342号)为代表的leuABCD操纵子中的基因。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一种以上的基因的表达来改进用于本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(欧洲专利申请公开1239041)。

棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括：扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而被赋予了L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭62-195293)、α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。

L-组氨酸生产菌

L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌24株(VKPM B-5945、俄罗斯专利第2003677号)、大肠杆菌80株(VKPM B-7270、俄罗斯专利第2119536号)、大肠杆菌NRRLB-12116-B12121(美国专利第4,388,405号)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)以及H-9343(FERM BP-6676)(美国专利第6,344,347号)、大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(欧洲专利申请公开第1085087号)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利第6,258,554号)，等等。

L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括其中编码L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达得到了增强的菌株。相关基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导可赋予对反馈抑制的抗性的突变，来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。

具有L-组氨酸生产能力的菌株的具体实例包括其中已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体的大肠杆菌FERM-P 5038和5048(特开昭56-005099号)，导入了氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(欧洲专利申请公开第1016710号)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)，等等。

L-谷氨酸生产菌

L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)VL334thrC⁺(EP 1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC基因和ilvA基因中有突变(美国专利4,278,765)。thrC基因的野生型等位基因是利用可在野生型大肠杆菌菌株K-12(VKPM B-7)细胞中增殖的噬菌体P1，通过常规转化方法导入的。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC⁺(VKPM B-8961)。

L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于L-谷氨酸生物合成系统酶中的1种或2种以上的活性得到增强的菌株。作为所述基因的例子，可以列举：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)等。所述酶中，优选谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合酶。

作为经过了修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增加的菌株的例子，可以列举欧洲专利申请公开第1078989号、欧洲专利申请公开第955368号以及欧洲专利申请公开第952221号中公开的菌株。

作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举下述酶的活性降低或缺损的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径改道而合成L-谷氨酸以外的化合物。作为这样的酶的例子，可以列举：异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟基酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)等。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺损、或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于埃希氏菌属的细菌及其获取方法在美国专利第5,378,616号和第5,573,945号中有记载。

作为具体例子，可以列举下述菌株。

大肠杆菌W3110sucA::Km^r

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

大肠杆菌W3110sucA::Km^r是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(以下也称“sucA基因”)而得到的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺损。

此外，作为α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的棒状杆菌型细菌，可以例举以下菌株。

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)L30-2株(特开2006-340603号说明书)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ΔS株(国际公开95/34672号小册子)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ12821(FERM BP-4172；参照法国专利公报9401748号说明书)

黄色短杆菌AJ12822(FERM BP-4173；法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERM BP-4174；法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌L30-2株(特开2006-340603号)

作为L-谷氨酸生产菌的其它例子，可以列举属于埃希氏菌属、且对天冬氨酸代谢拮抗物质有抗性的菌株。所述菌株可以缺损α-酮戊二酸脱氢酶，可以例举大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利第5,908,768号)，以及还降低了L-谷氨酸分解能力的FFRM P-12379(美国专利第5,393,671号)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利第6,110,714号)等。

作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌的例子，可以列举Pantoeaananatis AJ13355株。该菌株是从静冈县磐田市的土壤中作为能够在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培养基中生长的菌株而分离出来的菌株。Pantoeaananatis AJ13355于1998年2月19日被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-16644；于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离出来时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并作为成团肠杆菌AJ13355保藏，但近年来通过16S rRNA的碱基序列解析等，其被重新分类为Pantoeaananatis。

此外，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举α-酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)活性缺损、或者αKGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。作为这样的菌株有：缺损AJ13355株的αKGDH-E1亚基基因(sucA)而得到的AJ13356(美国专利第6,331,419号)，以及从AJ13355株中作为粘液质低生产突变菌株选择出来的SC17株衍生的sucA基因缺损株SC17sucA(美国专利第6,596,517号)。AJ13356于1998年2月19日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-16645，并于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6616。AJ13355以及AJ13356在上述保藏机构是作为成团肠杆菌保藏的，但是在本说明书中，将其描述为Pantoea ananatis。此外，SC17sucA株的内部编号为AJ417，已于2004年2月26日保藏于前述的产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-08646。

而且，作为属于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株以及NA1株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株是在SC17sucA株中导入大肠杆菌来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作为低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的抗性的菌株而选择出的菌株。此外，NP106株是质粒RSFCPG+pSTVCB从AJ13601株脱落而得到的菌株。AJ13601株于1999年8月18日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-17516，并于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-7207。

而且，作为赋予棒状杆菌型细菌L-谷氨酸生产能力的方法，可以采用扩增编码机械敏感性离子通道(mechanosensitive channel)的yggB基因的方法(国际公开WO2006/070944号)，导入在编码区域内引入有突变的突变型yggB基因的方法。yggB基因位于以Genbank登录号NC#003450登录的谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的基因组序列上的碱基编号1,337,692～1,336,091(互补链)，该基因编码以GenBank登录号NP#600492登录的膜蛋白质(也称为NCgl1221)。

作为赋予或者增强L-谷氨酸生产能力的其它方法，还可以列举：赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。例如：赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予苯并吡喃酮或萘醌类抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平4-88994)，等等。

作为这样的抗性菌的具体例子，可以列举诸如下述的菌株。

黄色短杆菌AJ3949(参照FERM BP-2632：特开昭50-113209)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(参照FERM P-5736；特开昭57-065198)

黄色短杆菌AJ11355(参照FERM P-5007；特开昭56-1889号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(参照FERM P-5020；特开昭56-1889号公报)

黄色短杆菌AJ11217(参照FERM P-4318；特开昭57-2689号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(参照FERM P-4319；特开昭57-2689号公报)

黄色短杆菌AJ11564(参照FERM P-5472；特开昭56-140895公报)

黄色短杆菌AJ11439(参照FERM P-5136；特开昭56-35981号公报)

谷氨酸棒杆菌H7684(参照FERM BP-3004；特开平04-88994号公报)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11426(参照FERMP-5123；特开平56-048890号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(参照FERM P-5137；特开平56-048890号公报)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11796(参照FERMP-6402；特开平58-158192号公报)

L-苯丙氨酸生产菌

L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物缺损的大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)(国际公开03/044191号)，携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利第5,354,672号)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)、大肠杆菌NRRLB-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146以及NRRL B-12147(美国专利第4,407,952号)等。此外，也可以使用携带编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)以及命名为AJ 12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作为亲本株(EP 488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性增加的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473号以及2003/0157667、国际公开03/044192号)。

作为属于棒状杆菌型细菌的苯丙氨酸生产菌，可以使用：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性减弱的谷氨酸棒状杆菌BPS-13株(FERMBP-1777)，K77(FERM BP-2062)和K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报331145号，特开平02-303495)，酪氨酸营养缺陷株(特开平05049489)等。

此外，对于苯丙氨酸生产菌，通过进行使得将副产物摄入细胞内的修饰，例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸摄取基因tyrP的表达量，也可以获得高效地生产L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。

L-色氨酸生产菌

L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株：大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473和2003/0157667)。

作为L-色氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(aroA，5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1种或2种以上酶的活性增强的菌株。预苯酸脱水酶和分支酸变位酶以双功能酶(分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(CM/PDH))的形式被pheA基因编码。所述酶之中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株(国际公开94/08031)，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。

L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-马来酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(国际公开2005/103275)。

作为棒状杆菌型细菌，可以使用下列菌株：磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒杆菌AJ12118(FERM BP-478，特许01681002号)、导入了色氨酸操纵子的棒状杆菌型细菌(特开昭63240794号公报)，导入了编码棒状杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因的棒状杆菌型细菌(特开01994749号公报)。

L-脯氨酸生产菌

作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，可以列举ilvA基因缺损、且能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(欧洲专利公开公报1,172,433号)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。

本发明中使用的细菌，可以通过增加一种以上参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达来进行改良。作为L-脯氨酸生产菌所优选的基因的例子，可以列举编码解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。而且，本发明中使用的细菌可以通过增加一种以上编码从细菌细胞中分泌L-氨基酸的蛋白质的基因的表达来进行改良。作为这样的基因，可以列举b2682基因和b2683基因(ygaZH基因)(欧洲专利公开公报1,239,041号)。

作为具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的例子，可以列举：NRRL B-12403以及NRRL B-12404(英国专利第2075056号)、VKPM B-8012(俄罗斯专利申请2000124295)、德国专利第3127361号所述的质粒突变体、Bloom F.R等(The 15th Miami winter symposium，1983，p.34)所述的质粒突变体等大肠杆菌株。

L-精氨酸生产菌

L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公开2002/058315)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请2,001,112,869)，大肠杆菌382菌株(VKPMB-7926)(欧洲专利公开公报1,170,358号)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生产株(欧洲专利公开公报1,170,361号)，等等。

L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括编码L-精氨酸生物合成系统酶的1种以上基因的表达增加的菌株。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。

L-缬氨酸生产菌

L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。优选将衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。

L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970已于1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1 Dorozhny Proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号为VKPM B-4411。

此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺乏H+-ATP酶的突变株(国际公开96/06926)作为亲本株。

作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，包括例如通过修饰而增强了编码L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成相关酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合酶、由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(国际公开00/50624)。此外，由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(transcriptional regulation)，所以最好解除弱化作用，以解除由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。

作为具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以通过降低或者缺损至少一种与减少L-缬氨酸产生的物质代谢途径相关的酶的活性来进行。例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(国际公开WO0050624)。

其它赋予L-缬氨酸生产能力的方法还包括例如赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。

例如，可以列举L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷性的、并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力的突变菌株(FERM P-1841，FERM P-29，特公昭53-025034)，对聚酮类有抗性的突变菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；特公平06-065314)，在以乙酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟代丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变菌株(FERMBP-3006，BP-3007，特许3006929号)。

L-异亮氨酸生产菌

L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase)等)的基因转化的重组菌株作为亲本株(特开平2-458号，FR 0356739，和美国专利第5,998,178号)。

属于棒状杆菌型细菌的L-异亮氨酸生产菌的例子包括：扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而被赋予了L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭62-195293)、α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。

L-甲硫氨酸生产菌

L-甲硫氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于L-苏氨酸营养缺陷株、对正亮氨酸有抗性的突变株(特开2000-139471号)。而且，还可以使用缺损了甲硫氨酸阻遏物的菌株、用编码高丝氨酸转琥珀酰酶、胱硫醚γ-合酶等L-甲硫氨酸生物合成相关蛋白质的基因转化过的重组菌株作为亲本株(特开2000-139471号)。

在通过基因重组来培育上述L-氨基酸生产菌时，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不损害所编码的蛋白质的功能的前提下，还可以使用该基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因。即，还可以是下述基因，所述基因编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或数个位置上的一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白质。

这里，所谓“一个或数个”，虽然因氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而异，但具体地是指优选1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个。作为保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。保守突变的代表是保守取代，作为可视作保守取代的取代，具体地可以列举：从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于基因所来源的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因例如可以这样获得：采用定点突变法对公知基因的碱基序列进行修饰，使得被编码的蛋白质的特定部位处的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或增加。

而且，具有如上所述的保守突变的基因还可以是编码下述蛋白质的基因：就编码的氨基酸序列全长而言，具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性，且具有与野生型蛋白质等同的功能。

此外，可以将基因序列中各自的密码子取代为易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。

具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等常规突变处理中使用的方法来获得。

此外，基因还可以是下述DNA，所述DNA与公知基因序列的互补序列或可由所述互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有与公知基因产物等同的功能的蛋白质。这里，“严格条件”，是指形成所谓特异性杂交体，但不形成非特异性杂交体的条件。举例说明：在具有高同源性的DNA之间、例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性低于上述的DNA之间则不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度、温度下，洗涤1次更优选2～3次的条件。

作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这种探针可以通过PCR制备，其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡核苷酸为引物，以包含这些碱基序列的DNA片段为模板来进行。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1％SDS。

上述的关于基因同源物以及保守突变的说明，同样适用于前述的脂肪酶基因。

<3>L-氨基酸的生产方法

本发明的L-氨基酸生产方法，是以通过培养基培养微型藻类，通过将该培养物在中温处理，制备促进具有L-氨基酸生产能力的细菌产生和蓄积L-氨基酸的该微型藻类的处理产物，将该细菌在包含该微型藻类的处理产物的培养基中培养，在培养物中产生并蓄积L-氨基酸，从该培养物收集L-氨基酸为特征的生产方法。由于上述处理产物，如前所述，是在中温处理微型藻类的培养物的反应液，或将其进一步提取或分级和/或施以其他处理所得的产物，因此认为其包括通过微型藻类产生的有机物在中温反应所生成的有机物或该有机物进一步通过其他处理转变成的有机物。

优选包含上述处理产物(下文中亦称为“中温处理产物”)作为碳源，在此情况下特别优选包含脂肪酸、葡萄糖和甘油等作为碳源。

前述“作为碳源”是指可在细菌增殖和L-氨基酸生产中，作为细胞成分和构成L-氨基酸的碳源的供给源有实质性贡献。只要与未加入中温处理产物的培养基相比，在用添加了该处理产物的培养基培养时，细菌的生长或L-氨基酸的产生和蓄积良好的话，则认为中温处理产物为碳源。而且，培养基可仅使用中温处理产物作为碳源，亦可包含其他碳源。

本发明的方法可以采用分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batchculture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方法，培养基中的中温处理产物可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中，或者包含于这两者中。

流加培养是指下述培养方法：将培养基连续地或间歇地添加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，连续培养指下述培养方法：连续地或间歇地将培养基流加至培养容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，与所流加的培养基等量)。此外，“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，在流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基(培养开始时的培养基)；“流加培养基”的意思是在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。此外，分批培养(batch culture)是指：每批一次准备新的培养基，将菌株接种到其中，并且直至收获都不加入培养基。

所使用的中温处理产物，可以使用任何浓度，只要该浓度适于L-氨基酸生产即可。用中温处理产物的成分的浓度表示时，例如可以是如下浓度。所含的作为淀粉糖化物的葡萄糖浓度是优选0.05w/v％～50w/v％左右、更优选0.1w/v％～40w/v％左右、特别优选0.2w/v％～20w/v％左右。所含的作为油脂水解物的甘油以及脂肪酸的量理想的是0.01～10w/v％、优选0.02～5w/v％、更优选0.05～2w/v％左右。中温处理产物可以单独使用，也可以与葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等其它碳源组合使用。这种情况下，中温处理产物与其它碳源可以以任意比例混合，但理想的是，碳源中的由微型藻类生产的有机物的比率为10重量％以上、更优选50重量％以上、更优选70重量％。优选的其它碳源是，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物、生物质水解而得到的糖液等糖类、乙醇、甘油等醇类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。

而且，在本发明中，可以在培养的全部步骤中均包含中温处理产物，也可以仅将其添加在流加培养基或者初始培养基中，而如果其它碳源充足的话，还可以存在一定时间的油脂水解物不足的时期。“暂时性地”可以是指例如全部发酵时间中的10％以内或20％以内、最大30％以内的时间里中温处理产物不足。像这样中温处理产物的浓度有时暂时性地变为0、但存在利用包含中温处理产物的培养基进行培养的期间的情形，包含在如上述的本发明的“培养基包含中温处理产物作为碳源”的表述中。

所使用的培养基中除了包含中温处理产物以外，可以使用在利用微生物进行的L-氨基酸发酵生产中传统上一直使用的培养基。即，可以使用除了碳源以外、还包含氮源、无机离子以及视需要的其它有机成分的常规培养基。这里，作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵、尿素等无机铵盐或硝酸盐，大豆水解物等有机氮，氨气、氨水等。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中可以仅包含所述氮源中的1种，也可以包含2种以上。所述氮源可以在初始培养基中使用，也可以在流加培养基中使用。此外，初始培养基、流加培养基可以使用相同的氮源，也可以在流加培养基中使用与初始培养基不同的氮源。

本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源、硫源。作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸多聚物如焦磷酸，等等。此外，作为硫源，只要包含硫原子即可，优选硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，这其中优选硫酸铵。

此外，培养基上述成分之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括微量金属、氨基酸、维生素、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解物等。作为微量金属，可以列举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以列举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。

此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选在培养基中添补所需求的营养素。特别是，对于可在本发明中使用的L-赖氨酸生产菌而言，大多如后述地强化了L-赖氨酸生物合成途径，而弱化了L-赖氨酸分解能力，因此，优选添加选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。此外，初始培养基与流加培养基的硫浓度可以相同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。

而且，本发明中使用的培养基只要是包含碳源、氮源以及视需要而定的其它成分的培养基即可，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。

中温处理产物中除了包含碳源以外，还包含可用于氨基酸的成分。与常规的培养基相比，本发明中使用的培养基，视需要可以减少氮源以及其它成分。

培养优选在需氧条件下实施1～7天，培养温度为20℃～45℃、优选24℃～45℃、特别优选33～42℃。培养优选为通气培养，优选进行调节使得氧浓度为饱和浓度的5～50％、理想的是10％左右。此外，培养中的pH优选为5～9。而且，为了调整pH，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质，例如碳酸钙、氨气、氨水等。

在如上所述的条件下，通过培养优选10小时～120小时左右，培养液中可以蓄积显著量的L-氨基酸。蓄积的L-氨基酸的浓度只要是能够从培养基或菌体收集、回收的浓度即可，优选为1g/L以上、更优选50g/L以上、更优选100g/L以上。

此外，在生产L-赖氨酸等碱性氨基酸时，可以采用下述方法来进行生产，所述方法中采用下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸：进行控制使得培养中的pH为6.5～9.0、而培养结束时的培养基的pH为7.2～9.0，并且控制发酵中发酵罐内压力为正，或者，向培养基中供给二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/L或20mM以上的培养期，并且以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的反荷离子(特开2002-65287、US2002-0025564A EP1813677A)。

此外，在L-谷氨酸发酵中，还可以使用已调整至能够使L-谷氨酸析出的条件的液体培养基，使进行培养的同时L-谷氨酸在培养基中析出。作为L-谷氨酸析出的条件，可以例举pH5.0～4.0、优选pH4.5～4.0、更优选pH4.3～4.0、特别优选pH4.0(欧洲专利申请公开第1078989号说明书)。

就从培养液回收L-氨基酸而言，可以组合常规的离子交换树脂法、沉淀法以及其它公知方法来实施。而且，当L-氨基酸在菌体内蓄积时，例如可以利用超声波等破碎菌体，并通过离心分离除去菌体，采用离子交换树脂法等从所得上清中回收L-氨基酸。回收的L-氨基酸可以是游离态的L-氨基酸，也可以是盐，包括硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。

此外，本发明中收集到的L-氨基酸除了包含目的L-氨基酸以外，还可以包含微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物。所收集的L-氨基酸的纯度为50％以上、优选85％以上、特别优选95％以上(US5,431,933，JP1214636B，US4,956,471，US4,777,051，US4946654，US5,840358，US6,238,714，US2005/0025878)。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。本实施例中使用了从得克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas at Austin，The CultureCollection of Algae(UTEX)，1 University Station A6700，Austin，TX 78712-0183，USA)获得的Chlorella kessleri 11h株(UTEX 263)、富油新绿藻UTEX 1185株和Nannochloris sp.UTEX LB 1999株。

<实施例1>微型藻类Chlorella kessleri 11h株的培养

将Chlorella kessleri 11h株在装有100mL的0.2×Gamborg氏B5培养基(日本制药)的500mL容量三角烧瓶中，以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造的培养装置CL-301)的条件振荡培养7天，以此为前培养液。在装有0.2×Gamborg氏B5培养基1.5L的5L容量微型发酵罐(石川制作所制)中添加前培养液30mL，在培养温度30℃、光强度20,000lux，并以500mL/min通入3％CO₂浓度的空气·CO₂混合气体培养14天。此外，光源使用来自荧光灯的白色光。

(0.2×Gamborg氏B5培养基)

120℃15分钟高压蒸汽灭菌

<实施例2>通过中温处理分解来自藻类的油脂和脂肪

将用实施例1中记载的方法培养的相当于9L培养液的藻体通过离心分离而沉淀之后，在-80℃储藏24小时。向沉淀再次加入1L的培养上清，将其中2ml置于试管内，在50℃以150rpm温育18小时。此时，亦设置添加10单位淀粉葡糖苷酶(Sigma Aldrich，A-9228)的处理区。将这些样品通过离心分离而沉淀，在将沉淀与上清分离之后，测定其各自包含的各有机物的量。该测定的结果示于表1。与未经处理相比，中温处理不但减少了油脂和淀粉的量，还增加了其分解产物即脂肪酸和甘油或者葡萄糖的量。此外，脂肪酸局限于沉淀物中，而葡萄糖和甘油释放于上清中。此外，通过在中温处理过程中进行淀粉葡糖苷酶处理，增加了葡萄糖的产生量。

表1

<实施例3>制备来自藻体的脂肪酸

将用实施例1中记载的方法培养的相当于培养液9L的藻体通过离心分离而沉淀之后，在-80℃储藏24小时。向该沉淀物再次加入500mL的培养上清，将其中250ml置于500mL容量的微型发酵罐(ABLE公司)中，在50℃以100rpm温育18小时。将获得的样品通过离心分离而沉淀，将该沉淀悬浮于40mL的超纯水。对于该悬液12.5ml，添加12.5ml的超纯水与25ml 0.2N NaOH之后，在95℃搅拌3小时。将获得的脂肪酸提取液用滤纸过滤。测定该提取液的脂肪酸浓度，并分别作为氨基酸发酵的碳源使用。

<实施例4>用藻类来源的脂肪酸作为碳源的L-赖氨酸产生培养

<4-1>fadR缺损的大肠杆菌生产菌的构建

调节大肠杆菌脂肪酸代谢的转录因子FadR是由fadR基因(SEQ ID NO：15)编码的(DiRusso，C.C.等1992.J.Biol.Chem.267：8685-8691)。作为用于破坏该基因的亲本株，使用国际专利公开WO2006/078039中记载的WC196ΔcadAΔldcC株作为大肠杆菌赖氨酸生产株。

编码调节脂肪酸代谢的转录因子fadR基因的缺失是通过由Datsenko和Wanner最早开发的称为Red驱动整合(Red-driven integration)的方法(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)和来自λ噬菌体的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.和Gardner，J.F.2002.J.Bacteriol.184：5200-5203)进行的。根据Red驱动的整合，将作为目标的基因的一部分设计在合成寡核苷酸的5’侧，而将抗生素抗性基因的一部分设计在合成寡核苷酸的3’侧，使用将该寡核苷酸作为引物所得的PCR产物，可一步构建出基因破坏的菌株。通过进一步与来自λ噬菌体的切出系统组合，可去除基因破坏的菌株中组入的抗生素抗性基因(特开2005-058227、WO2005/010175)。

作为PCR模板，使用质粒pMW118-attL-kan-attR(特开2005-058227、WO2005/010175)。pMW118-attL-kan-attR是在pMW118(宝生物公司)中插入噬菌体附着位点attL和attR基因，以及作为抗生素抗性基因的kan基因的质粒，插入顺序是attL-kan-attR。

使用在引物3’端具有对应于该attL和attR的两侧的序列，在引物5’端具有对应于作为目标基因的fadR基因的一部分的SEQ ID NO：16和17所示的寡核苷酸作为引物进行PCR。

将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，通过电穿孔导入包含具有温度敏感性复制能力的质粒pKD46的大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC株。质粒pKD46(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)包含λ噬菌体的总计2154个碱基的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459，31088～33241)，其包含编码受阿拉伯糖诱导性ParaB启动子调控的λRed同源重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物重组入WC196ΔcadAΔldcC株的染色体而言是必要的。

如下所述制备供电穿孔的感受态细胞。即，将包含100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中在30℃培养过夜的大肠杆菌WC196株，用包含氨苄青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL的LB培养基稀释100倍。通过使所得的稀释物在30℃通气下生长至OD600为约0.6，之后浓缩100倍，用10％甘油洗涤3次而使其可用于电穿孔。电穿孔使用70μL的感受态细胞和约100ng的PCR产物进行。电穿孔之后的细胞在添加SOC培养基(Sambrook，J.和Russell，D.W.2001.Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)在37℃培养1小时之后，在37℃在包含Km(卡那霉素)(40mg/L)的LB琼脂培养基上进行平板培养，选择Km抗性重组体。接着，为了去除pKD46质粒，在包含Km的LB琼脂培养基上，在42℃进行两次传代，测试所得的菌落的氨苄青霉素抗性，获得消除pKD46的氨苄青霉素敏感性株。

通过PCR确认可通过卡那霉素抗性基因鉴定的fadR基因的缺失。所得的fadR缺失株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan株。

接着，为了去除在fadR基因内导入的att-kan基因，使用上述的pMW-intxis-ts(特开2005-058227、WO2005/010175)作为辅助质粒(helperplasmid)。pMW-intxis-ts为携带编码λ噬菌体的整合酶(Int)的基因和编码切除酶(excisionase)(Xis)的基因，并具有温度敏感性复制能力的质粒。

遵循常规方法制备通过上述所得的WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan的感受态细胞，通过辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在30℃在包含100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行平板培养，选择氨苄青霉素抗性株。

然后，为了去除pMW-intxis-ts质粒，在LB琼脂培养基上在42℃进行两次传代，测试所得的菌落的氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性，获得卡那霉素和氨苄青霉素敏感性株，其为消除att-kan和pMW-intxis-ts的fadR破坏菌株。该株命名为WC196ΔcadAΔldcCΔfadR株。

遵循常规方法将WC196ΔcadAΔldcCΔfadR株用携带dapA、dapB、lysC和ddh基因的赖氨酸生产质粒pCABD2(WO95/16042)转化，获得WC196ΔcadAΔldcCΔfadR/pCABD2株。

将通过上述制备的株用包含25mg/L链霉素的LB培养基在37℃培养至OD600为约0.6之后，向培养液加入等量的40％甘油溶液，进行搅拌，然后以适当体积分装，储藏于-80℃，作为甘油储液(glycerol stock)。

<4-2>使用大肠杆菌L-赖氨酸生产菌将藻类来源的脂肪酸作为碳源进行的L-赖氨酸的生产培养。

使用上述<4-1>中构建的大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcCΔfadR/pCABD2(该菌株称为“WC196LCR/pCABD2”)作为L-赖氨酸生产菌。将大肠杆菌WC196LCR/pCABD2株的甘油储液融解，以100μL分别均匀地涂布于包含25mg/L链霉素的L平板，并在37℃培养20小时。将获得的平板上大约1/8量的细胞接种于坂口烧瓶中包含25mg/L链霉素的下述记载的20ml发酵培养基，用往复振荡培养装置在37℃培养48小时。对于作为碳源的藻类来源的样品，向藻类来源的脂肪酸提取液添加Tween 80至1％浓度，在搅拌之后，用1N HCl将pH调整至7.0，在120℃进行20分钟高压蒸汽灭菌后作为碳源溶液使用。培养中使用的培养基组成如下所示。

[埃希氏菌属细菌L-赖氨酸产生培养基]

用KOH调整至pH 7.0，在110℃进行10分钟高压蒸汽灭菌。需要说明的是，碳源、MgSO₄·7H₂O、PIPES缓冲液(pH 7.0)是分别另行灭菌之后进行混合的。

在24小时之后，通过Biotech Analyzer AS310(Sakura Seiki)测定培养上清的L-赖氨酸的量。在主培养基中的生长程度通过对活菌数进行计数来确定。重复两次的培养的结果的平均值示于表2。确认了从藻类来源的氨基酸可获得良好的L-赖氨酸的生产，其具有比通过试剂级油酸获得的L-赖氨酸的蓄积量更优异的结果。

表2

<实施例5>微型藻类Chlorella kessleri 11h株的培养

将Chlorella kessleri 11h株在装有100mL的0.2×Gamborg氏B5培养基(日本制药)的500mL容量三角烧瓶中，以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造的培养装置CL-301)的条件振荡培养7天，以此为前培养液。而且，光源使用的是来自荧光灯的白色光。在装有0.2×Gamborg氏B5培养基300mL的500mL容量培养基瓶中添加前培养液6mL，在培养温度30℃、光强度7,000lux，并以250mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件下，培养12天。

(0.2×Gamborg氏B5培养基)

120℃15分钟高压蒸汽灭菌

<实施例6>藻类中温处理的温度条件

将在实施例5中获得的培养液125ml置于500mL容量的发酵罐(ABLE公司)，以150rpm在各温度下培养18小时。将获得的各样品离心分离，测量所得的沉淀物中的脂肪酸量。其测定结果示于图1。与未处理相比，在40℃处理脂肪酸量增加，在45℃处理该量显著增加。

<实施例7>微型藻类Nannochloris sp.的培养

将Nannochloris sp.UTEX LB 1999株在装有10mL的Daigo IMK培养基(日本制药株式会社)的50mL容量三角烧瓶中以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造培养装置CL-301)的条件振荡培养8天。而且，光源使用来自荧光灯的白色光。作为Daigo IMK培养基的海水成分，使用人工海水Daigo人工海水SP(日本制药株式会社)。

(Daigo IMK培养基)

用1N NaOH调整至pH 8.0之后，在120℃进行10分钟高压蒸汽灭菌。

<实施例8>Nannochloris sp.的中温处理

将培养液0.5ml置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，并在50℃以1000rpm的条件温育20小时。将各样品离心分离，测定所得的沉淀中的脂肪酸量。其结果示于图2。与未处理相比，在50℃处理脂肪酸量显著增加，因此，确认了在Nannochloris sp.中亦可通过中温处理生成脂肪酸。

<实施例9>微型藻类Chlorella kessleri 11h株的培养

将Chlorella kessleri 11h株在装有300mL的0.2×Gamborg氏B5培养基(日本制药)的500mL容量三角烧瓶中，以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造的培养装置CL-301)，以250mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件下培养7天，以此为前培养液。而且，光源使用的是来自荧光灯的白色光。在装有0.2×Gamborg氏B5培养基300mL的500mL容量培养基瓶中添加前培养液6mL，在培养温度30℃、光强度7,000lux，并以250mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件下，培养12天。

(0.2×Ganborg氏B5培养基)

120℃15分钟高压蒸汽灭菌

<实施例10>藻类中温处理的各温度下的经时变化

将实施例9所得的培养液的pH用1N的HCl溶液调整至4.5，之后将1ml置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，以1000rpm在各温度下温育不同时间。将获得的各样品离心分离，测定所得的沉淀中的脂肪酸量。其测定结果示于图3。而且，相对脂肪酸生成率是以从未处理的藻体用有机溶剂提取的油脂完全分解时所生成的脂肪酸量作为100。在55℃或更高的温度，在第1小时脂肪酸量增加，在50℃至52℃的温度，在第4小时至第6小时脂肪酸量显著增加。

<实施例11>脂肪酸提取碱处理的pH条件

将从实施例9中获得的培养液离心分离，向沉淀添加培养上清，制备20倍浓缩液。将该浓缩液的pH用1N HCl调整至4.5，将1ml置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在52℃以1000rpm温育14小时。向所得的样品中添加3N NaOH，调整至不同pH，在90℃以1000rpm提取3小时，对这些样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图4。而且，相对脂肪酸生成率是以从未处理的藻体用有机溶剂提取的油脂完全分解时所生成的脂肪酸量作为100。在pH 10.5，提取出了部分脂肪酸，在pH 11.5，脂肪酸提取量增加，而在pH 12.5，该量显著增加。

<实施例12>脂肪酸提取碱处理的温度条件

将从实施例9中获得的培养液离心分离，向沉淀添加培养上清，制备20倍浓缩液。将该浓缩液的pH用1N HCl调整至4.5，将1ml置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在52℃以1000rpm温育14小时。向所得的样品中添加3N NaOH，调整至pH 12.5之后，在不同温度以1000rpm提取3小时，对这些样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图5。而且，相对脂肪酸生成率是以从未处理的藻体用有机溶剂提取的油脂完全分解时所生成的脂肪酸量作为100。在60℃，确认提取了脂肪酸，随着温度的上升，脂肪酸量增加，在90℃该量增加到最多

<实施例13>脂肪酸提取碱处理的时间

将从实施例9中获得的培养液离心分离，向沉淀添加培养上清，制备20倍浓缩液。将该浓缩液的pH用1N HCl调整至4.5，将1ml置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在52℃以1000rpm温育14小时。向所得的样品中添加3N NaOH，调整至pH 12.5之后，在90℃以1000rpm提取不同时间，对这些样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图6。而且，相对脂肪酸回收率是以从未处理的藻体用有机溶剂提取的油脂完全分解时所生成的脂肪酸量作为100。脂肪酸量在30分钟时增加，在60分钟、90分钟随着时间推移该量显著增加。此外，在120分钟之后，脂肪酸量并不继续增加。

<实施例14>微型藻类Chlorella kessleri 11h株的培养

将Chlorella kessleri 11h株在装有400mL的0.2×Gamborg氏B5培养基(日本制药)的500mL容量三角烧瓶中，以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造的培养装置CL-301)和以250mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件培养7天，以此为前培养液。而且，光源使用的是来自荧光灯的白色光。在装有0.2×Gamborg氏B5培养基400mL的500mL容量培养基瓶中添加前培养液8mL，在培养温度30℃、光强度7,000lux，并以250mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件下，培养12天。

(0.2×Gamborg’s B5培养基)

120℃15分钟高压蒸汽灭菌

<实施例15>藻类的二阶段中温处理中第一段处理温度条件的考察

将从实施例14中获得的培养液离心分离，向沉淀添加灭菌水，制备40倍浓缩液。将该浓缩液的pH用3N HCl调整至4.5，将500μl置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在50℃、52℃、55℃、57℃和60℃的不同温度静置预温育5分钟。接着，将各样品以与上述相同的温度以1000rpm温育30分钟之后，将样品在42℃以1000rpm温育4小时30分钟或9小时30分钟，进行油脂的水解。将获得的样品离心分离，对这些样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图7。与52℃的连续处理相比较，虽然在50℃和52℃，经30分钟的诱导之后，在42℃进行4小时30分钟几乎未确认到脂肪酸的生成，但是在42℃进行9小时30分钟之后，确认脂肪酸生成量多于在52℃的连续处理。此外从在55℃或更高温度进行30分钟的诱导处理之后，在42℃进行的4小时30分钟处理确认了脂肪酸的生成，随着这些诱导温度的下降，脂肪酸生成量增加。

<实施例16>藻类的二阶段中温处理中，第一段处理时间和第二段处理时间的考察

将从实施例14中获得的培养液离心分离，向沉淀添加灭菌水，制备40倍浓缩液。将该浓缩液的pH用3N HCl调整至4.5，将600μl置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在55℃静置预温育5分钟。接着，将各样品在55℃以1000rpm温育30分钟之后，将样品在42℃以1000rpm温育不同时间，进行油脂的水解。将获得的样品离心分离，对这些样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图8。在55℃的诱导温度进行10分钟和20分钟的情况下，分别在第4小时和第6小时增加了脂肪酸生成量。另一方面，在55℃的诱导温度进行30分钟的情况下，则从2小时开始脂肪酸生成量增加，之后在第8小时脂肪酸生成量增加至最大。

<实施例7>微型藻类Chlorella kessleri 11h株的培养

将Chlorella kessleri 11h株在装有800mL的0.2×Gamborg氏B5培养基(日本制药)的1000mL容量三角烧瓶中，以30℃、光强度7,000lux(TOMY公司制造的培养装置CL-301)和以400mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件培养7天，以此为前培养液。而且，光源使用的是来自荧光灯的白色光。在装有0.2×Gamborg氏B5培养基800mL的1000mL容量培养基瓶中添加前培养液16mL，在培养温度30℃、光强度7,000lux，并以400mL/min通入空气与3％CO₂的混合气体的条件下，培养14天。

(0.2×Gamborg氏B5培养基)

120℃15分钟高压蒸汽灭菌

<实施例18>对脂肪酸提取所用的有机溶剂的检查

将从实施例17中获得的培养液离心分离，向沉淀添加灭菌水，制备40倍浓缩液。将该浓缩液的pH用3N HCl调整至4.5，将600μl置于1.5ml容量的Eppendorf试管中，在55℃静置预温育5分钟，在相同温度以1000rpm温育30分钟之后，在42℃以1000rpm进行12小时的油脂水解。对获得的样品250μl进行离心，向将其沉淀在65℃用离心蒸发器干燥50分钟所得的样品或未经干燥处理的样品分别加入不同溶剂500μl。将这些样品在45℃以1000rpm提取30分钟，对各样品中的脂肪酸量进行测定。这些测定结果示于图9。需要说明的是，脂肪酸提取效率是以下述脂肪酸量作为100的相对值：将中温处理液25μl离心，将其沉淀悬于200μl的1％NaCl水溶液中，并置于分别添加了400μl的甲醇和氯仿的珠式细胞粉碎管中所提取的脂肪酸量。当未经干燥处理的样品用甲醇、乙醇、丙酮和丁醇提取时，具有较高脂肪酸提取效率，相反，在干燥之后用各溶剂提取时，其提取效率降低。此外，对于乙酸乙酯，干燥样品及未处理样品提取效率均降低。

Claims

1.一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括：

(a)通过在培养基中培养微型藻类并在40℃-70℃的中温处理该培养物，制备可促进具有L-氨基酸产生能力的细菌的L-氨基酸产生和蓄积的该微型藻类的处理产物，

(c)从培养物收集L-氨基酸，

其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)，且

其中所述处理产物是：

通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀，并包含脂肪酸；或

通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀离心而获得的上清，并包含葡萄糖或甘油；或

通过对在中温进行了处理的产物用碱或有机溶剂处理以提取脂肪酸而获得的提取物。

2.权利要求1的方法，其中在中温处理的温度为45℃或更高。

3.权利要求1的方法，其中在中温处理的温度为60℃或更低。

4.权利要求1的方法，其中所述处理产物是通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀，并包含脂肪酸。

5.权利要求1的方法，其中所述处理产物是通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的上清，并包含葡萄糖或甘油。

6.权利要求1的方法，其中所述处理产物是通过对在中温进行了处理的产物用碱或有机溶剂处理以提取脂肪酸而获得的提取物。

7.权利要求4的方法，其中对通过将在中温进行了处理的产物离心而获得的沉淀物用碱或有机溶剂进行处理。

8.权利要求6的方法，其中用碱的处理是在10.5或更高的pH进行。

9.权利要求8的方法，其中用碱的处理是在60℃或更高温度进行。

10.权利要求6的方法，其中用有机溶剂的处理是用甲醇、乙醇、丙酮、2-丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、氯仿、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲醚、乙醚或己烷进行的。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中在中温进行处理的过程中降低温度。

12.权利要求1至10任一项的方法，其中所述微型藻类是属于绿藻门(Chlorophyta)或不等鞭毛门(Heterokontophyta)的藻类。

13.权利要求12的方法，其中所述微型藻类是属于绿藻纲(Chlorophyceae)、四胞藻纲(Trebouxiophyceae)或硅藻纲(Bacillariophyceae)的藻类。

14.权利要求13的方法，其中所述微型藻类属于小球藻属(chlorella)、新绿藻属(Neochloris)、微球藻属(Nannochloris)或海链藻属(Thalassiosira)。