KR101540252B1 - 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조 방법은 동결건조된 미생물 배양액을 이용하여 식물성 오일로부터 높은 추출효율로 하이드록시 지방산을 얻을 수 있고, 용매 사용량을 저감할 수 있어 지방산 생산비용 절감 및 환경오염 방지에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법{Method for producing hydroxy fatty acid from vegetable oil using lyophilized microorganism culture medium}

본 발명은 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

하이드록시 지방산(Hydroxy fatty acid, HFA)은 일반 지방산의 중심사슬에 1개 이상의 하이드록실기를 갖고 있는 형태로 자연계에서 주로 식물체에서 극미량으로 발견되고 있다. 상기 하이드록시 지방산은 지방산 사슬에 추가적으로 붙어 있는 하이드록실기에 의해 지방산으로 하여금 높은 점성이나 반응성 등 특이한 성질을 갖도록 만들어 준다(Chemical and Biological conversion of soybean oil for industrial products, in Fats for the Future, edited by R.C. Cambie, Ellis Horwood Ltd Press, Chichester, pp:301-317). HFA는 연결되어 있는 하이드록시기의 수에 따라 모노-, 디-, 트리-하이드록시 지방산으로 분류되며, 하이드록시기 외에 별도의 구조를 포함하는 에폭시 하이드록시 지방산(epoxy-hydroxy fatty acid) 또는 옥소하이드록시 지방산(oxo-hydroxy fatty acid) 등도 포함할 수 있다.

HFA가 갖는 특이한 성질로 인해 이들은 다양한 생리활성기능을 가질 수 있으며, 그 결과 신농약, 신의약, 고기능성 레진 및 섬유소재, 생분해성 플라스틱 소재, 윤활제, 화장품, 페인트 등 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 응용될 수 있다. 이같이 하이드록시 지방산의 여러 기능성이 알려져 있으나, 자연계에 존재하는 하이드록시 지방산은 식물체 내에 미량으로만 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미생물을 이용하여 하이드록시 지방산을 생산하려는 연구가 시도되었다. 이의 예로, Flavobacterium sp DS5는 올레산(oleic acid)으로부터 10-하이드록시-옥타데카디에노익 산(10-hydroxy-octadecadienoic acid)을 생산할 수 있으며(Hou, C.T., J. Am. Oil. Chem. Soc. 1994, 71:975-978), Pseudomonas aeruginosa PR3는 넓은 범위의 기질을 사용하여 모노-, 디-, 트리-하이드록시 지방산을 생산할 수 있음이 알려져 있다(Kim, H. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 1999, 77, 95-99; Hou, C. T. et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 1991, 68, 99-101; Hou, C. T. et al., J. Ind. Microbiol. 1991, 7, 123-130; Kim, H. et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2000, 25, 109-115).

한편, HFA 중 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, DOD)은 올레산이나 식물성 기름으로부터 미생물에 의해 쉽게 생산된다(Hou, C. T. et al., J. Ind. Microbiol. 1991, 7, 123-130; Min-Jung Suh et al., Applied Micrbiology and Biotechnology 2011, 89:1721-1727). 또한 최근의 보고에 의하면, DOD가 다양한 병원성 세균에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Hye-Ran Sohn, et al., Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2013, 2: 85-87).

일반적으로 미생물을 이용하여 식물성 오일로부터 생산된 하이드록시 지방산은 미생물 배양액 중에 산재해 있으며, 이를 회수하기 위해 유기용매를 이용하여 추출하게 된다. 이때 사용되는 유기용매의 양은 미생물 배양액과 동량으로 사용되며 2회에 걸쳐 추출되므로 결과적으로 미생물 배양액의 2배에 해당하는 유기용매를 필요로 하게 된다(Hou, C. T. et al., J. Ind. Microbiol. 1991, 7, 123-130; Min-Jung Suh et al., Appl. Micrbiol. Biotechnol. 2011, 89:1721-1727). 이처럼 하이드록시 지방산 생산과정 중의 유기용매의 대량 사용은 하이드록시 지방산 생산원가를 높이는 요인이 되고 있으며, 사용된 용매의 처리과정에서 대기환경을 오염시킬 수 있는 원인이 되고 있다. 따라서 미생물 발효기술을 이용한 하이드록시 지방산 생산과정 중 유기용매의 사용량을 획기적으로 감소시킬 수 있는 기술이 개발된다면 하이드록시 지방산 생산비용 절감과 환경오염 방지를 위해 매우 유용하리라 판단된다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명의 발명자들은 미생물 균주 슈도모나스 에어루지노사 PR3(Pseudomonas aeruginosa PR3)를 이용하여 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 생산하는 공정에서 유기용매 사용량을 줄이고, 하이드록시 지방산 회수효율을 높이기 위하여 노력한 결과, 슈도모나스 에어루지노사 PR3 배양액을 동결건조할 경우, 유기용매 사용량을 감소시킬 수 있고, 하이드록시 지방산 회수효율을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

이러한 본 발명의 목적은 하이드록시 지방산 회수효율을 높이고 추출용매의 사용량을 현저히 감소시킬 수 있는 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물성 오일이 첨가된 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 농축하고 동결건조한 다음, 상기 동결건조된 미생물 배양액으로부터 하이드록시 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제조방법은, 동결건조된 미생물 배양액을 이용하여 식물성 오일로부터 높은 추출효율로 하이드록시 지방산을 얻을 수 있고, 용매 사용량을 저감할 수 있어 지방산 생산비용 절감 및 환경오염 방지에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 슈도모나스 에어루지노사 PR3 배양액에 올리브 오일을 첨가하여 3일간 배양하여 생산된 배양액과 이 배양액의 동결건조물을 비교한 도이다.
도 2는 물 사용량 및 용매 사용량에 따른 슈도모나스 에어루지노사 PR3 배양액의 동결건조물의 추출물 양의 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 방법을 이용한 추출물의 양과 기존의 추출방법을 이용하여 추출한 추출물의 양을 비교한 도이다.
도 4는 본 발명의 방법을 이용한 추출물과 기존의 추출방법을 이용한 추출물의 성분을 박층크로마토그래피로 비교한 도이다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용한 경우와 기존의 추출방법을 이용한 경우, 사용된 용매의 량을 비교한 도이다.

본 발명은

1)슈도모나스 에어루지노사를 1차 배양하고, 상기 슈도모나스 에어루지노사의 1차 배양액에 식물성 오일을 첨가한 후 2차 배양하여 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 얻는 단계;

2)상기 1)단계에서 얻은 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 농축하는 단계;

3)상기 2)단계에서 얻은 슈도모나스 에어루지노사 배양액의 농축액을 동결건조하는 단계; 및

4)상기 2)단계에서 얻은 동결건조된 슈도모나스 에어루지노사 배양액에서 하이드록시 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는, 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명에서 설명하는 미생물 배양액은 슈도모나스 에어루지노사를 1차 배양하여 얻어진 1차 배양액에 식물성 오일을 첨가한 후 2차 배양하여 얻어진 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 의미하는 것이다.

이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명의 상기 1)단계는 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 얻는 단계로, 상기 슈도모나스 에어루지노사 배양액은 슈도모나스 에어루지노사를 1차 배양한 후 얻어진 1차 배양액에 식물성 오일을 더 첨가하여 2차 배양함으로써 얻을 수 있다.

상기 슈도모나스 에어루지노사는 슈도모나스 에어루지노사 PR3 균주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 슈도모나스 에어루지노사 PR3 균주는 미국농산부연구소 미생물보관소(Agricultural research service culture collection, peroria, IL, USA)에 수탁번호 NRRL B-18602로 기탁되어 있다.

상기 1차 배양은 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% Dextrose)를 이용하여 28℃, 200rpm 조건하에서 배양할 수 있고, 배지의 조성은 필요에 따라 덱스트로즈(Dextrose) 대신 필요한 탄소원으로 대치하여 사용할 수 있으며, 대신 필용한 탄소원으로는 포도당(glucose), 갈락토오스(galactose), 과당(fructose) 등이 사용될 수 있다. 또한 효소추출물 및 펩톤(peptone)을 필요한 질소원으로 대치하여 사용할 수 있다. 배지의 pH는 7.0으로 유지하며 균주는 매 2~3일마다 계대 배양할 수 있다.

상기 1차 배양은 10~45℃, 바람직하게는 25~35℃의 온도에서 20~120시간, 바람직하게는 24~72시간 동안 수행될 수 있다.

상기 1차 배양 후에는 1차 배양액에 식물성 오일을 기질로 0.5~5.0부피%(v/v)의 농도, 바람직하게는 1부피%의 농도를 첨가하여 2차 배양한다. 상기 식물성 오일은 전 농도로 사용이 가능하나, 5.0부피%(v/v)의 농도를 초과할 경우에는 생산성이 낮아질 수 있어 전술한 범위로 사용하는 것이 보다 바람직하다.

또한 상기 식물성 오일은 올리브 오일을 사용하는 것이 좋으며, 특히 상기 올리브 오일은 올레산, 트리올레인, 올리브 오일 등을 사용할 수 있다.

또한 상기 2차 배양은 10~45℃에서, 바람직하게는 25~35℃의 온도에서 20~120시간, 바람직하게는 24~72시간 동안 수행될 수 있다. 또한 2차 배양 후에는 6N HCl을 가하여 배지의 pH를 2.0 이하로 낮추어 배양을 종료할 수 있다.

본 발명의 2)단계는 상기 1)단계에서 얻어진 미생물 배양액, 즉 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 진공농축하여 농축물을 수득하는 단계이다.

상기 미생물 배양액은 10~90℃, 바람직하게는 30~50℃ 범위에서 가열하며, 1~80torr의 진공상태의 압력으로 5~10시간 동안 수분을 증발시켜 농축물을 수득할 수 있다.

본 발명의 3)단계는 상기 2)단계의 미생물 배양액의 농축액을 동결건조하여 동결건조물을 수득하는 단계이다.

상기 미생물 배양액의 농축물은 -10~-70℃, 바람직하게는 -30~-60℃ 더욱 바람직하게는 -50℃로 동결시킨 후, 동결건조기에서 1~80 torr의 진공상태의 압력조건으로 2~96시간, 바람직하게는 24시간 동안 수분을 증발시켜 동결건조물을 수득할 수 있다.

본 발명의 4)단계는 상기 3)단계의 동결건조된 미생물 배양액으로부터 하이드록시 지방산을 추출하는 단계이다.

상기 하이드록시 지방산은 동결건조된 미생물 배양액에 물 및 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

상기 물은 동결건조된 미생물의 배양액 무게의 1~20배로 사용되는 것이 좋다.

또한 상기 용매로는 에틸 아세테이트를 사용하는 것이 바람직하며, 사용된 물의 양의 1~10배의 에틸아세테이트를 사용할 수 있다.

상기 추출은 필요에 따라 1~3회로 반복하여 수행될 수 있다.

특히, 상기 하이드록시 지방산은 동결건조된 미생물 배양액 무게의 6배에 해당하는 물을 첨가하여 죽 상태로 만든 후, 물 사용량의 1.5배에 해당하는 용매를 사용하여 2회 추출하는 것이 바람직하다.

또한 하이드록시 지방산은 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법은, 슈도모나스 에어루지노사 PR3을 1차 배양하고, 이 배양액에 올리브 오일을 첨가하여 2차 배양하여 미생물 배양액을 얻은 다음, 상기 얻어진 미생물 배양액을 농축하고 동결건조한 후, 상기 동결건조된 미생물 배양액에 물 및 에틸 아세테이트를 가하여 조추출물을 추출하고, 동결건조된 미생물 배양액의 무게에 따른 최적화된 물 및 아세테이트 양을 확인하였다. 상기 조추출물 양을 농축 및 동결건조하지 않은 기존 추출방법을 이용하여 추출한 조추출물의 양과 비교한 결과, 동결건조한 경우 추출효율이 48.4% 증가함을 확인하였고, DOD의 추출효율이 증가함을 확인하였고, 용매 사용량이 7배 감소함을 확인하였다. 이같은 본 발명의 하이드록시 지방산을 생산하는 방법을 사용하는 경우 하이드록시 지방산 생산효율을 높일 수 있고, 유기용매 사용량을 감소시킬 수 있는 이점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 본 발명의 미생물 배양액의 동결건조 전 후 사진비교

슈도모나스 에어루지노사 PR3(Pseudomonas aeruginosa PR3, 수탁번호 NRRL B-18602)를 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% Dextrose)를 이용하여 28℃, 200rpm 조건하에서 24시간 동안 1차 배양한 슈도모나스 에어루지노사 PR3 1차 배양액에 올리브 오일을 1부피%(v/v)의 농도로 첨가한 후, 3일간 배양하여 생산된 미생물 배양액(도 1의 왼쪽사진, 50㎖)을 수득하였다. 이 미생물 배양액을 5시간 동안 50℃, 10torr의 진공상태의 압력으로 농축하였다. 이어서 상기 미생물 배양액의 농축물을 -50℃, 5torr 압력조건에서 24시간 동안 동결건조한 건조물(도 1의 오른쪽사진, 800㎎)을 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 본 발명의 동결건조된 미생물 배양액의 건조물로부터 생성물을 추출하기 위한 최적조건 확인

상기 실시예 1에서 동결건조된 미생물 배양액으로부터 생성물을 추출하기 위하여, 건조물에 먼저 물을 가하여 죽과 같은 상태로 만든 후, 에틸 아세테이트를 이용하여 추출하였다. 건조물은 500㎎을 사용하였고, 첨가된 물은 건조물 무게의 2~6배까지 사용하였으며, 에틸아세테이트는 사용된 물의 양의 1~2배까지 사용하여 2회에 걸쳐 추출하였다. 첨가된 물 및 에틸아세테이트의 양에 따른 추출물의 양을 도 2에 나타내었다.

도 2에서 나타난 바와 같이, 물의 양을 1㎖ 및 2㎖로 사용하였을 경우, 용매 사용량이 증가할수록 추출된 조추출물의 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나 물을 3㎖로 사용한 경우 용매 사용량이 물 사용량의 1.5배 이상에서는 추출물의 양이 더 이상 증가하지 않아 시료 중의 생성물이 최대로 추출되었다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 동결건조된 미생물 배양액의 건조물로부터 생성물을 추출하기 위하여, 건조물 무게의 6배에 해당하는 물을 첨가하여 죽 상태로 만든 후, 사용된 물의 1.5배에 해당하는 용매를 사용하여 2회 추출할 때 최적의 추출효율을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용한 추출결과와 기존 추출방법을 이용한 추출결과 비교

상기 실시예 2에서 확인된 최적화된 추출방법을 이용한 추출효율과 기존의 추출방법을 이용한 추출효율을 비교하기 위하여, 농축 및 동결건조를 실시하지 않고 슈도모나스 에어루지노사 PR3(Pseudomonas aeruginosa PR3) 배양액 50㎖을 직접 에틸 아세테이트 50㎖과 디에틸 에테르(diethyl ether) 50㎖를 이용하여 2회 추출하였고, 추출된 용매를 혼합하여 용매를 증발시킨 후, 추출물의 무게와 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 방법을 거친 추출물의 무게를 비교하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 기존의 추출방법을 이용한 경우 잔류된 생성물의 무게를 확인한 결과 312㎎의 생성물을 얻었고, 50㎖의 미생물 배양액을 동결건조한 건조물 800㎎ 전체를 실시예 2에서 확인한 최적 추출조건을 적용하여 추출한 결과 463㎎의 생성물을 얻을 수 있었다. 즉, 본 발명의 추출방법을 이용한 경우 기존의 방법에 비해 추출효율이 48.4% 증가하였음을 알 수 있었다.

실시예 4. 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용하여 추출한 생성물과 기존 추출방법을 이용하여 추출한 생성물의 성분 비교

본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 최적화된 추출조건을 이용하여 추출한 생성물과 기존 추출방법을 이용하여 추출한 생성물의 성분을 비교하기 위하여, 두 생성물과 DOD 표준물질을 박층크로마토그래피로 분석하였다. 보다 구체적으로, 유리기판 위에 실리카겔(silica gel)로 코팅된 것을 사용하며 산물의 분리를 위한 용매는 툴루엔(toluene):디옥산(dioxan):아세트산(acetic acid)[79:14:7, v/v/v]의 혼합물을 이용하였다. 산물의 분리 후 산물의 확인은 황산 50% 용액을 기판 위에 분무한 뒤 100℃에서 10분 이상 가열하여 나타난 스팟으로 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, 두 생성물의 분리 양상이 동일하게 나타나고 있으며, 생성물 중에 DOD가 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용하였을 경우 대상물질인 DOD가 효율적으로 추출되었음을 알 수 있었다.

실시예 5. 본 발명의 최적화된 추출조건과 기존 추출방법을 이용하였을 경우 용매사용량 비교

본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 최적화된 추출조건을 이용하여 추출한 경우의 용매사용량을 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용하는 경우, 사용되는 용매의 량은 14.4㎖이었으며, 기존 추출방법을 이용하여 추출하였을 때 사용된 용매의 양은 100㎖이었다. 따라서, 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용할 때 기존 방법에 비해 용매 사용량을 7배 정도 크게 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

상기의 결과로 미루어 본 발명의 최적화된 추출조건을 이용할 때 기존의 방법에 비해 생성물의 추출효율은 48.4% 증가하고 용매사용량은 7배 정도 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims (11)

1. 식물성 오일이 첨가된 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 농축하고 동결건조한 다음, 상기 동결건조된 미생물 배양액으로부터 하이드록시 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제조방법은,
   1)슈도모나스 에어루지노사를 1차 배양하고, 상기 슈도모나스 에어루지노사의 배양액에 식물성 오일을 첨가하여 추가적으로 2차 배양하여 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 얻는 단계;
   2)상기 1)단계에서 얻은 미생물 배양액을 농축하는 단계;
   3)상기 2)단계에서 얻은 미생물 배양액의 농축액을 동결건조하는 단계; 및
   4)상기 3)단계에서 얻은 동결건조된 미생물 배양액에서 하이드록시 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 1)단계의 1차 배양은 10~45℃에서 20~120시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
4. 제2항에 있어서,
   상기 1)단계에서 식물성 오일은 올리브 오일인 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 올리브 오일은 올레산, 트리올레인 및 올리브 오일 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
6. 제2항에 있어서,
   상기 1)단계에서 식물성 오일은 0.5~1.5부피%(v/v)의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
7. 제2항에 있어서,
   상기 1)단계의 2차 배양은 10~45℃에서, 20~120시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
8. 제2항에 있어서,
   상기 2)단계에서 농축은, 미생물 배양액을 10~90℃ 범위에서 가열하며, 1~80torr의 진공상태의 압력으로 5~10시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
9. 제2항에 있어서,
   상기 3)단계에서 동결건조는 -10~-70℃에서 동결시킨 후, 동결건조기에서 1~80torr의 압력조건으로 2~96시간 동안 수분을 증발시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
10. 제2항에 있어서,
    상기 4)단계에서 추출은 동결건조된 미생물 배양액 무게의 1~20배의 물 및 사용된 물의 양의 1~10배의 에틸아세테이트로 1~3회 추출하는 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 하이드록시 지방산은 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid)인 것을 특징으로 하는 하이드록시 지방산의 제조방법.

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