CN103146786A

CN103146786A - 一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法

Info

Publication number: CN103146786A
Application number: CN2013100973961A
Authority: CN
Inventors: 陈宁; 刘玥; 徐庆阳; 谢希贤; 张成林; 刘淑云
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-03-25
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2013-06-12

Abstract

一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法。该方法以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGL为生产菌株，以梯度pH的顺序控制方式分批发酵生产腺苷，在菌体生长阶段控制pH为6.7-7.0，在达到一定菌体量后控制pH为6.0-6.3，发酵60h，腺苷产量为18.2g/L。该方法可以提高腺苷的产量，发酵过程无需增加额外设备，适合于工业化生产。

Description

一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及发酵过程控制，特别是一种梯度pH控制策略，应用于腺苷的发酵法生产。

背景技术

腺苷(Adenosine)，即为腺嘌呤核苷，化学名9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，分子式为C₁₀H₁₃N₅O₄、相对分子质量为267.24的白色或类白色的粉末。腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸（ATP）或腺苷双磷酸（ADP）形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸（cAMP）进行信号传递等。此外腺苷也是一种抑制性神经传导物（inhibitoryneurotransmitter），可能会促进睡眠。迄今为止，腺苷已被广泛应用于化工、食品、医药、日化等领域，由此可见，该化合物具有非常广泛的应用前景。其化学结构式为：

腺苷化学结构式

随着腺苷应用范围在不断扩大，其市场需求也在不断增长，而目前市场上腺苷的生产方法主要有化学合成法、酶法、发酵法。化学合成法主要以肌苷、次黄嘌呤、2，8-二氯嘌呤、2-甲基硫代腺苷等为原料，合成腺苷，但原料价格高、不适合工业生产。

酶法即RNA降解法，通过酶解RNA得到腺苷，但也存在生产成本过高等问题，此外RNA降解产生四种核苷的混合物，给后续的提取带来困难。

对于利用微生物发酵生产腺苷的研究为日本Haneda等发明最早见于70年代，经过20年的时间使嘌呤核苷的生产达到工业化大规模水平，而国内发酵法生产腺苷起步晚，仍然以化学法和酶法为主要方式生产腺苷。

相比之下，微生物发酵法生产腺苷，是一种绿色的工业，有着副产物少，环境污染小等优势。因此，在低碳环保的形势下，开发新的发酵生产腺苷的方法有着很大的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种采用两阶段梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法。

本发明具体技术方案

一种采用两阶段梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法，该方法采用二阶段梯度pH顺序控制的方式分批发酵生产腺苷，在菌体生长阶段，控制pH为6.7-7.0，菌体浓度达到OD_600nm*201.0-1.5后，控制pH为6.0-6.3，发酵菌株采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGL（该菌株已于2011年12月31日在中国生物工程杂志公开发表，文章为《过表达purA基因对腺苷积累的影响》，现保藏于天津科技大学生物工程学院菌种保藏中心）该菌表面不规则，边缘波状，直径1.5～2mm，革兰氏阳性菌，菌株为专性好氧，化能异养。所述的枯草芽孢杆菌，可以用其他芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌或酵母类真菌代替。

本发明具体操作方法是：将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XGL接种至活化斜面，28～32℃培养24～26h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，28～33℃，180～220rpm培养7～8h；按10～15%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，30～34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，培养时间58-60h。

其中，所述的斜面固体培养基包含以下组分以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2。

斜面培养条件：培养温度25～40℃，优选32～35℃，培养时间12～24小时，优选20～24小时。

所述的种子培养基包含以下组分以g/L计：口服葡萄糖20，玉米浆25mL/L，豆粕水解液10mL/L，酵母粉5，味精5，蛋白胨8，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.4，尿素5，黄嘌呤0.03，组氨酸0.03，pH7.0～7.2。

种子培养条件：培养温度25～40℃，优选32～35℃，培养时间5～12小时，优选6～8小时。

所述的液体发酵培养基包含以下组分以g/L计：口服葡萄糖80，酵母膏18，味精12，K₂HPO₄3，黄嘌呤0.03，组氨酸0.03，MgSO₄·7H₂O5，MnSO₄0.006，FeSO₄7H₂O0.006，CaCl₂2，玉米浆15mL/L。

发酵培养条件：培养温度25～40℃，优选32～35℃，培养时间32～72小时，优选50～60小时；接种量5～20%（V/V），优选接种量为8～10%。发酵罐通气搅拌控制溶氧范围10～40%，优选20～30%。在0～20h，控制pH为6.7-7.0，在20h至发酵结束控制pH为6.0-6.3。

由于每种微生物都有最适生长pH与最适产物积累的pH，腺苷的发酵生产中，pH偏高有利于菌体的生长，但不利于腺苷的大量积累而低pH下有利于腺苷的积累。pH偏低对菌体的生长不利，从而影响腺苷的产量，pH偏高会导致菌体大量合成，底物被大量消耗，从而流向产物的碳源不足影响产率。

本发明的优点和有益效果：

本发明根据菌体不同生长阶段的pH需求，提供一种梯度pH控制策略，在菌体生长阶段（0～20h）控制pH为6.7-7.0，当菌体浓度达到OD_600nm*201.0-1.5后，调整pH为6.0-6.3，发酵30～40小时，直至发酵结束，此时可以使菌体在最适积累腺苷的pH下达到最大积累。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域的技术人员能够理解，这些具体实例所描述的具体的物料比、工艺条件及其结果仅用于本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下各实施例中所用的菌株扩培方法如下：

斜面培养基配方以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2。

将冷藏的枯草芽孢杆菌XGL接种到斜面上，32℃培养箱培养24小时活化。

种子培养基配方以g/L计：口服葡萄糖20，玉米浆25mL/L，豆粕水解液10mL/L，酵母粉5，味精5，蛋白胨8，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.4，尿素5，黄嘌呤0.03，组氨酸0.03，pH7.0～7.2。

从活化的斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，33℃，200/min培养8h扩培。

以下各实施例中发酵产物腺苷含量所采用的分析方法如下：

发酵液中产物腺苷采用仪器Agilent1100高效液相色谱仪测定（HPLC）。

色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×416mm i.d.，5μm)，柱温30℃，检测器为紫外检测器（259nm），流动相为水：乙腈=90：10；流速1.0ml/min；进样量20μL。精确称取腺苷的标准品，用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液；将预处理的待测发酵液样品用去离子水稀释至适当的浓度，并用0.22μm微孔滤膜过滤，作为发酵样品溶液待检测，发酵样品根据峰面积计算腺苷产量。

实施例1：

发酵培养基以g/L计：口服葡萄糖80，酵母膏18，味精12，K₂HPO₄3，黄嘌呤0.03，L-组氨酸0.03，MgSO₄·7H₂O5，MnSO₄0.006，FeSO₄7H₂O0.006，CaCl₂2，玉米浆15mL/L。

以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养24h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，33℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至装有发酵培养基的5L发酵罐中，34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，菌体生长阶段，0-20h内控制pH为7.0，20h至发酵结束控制pH为6.3，腺苷产量达到18.2g/L。

斜面固体培养基和种子培养基见以上具体实施方式中所述（以下实施例同）。

实施例2：

以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养26h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，220rpm培养7～8h；按15%的接种量转接至装有发酵培养基（同实施例1）的5L发酵罐中，33℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，菌体生长阶段，0-20h内控制pH为6.7，20h至发酵结束控制pH为6.0，腺苷产量达到16.6g/L。

对照实施例3：

以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养24h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，33℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至装有发酵培养基（同实施例1）的5L发酵罐中，34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，控制pH为6.0，培养时间60h。腺苷产量达到7.2g/L。

对照实施例4：

以枯草芽孢杆菌为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养24h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，33℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至装有发酵培养基（同实施例1）的5L发酵罐中，34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，控制pH为7.0，培养时间60h。腺苷产量达到7.6g/L。

对照实施例5：

以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养24h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，33℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至装有发酵培养基（同实施例1）的5L发酵罐中，34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，菌体生长阶段，0-20h内控制pH为6.2，20h至发酵结束控制pH为7.0，腺苷产量达到5.6g/L。

综上所述，采用两阶段顺序控制pH的方法进行腺苷发酵，如实施例1、2，腺苷产量远远高于使用恒pH控制的腺苷发酵（对照实例3、4），对照实例5说明，在菌体生长阶段需要控制pH在较高范围（6.7-7.0），20h后控制pH为较低范围（6.0-6.3）才能使腺苷的产量达到较高水平。

Claims

1.一种采用梯度pH顺序控制发酵生产腺苷的方法，其特征在于所述方法采用二阶段梯度pH顺序控制的方式分批发酵生产腺苷，在菌体生长阶段，控制pH为6.7-7.0，菌体浓度达到OD_600nm*201.0-1.5后，控制pH为6.0-6.3；发酵菌株采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）XGL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法具体操作如下：以枯草芽孢杆菌XGL为出发菌株，接种至活化斜面，28～32℃培养24～26h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，28～33℃，180～220rpm培养7～8h；按10～15%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，30～34℃，溶氧维持在10～20%，用NH₃·H₂O调节pH，培养时间58-60h。

3.根据权利要求书2所述的方法，其特征是：

⑴斜面培养基成分以g/L计：葡萄糖2，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2；

⑵种子培养基成分以g/L计：口服葡萄糖20，玉米浆25mL/L，豆粕水解液10mL/L，酵母粉5，味精5，蛋白胨8，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.4，尿素5，黄嘌呤0.03，组氨酸0.03，pH7.0～7.2；

⑶液体发酵培养基成分以g/L计：口服葡萄糖80，酵母膏18，味精12，K₂HPO₄3，黄嘌呤0.03，组氨酸0.03，MgSO₄·7H₂O5，MnSO₄0.006，FeSO₄7H₂O0.006，CaCl₂2，玉米浆15mL/L。

4.根据权利要求书1、2或3所述的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌，用其他芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌或酵母类真菌代替。