CN104593442A - 一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法，所述方法包括利用大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC，保藏编号为CGMCC NO.8334，将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。本发明的四氢嘧啶生物生产方法，菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5克,合成效率达到11.67g/L.d，均高于已报道的合成水平。本发明提供的生产四氢嘧啶的方法，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种微生物发酵生产四氢嘧啶的方法。
背景技术
四氢嘧啶(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid；ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中应用最为广泛的渗透压调节物。四氢嘧啶分子具有高度水溶性、不带电荷的特点，在高盐环境下细胞可通过四氢嘧啶的高浓度积累提高胞内渗透压，却不会影响胞内生物大分子正常的生理功能。研究表明在高盐、高温、冷冻和干燥等逆境下四氢嘧啶对核酸、蛋白质、细胞膜及整个细胞可提供保护作用，因此在生物制剂、化妆品生产和制药等领域具有广泛的应用前景。
四氢嘧啶的生产传统工艺是利用嗜盐或耐盐微生物在高盐环境下合成积累四氢嘧啶，而在低盐环境下释放四氢嘧啶的特性，采用“细菌挤奶（Bacterial milking）”的方法，通过渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的高效分泌合成。该方法使用高盐培养基易对设备造成腐蚀，而且发酵产物成份复杂，增加了下游纯化工艺的难度，使得四氢嘧啶的生产成本居高不下，严重制约了四氢嘧啶的大规模应用。
目前现有的生产方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发一种高效的四氢嘧啶生产方法从而降低其生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法。
本发明提供的一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的；
所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌：
1）序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和/或SEQ ID №：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为将重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重组菌；所述重组载体具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQ ID №：1所示核酸序列的DNA片段所得的质粒；具体的，所述出发大肠杆菌为带有ΔaraBAD阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌；再具体的，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌BW25113(rrnB3ΔlacZ4787hsdR514Δ(araBAD)567Δ(rhaBAD)568rph-1)。
所述重组载体具体为pBAD-EctABC，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID №.5所示。
所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coliBW-pBAD-ectABC CGMCC NO.8334。
所述方法中，所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：
所述方法中，所述生物转化反应的条件包括：转化温度为30℃，控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0。
具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500转/分钟，通气量为2L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M柠檬酸水溶液维持pH至7.0。
所述方法中，所述生物转化反应的过程包括：将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液；向所述诱导培养液中加入所述含L-天冬氨酸钠的溶液至L-天冬氨酸钠终浓度为200mM；转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液，所述含L-天冬氨酸钠的溶液的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液；转化培养结束即得四氢嘧啶转化液。
所述方法中，所述“将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID№：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液”的方法包括下述1）和2）：
1）菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2.7L含100μg/ml氨苄青霉素的发酵培养基中，搅拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养基的流加速度为50mL/h，流加至菌体密度OD600达到50，菌体培养过程结束，进入诱导培养阶段；
2）诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养基，补料培养基的流加速度调至20mL/h；当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时，诱导培养过程结束；
所述菌体培养的条件为：培养温度为37℃，控制菌体培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制菌体培养体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500－800转/分钟，通气量为3L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0；
所述诱导培养的条件为：培养温度为30℃，控制诱导培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制诱导培养体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500－800转/分钟，通气量为3L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0；
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L；
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.1g，用5M盐酸水溶液定容，定容至1L。
所述发酵培养基置于NBS Bioflo30006L发酵罐中。
所述方法中，所述种子液的制备过程为：挑取所述重组大肠杆菌单菌落接入20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃、200rpm培养12小时；然后将20ml培养物转接至300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的种子培养基中，37℃、200rpm振荡培养12小时，即得种子液；
所述种子培养基的配制：蛋白胨16g,酵母膏10g,氯化钠5g,用水定容至1L，pH7.0。
所述方法中，所述生物转化反应完后，还包括胞内或胞外四氢嘧啶的抽提过程；
所述胞内四氢嘧啶的抽提过程包括：
取1ml所述四氢嘧啶转化液，8000rpm,20分钟离心收集菌体，菌体加入500μl抽提液，所述抽提液由体积比为10:5:4的甲醇:氯仿:水组成，震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相；上清转移至新离心管中，加入等体积的体积比为1:1的氯仿:水，振荡1小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉；
所述胞外四氢嘧啶的抽提过程包括：
取所述四氢嘧啶转化液8000rpm离心20分钟，取上清1ml置于离心管中，加入1ml氯仿振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
本发明的另一个目的是提供一种菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶的方法，所述方法包括：将每3L按照权利要求1-8任一所述的方法得到的四氢嘧啶转化液，按照下述步骤1）和2）操作：
1）8000rpm,20分钟离心收集菌体，用3L连续转化液重悬菌体后置于发酵罐中，转化培养至葡萄糖消耗完，开始补加转化培养基，转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基；转化培养结束即获得四氢嘧啶转化液2；
所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下：
所述100mM PBS缓冲液由380ml0.1M磷酸二氢钠溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠溶液配置而成；
所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
所述转化培养的条件包括：培养温度为30℃，控制转化培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，所述搅拌速度为500转/分钟，通气量为2L/min；具体的，通过2.7M氨水和1M柠檬酸水溶液维持pH至7.0；
2）将四氢嘧啶转化液2按照步骤1）进行重复循环操作n次,n≤3。
所述发酵罐为NBS Bioflo30006L发酵罐。
所述菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶的方法，还包括合并每次获得的离心去除菌体后的四氢嘧啶转化液，进行胞外四氢嘧啶的抽提过程：取所述去除菌体后的四氢嘧啶转化液8000rpm离心20分钟，取上清1ml置于离心管中，加入1ml氯仿剧烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
本发明的再一个目的是提供一种制备四氢嘧啶的转化培养基，所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
或，一种制备四氢嘧啶的发酵培养基、补料培养基或诱导培养基：
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L；
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.1g，用5M盐酸定容，定容至1L；
所述诱导培养基为在上述发酵培养基和/或补料培养基中，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L；
或，一种制备四氢嘧啶的连续转化液，所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下：
本发明的四氢嘧啶生物生产方法，菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5克,合成效率达到11.67g/L.d，均高于已报道的合成水平。因此本发明对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达情况。
图2为大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析。
图3为高密度培养中葡萄糖的利用及菌体密度的分析。
图4四氢嘧啶合成水平的分析。
图5五批四氢嘧啶转化液中四氢嘧啶合成水平的分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
延长盐单胞菌Halomonas elongate CGMCC No.1.6329购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。
pBAD/HisA购自invitrogen，产品目录号为V430-01；
实施例1、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的构建
(一)、四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达
1、PCR扩增四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码序列
以延长盐单胞菌H.elongate(CGMCC No.1.6329)的基因组DNA为模板，用引物EctABC-P1、EctABC-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
EctABC-P1：5’-CCTAGCTAGCATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTA-3’
EctABC-P2：5’-CCGCTGCAGTTACAGCGGCTTCTGGTCGTCGGCT-3’
2、酶切、连接
用NheI和PstI双酶切PCR扩增产物，与预先使用NheI和PstI双酶切的pBAD/HisA质粒大片段进行连接，得到重组质粒。
3、转化、筛选以及序列验证
用氯化钙化学转化法将上述制备的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒，进行测序验证。测序结果表明，上述制备的重组质粒中含有具有如序列表中的SEQ ID №.1所示核酸序列（即EctABC编码基因序列）的DNA片段，该序列分别编码具有序列表中SEQ ID №.2-4所示氨基酸序列的3种蛋白（即四氢嘧啶合成中的三个关键酶:氨基丁酸乙酰基转移酶EctA、二氨基丁酸氨基转移酶EctB、四氢嘧啶合成酶EctC），与已报道的序列一致。上述实验过程及结果证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作DH5α-pBAD-ectABC,阳性质粒记作pBAD-EctABC。质粒pBAD-EctABC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID №.5所示。
4、重组表达菌株的构建
用氯化钙化学转化法将重组质粒pBAD-EctABC转化至大肠杆菌K-12系列表达菌株BW25113(rrnB3ΔlacZ4787hsdR514Δ(araBAD)567Δ(rhaBAD)568rph-1)（购自Thermo Cat#OEC5042），用含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，获得EctABC重组表达菌株。检测重组菌株合成四氢嘧啶的能力，将其中合成能力较差的一株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC’；将其中合成能力较佳的一株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC将该合成能力较佳的大肠杆菌（Escherichia coli）BW-pBAD-ectABC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.8334，保藏日期为2013年10月15日，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中EctABC基因的表达
挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入5ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物1ml接种于100ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃剧烈振荡（200rpm）培养，至发酵液的OD600值达到0.6-0.8左右，向发酵体系中加入L-阿拉伯糖(L-阿拉伯糖的终浓度为1g/L），30℃条件下继续培养6小时。设含空载体大肠杆菌BW-pBAD为阴性对照。
发酵完毕后,5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎后12,000rpm离心15min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。检测结果见图1。图1中，泳道1表示含空载体大肠杆菌BW-pBAD阴性对照的检测结果；泳道2为四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的检测结果。
实施例3、四氢嘧啶合成能力较佳菌株BW-pBAD-ectABC保藏编号为CGMCC NO.8334的应用
（一）、菌株发酵及生物转化法制备四氢嘧啶过程
1、菌株发酵及EctABC基因的表达
挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入20ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物5ml接种于500ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基，37℃剧烈振荡（200rpm）培养，至发酵液的OD600值达到0.6-0.8左右，再向发酵体系中加入L-阿拉伯糖(L-阿拉伯糖终浓度为1g/L），30℃条件下继续培养6小时5000rpm离心15分钟，收集菌体。
2、生物转化反应
离心后菌体加入转化液，重悬菌体至OD600值达到10，取50ml重悬菌液于250ml三角瓶中，30℃振荡（100rpm）反应24小时。
转化液成分：100mM PBS缓冲液（pH7.0）中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L葡萄糖、10g/L甘油、10g/L KCl。其中，100mM PBS缓冲液（pH7.0）的配制方法为：取380ml0.1M磷酸二氢钠水溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠水溶液配制而成。
（二）、胞内四氢嘧啶的抽提
上述生物转化反应完后，离心（8000rpm,20分钟）收集上述转化后菌体，菌体于-80℃中预冷30分钟后至于冷冻干燥仪中冻干，称重得干菌体160毫克。
称取20mg冻干菌体，加入500ul抽提液（抽提液由体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、水组成），剧烈震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相。上清转移至新离心管中，加入等体积的氯仿与水的混合液（氯仿与水的体积比为1:1），剧烈振荡1小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
按上述方法提取胞内四氢嘧啶，直至将160毫克冻干菌体胞内四氢嘧啶提取完全。
（三）、胞外四氢嘧啶的抽提
离心（8000rpm离心20分钟）收集上清液500ul置于离心管中，加入500ul氯仿剧烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
按上述方法提取胞外四氢嘧啶，直至将50ml反应液中的四氢嘧啶提取完全。
（四）、四氢嘧啶HPLC检测
上述抽提获得的四氢嘧啶干粉溶于500ul浓度为80％(V/V)的乙腈水溶液中，0.22um有机型滤器过滤除去不溶物。过滤后样品用80％（V/V）乙腈水溶液适当稀释后HPLC检测四氢嘧啶浓度。HPLC检测仪为Agilent1260Infinity LC,检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为215nm，流动相80％（V/V）乙腈水溶液,流速为1.0mL/min,进样量为10uL，采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢嘧啶标准品作为定性及定量标准。
HPLC检测结果显示，生物转化反应24h后，从160毫克干菌体和50ml反应液中，分别共提取胞内四氢嘧啶15毫克、胞外四氢嘧啶170毫克；换算后，每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。胞外四氢嘧啶浓度为3.4mg/ml。
（五）、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析
按上述（一）-（四）所述方法，分别检测生物转化反应2、4、8、12、16、20、24h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，实验结果见图2所示。
图2结果显示，四氢嘧啶的合成量随着生物转化反应时间的增加而增加；生物转化反应4h后，菌株BW-pBAD-ectABC转化的四氢嘧啶开始分泌至胞外，随着反应时间的延长胞外四氢嘧啶的浓度显著增加，而胞内四氢嘧啶的含量保持恒定。转化20小时后四氢嘧啶的分泌速度减缓。生物转化反应24h后，每克菌体可以合成1.1克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。
实施例4、四氢嘧啶合成能力较佳菌株BW-pBAD-ectABC’的应用
按照上述实施例3所述的方法（即将实施例3中BW-pBAD-ectABC菌株替换为本对比例中的BW-pBAD-ectABC’菌株，其它均不变），利用大肠杆菌重组菌BW-pBAD-ectABC’制备四氢嘧啶后，检测生物转化反应24h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，HPLC检测结果显示，每克菌体可以合成0.75克四氢嘧啶，其中超过90％的四氢嘧啶分泌至胞外。菌株BW-pBAD-ectABC的四氢嘧啶合成效率显著高于BW-pBAD-ectABC’。
此外，目前已报道的合成四氢嘧啶效率最高的是Chromohalobacter salexigens，每克干菌体可以合成0.54克四氢嘧啶。
实施例5、利用大肠杆菌四氢嘧啶生产菌株实现对四氢嘧啶的工业化生产
一、发酵种子液制备
挑取大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC保藏编号为CGMCCNO.8334单菌落接入20ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，于37℃（200rpm）培养12小时。将上述20ml培养物转接至300ml含有氨苄青霉素（100μg/ml）的种子培养基中，37℃振荡（200rpm）培养12小时，即得种子液。种子培养基：蛋白胨16g,酵母膏10g,氯化钠5g,用水定容至1L，pH7.0。
二、发酵罐培养
（一）发酵罐培养过程
1、培养基的配制：
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0。
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L。
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.1g，用5M盐酸定容，定容至1L。
2、发酵罐培养过程及培养条件
1）菌体培养
300mL种子液接种于2.7L含氨苄青霉素（100μg/ml）的发酵培养基中（发酵培养基置于NBS Bioflo30006L发酵罐中），37℃搅拌培养至葡萄糖消耗完（本实施例共搅拌了6小时使得葡萄糖消耗完）时，流加补料培养基，补料培养基的流加速度为50mL/h，补料至菌体密度OD600达到50左右（本实施例共流加补料培养基10小时使得菌体密度OD600达到50），菌体培养过程结束，进入诱导培养阶段。
菌体培养条件：37℃（培养温度），500－800转/分钟（搅拌速度），3L/min(通气量)，通过调整转速控制溶氧在20％以上，2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0左右。
2）诱导培养
将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入L-阿拉伯糖(终浓度为1g/L），进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养基，补料培养基的流加速度调至20mL/h；当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时（本实施例诱导培养过程共使用了8小时），诱导培养过程结束。
诱导培养条件：30℃（培养温度），通过调整转速和通气量控制溶氧在20％以上（本实施例搅拌速度为500－800转/分钟、通气量为3L/min，使得溶氧在20％以上)；2.7M氨水和1M磷酸维持pH至7.0左右，其中，氨水除了起调节pH值的作用，还用作氮源。
3、培养基中葡萄糖浓度的测定：1mL发酵液离心取上清（12000rpm,10分钟），用SBA-40S葡萄糖测定仪（山东省科学院生物研究所）检测葡萄糖浓度。
（二）菌体密度及干重的测定
发酵过程中，菌体密度及干重测定结果如图3所示，培养24小时（搅拌培养6小时+补料10小时+发酵诱导培养8小时），菌体密度OD600达到65，细胞干重约20g/L。
细胞干重测定方法：取50ml发酵液离心收集菌体（8000rpm,20分钟），50ml生理盐水（0.9%NaCl）重悬菌体，再次离心收集菌体（8000rpm,20分钟）。菌体置于80℃干燥箱中干燥24小时直至重量恒定。通过50mL菌液中细胞干重与OD600菌体密度值的换算即可获得1L发酵液中的菌体干重。
三、四氢嘧啶生物转化
转化培养过程：发酵诱导培养过程结束后，向发酵罐中加入转化培养基至L-天冬氨酸钠终浓度为200mM（本实施例加入的转化培养基的量为400ml）；转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加转化培养基（本实施例在转化培养了12小时后，开始补加转化培养基），转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基（本实施例继续转化培养的时间共24小时），转化培养结束后得四氢嘧啶转化液。
转化培养基：2M L-天冬氨酸钠，100g/L的葡萄糖、100g/L的甘油、100g/L的KCl，溶剂为水。
转化培养条件：30℃（转化温度），通过调整搅拌速度和通气量控制溶氧在20％以上（本实施例搅拌速度为500转/分钟、通气量为2L/min)，2.7M氨水和1M柠檬酸（溶剂是水）维持pH至7.0左右。
四、胞内四氢嘧啶的抽提
取1ml四氢嘧啶转化液离心收集菌体（8000rpm,20分钟），菌体加入500ul抽提液：甲醇:氯仿:水（体积比为10:5:4），剧烈震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相。上清转移至新离心管中，加入等体积的氯仿:水（体积比为1:1），剧烈振荡1小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
按上述方法，完成所有四氢嘧啶转化液中菌体中的即胞内四氢嘧啶的抽提。
五、胞外四氢嘧啶的抽提
四氢嘧啶转化液8000rpm离心20分钟，取上清1ml置于离心管中，加入1ml氯仿剧烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
按上述方法，完成所有四氢嘧啶转化液中胞外四氢嘧啶的抽提。
六、四氢嘧啶HPLC检测
分别检测生物转化反应4、8、12、16、20、24、28、32、36h后，胞内四氢嘧啶和胞外四氢嘧啶的量，按下述方法检测：
分别将从上述不同转化反应时间得到的四氢嘧啶转化液中抽提获得的胞内或胞外四氢嘧啶干粉溶于1ml浓度为80％(V/V)的乙腈水溶液中，0.22um有机型滤器过滤除去不溶物。过滤后样品用80％（V/V）乙腈水溶液适当稀释后HPLC检测四氢嘧啶浓度。HPLC检测仪为Agilent1260Infinity LC,检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为215nm，流动相80％（V/V）乙腈水溶液,流速为1.0mL/min,进样量为10uL，采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢嘧啶标准品作为定性及定量标准。
检测结果见图4所示，四氢嘧啶的合成量随着生物转化反应时间的增加而增加；反应4小时开始胞外四氢嘧啶的浓度显著增加，而胞内四氢嘧啶的含量保持恒定。通过36小时的转化，胞外四氢嘧啶的浓度达到21g/L（实施例中，所述胞外四氢嘧啶的浓度是以每1L含有菌体的四氢嘧啶转化液中抽提得到的胞外四氢嘧啶的克数计算的）,合成效率达到14g/L.d。
实施例6、菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶
一、取3L实施例5中生物转化反应36h后获得的第一轮四氢嘧啶转化液，离心收集菌体（8000rpm,20分钟），用3L连续转化液重悬菌体后置于发酵罐中（NBS Bioflo30006L发酵罐），转化培养至葡萄糖消耗完，开始补加转化培养基（本实施例在转化培养了12小时后，开始补加转化培养基），转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基（本实施例继续转化培养的时间共24小时），转化培养结束后获得第二轮四氢嘧啶转化液。按实施例5中的方法检测四氢嘧啶的合成量。
连续转化液：100mM PBS缓冲液（pH7.0）中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L的葡萄糖、10g/L的甘油、10g/L的KCl；其中，PBS缓冲液（pH7.0）的组成为：取380ml0.1M磷酸二氢钠溶液加入620ml0.1M磷酸氢二钠溶液配置成100mM PBS缓冲液（pH7.0）；所述溶液的溶剂均为水。
转化培养基：2M L-天冬氨酸钠，100g/L的葡萄糖、100g/L的甘油、100g/L的KCl；所述溶液的溶剂均为水。
转化条件：30℃（转化温度），通过调整转速和通气量控制溶氧在20％以上（本实施例搅拌速度为500转/分钟、通气量为2L/min)，2.7M氨水和1M柠檬酸维持pH至7.0左右
二、利用上述第二轮四氢嘧啶转化液，按本实施例步骤一所述的方法再循环使用菌体3轮，合成四氢嘧啶，按实施例5中的方法检测四氢嘧啶的合成量，检测结果见图5。
如图5所示，第一轮转化1升发酵液获得胞外四氢嘧啶21克，第二轮转化1升发酵液获得19.6克胞外四氢嘧啶，第三轮转化1升发酵液获得17.9克胞外四氢嘧啶，第四轮转化1升发酵液获得16.2克胞外四氢嘧啶，第五轮转化效率有所降低，1升发酵液获得胞外四氢嘧啶12.8克，5轮转化1升发酵液共获得胞外四氢嘧啶87.5克。证明发酵所获菌体至少可以重复使用4－5次。该方法合成四氢嘧啶的效率达到11.67g/L.d明显高于现有其它生产方法。
Claims (10)
1.一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的；
所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌：
1）序列表中SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和/或SEQ ID №：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列；
3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4）与1）或2）或3）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO.8334。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的条件包括：转化温度为30℃，控制生物转化反应体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的过程包括：将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液；向所述诱导培养液中加入所述含L-天冬氨酸钠的溶液至L-天冬氨酸钠终浓度为200mM；转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液，所述含L-天冬氨酸钠的溶液的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液；转化培养结束即得四氢嘧啶转化液。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述“将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了SEQ ID №：2所示蛋白、SEQ ID №：3所示蛋白和SEQ ID №：4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液”的方法包括下述1）和2）：
1）菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2.7L含100μg/ml氨苄青霉素的发酵培养基中，搅拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养基的流加速度为50mL/h，流加至菌体密度OD600达到50，菌体培养过程结束，进入诱导培养阶段；
2）诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养基，补料培养基的流加速度调至20mL/h；当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时，诱导培养过程结束；
所述菌体培养的条件为：培养温度为37℃，控制菌体培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
所述诱导培养的条件为：培养温度为30℃，控制诱导培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L；
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.1g，用5M盐酸水溶液定容，定容至1L。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述种子液的制备过程为：挑取所述重组大肠杆菌单菌落接入20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃、200rpm培养12小时；然后将20ml培养物转接至300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的种子培养基中，37℃、200rpm振荡培养12小时，即得种子液；
所述种子培养基的配制：蛋白胨16g,酵母膏10g,氯化钠5g,用水定容至1L，pH7.0。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应完后，还包括胞内或胞外四氢嘧啶的抽提过程；
所述胞内四氢嘧啶的抽提过程包括：
取1ml所述四氢嘧啶转化液，8000rpm,20分钟离心收集菌体，菌体加入500μl抽提液，所述抽提液由体积比为10:5:4的甲醇:氯仿:水组成，震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相；上清转移至新离心管中，加入等体积的体积比为1:1的氯仿:水，振荡1小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉；
所述胞外四氢嘧啶的抽提过程包括：
取所述四氢嘧啶转化液8000rpm离心20分钟，取上清1ml置于离心管中，加入1ml氯仿振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
9.一种菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶的方法，所述方法包括：将每3L按照权利要求1-8任一所述的方法得到的四氢嘧啶转化液，按照下述步骤1）和2）操作：
1）8000rpm,20分钟离心收集菌体，用3L连续转化液重悬菌体后置于发酵罐中，转化培养至葡萄糖消耗完，开始补加转化培养基，转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基；转化培养结束即获得四氢嘧啶转化液2；
所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下：
所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
所述转化培养的条件包括：培养温度为30℃，控制转化培养体系的溶氧在20％以上，和维持pH至7.0；
2）将四氢嘧啶转化液2按照步骤1）进行重复循环操作n次,n≤3。
10.一种制备四氢嘧啶的转化培养基，所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
或，一种制备四氢嘧啶的发酵培养基、补料培养基或诱导培养基：
每1L发酵培养基的配制：葡萄糖10g,(NH4)2HPO48g,KH2PO413.3g,MgSO4·7H2O1.2g,柠檬酸1.7g,微量盐溶液10mL,用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7.0；
每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g,MgSO4·7H2O10g,微量盐溶液20mL,用水定容至1L；
每1L微量盐溶液的配制：FeSO4·7H2O10g,ZnSO4·7H2O2.25g,CuSO4·5H2O1g,MnSO4·5H2O0.5g,Na2B4O7·10H2O0.23g,CaCl2·2H2O2g,(NH4)6Mo7O240.1g，用5M盐酸定容，定容至1L；
所述诱导培养基为在上述发酵培养基和/或补料培养基中，加入L-阿拉伯糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为1g/L；
或，一种制备四氢嘧啶的连续转化液，所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下：
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|---|---|
| CN (1) | CN104593442B (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018403A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-04 | 天津科技大学 | 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN106754603A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-05-31 | 天津科技大学 | 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用 |
| CN107475282A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-15 | 河北师范大学 | 一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体及应用 |
| CN109182236A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用 |
| CN109439708A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-08 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法 |
| CN112961875A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-15 | 安徽师范大学 | 一种生物法生产四氢嘧啶的工程菌株的构建方法 |
| CN113308482A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-08-27 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用 |
| CN113528595A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-10-22 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法 |
| CN114134127A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-04 | 上海邦林生物科技有限公司 | 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体 |
| CN114621968A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-06-14 | 深圳中科翎碳生物科技有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法 |
| CN114934060A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-23 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN116218928A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-06-06 | 浙江熙正霖生物科技有限公司 | 通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺及应用 |
| CN116410950A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-07-11 | 云合(天津)生物技术有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101597581A (zh) * | 2009-07-13 | 2009-12-09 | 华北电力大学 | 一种嗜碱芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
| CN104560844A (zh) * | 2013-10-28 | 2015-04-29 | 南京众惠生物材料科技有限公司 | 一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用 |
-
2013
- 2013-11-01 CN CN201310534045.2A patent/CN104593442B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101597581A (zh) * | 2009-07-13 | 2009-12-09 | 华北电力大学 | 一种嗜碱芽孢杆菌及其培养方法和应用 |
| CN104560844A (zh) * | 2013-10-28 | 2015-04-29 | 南京众惠生物材料科技有限公司 | 一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ONO,H 等: "Halomonas elongata ectB, ectA, ectC genes for L-2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase", 《GENBANK》 * |
| 王新新 等: "耐盐石油烃降解菌研究进展", 《中国环境科学学会学术年会论文集 2012第3卷》 * |
| 龚皎: "大肠杆菌中四氢嘧啶合成通路的构建及优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 * |
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018403B (zh) * | 2015-07-14 | 2018-01-09 | 天津科技大学 | 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN105018403A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-04 | 天津科技大学 | 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN106754603A (zh) * | 2017-01-09 | 2017-05-31 | 天津科技大学 | 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用 |
| WO2018126610A1 (zh) * | 2017-01-09 | 2018-07-12 | 天津科技大学 | 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用 |
| CN106754603B (zh) * | 2017-01-09 | 2019-03-05 | 天津科技大学 | 利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用 |
| US11535876B2 (en) | 2017-01-09 | 2022-12-27 | Tianjin University Of Science And Technology | Xylose-induced genetically engineered bacteria used for producing ectoine and use thereof |
| CN107475282A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-15 | 河北师范大学 | 一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体及应用 |
| CN109182236A (zh) * | 2018-08-29 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用 |
| CN109439708A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-08 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法 |
| CN112961875B (zh) * | 2021-03-05 | 2022-07-19 | 安徽师范大学 | 一种生物法生产四氢嘧啶的工程菌株的构建方法 |
| CN112961875A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-15 | 安徽师范大学 | 一种生物法生产四氢嘧啶的工程菌株的构建方法 |
| CN113528595A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-10-22 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法 |
| CN113308482A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-08-27 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用 |
| CN113308482B (zh) * | 2021-05-28 | 2022-12-27 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用 |
| CN114134127A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-03-04 | 上海邦林生物科技有限公司 | 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体 |
| CN114134127B (zh) * | 2021-11-24 | 2023-06-23 | 上海邦林生物科技有限公司 | 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体 |
| CN114934060A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-23 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN114621968A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-06-14 | 深圳中科翎碳生物科技有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法 |
| CN114621968B (zh) * | 2022-05-17 | 2022-07-15 | 深圳中科翎碳生物科技有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法 |
| CN116218928A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-06-06 | 浙江熙正霖生物科技有限公司 | 通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺及应用 |
| CN116410950A (zh) * | 2023-06-06 | 2023-07-11 | 云合(天津)生物技术有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法 |
| CN116410950B (zh) * | 2023-06-06 | 2023-08-15 | 云合(天津)生物技术有限公司 | 四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |